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Biology

लेजर पर कब्जा Microdissection जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए माउस आंखों से अत्यधिक शुद्ध Trabecular Meshwork

Published: June 3, 2018 doi: 10.3791/57576
Automatic Translation
*1, *2, *1, 2, 2, 2,3, 2,4, 1
1Immunity, Inflammation, and Disease Laboratory, Division of Intramural Research, National Institute of Environmental Health Sciences, NIH, 2Cellular and Molecular Pathology Branch, Division of the National Toxicology Program, National Institute of Environmental Health Sciences, NIH, 3Integrated Laboratory Systems Inc., 4Experimental Pathology Laboratories Inc.
* These authors contributed equally

Summary

यहाँ, हम बहाव आरएनए विश्लेषण के लिए trabecular meshwork (TM) को अलग करने के लिए एक reproducible लेजर कैप्चर microdissection (LCM) के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन. tm में जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन का विश्लेषण करने की क्षमता tm के अंतर्निहित आणविक तंत्र को समझने में मदद मिलेगी नेत्र रोगों से संबंधित ।

Abstract

लेजर कैप्चर microdissection (LCM) एकल कोशिकाओं के जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण की अनुमति दी है और ऊतक वर्गों में समृद्ध कोशिका आबादी । LCM आणविक तंत्र के अध्ययन के लिए एक महान उपकरण कोशिका विभेद अंतर्निहित और विकास और मोतियाबिंद सहित विभिन्न रोगों की प्रगति है । मोतियाबिंद, जो प्रगतिशील ऑप्टिक न्यूरोपैथी के एक परिवार शामिल है, दुनिया भर में अपरिवर्तनीय अंधापन का सबसे आम कारण है । संरचनात्मक परिवर्तन और trabecular meshwork (TM) के भीतर नुकसान intraocular दबाव (IOP) है, जो मोतियाबिंद के विकास के लिए एक प्रमुख जोखिम कारक है में परिणाम कर सकते हैं । हालांकि, सटीक आणविक तंत्र शामिल अभी भी खराब समझ रहे हैं । जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण करने की क्षमता इन कोशिकाओं के समारोह और IOP और मोतियाबिंद के विकास के विनियमन में अपनी भूमिका में आगे अंतर्दृष्टि प्राप्त करने में महत्वपूर्ण होगा । इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए, माउस की आंखों के जमे हुए वर्गों से अत्यधिक समृद्ध TM अलग करने के लिए एक reproducible विधि और बहाव जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए एक विधि, जैसे आरटी-qPCR और आरएनए-Seq की जरूरत है । यहां वर्णित विधि बहाव डिजिटल पीसीआर और microarray विश्लेषण के लिए माउस आंखों से अत्यधिक शुद्ध TM को अलग करने के लिए विकसित की है । इसके अलावा, इस तकनीक को आसानी से अंय अत्यधिक समृद्ध नेत्र कोशिकाओं और सेल डिब्बों है कि मुश्किल से माउस आंखों से अलग किया गया है अलगाव के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । LCM और आरएनए विश्लेषण का संयोजन सेलुलर घटनाओं अंतर्निहित मोतियाबिंद की एक अधिक व्यापक समझ के लिए योगदान कर सकते हैं ।

Introduction

मोतियाबिंद ऑप्टिक न्यूरोपैथी और रेटिनोपैथी द्वारा विशेषता रोगों का एक समूह है कि अंततः अपरिवर्तनीय दृष्टिहीनता1,2की ओर जाता है । यह अनुमान है कि २०२० से अधिक ७०,०००,००० लोगों को दुनिया भर में रोग के कुछ फार्म के साथ रह जाएगा3,4,5,6,7। प्राथमिक खुला कोण मोतियाबिंद (POAG), मोतियाबिंद के सबसे प्रचलित प्रकार, जलीय हास्य में कमी (आह) बहिर्वाह intraocular दबाव (IOP)8,9,10के लिए अग्रणी की विशेषता है, 11,12,13,143,15,16,17,18. अनुपचारित छोड़ दिया, जीर्ण ऊंचा IOP रेटिना और ऑप्टिक तंत्रिका सिर को प्रगतिशील और अपरिवर्तनीय नुकसान की ओर जाता है रेडियल अंधापन1,2,19कारण । IOP को कम करने पर मोतियाबिंद ध्यान की प्रगति को धीमा करने के लिए सभी मौजूदा तरीके, या तो सिलिअरी शरीर द्वारा आह के उत्पादन की दर कम करने या यह बहिर्वाह1,8,9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14. trabecular meshwork (TM) सक्रिय रूप से प्राथमिक आह बहिर्वाह मार्ग और उसके अनुचित कार्य को विनियमित करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है ग्रस्त मोतियाबिंद1,2,19के लिए एक प्रेरणा का कारक है । हालांकि, आण्विक TM रोग के साथ जुड़े तंत्र और यह कैसे नियंत्रित आह जल निकासी अभी तक पूरी तरह से समझ में नहीं आ रहे है और वर्तमान में मोतियाबिंद अनुसंधान1,2,19के एक प्रमुख ध्यान केंद्रित है, 20. जबकि कई जीनोम-वाइड एसोसिएशन के अध्ययन (GWAS) मोतियाबिंद के लिए जीन की एक संख्या से जुड़े हुए है और टीएम में वृद्धि प्रतिरोध आह बहिर्वाह सुविधा के लिए, सटीक आणविक तंत्र है कि रोग के लिए नेतृत्व अभी तक पूरी तरह से समझ में नहीं आ रहे है21 , 22 , 23 , 24 , 25.

