Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

منصة موائع جزيئية أولتراهيغ الإنتاجية لتسلسل جينوم خلية واحدة

Published: May 23, 2018 doi: 10.3791/57598
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2, 1,2,3
1Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, California Institute for Quantitative Biosciences, University of California, San Francisco, 2UC Berkeley-UCSF Graduate Program in Bioengineering, University of California, San Francisco, 3Chan Zuckerberg Biohub

Summary

يكشف تسلسل خلية واحدة قد تغاير في النظم البيولوجية، ولكنها تفتقر إلى التكنولوجيات الحالية الإنتاجية اللازمة للتنميط العميقة وظيفة وتكوين المجتمع. هنا، يمكننا وصف سير عمل موائع جزيئية للتسلسل > خلية 50,000 جينوم خلية واحدة من تنوع السكان.

Abstract

تقنيات التسلسل شهدت تحولاً من الأكبر إلى خلية واحدة القرار استجابة لفهم دور التغايرية الخلوية متطورة في النظم البيولوجية. ومع ذلك، تسلسل خلية واحدة كبيرة من السكان قد أعاق القيود في تجهيز الجينوم للتسلسل. في هذه الورقة، ويصف لنا طريقة لتسلسل جينوم خلية واحدة (SiC-seq) الذي يستخدم ميكروفلويديكس الحبرية إلى عزل، وتضخيم، والرمز الشريطي الجينوم للخلايا المفردة. تغليف الخلية في ميكروجيلس يسمح بتنقية مجزأة وتاجمينتاتيون من الحمض النووي، بينما اندماج موائع جزيئية أزواج كفاءة كل الجينوم مع رمز شريطي فريد اليغنوكليوتيد خلية واحدة، مما يتيح > 50,000 الخلايا المفردة تكون متسلسلة كل تشغيل. هو ديمولتيبليكسيد البيانات التسلسل بالرمز الشريطي، توليد مجموعات من القراءات التي تنشأ من خلايا مفردة. كأسلوب الإنتاجية العالية والمنخفضة-التحيز في تسلسل خلية واحدة، سيمكن SiC seq طائفة أوسع من الدراسات الجينومية تستهدف السكان خلية المتنوعة.

Introduction

الجينوم بمثابة مخططا للهوية الخلوية والدالة، التي تحتوي على الكائن الحي بأكملها الترميز المحتملة. فهم البيولوجيا الخلوية على مستوى الجينوم يمكن أن تفسر تنوع المظهرية ملاحظتها داخل الخلية غير المتجانسة السكان. هذا التباين الواضح في الأنظمة البيولوجية، وله آثار واسعة النطاق على صحة الإنسان والمرض. على سبيل المثال، ترتبط الجينات نسخ عدد الاختلافات بين الخلايا السرطانية لتطور وانتشار السرطان1،2. في العدوى البكتيرية، الإمراضية جزر موجودة في جزء صغير من الجينوم يمكن نقلها أفقياً، ويؤدي إلى انتشار البكتيريا المقاومة للمضادات الحيوية3،4. هو تحدي الرئيسي في دراسة الجينوم على مستوى الخلايا المفردة كميات منخفضة من الحمض النووي المتاحة، فضلا عن الحاجة إلى تحليل آلاف خلايا العينة التنوع الكامل للأنماط الجينية. لهذه الأسباب، أعاقت القيود الإنتاجية التجريبية فعالية الدراسات خلية واحدة، يتحامل نتائج نحو الخلايا الأكثر وفرة. تقنيات عزل خلية واحدة مثل تدفق الفرز5،6، ملاقط بصرية7، امبيدمينت في معظم المواد الهلامية8، وميكروفلويديكس9 قادرون على تجهيز مئات خلايا لتسلسل؛ ومع ذلك، يمثل هذا جزء صغير فقط من معظم العينات. يسمح أسلوب لتسلسل جينوم خلية واحدة مع إنتاجية أعلى بكثير التنميط أكثر عمقاً وأكثر اكتمالا من السكان الخلية، وبالتالي توضيح دور أوضح التنوع داخل هذه المجتمعات.

ميكروفلويديكس الحبرية يتيح التلاعب الفائق بالخلايا والمواد الكاشفة البيولوجية داخل ملايين مفاعلات بيكوليتير-مقياس. وحتى الآن، ميكرودروبليت قد استخدمت تقنيات لدراسة أنماط التعبير التفاضلية بين خلايا من أنسجة غير متجانسة10،،من1112، عميق تسلسل جزيئات طويلة13،14 ،15، وسلوك الكروماتين إيمونوبريسيبيتيشن التسلسل (الرقائق-seq) تحليلات بشأن خلايا مفردة16. وفي الواقع، ميكرودروبليتس قادرون على عمليات الفائق، ومجزأة، وجعلها قابلة للتطبيقات في علم الجينوم خلية واحدة. تطوير هذه التكنولوجيا يعرض التحديات التكنولوجية الفريدة الخاصة به، ومع ذلك. يجب تفكيك الخلايا وتنقية وتضخيم مع التحيز الحد الأدنى، إلى شكل موحد عينة خلية السكان. بالإضافة إلى ذلك، خلافا للنصوص مرناً بوليادينيلاتيد في خلايا الثدييات، هناك لا فكرة الجزيئية قابلة للمقارنة في الجينوم لتسهيل القبض على الحمض النووي المستهدف. ولهذه الأسباب، قد يصعب تنفيذه في منصات ميكرودروبليت تسلسل جينوم خلية واحدة.

في هذا العمل، نحن نقدم بروتوكول مفصل لنهجنا ذكر سابقا موائع جزيئية خلية واحدة قادرة على تسلسل جينوم عشرات آلاف خلايا في تجربة واحدة17. مغلفة في النطاق ميكرون الهلاميات المائية مع هذه التكنولوجيا، ودعا SiC-seq، الخلايا البكتيرية وتفكيك فردياً، تاجمينتيد، واندمجت مع ميكرودروبليت الذي يحتوي على رمز شريطي اليغنوكليوتيد فريدة من نوعها، وهي تقسم على الحمض النووي للخلية عن طريق تداخل واحد ملحق تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). الهلاميات المائية مثابة حاويات معزولة فيها عالية الوزن الجزيئي المجينية الحمض النووي هو ستيريكالي المغطى، السماح لجزيئات أصغر مثل المنظفات والأنزيمات الحال للوصول وتنقية الحمض النووي قبل المتوازية18. هذا البروتوكول العمليات > 50,000 الخلايا المفردة في غضون ساعات، أسفر عن المراقب مكتبة جاهزة للتسلسل. عقب التسلسل، ما يلي: ديمولتيبليكسيد وفقا لتسلسلها الباركود خلية واحدة، أدى إلى dataset تتألف من ملايين القراءات، كل مع فهرس خلوية.

