Summary
Qui, descriviamo un protocollo per una microdissezione laser riproducibile (LCM) per isolare il trabecolato (TM) per analisi di RNA a valle. La capacità di analizzare i cambiamenti nell'espressione genica nella TM vi aiuterà a comprendere i meccanismi molecolari delle malattie oculari correlate a TM.
Abstract
Microdissezione laser (LCM) ha consentito di analisi dell'espressione genica di cellule singole e arricchita di popolazioni cellulari in sezioni di tessuto. LCM è un ottimo strumento per lo studio dei meccanismi molecolari alla base della differenziazione delle cellule e lo sviluppo e la progressione di varie malattie, compreso il glaucoma. Glaucoma, che comprende una famiglia di neuropatie ottiche progressive, è la più comune causa di cecità irreversibile in tutto il mondo. Cambiamenti strutturali e danno all'interno il trabecolato (TM) può causare aumento della pressione intraoculare (IOP), che è un fattore di rischio importante per lo sviluppo di glaucoma. Tuttavia, i precisi meccanismi molecolari coinvolti sono capiti ancora male. La possibilità di eseguire analisi di espressione genica sarà cruciale per ottenere ulteriori approfondimenti la funzione di queste cellule e il suo ruolo nella regolazione dello sviluppo dello IOP ed il glaucoma. Per raggiungere questo obiettivo, un metodo riproducibile per isolare altamente arricchito TM da sezioni congelate del mouse occhi e un metodo per l'analisi dell'espressione genica a valle, come RT-qPCR e RNA-Seq è necessario. Il metodo descritto nel presente documento è stato sviluppato per isolare altamente puro TM dagli occhi del mouse per PCR digitale a valle e l'analisi di microarray. Inoltre, questa tecnica può essere facilmente adattata per l'isolamento di altre cellule oculari altamente arricchite e compartimenti cellulari che sono stati difficili da isolare dagli occhi del mouse. La combinazione di analisi LCM e RNA può contribuire a una comprensione più completa degli eventi cellulari alla base di glaucoma.
Introduction
Il glaucoma è un gruppo di malattie caratterizzate da neuropatia ottica e retinopatia che infine conduce a cecità irreversibile1,2. Si stima che entro il 2020 oltre 70 milioni di persone in tutto il mondo vivrà con qualche forma di malattia3,4,5,6,7. Glaucoma ad angolo aperto primario (POAG), il più diffuso tipo di glaucoma, è caratterizzato da una diminuzione nel deflusso di umore acqueo (AH) che conduce all'aumento della pressione intraoculare (IOP)8,9,10, 11,12,13,143,15,16,17,18. Sinistro non trattati, cronicamente elevato IOP conduce alla progressiva e irreversibile danno alla retina ed al nervo ottico testa causando cecità radiale1,2,19. Tutti i metodi attuali per rallentare la progressione della messa a fuoco di glaucoma sulla riduzione della IOP, diminuendo il tasso di produzione di AH di corpo ciliare o migliorare il suo deflusso1,8,9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14. il trabecolato (TM) svolge un ruolo fondamentale nel regolare attivamente la via di uscita AH primaria e la sua funzione impropria è un fattore scatenante per ipertesi glaucoma1,2,19. Tuttavia, i meccanismi molecolari associati a disfunzione TM e come regola AH drenaggio ancora completamente non sono capiti ed sono attualmente degli obiettivi principali di glaucoma ricerca1,2,19, 20. mentre diversi studi di associazione genome-wide (GWAS) hanno collegato un numero di geni per il glaucoma e la resistenza aumentata alla funzione di uscita AH presso il TM, l'esatto meccanismo molecolare che portano alla malattia non sono ancora pienamente compreso21 , 22 , 23 , 24 , 25.
Modelli animali hanno notevolmente migliorato la nostra conoscenza attuale di progressione di malattia nel glaucoma (esaminata estesamente in3,15,16,26,27,28, 29,30,31,32,33). Sono stati sviluppati diversi metodi all'avanguardia per studiare le TM34,35,36 e questi metodi sono stati ampiamente utilizzati per far avanzare la nostra comprensione corrente del tessuto normale e malato. Un settore che non è stato ampiamente esplorato è l'utilizzo di modelli di topi geneticamente modificati per lo studio dei meccanismi molecolari del fallimento di TM. Transgenici knock-in e gli studi di topo knock-out di geni TM connesso, come Myocilin (Myoc)37,38 e Cyp1b139, sono stati i principali strumenti per lo studio dei meccanismi molecolari di TM funzione. Comprensibilmente, le piccole dimensioni del TM in topi rappresentano un grave ostacolo che deve essere superato per cominciare a studiare questo tessuto. Modelli murini rappresentano un potente strumento per lo studio della genetica e i meccanismi molecolari della malattia, mentre i progressi nelle tecnologie di LCM offrono gli strumenti necessari per potenziare lo studio dei tessuti più piccoli e più delicati, tra cui il TM.