पशु मॉडल बहुत मोतियाबिंद में रोग प्रगति के हमारे वर्तमान ज्ञान को बढ़ाया है (बड़े पैमाने पर की समीक्षा की3,15,16,26,27,28, 29,30,31,३२,३३) । कई अग्रणी तरीकों TM३४,३५,३६ का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है और इन तरीकों को व्यापक रूप से सामांय और रोगग्रस्त ऊतक के बारे में हमारी वर्तमान समझ अग्रिम किया गया है । एक क्षेत्र है कि बड़े पैमाने पर पता लगाया नहीं किया गया है आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस मॉडल के उपयोग के लिए TM विफलता के आणविक तंत्र का अध्ययन है । ट्रांसजेनिक नॉक-इन और नॉक-आउट माउस स्टडीज ऑफ टीएम एसोसिएटेड जीन, जैसे Myocilin (Myoc)३७,३८ और Cyp1b1३९, के आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए प्राथमिक औजार रहे हैं TM समारोह. जाहिर है, चूहों में TM के छोटे आकार के एक गंभीर बाधा है कि आदेश में इस ऊतक का अध्ययन शुरू करने के लिए दूर किया जाना चाहिए का प्रतिनिधित्व करता है । माउस मॉडल आनुवंशिकी और रोग के आण्विक तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण का प्रतिनिधित्व करते हैं, जबकि LCM प्रौद्योगिकियों में अग्रिम आवश्यक उपकरण प्रदान करने के लिए सबसे छोटी और सबसे नाजुक ऊतकों के अध्ययन, TM सहित सशक्त ।

इस रिपोर्ट में, एक मजबूत और reproducible विधि अत्यधिक समृद्ध TM के LCM के लिए माउस आंखों से बाद में आरएनए अलगाव के साथ वर्णित है, और बहाव अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए प्रवर्धन । इसी तरह की विधियों का इस्तेमाल किया गया है चूहों में सफलतापूर्वक नेत्र ऊतकों के अन्य प्रकार को अलग करने के लिए४०,४१,४२,४३,४४, कार्यप्रणाली की रिपोर्ट के साथ साथ अन्य करने के लिए लागू किया जा सकता आंख के असतत ऊतकों आरएनए, microRNA, डीएनए, और प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए । महत्वपूर्ण बात, इस तकनीक आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों के उपयोग को बेहतर ढंग से मोतियाबिंद और नेत्र रोग में TM हानि की आणविक रोगजनन समझने के लिए सक्षम बनाता है3,15,16,17 ,18,26,31,४५,४६. LCM द्वारा माउस आंखों के TM अलग करने की क्षमता कई नेत्र रोगों के आणविक तंत्र में आगे अंतर्दृष्टि प्राप्त करने में एक उपयोगी तकनीक होगी ।

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Protocol

राष्ट्रीय पर्यावरण स्वास्थ्य विज्ञान संस्थान (NIEHS) पशु देखभाल और उपयोग समिति (ACUC) ने NIEHS पशु अध्ययन प्रस्ताव के तहत इस अध्ययन की सभी कार्यप्रणाली को मंजूरी दी IIDL 05-46.

1. लेजर Microdissection के लिए इष्टतम ऊतक संग्रह

  1. 2 से 3 महीने के पुराने चूहों को प्राप्त करें, पुरुष या महिला C57BL/ 1 मिनट या जब तक श्वसन रह गया है की एक ंयूनतम के लिए2 सह के साथ Euthanize । पिंजरे से पशु निकालें और या तो ग्रीवा अव्यवस्था, decapitation, या thoracotomy द्वारा मौत आश्वासन देता हूं ।
  2. विच्छेदन से पहले, सुनिश्चित करें कि सभी विच्छेदन उपकरण स्वच्छ और निष्फल हैं ।
    नोट: आंखों के हटाने के लिए घुमावदार कैंची और दांतेदार टिप के साथ संदंश (पसंदीदा टिप आकार: ०.५ x ०.४ mm) की जरूरत होगी ।
  3. अपनी तरफ एक सपाट सतह पर माउस को नीचे रखना ताकि आंख आसानी से सुलभ हो । canthus पर समझ (आंख के कोने) संदंश के साथ माउस को स्थिर करने के लिए, तो घुमावदार कैंची का उपयोग, वक्र आंख से दूर का सामना करना पड़, आंखों के आसपास काट एक गाइड के रूप में आंख गर्तिका का उपयोग कर जब तक गोलक आसानी से गर्तिका से लिया जा सकता है (वक्र का उपयोग नहीं कैंची के नुस्खे) ।
  4. धीरे खींचो और, घुमावदार कैंची का उपयोग कर, ऑप्टिक तंत्रिका, जो कक्षीय गर्तिका से आंख विज्ञप्ति में कटौती । ध्यान से आंख से गैर नेत्र ऊतक निकालें और 1x फास्फेट में कुल्ला खारा (पंजाब) । दोहराने १.३-contralateral आंख के लिए १.४ ।
  5. एक ऊतक पोंछ के साथ आंख दाग embedding से पहले किसी भी नमी को दूर करने के लिए । नमूना मोल्ड में आंख प्लेस (25 x 20 x 5 मिमी3) इतना है कि लेंस और ऑप्टिक तंत्रिका बेंच शीर्ष के समानांतर क्रम में sagittal वर्गों को प्राप्त करने के लिए कर रहे हैं । इष्टतम काटने तापमान (O.C.T.) यौगिक और फ्रीज करने के लिए सूखी बर्फ पर जगह में आंखें एंबेड । एक बार जमे हुए,-८० डिग्री सेल्सियस पर ब्लॉकों की दुकान ।