Protocol

1-تصنيع الجهاز موائع جزيئية

  1. إعداد موائع جزيئية تصاميم قناع باستخدام برامج التصميم بمساعدة الكمبيوتر (CAD) (تقدم وصفه. DWG؛ راجع الملفات التكميلية). أن هذه النماذج المطبوعة من قبل البائع بدقة ميكرون 10 على فيلم الدائرة مجلس.
    ملاحظة: لأجهزة موائع جزيئية متعدد الطبقات، أقنعة المقابلة تحتوي علامات المحاذاة.
  2. لكل جهاز، واختلاق العفن سيد سو-8 (الشكل 1A) على النحو التالي.
    1. تعد رقاقة سيليكون قطرها 3 في بصب حوالي 1 مل من 3025 سو-8 مقاوم الضوء على المركز من يفر. تأمين يفر على المغطى تدور تشاك بتطبيق شفط.
    2. انظر الجدول 1 للحصول على قائمة من سمك طبقة وتدور بسرعة لكل جهاز. لجميع الأجهزة، ويبدأ طلاء تدور مع 30 s 500 لفة في الدقيقة، تليها 30 s بسرعة المشار إليه.
    3. إزالة يفر سو-8-السليكون من زيادة ونقصان المغطى وخبز لينة على هوتبلت تعيين إلى 135 درجة مئوية للحد الأدنى 30 تسمح ليفر لتبرد بدرجة حرارة الغرفة بعد الخبز.
    4. تعريض رقاقة سو-8-السيليكون مع قناع موائع جزيئية مناسبة تحت "الصمام الأشعة فوق البنفسجية" 190 ميغاواط، 365 نانومتر وتحديدالمنطقه لمدة 3 دقائق.
    5. بعد التعرض، جد خبز يفر على هوتبلت تعيين إلى 135 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة. وفي أعقاب هذه الخطوة الخبز، تسمح يفر لتبرد بدرجة حرارة الغرفة.
    6. لجهاز واحد الطبقات موائع جزيئية، قم بالتخطي إلى الخطوة 1.2.7. جهاز متعدد طبقات موائع جزيئية، كرر الخطوات 1.2.1-1.2.5 للطبقة الثانية من مقاوم الضوء (الشكل 1B).
    7. بعد خبز الثابت الأول لجهاز طبقة واحدة (أو خبز الثابت الثاني لجهاز متعدد طبقات)، تطوير يفر بغمر أنه في حمام من البروبيلين غليكول مونوميثيل البروم ثنائي الفينيل اسيتات (بجميا) لمدة 30 دقيقة.
    8. بعد التنمية ليفر، استخدام زجاجة بخ تحتوي على بجميا شطف الرقاقة. ثم شطف يفر بزجاجة بخ تحتوي على الكحول قبل وضعه على هوتبلت 135 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة حتى تجف.
    9. ضع الرقاقة (يشار إليها من الآن فصاعدا الماجستير) في طبق بتري لصب مع بولي دايمثيل سيلوكسان (PDMS).
  3. مع سيد إعدادها في الخطوة 1، 2، نشرع في القيام بتصنيع الجهاز مع صب PDMS.
    1. إعداد PDMS عن طريق الجمع بين سيليكون قاعدة مع عامل علاج في نسبة 11:1 حسب الكتلة. مزيج قاعدة السيليكون وعامل المعالجة باليد بعصا ضجة.
    2. ديغا PDMS بوضعه في غرفة كبسولة وتطبيق فراغ. السماح PDMS ديغا حتى فقاعات الهواء لم تعد مرئية (عادة 30 دقيقة).
    3. صب PDMS ديجاسيد بعناية على سيد، إلى سمك طبقة PDMS نهائية لحوالي 5 مم. ديغا PDMS مرة أخرى للتأكد من إزالة أي فقاعات الهواء.
    4. بعد جليحه، خبز PDMS وسيد على 80 درجة مئوية لمدة 80 دقيقة.
    5. عناية المكوس لوح PDMS شُفي من المخبوزات الرئيسية باستخدام شفرة حلاقة. التأكد من وجود جميع التخفيضات على رأس رقاقة السيليكون.
      ملاحظة: قد يؤدي أي تخفيضات أدلى قبالة رقاقة السيليكون lip منع الترابط موحدة.
    6. لكمه على مداخل ومنافذ باستخدام لكمه خزعة 0.75 ملم. قم بإزالة أي الغبار وطائشة PDMS استخدام شريط تغليف الجانب ميزة للجهاز.
    7. قبل البلازما علاج الجهاز، تنظيف شريحة زجاجية 50 مم × 75 مم الشطف مع الايزوبروبانول والتجفيف.
    8. مع ملامح مواجهة للعلاج البلازما ومكان الشريحة البلاط والزجاج PDMS في بوندير البلازما. إجراء معاملة البلازما استخدام البلازما2 [مبر] س 1 ل 1 دقيقة بوند الشريحة بالجمع يتعرض الجهاز للزجاج، أو الوجه لأعلى، الجانبين معا.
    9. وبعد العلاج البلازما، خبز الجهاز عند 80 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة.
    10. وأخيراً، حقن السوائل المعالجة السطحية الزجاج في أحد مداخل لتقديم قنوات موائع جزيئية مسعور. ضمان جميع القنوات التي غمرت تماما مع الحل وتكرار الحقن لكل دروبماكير. خبز الجهاز المعالجة عند 80 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة تتبخر المذيبات الزائدة.

2-تغليف الخلايا في ميكروجيلس [اغروس]

ملاحظة: انظر الشكل 2A.

  1. إعداد 1 مل من 3% w/v انصهار منخفضة الحرارة [اغروس] في 1 × تريس يدتا (TE) المخزن المؤقت. يبقى الحل [اغروس] على كتلة حرارة 90 درجة مئوية حتى قبل المحاقن تحميل مباشرة.
  2. إعداد تعليق خلية.
    ملاحظة: هذا البروتوكول وأجهزة موائع جزيئية المرتبطة به قد تم التحقق من صحة للعمل مع الخلايا البكتيرية، أما من الأوراق المالية المجمدة أو إعداد جديدة. خلايا الثدييات، تبعاً لنوع الخلية، قد تتطلب تعديلاً لإبعاد القناة موائع جزيئية لاستيعاب أحجام الخلايا الكبيرة.
    1. ريسوسبيند الخلايا الموجودة في 1 مل من المحلول الملحي مخزنة الفوسفات (PBS).
    2. عد الخلايا في هيموسيتوميتير أو عن طريق تدفق الفرز. ل 25 ميكرومتر ميكروجيلس بمعدل تغليف خلية هدف 1 في 10، إعداد 1 مل تعليق خلية بتركيز نهائي 2-4 × 107 خلايا/مل.
    3. تدور الخلايا لأسفل في 3,000 ز x للحد الأدنى 3 Aspirate المادة طافية وريسوسبيند بيليه الخلية في 1 مل 17% v/v كثافة متوسطة الانحدار (انظر الجدول للمواد) في برنامج تلفزيوني. يبقيه على الجليد حتى تحميل المحاقن.
  3. تحميل حقنه 3 مل مع النفط المفلورة (HFE) الذي يحتوي على 2% w/w بيرفلوروبولييثير--البولي إثيلين غليكول (فب-شماعة) خافض للتوتر السطحي وأنها تناسب مع إبرة ز 27، ووضعه في مضخة الحقن.
    ملاحظة: تناسب جميع الحقن بإبرة ز 27 موائع جزيئية خطوات في هذا البروتوكول. للحد من خطر الثقب عرضية، إبقاء قبعات على جميع الإبر حتى يبدأ تشغيل المضخة.
  4. تحميل تعليق خلية والمنصهر [اغروس] إلى 1 مل المحاقن وتناسب كلا مع الإبر 27-قياس ومكان هذه إلى مضخات الحقن.
  5. الاحتفاظ بحقنه [اغروس] ومضخة دافئة مع سخان الفضاء صغيرة لمنع التبلور في الحقن والأنابيب مدخل [اغروس]. تعيين سخان الفضاء إلى مرتفع ووضعه بحيث يكون السطح تدفئة حوالي 10 سم بعيداً عن المحاقن. التأكد من أن درجة الحرارة تقاس في المحاقن حوالي 80 درجة مئوية.
    ملاحظة: ينصح المستخدمين بالحفاظ على السخان في المسافة الموصى بها من أجهزة الضخ تقليل مخاطر تلف المعدات، بما في ذلك ذوبان الأنابيب.
  6. توليد 25 قطرات ميكروجيل مكم باستخدام جهاز دروبماكينج تدفق المشارك.
    ملاحظة: انظر الشكل 3 ألف لجهاز تخطيطي يشير إلى موقع كاشف مداخل ومخرج.
    1. قم بتوصيل إبر المحاقن مداخل الجهاز موائع جزيئية باستخدام قطع من أنابيب البولي إيثيلين (PE). قبل إدخال الأنابيب في الجهاز، رئيس الوزراء مضخات لإزالة الهواء من السطر.
    2. توصيل قطعة من الأنبوب إلى المنفذ ووضع نهاية حرة في أنبوب جمع 15 مل.
    3. استخدام معدلات التدفق (مستحسن) التالية دروبماكينج: 800 ميليلتر/ح ل HFE 2% w/w فب-شماعة؛ 200 ميليلتر/ح بتعليق خلية في برنامج تلفزيوني؛ و 200 ميليلتر/ح 3% w/v [اغروس].
  7. بعد دروبماكينج، بوضع أنبوب جمع عند 4 درجة مئوية مدة 30 دقيقة لضمان جيلاتيون كاملة [اغروس].