In questo rapporto, un metodo affidabile e riproducibile è descritto per il LCM di TM altamente arricchito dagli occhi del mouse insieme successivo isolamento del RNA e l'amplificazione per analisi di espressione a valle. Metodi simili sono stati utilizzati con successo nei topi per isolare altri tipi di occhio tessuti40,41,42,43,44, la metodologia segnalata qui può essere applicata ad altri discreti tessuti dell'occhio per studiare il RNA, i microRNA, DNA e proteine. Soprattutto, questa tecnica consente l'uso di topi geneticamente modificati per meglio comprendere la patogenesi molecolare della compromissione TM glaucoma e malattia oculare3,15,16,17 ,18,26,31,45,46. La possibilità di isolare la TM degli occhi del mouse di LCM sarà una tecnica utile ad ottenere ulteriori comprensioni nei meccanismi molecolari di parecchie malattie oculari.
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Protocol
Il National Institute di Environmental Health Sciences (NIEHS) Animal Care e utilizzo Comitato (ACUC) ha approvato tutte le metodologia di questo studio sotto il NIEHS animale studiare proposta IIDL 05-46.
1. ottimale dei tessuti insieme per microdissezione Laser
- Ottenere 2 ai topi di 3 mesi, maschio o femmina C57BL/6. Eutanasia con CO2 per un minimo di 1 min o fino a quando la respirazione è cessato. Rimuovere l'animale dalla gabbia e assicurare la morte da dislocazione cervicale, decapitazione o toracotomia.
- Prima della dissezione, garantire che tutti gli strumenti di dissezione sono puliti e sterilizzati.
Nota: Per la rimozione degli occhi curvo forbici e pinzette con punta seghettata (preferito punta dimensioni: 0,5 x 0,4 mm) saranno necessari. - Stabiliscono il mouse su una superficie piana sul suo lato, in modo che l'occhio è facilmente accessibile. Afferrare sul canthus (angolo dell'occhio) con il forcipe per stabilizzare il mouse, quindi utilizzando le forbici curve, affrontando la curva lontano dagli occhi, tagliata intorno all'occhio utilizzando lo zoccolo dell'occhio come guida fino a quando il bulbo oculare può essere facilmente preso dalla presa di corrente (utilizzare la curva non la punte delle forbici).
- Tirare delicatamente e, usando le forbici curve, tagliare il nervo ottico, che rilascia l'occhio dalla presa orbitale. Rimuovere con cautela non oculari tessuto dall'occhio e risciacquare in 1x tamponato fosfato salino (PBS). Ripetere 1.3-1.4 per l'occhio controlaterale.
- Della macchia dell'occhio con un panno di tessuto per rimuovere eventuali tracce di umidità prima di incorporare. Posizionare l'occhio in stampo campione (25 x 20 x 5 mm3) in modo che la lente e del nervo ottico sono paralleli alla parte superiore del banco per ottenere sezioni sagittali. Incorporare gli occhi in ottimale taglio temperatura (t.o.c.) composto e posto sul ghiaccio a secco per congelare. Una volta congelato, memorizzare i blocchi a-80 ° C.
2. congelato della sezione Preparazione per il Laser Microdissection
- Prima dell'uso Incubare i vetrini di membrana in polietilene tereftalato (PET) in cross-linker UV alla massima potenza per 45 min.
- Spruzzare la soluzione di decontaminazione di RNAsi sul pennello, forcipe, vasetti di accoppiamento e montaggio autocentrante. Pulire accuratamente. Risciacquare con acqua priva di nucleasi e asciugare. Pulire il criostato con etanolo al 100% per evitare la contaminazione incrociata.
- Regolare il criostato a-18 ° C. Rimuovere un blocco congelato dal congelatore a-80 ° C in un momento e consegnare al criostato con ghiaccio secco. Consentire il blocco congelato per equilibrare con la temperatura del criostato per un minimo di 10 min.