2. लेजर Microdissection के लिए जमे हुए अनुभाग तैयारी

  1. इससे पहले उपयोग की मशीन पॉलीथीन terephthalate (पीईटी) यूवी पार-४५ मिनट के लिए अधिकतम शक्ति में लिंकर में झिल्ली स्लाइड ।
  2. ब्रश पर स्प्रे RNase दूषण समाधान, संदंश, युग्मन जार, और बढ़ते चक । अच्छी तरह पोंछ लें । nuclease के साथ कुल्ला-मुक्त पानी और सूखी । क्रॉस-प्रदूषित होने से बचने के लिए १००% इथेनॉल के साथ cryostat को पोंछें ।
  3. -18 डिग्री सेल्सियस cryostat समायोजित करें । एक समय में-८० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से एक जमे हुए ब्लॉक निकालें और सूखी बर्फ के साथ cryostat करने के लिए उद्धार । जमे हुए ब्लॉक की अनुमति दें 10 मिनट की एक ंयूनतम के लिए cryostat के तापमान के साथ equilibrate ।
  4. बढ़ते खंड (चित्र 1a) पर O.C.T. की एक छोटी राशि निचोड़ और मोल्ड से ऊतक ब्लॉक हटाने और ध्यान से बढ़ते चक (चित्र 1b) पर ब्लॉक जगह है । एक बार बढ़ते चक पर ऊतक ब्लॉक ठोस जमे हुए है, cryostat (चित्रा 2a) के नमूना धारक पर डालें ।
  5. ऊतक नमूने तक पहुंचने के लिए O.C.T. ब्लॉक के माध्यम से 8 µm वर्गों और ध्यान से अनुभाग में कटौती करने के लिए cryostat समायोजित करें । एक बार ऊतक मनाया, अनुभाग रोक, सभी पक्षों पर जमे हुए ब्लॉक ट्रिम कर दीजिए एक साफ उस्तरा ब्लेड का उपयोग कर और ऊतक आसपास के O.C.T. के 3-4 mm छोड़ने के लिए पेंट ब्रश(चित्रा बी) के साथ हैंडलिंग सक्षम करने के लिए) । नमूना पार-संदूषण से बचने के लिए प्रत्येक नमूना परिवर्तन के बीच रोल प्लेट के बजाय एक नया साफ पेंट ब्रश का उपयोग करें ।
  6. जल्दी से काम कर आंख के माध्यम से अनुभाग । एक त्वरित एक कदम hematoxylin और eosin के साथ स्लाइड बाढ़ से हर तीसरे खंड दाग (एच एंड ई) ६० एस के लिए दाग, नल का पानी, हवा सूखी, समाशोधन एजेंट में स्पष्ट और एक coverslip के साथ एक आरोप लगाया गिलास स्लाइड पर माउंट के साथ कुल्ला । खुर्दबीन के नीचे देखें और TM कट वर्गों में स्पष्ट है जब तक अनुभाग जारी ।
  7. एक बार TM प्रकट करने के लिए शुरू होता है, 2 वर्गों में कटौती और नित्य एच एंड ई के लिए एक चार्ज गिलास स्लाइड पर माउंट LCM के साथ काटने के लिए एक नक्शा फार्म ।
    नोट: मानचित्र और दाग विवरण के लिए अनुभाग 3 देखें ।
  8. पहले एच एंड ई नक्शा स्लाइड के बाद, कट और लाइन अप 6 सीरियल 8-µm मोटी वर्गों में cryostat और साथ ही पीईटी झिल्ली स्लाइड पर माउंट (चित्र 3ए, बी). संक्षेप में झिल्ली की पीठ के साथ दस्ताने अंगूठे फिसलने से ऊतक का पालन । बढ़ते के बाद, सूखी बर्फ पर एक स्लाइड बॉक्स में पालतू झिल्ली स्लाइड तुरंत जगह है ।
    नोट: कम वर्गों माउंट किया जा सकता है, हालांकि, एक बार में स्लाइड पर कई वर्गों बढ़ते प्रत्येक अनुभाग कमरे के तापमान हवा के संपर्क में है समय की मात्रा को सीमित करके आरएनए गिरावट को कम करने के लिए सिफारिश की है.
  9. अनुभाग के लिए आंख जारी रखें, प्रत्येक दो पीईटी झिल्ली के साथ स्लाइड के बाद प्रत्येक 6 वर्गों, एक आरोपित गिलास स्लाइड पर दो वर्गों को इकट्ठा करने के लिए एक और नक्शा स्लाइड बनाने के लिए एच & ई धुंधला । अनुभाग जारी, लगभग १०० सीरियल 8-µm मोटी वर्गों, जब तक TM अब दिखाई नहीं देता है । एक चार्ज किया गिलास स्लाइड पर जल्दी से एक अनुभाग धुंधला द्वारा की पुष्टि करें (२.६ देखें) ।
  10. बाद में LCM उपयोग के लिए-८० ° c पर सभी पीईटी झिल्ली स्लाइड की दुकान ।

3. एच एंड ई नक्शा स्लाइड धुंधला प्रोटोकॉल और रूपात्मक समीक्षा

  1. चार्ज किए गए ग्लास स्लाइड पर मानचित्र स्लाइड की कल्पना और समीक्षा करने के लिए, 7 एस के लिए तेजी से फिक्सिंग समाधान की १०० मिलीलीटर से भरे एक दाग जार में तुरंत स्थानांतरित करके ऊतक को ठीक करें । स्लाइड को आसुत जल में डूबाकर कुल्ला करें 10-20 बार , तो साफ आसुत जल के साथ एक युग्मन जार करने के लिए स्लाइड हस्तांतरण ।
  2. पानी और दाग से स्लाइड निकालें सूखी किनारों ऊतक पोंछे के साथ । पिपेट २०० µ एल संशोधित फ़िल्टर हैरिस प्रत्येक खंड पर Hematoxylin और कमरे के तापमान पर 30 एस के लिए मशीन । ध्यान से नल पानी चल रहा है जब तक पानी साफ चलता है के तहत स्लाइड कुल्ला । दाग एक ऊतक के साथ स्लाइड के अंत प्रत्येक चरण के बीच पोंछें (३.२ से प्रत्येक चरण के बीच दाग-३.५) अतिरिक्त तरल को दूर करने के लिए ।
  3. 30 एस के लिए कमरे के तापमान पर 1x पंजाब में स्लाइड प्लेस । फिर, ध्यान से 30 एस के लिए नल का पानी रनिंग के तहत स्लाइड कुल्ला ।
  4. डुबकी ९५% इथेनॉल स्नान में 3-4 बार स्लाइड । स्लाइड पर ऊतक कवर और कमरे के तापमान पर 15 एस के लिए गर्मी के लिए पर्याप्त Eosin Y डाई समाधान लागू करें ।
  5. ९५% इथेनॉल स्नान 10-20 त्वरित डुबकी प्रत्येक के साथ दो बार में स्लाइड कुल्ला । १००% इथेनॉल स्नान 10-20 त्वरित डुबकी प्रत्येक के साथ दो बार में स्लाइड कुल्ला । फिर, xylene स्नान में दो बार कुल्ला स्लाइड (10-20 त्वरित डुबकी प्रत्येक) ।
  6. ऊतक को राल बढ़ते माध्यम लागू करने से माउंट, coverslip सावधानी से जोड़ने के लिए हवा के बुलबुले से बचने और इसे रात भर डाकू में सूखी ।
  7. विज़ुअल रूप से या किसी डिजिटल स्लाइड स्कैनर के उपयोग से स्लाइड् स की समीक्षा करें । स्पष्ट रूप से दिखाई और काटने के लिए सुलभ TM के साथ नक्शा स्लाइड की पहचान । LCM के लिए इन मानचित्र स्लाइड के बीच पीईटी झिल्ली स्लाइड का उपयोग करें ।