3-كسر والغسيل ميكروجيلس [اغروس]

  1. إزالة الطبقة السفلي من النفط من أنبوب جمع استخدام المحاقن 3 مل مزودة بإبرة ز 20، مع الحرص على عدم الإخلال بالطبقة العليا من القطرات [اغروس].
  2. كسر المستحلبات مع بيرفلوروكتانول (مكتب تمويل البرامج).
    1. أضف 1 مل من 10% v/v مكتب تمويل البرامج في HFE للقطرات [اغروس]. بيبيت هذا الحل صعودا وهبوطاً لمدة 1 دقيقة لدقة معطف المستحلبات.
      ملاحظة: لجميع ميكروجيل يغسل الخطوات، بيبيت الحلول مع تلميح 1,000 ميليلتر. يجب أن يظهر بتعليق ميكروجيل متجانسة وخالية من كتل بعد بيبيتينج عليه.
    2. تدور أنبوب مخروطي في 2,000 س ز لمدة 1 دقيقة لجمع ميكروجيلس [اغروس]. إزالة المادة طافية HFE/مكتب تمويل البرامج عن طريق الاستنشاق؛ ميكروجيلس الآن خالية من طبقة على السطح وسوف تظهر واضحة.
  3. أغسل ميكروجيلس مع خافض للتوتر السطحي في الهكسين.
    تنبيه: هو الهكسين المذيبات عضوية المتطايرة، وينبغي أن تجري المياه والصرف الصحي في الخطوة 3، 3 في غطاء دخان.
    1. إضافة 2 مل من 1% v/v سوربيتان مونولياتي السطح النطاق (انظر الجدول للمواد) في الهكسين إلى ميكروجيلس [اغروس]. بيبيت صعودا وهبوطاً x 10 لمزيج، ضمان تفكك كامل ميكروجيل بيليه.
    2. تدور الأنبوب في 1,000 س ز لمدة 1 دقيقة لجمع ميكروجيلس. نضح المادة طافية لإزالة الحل الفاعل/الهكسين.
    3. تكرار الغسيل الفاعل/الهكسين.
  4. أغسل ميكروجيلس في مخزن مؤقت مائي لإزالة أي بقايا من المذيبات العضوية.
    1. إضافة 5 مل من المخزن المؤقت تيت [0.1% v/v أوكتيلفينول اثوكسيلاتي المنظفات النطاق (انظر الجدول للمواد) في تي س 1] أن الأنبوبة المخروطية. بيبيت صعودا وهبوطاً x 10 للمزيج.
    2. تدور أنبوب مخروطي في 2,000 س ز 2 دقيقة لجمع في ميكروجيلس. نضح المادة طافية لإزالة المخزن المؤقت تيت.
    3. كرر التيت يغسل 2 x.
    4. إضافة مل 5 x 1 TE المخزن المؤقت إلى الأنبوبة المخروطية. بيبيت صعودا وهبوطاً x 10 للمزيج.
    5. تدور أنبوب مخروطي في 2,000 س ز 2 دقيقة لجمع في ميكروجيلس. نضح المادة طافية لإزالة المخزن المؤقت الشركة المصرية للاتصالات.
    6. تكرار الغسيل الشركة المصرية للاتصالات.
  5. تحقق من التغليف الخلية في ميكروجيلس تحت مجهر تكبير X 400 تلطيخ قاسمة 10 ميليلتر من الهلام مع الحمض النووي x 1 وصمة عار (انظر الجدول للمواد).
    ملاحظة: سوف تظهر ميكروجيلس الواضح تحت قناة شفافة بينما الخلية سوف فلوريسسي الحمض النووي تحت قناة التجارة والنقل (497/520 nm الإثارة/الانبعاثات الأطوال الموجية). تراكب قنوات شفافة ومضيئة سوف تظهر الخلايا في ميكروجيلس كما هو مبين في الشكل 4A.

4-تحلل خلايا في [اغروس] عن طريق الإنزيمات الحال

  1. إعداد 1 مل إنزيم الحال كوكتيل استخدام 800 ميليلتر TE المخزن المؤقت (س 1)، ميليلتر 2 إنزيم الخميرة الحال (الأسهم يو/ميليلتر 5، 10 U/mL النهائي)، 30 ميليلتر من ديثيوثريتول (1 م الأوراق المالية، والنهائي 30 ملم) 60 ملغ ليسوزيمي (مسحوق المجففة بالتبريد)، 15 ميليلتر يدتا (0.5 م الأوراق المالية ، 7.5 مم النهائي)، 2 ميليلتر من موتانوليسين (100 يو/ميليلتر الأسهم، 200 يو/مليلتر النهائي) و 2 ميليلتر من ليسوستافين (10 ش/ميليلتر الأسهم، يو 20/مل النهائي) 30 ميليلتر من كلوريد الصوديوم (1 م الأوراق المالية، النهائي 30 مم).
  2. إضافة TE إضافية إعادة وحدة التخزين إلى 1 مل. مزيج الحل قبل فورتيكسينج.
  3. إضافة 1 مل كامل الحل الإنزيم الحال لا يزيد عن 1 مل ميكروجيلس غسلها. مزيج من بيبيتينج x 10. الخليط في 37 درجة مئوية لاحتضان > ح 2 في شاكر (الحد الأقصى هو الحضانة بين عشية وضحاها).

5-ميكروجيل المنظفات الصناعية على أساس المعاملة

  1. عقب تحلل عن طريق الإنزيمات الحال (الخطوة 4)، يغسل في ميكروجيلس.
    1. وتدور إلى أسفل ميكروجيلس في 2,000 س ز 2 دقيقة نضح المادة طافية. سوف تظهر القطرات بيضاء معتمة بسبب الحطام خلية موزعة في بيليه.
    2. ريسوسبيند ميكروجيلس في 5 مل من المخزن المؤقت تريس-HCl 10 ملم وبيبيت صعودا وهبوطاً x 10 لمزيج.
    3. تدور الخليط أسفل في 2,000 س ز لمدة 2 دقيقة، ثم إزالة المادة طافية بالطموح.
  2. تنفيذ علاج منظفات على ميكروجيلس.
    1. ريسوسبيند المواد الهلامية في ليثيوم دوديسيل كبريتات (أغطية) تحلل المخزن مؤقت (0.5% w/v أغطية في 20 مم تريس-HCl) و 60 ميليلتر يدتا 0.5 M لوحدة تخزين نهائي لمل 3.
    2. إضافة 5 ميليلتر إنزيم "البروتيناز ك" (800 يو/مليلتر الأسهم). ثم احتضان بيبيت صعودا وهبوطاً x 10 لمزيج، المخلوط في 42 درجة مئوية في كتلة حرارة ح 1 جعل أغشية الخلية وهضم البروتينات.
  3. عقب العلاج المنظفات، وتغسل في ميكروجيلس.
    1. تدور أنبوب مخروطي مع ميكروجيلس أسفل في 2,000 س ز 2 دقيقة إزالة المادة طافية بالطموح.
    2. أغسل ميكروجيلس مع 10 مل من 2% v/v بوليسوربيت 20 في المياه. بيبيت صعودا وهبوطاً x 10 للمزيج.
    3. تدور أنبوب مخروطي أسفل في 2,000 س ز لمدة 2 دقيقة، ثم إزالة المادة طافية بالطموح.
    4. أغسل ميكروجيلس مع 10 مل إيثانول 100% لإلغاء تنشيط أي إنزيم المتبقية. بيبيت صعودا وهبوطاً x 10 للمزيج.
    5. تدور أنبوب مخروطي أسفل في 2,000 س ز لمدة 2 دقيقة، ثم إزالة المادة طافية بالطموح.
    6. أغسل ميكروجيلس مع 10 مل من 0.02% v/v بوليسوربيت 20 في المياه. بيبيت صعودا وهبوطاً x 10 للمزيج.
    7. تدور أنبوب مخروطي أسفل في 2,000 س ز لمدة 2 دقيقة، ثم إزالة المادة طافية بالطموح.
    8. أغسل تكرار بوليسوربيت 20 3 x. تمرير الحل من خلال مصفاة خلية 100 ميكرومتر قبل الغسيل الأخير لإزالة أي كتل كبيرة.
  4. ريسوسبيند ميكروجيلس في 5 مل من 10 ملم تريس-HCl العازلة لمنع تدهور الحمض النووي. قد يتم تخزين في ميكروجيلس عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد قبل تاجمينتيشن (الخطوة 7).