- Spremere una piccola quantità di o.c.t. sul pezzo di montaggio (Figura 1A) e rimuovere il blocco di tessuto dallo stampo e posizionare il blocco sul mandrino di montaggio (Figura 1B). Una volta che il blocco di tessuto sul mandrino di montaggio viene congelato inserire sul supporto esemplare del criostato (Figura 2A).
- Regolare il criostato per tagliare 8 µm sezioni e sezione attentamente attraverso il blocco di o.c.t. raggiungere il campione di tessuto. Una volta che il tessuto è osservato, smettere di sezionamento, tagliare i blocchi congelati su tutti i lati con una lama di rasoio pulita e lasciare 3-4 mm di o.c.t. il tessuto circostante per consentire la movimentazione con il pennello (Figura 2B). Utilizzare un nuovo pennello pulito invece della piastrina di rotolo tra ogni cambiamento di campione per evitare la contaminazione del campione.
- Sezione attraverso l'occhio lavorando rapidamente. Macchia macchia ogni terza sezione tramite il flooding il vetrino con eosina (H & E) e un rapido passaggio singolo per 60 s, sciacquare con acqua corrente, aria secca, chiaro in agente di compensazione e montare su un vetrino di carica con un vetrino coprioggetti. Mostra sotto il microscopio e continuare fino a quando il TM è evidente nelle sezioni tagliare di sezionamento.
- Una volta che il TM comincia ad apparire, tagliare 2 sezioni e montare su una lastra di vetro carica per routine H & E che macchia per formare una mappa per il taglio con LCM.
Nota: Vedere sezione 3 per mappa e dettagli colorazione. - Dopo il primo H & E mappa diapositiva, tagliare e linea 6 sezioni spesse seriale 8-µm a criostato e contemporaneamente montare nella diapositiva di membrana di PET (Figura 3A, B). Aderire il tessuto facendo scorrere brevemente pollice inguantato lungo la parte posteriore della membrana. Dopo il montaggio, posizionare la diapositiva di membrana PET immediatamente in una casella di scorrimento in ghiaccio secco.
Nota: Possono essere montati meno sezioni, tuttavia, si consiglia di montare più sezioni sulla diapositiva in una sola volta a ridurre il degrado del RNA limitando la quantità di tempo che ogni sezione è esposto all'aria a temperatura ambiente. - Continuare a sezione l'occhio, dopo ogni due scivoli di membrana PET con 6 sezioni ciascuna, due sezioni di raccogliere su un vetrino di carica per creare un'altra mappa diapositiva per la macchiatura di H & E. Continuare sezionamento, circa 100 µm 8 seriale sezioni spesse, fino a quando TM non è più visibile. Confermare macchiando rapidamente una sezione su un vetrino carica (Vedi 2.6).
- Memorizzare tutte le diapositive di membrana PET a-80 ° C per un uso successivo LCM.
3. H & E mappa Slide che macchia protocollo e revisione morfologica
- Per visualizzare ed esaminare i vetrini mappa sulle diapositive di vetro carica, fix il tessuto trasferendo immediatamente in una vaschetta di colorazione riempita con 100 mL di soluzione di fissaggio rapida per 7 s. risciacquo la diapositiva immergendolo in acqua distillata 10 - 20 volte , quindi trasferire la diapositiva a un barattolo di accoppiamento con acqua distillata.
- Rimuovere il vetrino da acqua e tamponare i bordi asciutti con un panno di tessuto. Dispensare 200 µ l per volta filtrata Harris Hematoxylin su ogni sezione e incubare per 30 s a temperatura ambiente. Risciacquare accuratamente il vetrino sotto acqua corrente fino a quando non esce pulita. Asciugare le estremità del vetrino con un panno di tessuto tra ogni passaggio (macchia tra ogni passaggio da 3.2-3.5) per rimuovere il liquido in eccesso.
- Diapositiva di posto in 1X PBS a temperatura ambiente per 30 s. Quindi, risciacquare accuratamente il vetrino sotto acqua corrente per 30 s.
- Immergere la diapositiva 3 - 4 volte in bagno di etanolo 95%. Applicare la soluzione abbastanza colorante eosina Y per coprire il tessuto sulla diapositiva e incubare per 15 s a temperatura ambiente.
- Sciacquare il vetrino in bagno di etanolo 95% due volte con rapidi tuffi 10-20. Sciacquare il vetrino in bagno di etanolo 100% due volte con rapidi tuffi 10-20. Quindi, risciacquare diapositiva due volte in bagno di xilene (10-20 veloce DIP ogni).