4. पॉलीथीन Terephthalate (पीईटी) झिल्ली स्लाइड प्रसंस्करण और दाग प्रोटोकॉल

  1. पहले फ्रीजर से पीईटी स्लाइड को हटाने के पहले cresyl वायलेट शेयर समाधान ०.३ जी cresyl वायलेट एसीटेट को भंग करके तैयार ७५% इथेनॉल और जगह के लिए शेखर पर 2 ज. फ़िल्टर के साथ समाधान ०.२२ µm बाँझ फ़िल्टर इकाई और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर के लिए नहीं रह से 6 सोम Ths.
  2. एक 1:4 अनुपात में ताजा ७५% इथेनॉल के साथ eosin Y शराबी समाधान तैयार करें । तैयार निर्धारण (७५% इथेनॉल) और निर्जलीकरण समाधान (७५%, ९५%, और १००% इथेनॉल) स्वच्छ, nuclease मुक्त, बर्फ पर ५० मिलीलीटर शंकु के ट्यूब में । प्रत्येक समाधान के लिए RNase अवरोधक जोड़ें ।
  3. से जमे हुए ऊतक वर्गों युक्त स्लाइड बॉक्स निकालें-८० ° c फ्रीजर और सूखी बर्फ पर जगह है । समय पर एक स्लाइड की प्रक्रिया । स्लाइड को तुरंत ठंडे में रख कर स्लाइड फिक्स करें ७५% इथेनॉल के लिए 30 एस ।
  4. धीरे nuclease में स्लाइड डुबकी 10-15 एस के लिए नि: शुल्क पानी के लिए ऊतक वर्गों के साथ हस्तक्षेप के बिना O.C.T. भंग ।
  5. ध्यान से पिपेट ३०० µ एल के १.५% cresyl वायलेट एसीटेट समाधान वर्गों पर सीधे और कमरे के तापमान पर ४५ एस के लिए मशीन । फिर, यह 30 एस के लिए ७५% इथेनॉल स्नान में रखकर एक बार धो पिपेट २०० µ एल eosin Y समाधान वर्गों और 3-5 एस के लिए मशीन पर ।
  6. बाद में स्लाइड रखकर निर्जलीकरण ऊतक ७५% इथेनॉल, ९५% इथेनॉल, और अंत में, १००% इथेनॉल स्नान के लिए 30 एस प्रत्येक । हर कदम के बीच एक ऊतक पोंछने के साथ स्लाइड के अंत दाग अतिरिक्त तरल हटाने के लिए । स्लाइड हवा पूरी तरह से 5 मिनट के लिए हुड के नीचे सूखी चलो । एक बार सूखा, तुरंत बाद LCM प्रदर्शन करते हैं ।
    नोट: यह इस कदम के लिए xylene के उपयोग से बचने के लिए सिफारिश की है, यह ऊतक वर्गों को अपर्याप्त रूप से झिल्ली स्लाइड करने के लिए बांड पैदा कर सकता है और ऊतक पर कब्जा करने की क्षमता कम कर देता है ।