6-توليد الباركود قطرات من PCR الرقمية

  1. إعداد مخزون 500 م من بار التمهيدي (الجدول 2) في 1 × المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات في أنبوب منخفض--ربط. قبل كل استخدام، تخفف من التمهيدي إلى رصيد عامل من 01:00 م والحرارة إلى 70 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة على كتلة حرارة.
  2. إعداد مزيج تفاعل PCR 150 ميليلتر 75 باستخدام مزيج ميليلتر عالية الدقة ابدأ الساخنة الرئيسية (انظر الجدول للمواد) (2x)، ميليلتر 42 الماء بكر الصف، 3 ميليلتر من التمهيدي DNA_BAR (10 ميكرون الأسهم، 0.2 ميكرون النهائي)، 3 ميليلتر من P7_BAR التمهيدي (10 ميكرون الأسهم ، 0.2 ميكرون النهائي)، 6 ميليلتر لتمييع الباركود (01:00 م الأسهم، النهائي 40 fM) وميليلتر 6 من بوليسوربيت 20 (50% v/v الأسهم، 2% النهائي) 15 ميليلتر من شماعة 6 ك (50% w/v الأسهم، 5% النهائي). مزيج من بيبيتينج صعودا وهبوطاً 10 x.
  3. إعداد حقنه HFE المدعومة برسم 200 ميليلتر من HFE النفط في محقن وأنها تناسب مع إبرة. إرفاق مقطع من أنابيب PE بالإبرة ورئيس الوزراء على الخط باليد. إدراج نهاية الأنبوب PE إلى الحل المستهدفة ورسم بعناية كل ميليلتر 150 من مزيج PCR في الأنبوب PE والمحاقن. تحميل المحاقن في مضخة الحقن.
  4. تحميل حقنه 1 مل مع النفط المفلورة (HFE) الذي يحتوي على 2% w/w بيرفلوروبولييثير--البولي إثيلين غليكول (بفبي-شماعة) خافض للتوتر السطحي وأنها تناسب مع إبرة ووضعه في مضخة الحقن.
  5. توليد 25 ميكرومتر الباركود قطرات باستخدام جهاز دروبماكينج تدفق المشارك.
    ملاحظة: انظر الشكل 3 ألف لجهاز تخطيطي يشير إلى موقع كاشف مداخل ومخرج.
    1. التوصيل مدخل خلايا من جهاز دروبماكير تدفق المشارك مع قطعة صغيرة من الرصاص اللحيم.
    2. الاتصال المحاقن محملة HFE وبكر مزيج لمداخل الجهاز موائع جزيئية باستخدام قطع من أنابيب PE، استخدام مدخل المنصهر [اغروس] للرمز الشريطي مزيج PCR. قبل إدخال الأنابيب في الجهاز، رئيس الوزراء مضخات لإزالة الهواء من السطر.
    3. توصيل قطعة من الأنبوب إلى المنفذ ووضع نهاية حرة في أنبوب بكر 0.2 مل. استخدام معدلات التدفق (مستحسن) التالية دروبماكينج: 600 ميليلتر/ح ل HFE 2% w/w فب-شماعة و 200 ميليلتر/ح لمزيج PCR. جمع القطرات في أنابيب PCR مع حوالي 50 ميليلتر من قطرات في كل أنبوبة.
  6. بعد دروبماكينج، بعناية إزالة الطبقة السفلي من النفط HFE من مستحلبات استخدام هلام-تحميل بيبيت نصائح واستبدالها بالنفط المفلورة FC-40 التي تحتوي على 5% w/w فب-شماعة خافض للتوتر السطحي. دورة حرارية مع البروتوكول التالي: 98 درجة مئوية لمدة 3 دقائق، x 40 من (98 درجة مئوية لمدة 10 ق، 62 درجة مئوية 20 s، 72 درجة مئوية 20 s)، 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، وعقد بعد ذلك في 12 درجة مئوية.
    ملاحظة: يمكن تخزين قطرات تدوير الحرارية عند 4 درجة مئوية ليصل إلى 1 يوم.
  7. تحقق من معدل التضخيم وتغليف الباركود.
    1. إعداد حمض النووي 1 x وصمة عار (انظر الجدول للمواد) في HFE مع 2% w/w فب-شماعة خافض للتوتر السطحي؛ وصمة عار الامتزاج بشكل هامشي في HFE وسيتم ربط الحمض النووي في القطرات.
    2. إضافة 1 ميليلتر من مستحلب الباركود الحرارية تدوير إلى 10 ميليلتر من زيت المصبوغة. احتضان لهم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    3. صورة قطرات بالفحص المجهري نيون (قناة بروتينات فلورية خضراء، 497/520 nm الإثارة/الانبعاثات أطوال موجية) في تكبير X 200 وحساب معدل تغليف الباركود. لاحظ أن الإشارة ستكون منفصلة: قطرات يحتوي على الرموز الشريطية تضخيم سوف فلوريسسي الزاهية، بينما قطرات الفارغة ستظهر الظلام (الشكل 4 باء).

7-تاجمينتيشن للحمض النووي في قطرات

ملاحظة: انظر الشكل 2B.

  1. إعداد 500 ميليلتر لحل تاجمينتيشن باستخدام الكواشف من إعداد مكتبة الجيل التالي تسلسل كيت (انظر الجدول للمواد). استخدام ميليلتر 7 إنزيم تاجمينتيشن و 250 ميليلتر من المخزن المؤقت تاجمينتيشن 243 ميليلتر من الماء بكر-الصف. مزجها فورتيكسينج وتدور الخليط أسفل لجمع. تحميل هذا الحل إلى حقنه المدعومة من النفط 1 مل HFE وأنها تناسب مع إبرة.
  2. إعداد ميكروجيلس لحقن.
    1. وتدور أسفل أنبوب ميكروجيل لمدة 2 دقيقة في 2,000 س ز نضح المادة طافية. نقل 200 ميليلتر من المواد الهلامية إلى أعلى حقنه تدعمها HFE مع تلميح بيبيت تحميل جل وختم على فوهة مع قطعة صغيرة من الشريط.
    2. استخدام محول جهاز الطرد مركزي طباعة 3D (انظر تكميلية الملفات 1 و 2)، تدور حقنه ميكروجيل لمدة 3 دقائق في 3,000 س ز.
    3. إزالة المادة طافية السائل من المحاقن استخدام تلميح بيبيت جل في تحميل. دفع طبقة ميكروجيل إلى القاعدة فوهة المحقن. يصلح حقنه بإبرة.
  3. تحميل حقنه 3 مل مع النفط المفلورة (HFE) الذي يحتوي على 2% w/w بيرفلوروبولييثير--البولي إثيلين غليكول (فب-شماعة) خافض للتوتر السطحي وأنها تناسب مع إبرة ووضعه في مضخة الحقن.
  4. إعادة تغليف في ميكروجيلس في قطرات تحتوي على كواشف تاجمينتاتيون.
    ملاحظة: انظر الشكل 3B لجهاز تخطيطي يشير إلى موقع كاشف مداخل ومخرج.
    1. قم بتوصيل الحقن التي تحتوي على HFE، ومزيج تاجمينتيشن، وميكروجيلس إلى مداخل الجهاز موائع جزيئية باستخدام قطع من أنابيب PE. قبل إدخال الأنابيب في الجهاز، رئيس الوزراء مضخات لإزالة الهواء من السطر.
    2. توصيل قطعة من الأنبوب إلى المنفذ ووضع نهاية الحرة في حقنه 1 مل فارغة مع المكبس إلى السطر 1 مل.
    3. استخدام معدلات التدفق (مستحسن) التالية دروبماكينج: 2,000 ميليلتر/ح ل HFE 2% w/w فب-شماعة و 200 ميليلتر/ح ميكروجيلس 500 ميليلتر/ح لهذا المزيج تاجمينتيشن.
  5. تحقق من معدل تغليف ميكروجيل تحت مجهر خفيفة في تكبير X 400. يجب أن تحتوي على حوالي 80-90% القطرات ميكروجيل، كما هو مبين في الشكل 4.
  6. تناسب حقنه تحتوي على مستحلبات تاجمينتاتيون بإبرة واحتضان تستقيم في كتلة الحرارة أو فرن ح 1 في 55 درجة مئوية تفتيت الحمض النووي الجينوم.