- Montaggio mediante l'applicazione di mezzo di montaggio resinoso al tessuto, aggiungere coprioggetto attentamente per evitare bolle d'aria e lasciarlo asciugare durante la notte nella cappa.
- Scrivi una recensione su diapositive H & E visivamente o utilizzando un scanner per diapositive digitale. Identificare mappa diapositive con TM chiaramente visibile e accessibile per il taglio. Utilizzare il PET diapositive di membrana tra questi mappa diapositive per LCM.
4. in polietilene tereftalato (PET) membrana scivola protocollo di lavorazione e colorazione
- Prima rimozione PET diapositive dal freezer prima preparare la soluzione di riserva di cresyl violet da sciogliere 0,3 g di acetato di cresile viola in 20 mL di etanolo al 75% e posizionarla sui shaker per 2 h. filtro la soluzione con 0,22 µm filtrazione sterile e conservare a 4 ° C per non più di 6 lun THS.
- Preparare soluzione alcolica di eosina Y con etanolo al 75% con un rapporto di 1:4. Preparare la fissazione (75% etanolo) e soluzioni di disidratazione (75%, 95% e 100% etanolo) nei tubi in polipropilene pulita, priva di nucleasi, 50 mL conica sul ghiaccio. Aggiungere RNasi inibitore ogni soluzione.
- Rimuovere la casella di scorrimento contenente sezioni di tessuto congelato dal congelatore a-80 ° C e posizionarlo sul ghiaccio secco. Elaborare una diapositiva alla volta. Difficoltà diapositive inserendo la diapositiva immediatamente in etanolo freddo 75% per 30 s.
- Immergere delicatamente il vetrino in acqua privo di nucleasi per 10-15 s sciogliere o.c.t. senza interferire con le sezioni di tessuto.
- Attentamente Dispensare 300 µ l di soluzione di acetato viola di cresyl 1,5% direttamente le sezioni e incubare per 45 s a temperatura ambiente. Lavare una volta inserendolo nella vasca di etanolo di 75% per 30 s. pipetta 200 µ l eosina Y soluzione sulle sezioni, quindi incubare per 3-5 s.
- Disidratare tessuto inserendo la diapositiva successivamente nel 75% etanolo, etanolo al 95% e infine, bagno di etanolo 100% per 30 s ciascuno. Asciugare le estremità del vetrino con un panno di tessuto tra ogni passo per eliminare il liquido in eccesso. Lasciare asciugare completamente sotto il cofano per 5 min l'aria di diapositiva. Una volta asciutto, eseguire immediatamente dopo il LCM.
Nota: Si raccomanda di evitare l'uso di xilene per questo passaggio, può causare le sezioni di tessuto legare non adeguatamente alla diapositiva di membrana e riduce l'efficienza di cattura del tessuto.
5. laser Microdissection con Laser UV
- Accendere il computer e consentire al boot. Accendere l'alimentazione della luce bianca del microscopio. Attivare il tasto laser UV e un LED si illumina di giallo. Avviare il software di LCM, consentono di caricare completamente e un video live visualizzerà. Premere il pulsante laser sulla casella di controllo e un LED verde si accende.
- Caricare una nuova diapositiva di vetro sul palco microscopio, quindi porre il vetrino di membrana PET con il lato di tessuto macchiato rivolto verso il basso direttamente sulla parte superiore del vetrino. Assicurarsi che la membrana e il vetrino sono strettamente accoppiati sul tavolino del microscopio.
- Inizio LCM impostando prima i limiti di diapositiva. Scegliere il più basso 4 X ingrandimento nel pannello oggettivo (Figura 4). Quindi è possibile definire l'area di lavoro della diapositiva membrana spostando i microscopi xy-fase fino a quando nell'angolo superiore sinistro dove si incontrano il metallo e la membrana è visibile nel video live feed, premere il pulsante "Limite 1" ed un rettangolo rosso apparirà sulla tabella di marcia. Successivamente, passare alla xy-fase fino all'angolo opposto e premere il pulsante "limite di 2". Premere il pulsante "scan" per creare un'immagine di tabella di marcia della membrana e tessuti tra i limiti impostati.
- Fare doppio clic vicino il TM di una delle sezioni di occhio all'interno della tabella di marcia, la TM possono essere posizionati vicino all'apice dell'angolo irido-corneale (Figura 5A). Una volta individuata la TM, aumentare l'ingrandimento 10x e manualmente il TM. Ripetere con 20 X e 40 X obiettivi. Quando il TM è a fuoco con l'obiettivo 40x (figura 5B), spostarsi in un'area vuota nelle vicinanze (messa a fuoco potrebbe essere necessario essere leggermente regolata), selezionare lo "strumento di disegno a mano libera" e disegnare una linea lunga su un'area vuota del tessuto.