5. यूवी लेजर के साथ लेजर Microdissection

  1. कंप्यूटर को चालू करें और बूट करने की अनुमति दें । माइक्रोस्कोप सफेद प्रकाश बिजली की आपूर्ति पर बारी । यूवी लेजर कुंजी को चालू करें और एक पीले एलईडी रोशन करेंगे । LCM सॉफ्टवेयर शुरू, यह पूरी तरह से लोड करने के लिए अनुमति देते हैं और एक लाइव वीडियो प्रदर्शित करेगा. नियंत्रक बॉक्स पर लेजर बटन दबाएँ और एक हरे रंग की एलईडी रोशन करेंगे ।
  2. माइक्रोस्कोप मंच पर एक नया गिलास स्लाइड लोड, तो कांच स्लाइड के शीर्ष पर सीधे नीचे का सामना करना पड़ के साथ दाग ऊतक पक्ष के साथ पीईटी झिल्ली स्लाइड जगह है । सुनिश्चित करें कि झिल्ली और काँच की स्लाइड को माइक्रोस्कोप की अवस्था पर कसकर बाँधा जाता है.
  3. पहले स्लाइड सीमाएं सेट करके LCM प्रारंभ करें । उद्देश्य पैनल में सबसे कम 4x आवर्धन चुनें (चित्रा 4) । फिर ऊपरी बाएँ कोने जहां धातु और झिल्ली से मिलने के लाइव वीडियो फ़ीड में दिखाई दे रहा है, जहां तक कि सूक्ष्मदर्शी xy-चरण ले जाकर झिल्ली स्लाइड के कार्य क्षेत्र को परिभाषित, "सीमा 1" बटन दबाएँ और एक लाल आयत रोडमैप पर दिखाई देगा. इसके बाद, xy-चरण को विपरीत कोने में ले जाएं और "2 सीमा" बटन दबाएं । सेट सीमा के बीच झिल्ली और ऊतकों की एक रूपरेखा छवि बनाने के लिए "स्कैन" बटन दबाएँ.
  4. रोडमैप के भीतर आंख वर्गों में से एक के टीएम के पास डबल क्लिक करें, tm iridocorneal कोण के शीर्ष के पास स्थित हो सकता है (चित्र 5) । tm की पहचान की गई है एक बार, 10x और मैंयुअल रूप से tm पर ध्यान केंद्रित करने के लिए आवर्धन वृद्धि हुई है । 20X और 40X उद्देश्यों के साथ दोहराएं । जब TM 40X उद्देश्य (चित्रा 5B) के साथ ध्यान में है, पास के एक खाली क्षेत्र में नेविगेट (ध्यान थोड़ा समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है), "मुक्तहस्त ड्राइंग उपकरण" का चयन करें और ऊतक के एक रिक्त क्षेत्र पर एक लंबी लाइन आकर्षित ।
  5. लेजर पैरामीटर सेट इतना है कि "कट वेग" ३४% है, "फोकस" ५८% है, और "पावर" ७०% है (चित्रा 4), तो "कट" बटन दबाएँ. एक स्पष्ट और ठीक काटने लाइन मनाया जब तक गति, ध्यान, और बिजली मापदंडों के लिए ठीक लेजर समायोजन करें ( चित्रा 5Cदेखें). सटीक काटने के लिए, काटने कार्रवाई सुनिश्चित करने के लिए तैयार रेखा इस प्रकार है ।
  6. कैप धारक में अलगाव ट्यूब ढक्कन लोड और ट्यूब खुला । कैप-होल्डर को कैप-लिफ्ट में अटैच करें और ट्यूब को उलटा कर लें । विश्वास दिलाता हूं कि चिपकने वाला टोपी सामग्री टोपी की नोक से परे बहर सुनिश्चित करने के लिए कि वांछित ऊतक ठीक से कब्जा कर लिया है ।
  7. सॉफ्टवेयर पैनल में "मैनुअल" विच्छेदन मोड का चयन करें । सावधानीपूर्वक समीक्षा करें कि TM (आरेख 5B) सीधे आइसोलेशन ट्यूब के नीचे है । सफेद संतुलन सेट और इष्टतम छवि गुणवत्ता (चित्रा 4) प्राप्त करने के लिए चमक समायोजित करें ।
  8. काटना शुरू करने के लिए, मैन्युअल रूप से फ़ोकस समायोजित करें और मुक्तहस्त उपकरण का उपयोग करके एक रेखा आरेखित करें, सुनिश्चित करें कि संग्रह कैप अभी तक झिल्ली को छूकर नहीं ऊपर की स्थिति में बनी हुई है. जहां TM श्वेतपटल (चित्रा 5C) मिलता है के पास आंशिक हलकों ड्रा, तो "कट दबाएँ." एक बार पहली कटौती कर रहे हैं, नीचे की स्थिति में टोपी की स्थिति और फिर से ध्यान समायोजित, तो खुले या मुक्त अंतरिक्ष में दो पंक्तियों को आकर्षित करने के लिए दो आंशिक TM चारों ओर सर्कल पूरा हलकों कनेक्ट, तो प्रेस "कट" और अनुभाग से ऊतक इकट्ठा , तो यह सुनिश्चित करें कि TM को microdissection कैप (चित्र 5d-F) द्वारा उठाया गया था ।
  9. ऊपर की स्थिति में टोपी वापस स्थिति और दोहराने (५.२-५.८) शेष वर्गों पर । थोड़ा टोपी की स्थिति को समायोजित करें ताकि सभी अलग नमूनों टोपी पर फिट होगा और ओवरलैप नहीं (चित्र) । एकरूपता के लिए, एक स्लाइड के लिए समय विंडो 20 min. अधिक समय सभी वर्गों से TM अलग करने के लिए आवश्यक है, तो पीईटी स्लाइड प्रति कम वर्गों का उपयोग करें । अगले पालतू झिल्ली के लिए, एक नया अलगाव ट्यूब डालें और 5 अनुभाग दोहराएँ ।

6. Microdissected TM ऊतक के Lysis

  1. ताजा आरएनए lysis बफर LCM अलग ऊतक लाइसे करने के लिए तैयार करते हैं । जोड़ें 10 µ l β-mercaptoethanol प्रत्येक 1 मिलीलीटर lysis बफ़र के लिए । lysis बफ़र β-mercaptoethanol के साथ नहीं अब 1 महीने के लिए कमरे के तापमान पर संग्रहीत है ।
  2. microdissection के शुरू से 20 मिनट के भीतर कैप धारक से अलगाव ट्यूब निकालें । आँख से टोपी सतह कल्पना TM का कब्जा सुनिश्चित करने के लिए ।
  3. ध्यान से पिपेट संग्रह lysis बफर सुनिश्चित करने के ट्यूब के ढक्कन पर 10 µ एल lysis बफर पूरी तरह से microdissected TM शामिल हैं । धीरे बंद चिपकने वाला टोपी और मशीन संग्रह ट्यूब उल्टा 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर नीचे । मशीन के बाद, 2 मिनट के लिए ८०० x g पर केंद्रापसारक और सूखी बर्फ पर जगह lysate । बाद में शुद्धि और विश्लेषण के लिए-८० डिग्री सेल्सियस पर lysates स्टोर ।