8-خلية واحدة المتوازية باندماج مزدوجة موائع جزيئية

ملاحظة: انظر الشكل 2.

  1. إعداد قطرات الرمز الشريطي للاندماج بالاستعاضة عن الكسر النفط FC-40 مع HFE 2% w/w فب-الوتد. نقل هذه القطرات في محقن 1 مل بعناية، وأنها تناسب مع إبرة، ووضعه في مضخة الحقن.
  2. تحميل المحاقن الحبرية ميكروجيل المحتضنة وتاجمينتيد في مضخة الحقن.
  3. إعداد 500 ميليلتر من مزيج PCR. إضافة الكواشف الترتيب التالي للحيلولة دون تشكيل رواسب: 140 ميليلتر المياه PCR-الصف، 10 ميليلتر من التمهيدي P5_DNA (10 ميكرون الأسهم، 0.2 ميكرون النهائي)، 10 ميليلتر من التمهيدي P7_BAR (10 ميكرون الأسهم، 0.2 ميكرون النهائي)، 50 ميليلتر من شماعة 6 ك (الأسهم 50% w/v ، 5% النهائي)، 50 ميليلتر من بوليسوربيت 20 (50% v/v الأسهم، 5% النهائي)، 250 ميليلتر من مزيج ماجستير بوليميراز (2x) (انظر الجدول للمواد)، 10 ميليلتر من بوليميريز متحاور (انظر الجدول للمواد)، و 10 ميليلتر لتحييد المخزن المؤقت (انظر الجدول للمواد). مزجها بيبيتينج صعودا وهبوطاً 10 x وتدور الخليط أسفل لأنه جمع. تحميل هذا الحل إلى حقنه 1 مل تدعمها HFE وأنها تناسب مع إبرة ووضعه في مضخة الحقن.
  4. تحميل ثلاثة 3 مل المحاقن مع النفط المفلورة (HFE) الذي يحتوي على 2% w/w بيرفلوروبولييثير--البولي إثيلين غليكول (فب-شماعة) خافض للتوتر السطحي، تناسب كل منها بإبرة ووضعها في المحاقن مضخات.
  5. تحميل ثلاثة 1 مل المحاقن مع 2 م كلوريد الصوديوم، تناسب كل منها بإبرة وجانبا منها.
  6. دمج قطرات الباركود، قطرات الجينوم تاجمينتيد، ومزيج PCR باستخدام جهاز الاندماج مزدوجة.
    ملاحظة: انظر الشكل 5 لجهاز تخطيطي تشير إلى الموقع مداخل الكاشف والقطب ومنفذا.
    1. قم بتوصيل المحاقن كلوريد الصوديوم 3 2 مسرى مداخل وخندق واحد إينليتوسينج قطعة من الأنبوب PE. أقطاب كهربائية، لا تنطبق الضغط الحقن يدوياً حتى يتم ملء الأقطاب تماما مع الحل الملح. بعد ملء الأقطاب، ممارسة الضغط اليدوي للمحاقن الخندق حتى يمتلئ الخندق. قم بتوصيل الطرف الحر من الخندق مع قطعة صغيرة من الرصاص اللحيم.
    2. قم بتوصيل الحقن HFE 3 التي شنت على مضخات 2 مداخل النفط مباعدة وزيت دروبماكينج إينليتوسينج قطعة من الأنبوب PE. قبل إدخال الأنابيب في الجهاز، رئيس الوزراء مضخات لإزالة الهواء من السطر.
    3. الاتصال المحاقن مزيج PCR وقطرات ميكروجيل حقنه الباركود قطرات حقنه لمداخل كل منها استخدام أنابيب PE. إطلاق النار على جميع أنابيب حقن الحبرية مع بندقية المكافحة الساكنة قبل توصيلها بابر المحاقن؛ علاج المكافحة الساكنة يقلل من خطر الحبرية التلاحم الناجمة عن رسوم ثابتة على أنابيب PE.
    4. توصيل قطعة من الأنبوب PE بمأخذ التيار ووضع نهاية حرة في أنبوب بكر 0.2 مل.
    5. قم بتوصيل الإبر المحاقن القطب العاكس فلورسنت كاثود بارد استخدام إحدى قصاصات التمساح. تعيين العاكس العاصمة إمدادات الطاقة إلى 2 V.
    6. تشغيل الجهاز الاندماج مزدوجة مع معدلات تدفق الموصى بها: 300 ميليلتر/ح لقطرات ميكروجيل تاجمينتيد، 100 ميليلتر/ح لقطرات الباركود، 1500 ميليلتر/ح ل HFE 2% w/w فب-شماعة (دروبماكينج النفط)، 600 ميليلتر/ح للتضخيم مزيج، 200 ميليلتر/ح HFE 2% w/w شماعة PFPE ( الرمز الشريطي فاصل النفط)، و 700 ميليلتر/ح ل HFE 2% w/w فب-شماعة (ميكروجيل فاصل النفط). جمع القطرات إلى أنابيب PCR مع حوالي 50 ميليلتر من مستحلب في كل أنبوبة.
  7. قبل ركوب الدراجات الهوائية الحرارية، بعناية إزالة الطبقة السفلي من النفط HFE من مستحلبات استخدام هلام-تحميل بيبيت نصائح واستبدالها بالنفط المفلورة FC-40 التي تحتوي على 5% w/w فب-شماعة خافض للتوتر السطحي. دورة حرارية مع البروتوكول التالي: 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق, 95 درجة مئوية لمدة دقيقة 2, 30 x (95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، 60 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة)، 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، ثم عقد في 12 درجة مئوية.
  8. استرداد المراقب الحمض النووي من قطرات تدوير الحرارية.
    1. تجمع القطرات في أنبوب ميكروسينتريفوجي وكسر المستحلبات استخدام 20 ميليلتر من مكتب تمويل البرامج. دوامة منهم 10 s المزيج.
    2. تدور الأنبوب في 10,000 س ز لمدة 1 دقيقة يجزئ المخلوط في مراحل النفط (أسفل) والمائية (أعلى). بعناية إزالة الطبقة المائية العليا من الأنبوب باستخدام بيبيت وتحويلها إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي جديدة. تجاهل مرحلة النفط.
    3. تنقية المنتج بكر المراقب في عمود دوران وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة والوتي أنه في 20 ميليلتر x 1 TE المخزن المؤقت.
    4. الشروع في تسلسل المؤداة والتحليل وفقا للخطوات 9 و 10.

9-مكتبة الإعداد والتسلسل

  1. تعد المكتبة خلية واحدة للتسلسل باتباع بروتوكولات الشركة المصنعة لحجم جزء التحديد والقياس الكمي.
  2. تسلسل المكتبة نهاية الاقتران مع الكيمياء الافتراضي لقراءة 1 و 2 القراءة. استخدام التمهيدي 1 فهرس مخصص I7_READ (الجدول 2) لمؤشر 15-بي بي قراءة، المقابلة للرمز الشريطي خلية واحدة.

10-تحليل بيانات خلية واحدة

ملاحظة: يمكن تحميل البرامج النصية بيثون مخصص لمراقبة الجودة والتحليل الأولى للبيانات SiC seq من https://www.github.com/AbateLab/SiC-seq.

  1. تشغيل البرنامج النصي "barcodeCleanup.py" إجراء مراقبة الجودة على يقرأ المراقب وتصدير البيانات خلية واحدة إلى قاعدة بيانات SQLite. لتجربة التحكم، استخدم هذا البرنامج النصي مع "-محاذاة" العلم لتعيين محاذاة على ما يلي للجينوم مرجعية معروفة.
  2. تحليل نقاء المجموعات الباركود (لتجربة التحكم) باستخدام البرنامج النصي "purity.py" وتأكيد القيم درجة نقاء عالية تتسق مع الشكل 6B.