- Impostare i parametri laser in modo che la "velocità di taglio" è del 34%, "focus" è del 58% e "potenza" è del 70% (Figura 4), quindi premere il pulsante di "tagliare". Fare regolazioni fini laser alla velocità, messa a fuoco e parametri di potenza fino a quando una linea chiara e fine taglio è osservata (Vedi Figura 5). Per un taglio preciso, garantire un'azione di taglio segue la linea disegnata.
- Caricare il coperchio del tubo di isolamento nel titolare del tappo e aprire il tubo. Montare il supporto della PAC PAC-Lift e assicurarsi che il tubo è invertito. Assicurare che il materiale adesivo tappo sporge oltre la punta del tappo per garantire che il tessuto desiderato sia stato acquisito correttamente.
- Selezionare la modalità di dissezione "Manuale" nel pannello di software. Controllare attentamente che il TM (figura 5B) è direttamente sotto al tubo di isolamento. Impostare il bilanciamento del bianco e regolare la luminosità per acquisire la qualità di immagine ottimale (Figura 4).
- Per iniziare il taglio, manualmente regolare la messa a fuoco e disegnare una linea utilizzando lo strumento mano libera, assicurarsi che il tappo di raccolta rimane nella posizione di backup non ancora toccare la membrana. Disegnare cerchi parziale vicino a dove il TM incontra la sclera (Figura 5), quindi premere "tagliare". Una volta finiti i primi tagli, posizionare la calotta in posizione abbassata e ri-regolare la messa a fuoco, quindi disegnare due linee nello spazio aperto o gratuito per collegare i due cerchi parziali completando il cerchio intorno la TM, quindi premere "tagliato" e raccogliere tessuto dalla sezione , assicurarsi che il TM era prelevati dalla PAC microdissection (Figura 5 D-F).
- Posizionare la calotta in posizione sollevata e ripetere (5.2-5.8) le sezioni rimanenti. Regolare leggermente la posizione del tappo così tutti i campioni isolati si adatta sul cappuccio e non si sovrappongono (Figura 5). Per coerenza, la finestra di tempo per una diapositiva è 20 min uso meno sezioni ad animale diapositiva se è necessario più tempo per isolare TM da tutte le sezioni. Per il prossima membrana PET, inserire un nuovo tubo di isolamento e ripetere il punto 5.
6. lisi del tessuto Microdissected TM
- Appena preparare buffer di lisi di RNA per lisare tessuto isolato di LCM. Aggiungere 10 µ l β-mercaptoetanolo per ogni 1 mL di tampone di lisi. Conservare il tampone di lisi con β-mercaptoetanolo a temperatura ambiente per non più di 1 mese.
- Rimuovere il tubo di isolamento da titolare cap entro 20 min dall'inizio della microdissection. Visualizzare la superficie del tappo dall'occhio per garantire la cattura di TM.
- Attentamente e Pipettare 10 µ l di tampone di lisi sul coperchio del tubo di raccolta garantendo il buffer di lisi copre completamente il microdissected TM. Delicatamente chiudere adesivo tappo e incubare la provetta capovolta a temperatura ambiente per 10 min. Dopo l'incubazione, centrifugare a 800 x g per 2 minuti e posto lisato su ghiaccio secco. Memorizzare i lysates a-80 ° C per la successiva purificazione e analisi.
7. RNA isolamento ed analisi di qualità
- Analizzare la qualità di RNA di scongelare i campioni a temperatura ambiente. Piscina insieme tutti i campioni isolato da un singolo mouse in una provetta di microfuge 1,5 mL RNAsi-libera.
Nota: ad esempio, per ogni replica biologico, 10-12 tubetti con tappo microdissected in lisato 10 µ l sono stati generati e tutti i lisati sono stati trasferiti in un unico tubo per ogni replica biologico (100-120 µ l lisato). - Aggiungere un volume di etanolo al 70% preparata al momento (fatta con acqua RNAsi-libera) per ogni soluzione lisato. Poi, purificare il RNA totale seguendo le linee guida utente di RNA isolamento kit. Garantire la rimozione del DNA genomico da ogni campione di RNA.