7. आरएनए अलगाव और गुणवत्ता का विश्लेषण

  1. कमरे के तापमान पर नमूनों को गल कर आरएनए गुणवत्ता का विश्लेषण करें । एक साथ एक RNase-मुक्त १.५ मिलीलीटर microfuge ट्यूब में एक ही माउस से अलग सभी नमूनों पूल ।
    नोट: उदाहरण के लिए, प्रत्येक जैविक दोहराने के लिए, 10 µ एल lysate में microdissected टोपियां के साथ 10-12 ट्यूबों उत्पंन किया गया और सभी lysates एक जैविक प्रतिकृति (१००-१२० µ एल lysate) के लिए एक ट्यूब में स्थानांतरित किया गया ।
  2. प्रत्येक lysate समाधान के लिए हौसले से तैयार ७०% इथेनॉल (RNase-मुक्त पानी के साथ बनाया) की एक मात्रा जोड़ें । फिर, आरएनए अलगाव किट उपयोगकर्ता दिशानिर्देश के बाद कुल आरएनए शुद्ध । प्रत्येक आरएनए नमूना से जीनोमिक डीएनए को हटाने सुनिश्चित करें ।
    नोट: जीनोमिक डीएनए बहाव आरएनए विश्लेषण के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं ।
  3. प्रत्येक माउस से एक साथ नमूने पूलिंग और राइबोसोमल आरएनए अखंडता (चित्रा 6A) का विश्लेषण करके TM से अलग आरएनए की गुणवत्ता को मापने.
    नोट: TM के छोटे आकार के कारण, राइबोसोमल आरएनए चोटियों (१,०००-४,००० बीपी में चित्रा 6A, सी) जो आरएनए अखंडता संख्या (रिण) की गणना करने के लिए उपयोग किया जाता है के बीच मनाया आरएनए गुणवत्ता प्रोफ़ाइल पर (चित्र घमण्ड) नहीं हो सकता ४७.
    1. झिल्ली स्लाइड पर अधिक प्रचुर मात्रा में शेष ऊतक से आरएनए अलग करके आरएनए अखंडता का एक अधिक सटीक उपाय प्राप्त करें । एक प्रतिनिधि रिण प्राप्त करने के लिए, एक ऊतक अनुभाग पर pipetting 10 µ एल lysis बफर द्वारा झिल्ली स्लाइड पर नेत्र-ऊतक से आरएनए अलग और आरएनए अलगाव प्रदर्शन करते हैं । आरएनए गुणवत्ता का विश्लेषण और रिण की गणना (चित्रा 6C).
  4. बहाव आरएनए अनुप्रयोगों के लिए, अनुक्रमण और सीडीएनए पुस्तकालय पीढ़ी के लिए एक कम इनपुट आरएनए किट का उपयोग करें LCM अलग TM के रूप में छोटे रूप में ८० वर्गों से reproducible परिणाम उपज के लिए ।

8. विश्लेषण

  1. यह पुष्टि करने के लिए कि एकत्र किए गए ऊतक TM-एसोसिएटेड जीन में समृद्ध है, microdissected पूरी आंख, श्वेतपटल, आईरिस, रेटिना, कॉर्निया, और 3 अलग चूहों से लेंस से कई अतिरिक्त आरएनए इकट्ठा । अलग टीएम और सिलिअरी 4 अलग चूहों से एकत्र शरीर से LCM एकत्र आरएनए के साथ संयोजन में इस आरएनए का उपयोग करें ।
  2. microdissected नमूनों से आरएनए परिवर्तित एक सीडीएनए रिवर्स प्रतिलेखन किट का उपयोग सीडीएनए के लिए किया गया था । LCM अलग नमूनों से आरएनए बढ़ाना और सीडीएनए किट के लिए एक कम इनपुट आरएनए का उपयोग कर सीडीएनए में परिवर्तित.
  3. जीन trabecular meshwork के लिए सभी आरएनए का विश्लेषण, myocilin (MYOC) और अल्फा-actin-2 (ACTA2), और डिजिटल पीसीआर (चित्रा HSP90a1-बी) द्वारा 7A गृह व्यवस्था जीन का उपयोग कर सामान्य.

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Representative Results

LCM से टीएम और सिलिअरी शरीर से एकत्र आरएनए 4 अलग चूहों के लिए जीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण और पूरी आंख में उस के साथ अभिव्यक्ति की तुलना करने में सक्षम होने के लिए पृथक किया गया था, श्वेतपटल, आईरिस, रेटिना, कॉर्निया, और तीन अलग चूहों से अलग लेंस. tm जीन एक्सप्रेस, MYOC४८ और ACTA2४९ सभी एकत्र ऊतकों में विश्लेषण किया गया पुष्टि करने के लिए कि अलग tm नमूने वास्तव में उच्च tm में समृद्ध थे । LCM नमूनों डिजिटल पीसीआर से सीडीएनए की बेहद कम मात्रा के कारण इस्तेमाल किया गया था, जो कम सामग्री के साथ अधिक reproducible होना सिद्ध किया गया है५०. MYOC और ACTA2 की अभिव्यक्ति सामान्यीकृत HSP90a1 गृह व्यवस्था जीन का उपयोग कर रहा था, तो प्रत्येक ऊतक पूरी आंख की है कि तुलना में किया गया था । इन परिणामों से पता चलता है कि MYOC (चित्रा 7A) और ACTA2 (चित्रा 7B) अत्यधिक टीएम नमूनों में व्यक्त कर रहे हैं, बहाव आरएनए के लिए अत्यधिक समृद्ध टीएम नमूनों से उच्च गुणवत्ता आरएनए के सफल अलगाव की पुष्टि विश्लेषण. अवधारणा के सबूत के रूप में, इस तकनीक TM-पृथक WT चूहों से तैयार आरएनए और एक ऊंचा IOP phenotype के साथ चूहों के एक तनाव से और microarray द्वारा विश्लेषण करने के लिए लागू किया गया था. इस विश्लेषण के कई मोतियाबिंद है कि अंतर WT चूहों और मोतियाबिंद phenotype के साथ चूहों के उन लोगों के बीच व्यक्त कर रहे है में फंसा जीन की पहचान (चित्रा 7C) ।