Representative Results

سير العمل التجريبي SiC seq يحتوي على 3 أجهزة موائع جزيئية PDMS ملفقة باستخدام إجراء الطباعة حجرية ناعمة (الشكل 1). دروبماكير تدفق المشارك (الشكل 3A) يولد 25 ميكرومتر قطرات الباركود الرقمية لوسم الحمض النووي مع معرف فريد خلية واحدة. النوكليوتيد الباركود تتكون من تسلسل منحط 15 bp يحف به مقابض PCR للتضخيم (الجدول 2، بار التمهيدي). هي تضعف الرموز الشريطية إلى تركيز فيمتومولار على تحقيق تغليف جزيء واحد، وتلقى جميع قطرات fragment(s) الرمز الشريطي أما 0 أو 1. قطرات تحتوي على رمز شريطي تتضخم، مما أسفر عن العديد من نسخ أمبليكونس الباركود مزدوجة-الذين تقطعت بهم السبل. وصمة حمض النووي يستخدم للتحقق من التضخيم ناجحة وقياس معدل تغليف أجزاء الباركود (الشكل 4 باء). ميكروجيلس يتم إنشاؤها بواسطة الاشتراك تتدفق تعليق خلية بكتيرية والمنصهر [اغروس] هلام في معدلات التدفق متساوية (الشكل 2A). [اغروس] أعد في مرتين التركيز النهائي المطلوب، كما يخفف عملية دروبماكينج تدفق المشارك فعلياً في المحاليل بمعامل 2. كما يبرد [اغروس]، فإنه يتصلب في ميكروجيل قطرها 25 ميكرومتر الاحتلال حجم كروي الحبرية.

ينقي سلسلة من خطوات الغسيل وتحلل الحمض النووي الجينومي عالية الوزن الجزيئي في ميكروجيلس (الشكل 2). بعد كسر في المستحلبات، تنفذ يغسل مائي بكميات كبيرة في تمييع بتتبع المذيبات العضوية التي يمكن أن تحول دون العلاج الأنزيمي المتلقين للمعلومات. ولوحظت ميكروجيلس غسلها تحت مجهر للتحقق من معدل تغليف الخلية (الشكل 4 أ). يتم إضافة مزيج إنزيمات بنشاط واسع في الحال إلى تعليق ميكروجيل لهضم الجدران خلية البكتيريا والميكروبات التوكسينات19. علاج ثاني مع "ك البروتيناز" والمنظفات ويتحلل في البروتينات وسولوبيليزيس الحطام خلية.

تاجمينتيشن لتنقية الحمض النووي تجري في قطرات لتجنب التلوث عبر المحتملة الناجمة عن انتشار شظايا من الحمض النووي تاجمينتيد صغيرة بين ميكروجيلس18. جهاز تغليف الحبرية (الشكل 3B) كومبارتمينتاليزيس كل ميكروجيل مع إنزيم المخزن المؤقت وتاجمينتاتيون، وشظايا الحمض النووي المزدوج-الذين تقطعت بهم السبل في وقت واحد بينما أيضا "علامات" أنه مع اليغنوكليوتيد مسبقة20. يتم تحميلها ميكروجيلس في القطرات كجسيمات معبأة إغلاق، تحقيق معدلات تغليف تقترب من ميكروجيل 1 لكل قطره مع قليل دوبليتس21 (الشكل 4).

في الخطوة النهائية لسير العمل موائع جزيئية (الشكل 2)، يقوم جهاز عملية اندماج مزدوج يجمع بين 1 الباركود قطره وقطره 1 التي تحتوي على ميكروجيل، ومزيج التضخيم في عملية من خطوتين التي تسيطر عليها. أولاً، معالجة تجميعية تحتوي على كاشف PCR إقران ودمجها مع انخفاض الرمز شريطي في المنطقة تظهر باللون الأصفر (الشكل 5). إنتاج أقطاب المياه المالحة في قناة موائع جزيئية تدرج ارتفاع حقل الكهربائي الذي يقوم بتشغيل عملية الدمج الحبرية. بطريقة مماثلة، يقترن معالجة تجميعية ميكروجيل الحبرية المدمجة الأولى ودمجها لمرة ثانية في منطقة يظهر باللون الأحمر. يتم جمع القطرات وتدوير الحرارية قبالة رقاقة في ملحق واحد-التداخل (سو) بكر. تسمح نهايات متكاملة متداخلة الرمز الشريطي والحمض النووي الجينوم تاجمينتيد الانصهار والتضخيم الهائل من بنيات المراقب فقط بشكل صحيح.

البيانات التسلسل هو أولاً تصفية حسب نوعية قراءة ومن ثم توزيعه بتجميع ما يلي: وفقا لتسلسلها الباركود خلية واحدة 15-بي بي. لمجموعة الرمز شريطي لأن يعتبر صحيحاً، ينبغي أن تتضمن حدا أدنى من القراءة؛ يحد من التحليل للخلايا مع كمية مفيدة من البيانات تسلسل هذه العتبة ويزيل الباركود تحور PCR "الأيتام" من dataset. في هذه العينة تشغيل، يتم تعيين الحد الأدنى إلى 7.5 كيلو بايت في الثانية الواحدة والمجموعة (ما يلي: 50 من 150 شركة بريتيش بتروليوم كل). رسم بياني للتهم الباركود مقابل حجم المجموعة تبين أن قسما كبيرا من المجموعات الباركود صالحة فقط فوق عتبة حجم (الشكل 6A).

في تجربة التحكم حيث يعرف تركيبة المجتمع الميكروبية، تستخدم نقاء وقياسات الوفرة النسبية لتقييم نوعية SiC-seq تشغيل. وهنا يتم تحليل مجتمع 10-الخلية اصطناعية تتكون البكتيريا سلبية الغرام 3، 5 إيجابية البكتيريا والخمائر 2. يتم تعريف نقاء مجموعة باركود معين كعدد ما يلي: رسم خرائط الجينوم الأكثر شيوعاً في المجموعة مقسوماً على العدد الكلي لما يلي في المجموعة. أن الغالبية العظمى من جماعات الباركود بورتيس أكبر من 0.95 (الشكل 6B). يتم حساب الوفرة النسبية لأنواع الخلايا عد القراءات الخام، وفرز المجموعات الباركود، حيث المجموعات التي يتم تعيين نوع خلية المقابلة لتوافق الآراء بين الأعضاء ما يلي: (الشكل 6). الوفرة من القراءات ومجموعات الرموز الشريطية تتبع بنسب متساوية تقريبا، مما يشير إلى أن سكان الخلية يتم يتم أخذ عينات مثل أن لا ترد بعض الأنواع في مجموعات الباركود غير متناسب صغيرة أو كبيرة. التآمر التغطية الإجمالية لجميع مجموعات الرمز الشريطي من نوع واحد يشير إلى تغطية عالية عبر كامل الجينوم، مع قليل أو لا يوجد مناطق التسرب (الشكل 7). يمكن التحقق من اتساق التغطية مع توزيع الترددات من قيم تغطية طبيعية، مع معظم القيم تتمحور حول المتوسط (الشكل 7، اقحم).