Nota: Il DNA di Genomic può interferire con analisi di RNA a valle. - Misurare la qualità del RNA isolato dalla TM pool insieme di campioni da ogni mouse e analizzando l'integrità di RNA ribosomiale (Figura 6A).
Nota: A causa delle piccole dimensioni del TM, picchi di RNA ribosomiale (rRNA) potrebbero non essere osservabile (Figura 6B) sul profilo di qualità del RNA (due picchi osservati tra 1.000-4.000 bp in Figura 6A, C) che viene utilizzato per calcolare il numero di integrità di RNA (RIN) 47.- Ottenere una misura più accurata dell'integrità di RNA isolando RNA dal tessuto rimanente più abbondante nella diapositiva di membrana. Per ottenere un rappresentante RIN, RNA isolato dal tessuto oculare-sulla diapositiva della membrana di pipettaggio 10 Lisi µ l tampone sulla sezione di un tessuto ed eseguire isolamento del RNA. Analizzare la qualità di RNA e calcolare RIN (Figura 6).
- Per applicazioni a valle di RNA, utilizzare un kit di RNA basso input per la generazione della libreria cDNA e sequenziamento di cedere riproducibile risultati da appena 80 sezioni di LCM isolato TM.
8. analisi
- Per verificare che il tessuto raccolto è infatti arricchito in geni associati TM, raccogliere più ulteriore RNA da occhio intero microdissected, sclera, iride, retina, cornea e lente da 3 topi separati. Uso da che questo RNA in combinazione con LCM raccolti RNA isolato TM e corpo ciliare raccolti da 4 topi separati.
- Converti che il RNA dai campioni microdissected era di cDNA usando un kit di trascrizione inversa di cDNA. Amplificare il RNA dai campioni di LCM isolato e convertire in cDNA usando un basso input RNA al kit di cDNA.
- Tutto il RNA per trabecolato che esprimono i geni, myocilin (MYOC) e alfa-actina-2 (ACTA2), di analizzare e normalizzare utilizzando il gene housekeeping HSP90a1 mediante PCR digitale (figura 7A-B).
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Representative Results
LCM raccolti RNA dalla TM e corpo ciliare da 4 diversi topi è stato isolato al fine di essere in grado di analizzare l'espressione genica e confrontare l'espressione con cui in occhio intero, sclera, iride, retina, cornea e lente isolati da tre topi separati. TM che esprimono i geni, MYOC48 e ACTA249 sono stati analizzati in tutti i tessuti raccolti per confermare che i campioni di TM isolati infatti altamente sono stati arricchiti in TM. Dovuto la quantità estremamente bassa di cDNA da campioni di LCM digitale PCR è stato usato, che ha dimostrato di essere più riproducibile con meno materiale50. L'espressione di MYOC e ACTA2 era normalizzata utilizzando il gene housekeeping HSP90a1 , quindi ogni tessuto è stato confrontato a quello dell'intero occhio. Questi risultati indicano che MYOC (figura 7A) e ACTA2 (figura 7B) sono altamente espressi nei campioni TM, confermando il successo isolamento di RNA di alta qualità dai campioni altamente arricchiti TM per il RNA a valle analisi. Come prova di concetto, questa tecnica è stata applicata al RNA isolato TM preparati da topi WT e da un ceppo di topi con un fenotipo IOP elevato ed analizzati mediante microarray. Questa analisi ha identificato molti geni implicati nel glaucoma differenzialmente espressi tra i topi TM di WT e quelli dei topi con il fenotipo di glaucoma (Figura 7).