Figure 1
चित्रा 1: cryostat में जमे हुए ऊतक ब्लॉक के स्थान । (क) ओ. सी. टी बढ़ते मध्यम cryostat बढ़ते खंड के लिए लागू किया जाता है । (ख) जमे हुए नमूना ब्लॉक समान रूप से बढ़ते चक पर रखा गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: cryostat में जमे हुए नेत्र ऊतक की धारा प्रक्रिया । (क) आँख के ऊतकों तक पहुँचने के लिए सतह काटने की तैयारी. (ख) लेजर microdissection के लिए वर्गों को इकट्ठा करने से पहले जमे हुए ब्लॉक के ट्रिमिंग O.C.T. । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: cryostat में जमे हुए वर्गों की तैयारी । (A) 6 सीरियल 8 µm मोटे सेक्शन cryostat में लाइन कर रहे हैं । (ख) वर्गों एक साथ पीईटी झिल्ली स्लाइड पर बढ़ रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: लेजर microdissection सॉफ्टवेयर के स्क्रीनशॉट महत्वपूर्ण सुविधाओं पर प्रकाश डाला. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: trabecular meshwork के समुचित अलगाव के लिए trabecular meshwork और यूवी लेजर पैरामीटर सेटिंग्स का स्थान । (क) कम (4x) पीईटी झिल्ली पर एक ही खंड के लेजर microdissection के लिए trabecular meshwork पर प्रकाश डाला आवर्धन । (ख) उच्च (40X) trabecular meshwork और आसन्न ऊतकों का आवर्धन । (ग) ऊपर की स्थिति में टोपी के साथ scleral क्षेत्र के पास TM के पहले आंशिक सर्कल कटौती । (घ) मुक्त अंतरिक्ष में अंतिम कटौती है कि नीचे की स्थिति में टोपी के साथ TM चारों ओर सर्कल पूरा करें । (ङ) TM खंड से हटा दिया और (च) टोपी से जुड़े । (छ) एकाधिक कट वर्गों एक ही पालतू झिल्ली से कटौती नहीं अतिव्यापी टोपी का पालन किया । एस (श्वेतपटल), अनुसूचित जाति (Schlemm की नहर), टीएम (Trabecular Meshwork), एसी (पूर्वकाल चैंबर). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: कुल आरएनए उपज और गुणवत्ता microdissected trabecular meshwork ऊतक से प्राप्त आकलन. (क) trabecular meshwork के ८० वर्गों से कुल आरएनए (अनुमानित क्षेत्र आकार 0.8 मिमी2) था. (ख) trabecular meshwork के 20 खंडों में से कुल आरएनए (अनुमानित क्षेत्र आकार 0.2 mm2) था । (ग) लेसर microdissection के बाद शेष नेत्र ऊतक से कुल आरएनए. रिन, आरएनए अखंडता संख्या; बीपी, आधार जोड़े । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्र 7: बहाव आरएनए विश्लेषण LCM पृथक trabecular meshwork. मात्रात्मक डिजिटल पीसीआर tm के विश्लेषण-LCM द्वारा अलग tm में जुड़े जीन । tm-जुड़े जीन (क) MYOC (ख) ACTA2 उच्च LCM में व्यक्त की अंय नेत्र ऊतकों की तुलना में TM नमूनों पर कब्जा कर लिया । (ग) trabecular meshwork आरएनए के microarray विश्लेषण से प्राप्त आंकड़ों से उत्पन्न हीटमैप एक ऊंचा WT IOP के साथ phenotype चूहों और KO चूहों से अलग किया गया. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 8
चित्र 8: अनुकूलन से पहले और बाद में ऊतक तैयार करने की तुलना. नेत्र वर्गों में कटौती और पालतू झिल्ली स्लाइड पर रखा के साथ या तो (एक) मानक ९५% इथेनॉल निर्जलीकरण तैयारी (ख) या अनुकूलित ७५% इथेनॉल निर्जलीकरण तैयारी । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

TM सक्रिय रूप से समस्थिति IOP को बनाए रखने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है और इसकी शिथिलता ग्रस्त मोतियाबिंद1,2,19के लिए मुख्य प्रेरणा का कारक के रूप में स्वीकार कर लिया है । कई GWAS विश्लेषण द्वारा की पहचान की जीन में एकल न्यूक्लियोटाइड बहुरूपताओं की संख्या में वृद्धि हुई मोतियाबिंद के जोखिम और वृद्धि प्रतिरोध करने के लिए जोड़ा गया है आह बहिर्वाह सुविधा TM में; हालांकि, सटीक आणविक तंत्र है कि इस बीमारी को जंम दे अभी तक पूरी तरह से समझ में नहीं है21,22,23,24,25। आनुवंशिक माउस मॉडल मोतियाबिंद के आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान कर सकते हैं । हालांकि, माउस TM ऊतक के छोटे आकार जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए माउस आंखें और उच्च गुणवत्ता आरएनए से अत्यधिक समृद्ध TM के अलगाव के लिए एक दुर्जेय चुनौती का प्रतिनिधित्व करता है । LCM कोशिकाओं की एक एकल या कम संख्या को अलग करने के लिए एक मूल्यवान तकनीक है और विशिष्ट कोशिका प्रकार के लिए समृद्ध ऊतक नमूनों में जीन अभिव्यक्ति का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इस अध्ययन में, एक मजबूत और reproducible LCM विधि उच्च समृद्ध tm और उच्च गुणवत्ता आरएनए कि tm में जीन अभिव्यक्ति और सेल संकेतन के विनियमन का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता को अलग करने के लिए वर्णित है । इसके अलावा, वर्णित LCM विधि भी आंख के भीतर अंय ऊतकों को लागू किया जा सकता है ।