Figure 1
الشكل 1 : تصنيع أجهزة موائع جزيئية بالطباعة الحجرية التصويرية. (أ) ماجستير ملفقة قوالب مع ارتفاع ميزة وحيدة التي تدور طلاء طبقة من سو-8 مقاوم الضوء على رقاقة سيليكون. ثم هو منقوشة مقاوم الضوء مع قناع فوتوليثوغرفيك والأشعة فوق البنفسجية الخفيفة، كروسلينكينج سو-8 المكشوفة. وأخيراً، يتم حل أونكروسلينكيد سو-8 في حمام مطور. يستخدم العفن الناتجة ليلقي PDMS الذي هو الرهينة إلى شريحة زجاج لإنتاج الجهاز موائع جزيئية كاملة. (ب) لجهاز مزدوج الطبقة، والتلفيق وبالمثل يبدأ بخطوات تدور طلاء والتعرض. ثم يتم تكرار هذه الخطوات لإنشاء جهاز طبقتين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: نظرة عامة على سير العمل SiC seq. تعليق الميكروبية (A) A يتدفق يشترك مع [اغروس] المنصهر في جهاز دروبماكير لتغليف الخلايا المفردة في ميكروجيلس. (ب) ميكروجيلس تخضع لسلسلة من يغسل لتنقية الحمض النووي الجينوم البكتيري. الحال الإنزيمات هضم الجدران خلية البكتيريا إيجابية والخمائر، والمنظفات سولوبيليزيس الحطام الخلوية. ميكروجيلس إعادة مغلفة في قطرات تاجمينتاتيون للحد من التلوث عبر. (ج) دمج موائع جزيئية يجمع بين باركود PCR رقمية وجينوم ميكروجيل تاجمينتيد، ومزيج تضخيم بمعدل > 1 كيلو هرتز. التوصيلات باركود خلية واحدة فريدة من نوعها على الجينوم تاجمينتيد قبالة رقاقة الشركات المملوكة للدولة-بكر ويسهب بشكل انتقائي تماما نيات المراقب. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: أجهزة موائع جزيئية لتغليف إعادة دروبماكينج وميكروجيل. (أ) هذا الفريق يظهر دروبماكير تدفق المشارك (25 ميكرون من ميزة الارتفاع). يتم عرض الخلايا والمنصهر [اغروس] إلى الجهاز في معدلات التدفق متساوية لإنتاج 25 ميكرومتر قطرات مفترق ميكرومتر µm x 25 25. دروبماكينج الباركود الرقمية، يتم توصيل مدخل الخلية، ويتم إدخال مزيج PCR في المدخل [اغروس]. (ب) هذا الفريق يظهر جهاز إعادة تغليف ميكروجيل (25 ميكرون من ميزة الارتفاع). ميكروجيلس تتدفق مدخل على شكل القمع للحفاظ على وجبات إغلاق يأمر بها وتتلقى كمية من مزيج تاجمينتاتيون قبل إعادة التغليف مفترق ميكرومتر 25 µm x 30. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4 : ميكروجرافس قطرات وميكروجيلس- (أ) هذا الفريق يظهر غسلها 25 ميكرومتر ميكروجيلس قبل تحلل الانزيمية. فلوريسسينتلي ملطخة البكتيريا للتحديد الكمي لمعدل التغليف. إحصائيات تحميل Poisson تملي أن الخلايا مغلفة بمعدل 1 في 10 قطرات أو أقل لتقليل تواتر أحداث متعددة-التغليف. (ب) يظهر هذا الفريق صورة مجهرية fluorescence 25 ميكرومتر الباركود الرقمية قطرات تعامل مع وصمة عار حمض النووي. إنتاج قطرات تحتوي على شظايا الباركود تضخيم إشارة قوية الأسفار. (ج) يظهر هذا الفريق ميكروجيلس إعادة تغليف في 50 ميكرومتر قطرات. إغلاق التعبئة ميكروجيلس يسمح لتغليف معدلات تقترب من جل 1 كل قطره ماء مع قليل دوبليتس. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الشكل 5 : جهاز الاندماج مزدوجة موائع جزيئية لجينوم خلية واحدة المتوازية. عملية اندماج خطوتين أزواج قطرات الباركود مع الجينوم تاجمينتيد في الفائق. أولاً ولدت قطرات مزيج PCR ودمجها مع معالجة تجميعية باركود في المنطقة تظهر باللون الأصفر باستخدام أقطاب المياه المالحة. المقبل، عرض معالجة تجميعية تحتوي على ميكروجيل ودمجها لمرة ثانية في منطقة يظهر باللون الأحمر. مداخل النفط تسمح بمراقبة دقيقة للتباعد بين قطرات رينجيكتيد. قاعة إعادة الرمز الشريطي ونفطها مباعدة توضع على طبقة 25 ميكرومتر أقصر، مظللة باللون الأزرق. جميع ميزات الجهاز أخرى تنتمي إلى طبقة أكثر سمكا مع 45 ميكرومتر من الطول الإجمالي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
الرقم 6 : الباركود مجموعة مقاييس لمجتمع 10-الخلية الميكروبية اصطناعية. (أ) هذا الفريق ويبين توزيع الرمز الشريطي أحجام المجموعة. إنقاص عدد مجموعات ذات حجم معطى أضعافاً مضاعفة كما يزيد حجم المجموعة. حد أدنى من 7.5 كيلو بايت في الثانية الواحدة والمجموعة يحد من التحليل للمجموعات مع كمية كافية من المعلومات ويزيل تسلسل تحور PCR "يتامى". (ب) هذا الفريق ويبين توزيع الرمز الشريطي بورتيس المجموعة. الغالبية العظمى (> 90%) من المجموعات بدرجة نقاء عالية جداً (> 95%). (ج) يظهر هذا الفريق الوفرة النسبية للأنواع 10 تحسب على مستوى المجموعة القراءة والرمز الشريطي. 2 عد الأساليب نتائج مماثلة، مشيراً إلى أن أحجام المجموعة رمز شريطي تتسق عبر الأنواع. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 7
الشكل 7 : تجميع التغطية الجينوم من نجحت عصية المجموعات الباركود. على ما يلي من جميع المجموعات الباركود رسم الخرائط إلى بكتيريا نجحت (N = 9,398) هي تجميع وتحليل في مجموعها. خارطة تغطية تعميم يوضح توحيد التغطية من SiC seq على ما يلي، مع لا مناطق التسرب يمكن ملاحظتها. خط متقطع حول المحيط تشير إلى أن متوسط التغطية (5.55 x). ويبين الرسم البياني اقحم الترددات التغطية النسبية أن الجزء الأكبر من هذه القواعد مشمولة في عمق بالقرب المتوسط على نطاق الجينوم، ممثلة بخط متقطع. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الجهاز ارتفاع الطبقة الأولى (ميكرومتر) سرعة الدوران طبقة 1 (لفة في الدقيقة) ارتفاع الطبقة الثانية (ميكرومتر) سرعة الدوران الطبقة الثانية (لفة في الدقيقة)
دروبماكير تدفق المشارك 25 4000 N/A N/A
هلام انكابسولاتور إعادة 25 4000 N/A N/A
الدمج مزدوجة 25 4000 20 5000

الجدول 1: معلمات تصنيع الجهاز موائع جزيئية. يظهر هذا الجدول قائمة موائع جزيئية الأجهزة المستخدمة في سير العمل SiC seq على سرعات المطلوبة لزيادة ونقصان مقاوم الضوء طلاء (استناداً إلى مواصفات الشركة المصنعة ل 3025 سو-8).

التسمية تسلسل (5 '> 3')
بار جكاجكتجكجتاتاجكجاجتاكاتكتجكتكتجاتجككجكاتاجننننننننننننننتاجككاجككككجاكاكت
DNA_BAR كتجتكتكتاتاكاكاتكتككجاجكككاكجاجاكجتجتكجججكتجكتا
P7_BAR كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتكاجكتجكجتاتاجكج
P5_DNA آتجاتاكجكجاككاككجاجاتكتاكاكتكجتكجكاجكجتك
I7_READ جكككاكجاجاكجتجتكجججكتجكتا

الجدول 2: تسلسل التمهيدي.

ملف إضافي 1: اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

ملف إضافي 2: اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Discussion

سير العمل موائع جزيئية SiC seq تنتج بيانات تسلسل جينوم خلية واحدة من آلاف خلايا البكتيرية. الرموز الشريطية الرقمية تقسم على مورثات الخلايا مغلفة ميكروجيل تسمح deconvolution في السيليكون خ ع البيانات إلى مجموعات من يقرأ المراقب التي تنشأ من خلية واحدة. تجربة التحكم مع مجتمع الميكروبي لتكوين المعروفة أمر ضروري لتقييم نقاء المجموعات الباركود. جزء كبير من المجموعات المنخفضة-نقاء يشير إلى أن معدل تغليف خلية مرتفع للغاية، أو أن هناك التلوث عبر التجميعية الهامة التي تحدث أثناء خطوات المعالجة موائع جزيئية. وفقا لإحصاءات بواسون، ينبغي تغليف الرموز الشريطية والخلايا بنسبة مستهدفة من الجسيمات 1 لكل 10 قطرات الحد من معدل الأحداث تغليف متعددة إلى أقل من 5 في المائة من جميع قطرات غير فارغة. سعر تغليف أعلى من هذا يزيد معدلات doublets أضعافاً مضاعفة، حتى تحقق نسبة التغليف أثناء عملية دروبماكينج ذات أهمية حاسمة. ينبغي أن يكون المستخدمين الحذر خاصة لتغليف خلايا متعددة في ميكروجيل واحد لأنه لا يمكن أن يقرأ من خلايا مختلفة تقاسم نفس تسلسل الباركود بيوينفورماتيكالي مفصولة. في الحالة يتلقى تلك الخلية 1 2 الرموز الشريطية مختلفة، نقاء المجموعة رمز شريطي، لا تتأثر على الرغم من أن قياسات الوفرة هي منحرفة عند عد بتسلسل الباركود.