Figura 1: posizionamento del tessuto congelato bloccare nel criostato. (A) mezzo di montaggio O.C.T viene applicato il blocco di montaggio del criostato. (B) blocco campione congelato è uniformemente sul mandrino di montaggio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: procedura di tessuto dell'occhio congelato nel criostato di sezionamento. (A) preparazione della superficie di taglio per raggiungere il tessuto dell'occhio. (B) o.c.t. taglio del blocco congelato prima di raccogliere le sezioni per il laser microdissection. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: preparazione di sezioni congelate nel criostato. (A) 6 seriale 8 µm spessore sezioni sono allineate in del criostato. (B) sezioni contemporaneamente sono montate sulla diapositiva membrana PET. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Screenshot del software di microdissezione laser evidenziando le caratteristiche importanti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: posizione del trabecolato e le impostazioni dei parametri laser UV per adeguato isolamento del trabecolato. (A) ingrandimento basso (4 X) di una singola sezione sulla membrana PET evidenziando il trabecolato per microdissezione laser. (B) alto (40 X) ingrandimento del trabecolato e tessuti adiacenti. (C) primo cerchio parziale taglia del TM vicino alla regione scleral con il tappo in posizione sollevata. (D) finale tagli nello spazio libero che completano il cerchio intorno al TM con il tappo in posizione abbassata. (E) TM rimosso dalla sezione e (F) attaccato al tappo. (G) più tagliati sezioni tagliate dalla stessa membrana PET non sovrapposti aderiti al cap. S (Sclera), SC (canale di Schlemm), TM (trabecolato), AC (camera anteriore). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: stima di resa e qualità di RNA totale ottenuto dal tessuto microdissected trabecolato. (A) RNA totale da 80 sezioni del trabecolato (dimensioni dell'area approssimata era 0,8 mm2). (B) RNA totale da 20 sezioni del trabecolato (dimensioni dell'area approssimata era 0,2 mm2). (C) RNA totale da tessuto occhio restante dopo microdissezione laser. RIN, RNA integrità numero; BP, coppie di basi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: analisi di RNA a valle di LCM isolato trabecolato. Analisi quantitativa di PCR digitale di geni associati TM nella TM isolato di LCM. I geni TM-collegato (A) MYOC (B) ACTA2 altamente espresso in LCM catturato campioni TM rispetto ad altri tessuti dell'occhio. (C) Heatmap generati dai dati ottenuti dall'analisi di microarray del trabecolato RNA isolati da topi WT e KO topi con un fenotipo IOP elevato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8: confronto della preparazione del tessuto prima e dopo l'ottimizzazione. Sezioni di occhio tagliato e inserito il PET diapositive di membrana sia con (A) la preparazione di disidratazione di etanolo al 95% standard (B) o la preparazione di disidratazione di etanolo di 75% ottimizzato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il TM svolge un ruolo vitale nel mantenere attivamente omeostatico IOP e sua disfunzione è ampiamente accettata come il principale fattore causativo per ipertesi glaucoma1,2,19. Un numero di polimorfismi a singolo nucleotide in diversi geni identificati dall'analisi di GWAS è stato collegato al rischio del glaucoma aumentato e la resistenza aumentata alla funzione di uscita AH presso il TM; Tuttavia, i meccanismi molecolari precisi che danno origine a questa malattia non sono ancora pienamente compreso21,22,23,24,25. Modelli genetici murini possono fornire un potente strumento per studiare i meccanismi molecolari del glaucoma. Tuttavia, le piccole dimensioni del mouse tessuto TM rappresentano una sfida formidabile per l'isolamento di TM altamente arricchito da mouse occhi e RNA di alta qualità per analisi di espressione genica. LCM è una tecnica importante per isolare un singolo o basso numero di cellule e può essere utilizzato per studiare l'espressione genica in campioni di tessuto arricchito per tipi cellulari specifici. In questo studio, un metodo affidabile e riproducibile di LCM è descritto per isolare TM altamente arricchito e RNA di alta qualità che può essere utilizzato per studiare la regolazione dell'espressione genica e segnalazione delle cellule in TM. Inoltre, il metodo descritto di LCM può applicarsi anche ad altri tessuti all'interno dell'occhio.
Tecnologia di LCM e un'alta attenzione al dettaglio per l'ottimizzazione della movimentazione del tessuto ha giocato un ruolo vitale nello sviluppo positivo di questo metodo. La metodologia di conservazione dei tessuti e l'isolamento è un componente chiave nell'isolamento del RNA di alta qualità per analisi di espressione genica. LCM richiede un'attenzione molto alta al dettaglio nella dissezione, cryosectioning, fissazione, colorazione, disidratazione e la durata di tempo di microdissezione laser per avere successo nell'ottenere qualità RNA51. Spessore di sezione del tessuto può essere aumentato; Tuttavia, come lo spessore aumenta così funziona il UV laser potenza necessaria. Aumentato laser potenza risultati in un più ampio percorso di laser che possono causare la degradazione del RNA. È stato trovato che il percorso del laser con 8 µm sezioni era sottile e fornito abbastanza tessuto per analisi di RNA a valle. Figura 8 spettacoli come ottimizzazione della preparazione del tessuto possa alterare drasticamente la capacità di laser sezionare il TM dall'occhio. L'ottimizzazione di questo passaggio nel protocollo (come descritto nella sezione 4) ha reso superiore oculare-tessuto immobilizzazione e la rimozione completa di t.o.c. (Figura 8B) utilizzando semplicemente 75% invece di etanolo al 95% (Figura 8A) per disidratare il tessuto seguita da incubazione in acqua RNAsi-libera per rimuovere i supporti di montaggio. Ulteriore disidratazione e colorazione si ottiene utilizzando reagenti di colorazione base alcolica. Inoltre, è stato trovato quella base alcolica superiore colorazione reagenti ha prodotti risultati relativi reagenti di colorazione acquosi (viola di cresyl basati su acqua o ematossilina) e ulteriormente aiuta a preservare l'integrità di RNA52. Nel complesso, l'elaborazione di tessuti oculari utilizzando il protocollo ottimizzato con base alcolica colorazione reagenti hanno reso coerente oculare-sezioni di tessuto che sono stati completamente immobilizzate sulla diapositiva membrana PET.