LCM प्रौद्योगिकी और ऊतक हैंडलिंग के अनुकूलन के लिए विस्तार करने के लिए एक उच्च ध्यान इस पद्धति के सफल विकास में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाई । ऊतक संरक्षण और अलगाव की पद्धति जीन अभिव्यक्ति की रूपरेखा के लिए उच्च गुणवत्ता आरएनए अलग करने में एक महत्वपूर्ण घटक है । LCM विच्छेदन, cryosectioning, निर्धारण, धुंधला, निर्जलीकरण, और लेजर microdissection के समय की अवधि में विस्तार करने के लिए एक बहुत ही उच्च ध्यान देने की आवश्यकता है गुणवत्ता आरएनए५१प्राप्त करने में सफल होने के लिए । ऊतक अनुभाग मोटाई बढ़ाया जा सकता है; हालांकि, के रूप में मोटाई बढ़ जाती है तो यूवी लेजर शक्ति की जरूरत है । एक व्यापक लेजर पथ है कि आरएनए क्षरण पैदा कर सकता है में लेजर पावर परिणाम में वृद्धि हुई । यह पाया गया कि 8 µm वर्गों के साथ लेजर पथ पतली और बहाव आरएनए विश्लेषण के लिए पर्याप्त ऊतक प्रदान की गई थी । चित्रा 8 से पता चलता है कैसे ऊतक की तैयारी के अनुकूलन काफी लेजर करने की क्षमता को बदल सकते है आंख से TM काटना । प्रोटोकॉल में इस कदम का अनुकूलन (के रूप में 4 खंड में वर्णित) बेहतर नेत्र-ऊतक स्थिरीकरण और O.C.T. के पूर्ण हटाने (चित्रा 8B) बस ९५% इथेनॉल (चित्रा 8Aके बजाय ७५% का उपयोग करके) को निर्जलीकरण ऊतक RNase में मशीन के बाद मुक्त पानी बढ़ते मीडिया को दूर करने के लिए । इसके अलावा निर्जलीकरण और दाग शराब का उपयोग करके हासिल की है आधारित धुंधला एजेंट । इसके अलावा, यह पाया गया कि शराब आधारित धुंधला एजेंट जलीय धुंधला रिएजेंट (जल आधारित cresyl वायलेट या hematoxylin) के सापेक्ष बेहतर परिणाम मिले और आगे आरएनए अखंडता५२की रक्षा में मदद करता है । कुल मिलाकर, प्रसंस्करण आंख के ऊतकों शराब के साथ अनुकूलित प्रोटोकॉल का उपयोग आधारित धुंधला एजेंट सुसंगत आंख ऊतक वर्गों है कि पूरी तरह से पालतू झिल्ली स्लाइड पर स्थिर थे उपज ।

इस अध्ययन के लिए हमारा लक्ष्य बहाव अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए माउस आंखों के टीएम से उच्च गुणवत्ता mRNA अलग करने के लिए एक मजबूत और विश्वसनीय तरीका विकसित करने के लिए आणविक तंत्र है कि आबाद ऊंचा IOP और मोतियाबिंद में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए किया गया । के रूप में चित्रा 7Cमें हीटमैप में दिखाया गया है, LCM से अलग tm के वर्णित प्रोटोकॉल एक बहुत ही विश्वसनीय विधि को अलग करने के लिए टीएम और जीन अभिव्यक्ति में अध्ययन के मतभेदों से जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती चूहों से tm में मतभेद प्रदान करता है । यहां वर्णित विधि जांचकर्ताओं एक vivo में प्रणाली है कि अपेक्षाकृत आसान और विश्वसनीय है में मोतियाबिंद के रोगजनन के लिए केंद्रीय ऊतक पर आणविक विश्लेषण प्रदर्शन करने की अनुमति देगा और जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण करने के लिए लागू किया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ACTA2 ddPCR Primers (dMmuCPE5117282) BioRad 10031252 FAM
Agilent 2100 Bioanalyzer Agilent Technologies G2946-90004
Agilent RNA 6000 Pico kit Agilent Technologies 5067-1513
BioRad QX200 Droplet Digital PCR System BioRad
Small Paint Brush
Charged Glass Microscope Slide Thermo scientific 4951PLUS-001
Cresyl Violet Acetate Sigma Aldrich C5042
Curved Scissors
Eosin Y dye Thermo scientific 71204
Ethanol
Forceps Curved and Serrated tip (preferred tip size: 0.5 x 0.4 mm)
HemaCen American MasterTech STHEM30
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Applied Biosystems 4368814
Hsp90a ddPCR Primers(dMmuCPE5097465) BioRad 10031255 VEX
Leica CM1850 Cryostat Leica
Millex-GS filter unit EMD Millipore SLGS033SB 0.22 µm
MMI CellCut UV Cutting Model Molecular Machines & Industries LCM intrument
MMI CellTools Software Molecular Machines & Industries 50202 LCM software
Sample Tube for Laser Capture Microdisssection ASEE Products ST-LMD-M-500 Isolation Cap Tube/Manufactured by Microdissect GmBH in Germany and distrubted by ASEE Products
Sample Tube for Laser Capture Microdisssection (Alternative) Molecular Machines & Industries
modified Harris Hematoxylin Thermo scientific 7211 FAM
MYOC ddPCR Primers (dMmuCPE5095712) BioRad 10031252
PBS
Memebrane Slides, RNase Free ASEE Products FS-LMD-M-50r Polyethylene terephthalate (PET) membrane/Manufactured by Microdissect GmBH in Germany and distrubted by ASEE Products
Memebrane Slides, RNase Free (Alternative) Molecular Machines & Industries 50102
Rapid Fix Thermo scientific 6764212 H&E staining
RLT Buffer Qiagen 79216 lysis bufffer used for LCM samples
RNAseZap Sigma R2020 RNase decontamination solution
Protect RNA RNAse Inhibitor Sigma Aldrich R7397
RNeasy Micro Kit Qiagen 74004 RNA isolation kit
SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit Takara Clontech 634888 low input RNA to cDNA kit for LCM samples
SuperMix (no dUTP) BioRad 1863023 digital PCR master mix
Tissue-Tek Cryomold (25mm x 20mm x5mm) Sakura 4557
Tissue-Tek O.C.T. Compound Sakura 4583
Stratalinker UV Crosslinker Stratagene 400075
Xylene Macron 8668

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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लेजर पर कब्जा Microdissection जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए माउस आंखों से अत्यधिक शुद्ध Trabecular Meshwork
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Sutherland, C., Wang, Y., Brown, R. V., Foley, J., Mahler, B., Janardhan, K. S., Kovi, R. C., Jetten, A. M. Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis. J. Vis. Exp. (136), e57576, doi:10.3791/57576 (2018).

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