Il nostro obiettivo per questo studio è stato quello di sviluppare un metodo robusto e affidabile per l'isolamento di alta qualità mRNA dalla TM degli occhi del mouse per l'analisi di espressione a valle al fine di ottenere le comprensioni nei meccanismi molecolari che sottendono lo IOP elevato ed il glaucoma. Come mostrato nell'heatmap in Figura 7, il protocollo descritto di isolamento TM di LCM fornisce un metodo molto affidabile per isolare RNA da TM e studiare le differenze nell'espressione genica in TM da wild type e topi mutanti. Il metodo descritto nel presente documento permetterà ai ricercatori di effettuare analisi molecolare su un tessuto centrale alla patogenesi del glaucoma in un sistema in vivo che è relativamente facile e affidabile e può essere applicato all'analisi dell'espressione genica.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACTA2 ddPCR Primers (dMmuCPE5117282) | BioRad | 10031252 | FAM |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2946-90004 | |
| Agilent RNA 6000 Pico kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| BioRad QX200 Droplet Digital PCR System | BioRad | ||
| Small Paint Brush | |||
| Charged Glass Microscope Slide | Thermo scientific | 4951PLUS-001 | |
| Cresyl Violet Acetate | Sigma Aldrich | C5042 | |
| Curved Scissors | |||
| Eosin Y dye | Thermo scientific | 71204 | |
| Ethanol | |||
| Forceps | Curved and Serrated tip (preferred tip size: 0.5 x 0.4 mm) | ||
| HemaCen | American MasterTech | STHEM30 | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368814 | |
| Hsp90a ddPCR Primers(dMmuCPE5097465) | BioRad | 10031255 | VEX |
| Leica CM1850 Cryostat | Leica | ||
| Millex-GS filter unit | EMD Millipore | SLGS033SB | 0.22 µm |
| MMI CellCut UV Cutting Model | Molecular Machines & Industries | LCM intrument | |
| MMI CellTools Software | Molecular Machines & Industries | 50202 | LCM software |
| Sample Tube for Laser Capture Microdisssection | ASEE Products | ST-LMD-M-500 | Isolation Cap Tube/Manufactured by Microdissect GmBH in Germany and distrubted by ASEE Products |
| Sample Tube for Laser Capture Microdisssection (Alternative) | Molecular Machines & Industries | ||
| modified Harris Hematoxylin | Thermo scientific | 7211 | FAM |
| MYOC ddPCR Primers (dMmuCPE5095712) | BioRad | 10031252 | |
| PBS | |||
| Memebrane Slides, RNase Free | ASEE Products | FS-LMD-M-50r | Polyethylene terephthalate (PET) membrane/Manufactured by Microdissect GmBH in Germany and distrubted by ASEE Products |
| Memebrane Slides, RNase Free (Alternative) | Molecular Machines & Industries | 50102 | |
| Rapid Fix | Thermo scientific | 6764212 | H&E staining |
| RLT Buffer | Qiagen | 79216 | lysis bufffer used for LCM samples |
| RNAseZap | Sigma | R2020 | RNase decontamination solution |
| Protect RNA RNAse Inhibitor | Sigma Aldrich | R7397 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | RNA isolation kit |
| SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit | Takara Clontech | 634888 | low input RNA to cDNA kit for LCM samples |
| SuperMix (no dUTP) | BioRad | 1863023 | digital PCR master mix |
| Tissue-Tek Cryomold (25mm x 20mm x5mm) | Sakura | 4557 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura | 4583 | |
| Stratalinker UV Crosslinker | Stratagene | 400075 | |
| Xylene | Macron | 8668 |
References
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