التلوث عبر الحبرية قد تنشأ أيضا بسبب ظروف الاندماج دون الحد الأمثل. أثناء عملية ناجحة، يمكن أن كنترولبلي زوج الجهاز الاندماج موائع جزيئية (الشكل 5) 1 الحبرية الباركود مع ميكروجيل 1 وحجم الكاشف PCR. سيؤدي إلى معدلات التدفق المثالي عدم معالجة تجميعية الأقران في نسب غير صحيحة: 1 الباركود يمكن أن يقترن ميكروجيلس 2، على سبيل المثال. المقصود أن تكون تقديرات معدلات تدفق جميع المدرجة في البروتوكول وقد تحتاج إلى تعديلها تبعاً لاختلافات طفيفة في أحجام التجميعية وهندسة الجهاز. المستخدمين الذين لديهم وصول للكاميرات مع قدرات تسجيل عالية السرعة (> إطارات 10,000/s) ينبغي التحقق من عملية الدمج الصحيح الحبرية في البداية وعلى مدى العملية موائع جزيئية. يمكن للمستخدمين دون الحصول على كاميرا عالية السرعة جمع كمية صغيرة من الإخراج المدمجة وقياس أحجام الحبرية تحت مجهر يدوياً. يجب أن يكون حجم الحبرية موحدة: فائض في الباركود غير مدمجة أو قطرات ميكروجيل يشير إلى أنه ينبغي خفض معدلات حقن تبعاً لذلك.

ينبغي اتخاذ عدة احتياطات عامة عند التعامل مع ميكروجيلس وميكرودروبليتس للحفاظ على سلامتهم. ميكروجيلس، على الرغم من أن قوي ميكانيكية، يجب أن يكون بما فيه الكفاية تبرد قبل كسر والغسيل خطوات لضمان جيلاتيون كاملة. ميكروجيلس عدم كروية هي إشارة إلى أن [اغروس] لا تعطي الوقت الكافي لترسيخ. عند غسل ميكروجيلس، تدور التعليق أسفل السرعات المطلوبة لتجنب خسارة المنتج. المائية [اغروس] إنكسار عن كثب مطابقة للمياه وقد يكون من الصعب على انظر في أنبوب22، حيث المستخدمين ينبغي أن تحدد بدقة الحدود هلام السائل قبل تطلع. قطرات الماء في النفط معرضة للتلاحم بحشد قوات ثابتة23 في مختبر القفازات وأنابيب. لهذا السبب، نوصي بتحميل الحقن حقن الحبرية بأيديهم العارية وعلاج كافة الأسطر مع بندقية مكافحة ساكنة قبل فتيلة مضخة حقن. يمكن إزالة قطرات كبيرة ملتئم بالتناوب المستحلبات في حقنه ببطء ويدويًا يسفط قطرات أكبر، التي تتراكم بالقرب من أعلى بسبب قوتها ازدهار أكبر.

Seq سيك هو أول تقنية لإظهار تسلسل جينوم خلية واحدة > 50,000 الخلايا البكتيرية. هذا البرنامج يوفر مزايا كبيرة في إنتاجية أكثر من النهج القائمة وتمكن أعمق لأخذ عينات من المجتمعات الميكروبية غير متجانسة. وحتى الآن استخدمت التكنولوجيات موائع جزيئية لتسلسل جينوم خلية واحدة ميكروتشامبيرس9 وميكروويلس24 لعزل الخلية والتضخيم، ولكن مع الوسيطة في نطاق فقط من عشرات إلى مئات خلايا. تدفق فرز الخلايا المفردة في ويلبلاتيس5،6 يتطلب لا الأجهزة المتخصصة موائع جزيئية ولكن يمتلك إنتاجية منخفضة على نحو مماثل. نظراً لأن عينات التربة والمياه من البيئة قد يشيع التنوعات ألفا > 1,000 في هذه الأنواع من المستوى25،26، SiC seq مفيد جداً بحكم قدرته على العينة عدد أكبر بكثير من الكائنات الحية. يكون سير العمل SiC seq قابلة للتكيف للمدخلات الخلية من مختبر الثقافة، والبيئة الطبيعية، أو مضيف معيشة. عينة خلية تحتاج فقط في وقف مائي وخالية من جزيئات كبيرة (> 10 ميكرون) تكون مناسبة لتغليف موائع جزيئية. على سبيل المثال، الأسلوب قد طبق سابقا على عينة من مياه البحر باستخدام سلسلة من المياه والصرف الصحي وتصفية خطوات لعملية ما قبل الخلايا قبل تغليف17.

البروتوكول SiC seq يولد كمية ضئيلة نسبيا من تسلسل البيانات من كل خلية مفردة، وقد لا تكون مناسبة لجميع التطبيقات. تتطلب بعض خوارزميات المعلوماتية الحيوية مثل الجمعية الجينوم حيثياته أو متغير واحد النوكليوتيدات (الهولندية) تطلق على أعماق تغطية أكبر للعمل بفعالية. بدلاً من ذلك، يمكن أن تكون مجموعات الرمز الشريطي متفاوت المسافات في السيليكون التصنيفية binning أساليب27 حيث أنه يمكن تطبيق الخوارزميات في مجموعات أكبر من ما يلي. يجوز كفاءة سير العمل SiC seq المتوازية الشاملة منخفضة نسبيا أيضا تحديات في الحالات التي يكون فيها توافر العينة الإدخال المنخفضة. Seq سيك ويعتمد على خطوة تغليف توزيع Poisson باركود، ولذلك تلقي رمز شريطي جزيئي حوالي 10% الخلايا وتتضخم خلال الخطوة إعداد مكتبة النهائي. بينما هذا يماثل الأخرى المستندة إلى ميكرودروبليت المتوازية مخططات10، المستخدمين الذين يعملون مع عينات الخلايا الثمينة قد يجدون صعوبة في تحقيق العائد مكتبة كافية للتسلسل وقد تحتاج إلى زيادة عدد دورات PCR في النهائي الخطوة التضخيم. حل محتمل آخر للمستخدمين ذوي الخبرة موائع جزيئية لفرز قطرات الباركود إيجابية بعد الخطوة PCR الرقمية، مما يجعل كفاءة المتوازية الشاملة > 85%28.

اتجاه مستقبل محتمل للتكنولوجيا SiC seq هو تكييف سير العمل للاستخدام مع خلايا الثدييات، مما يمهد الطريق للجديد من الدراسات السريرية في خلية واحدة. على سبيل مثال، خلايا تحليل التباين رقم نسخة بين السرطان واحد أيار زيادة فهمنا لدور عدم التجانس في أمراض السرطان2. وبدلاً من ذلك، سيمكن دمج SiC seq مع الأساليب القائمة التحقيق وإثراء تسلسل الحمض النووي لفائدة29 تسلسل وحيدة الخلية المستهدفة من الفئات السكانية الفرعية أو السلالات النادرة من الخلايا. مع العينات البيئية، يمكن استهداف الجينات من ضمن مسار التمثيل الغذائي معروفة وتحليلها سياقياً جنبا إلى جنب مع جينات للتعرف على رواية المجينية الجزر المجاورة. من داخل بيئة الإنسان مضيف، عينات عيار منخفض البكتيريا المسببة للأمراض يمكن أن تكون معزولة ومتسلسلة على مستوى خلية واحدة لدراسة المزيد عن كثب أصولهم أوضح من ضراوة.

Disclosures

براءات الاختراع المتعلقة بسير العمل هذا قد تكون مرخصة "البعثة السيرة الذاتية"، أباتي ر آدم الذي هو أحد المساهمين.

Acknowledgments

هذا العمل كان تدعمها "المؤسسة الوطنية للعلوم" من خلال جائزة مهنة (رقم المنحة DBI 1253293)؛ المعاهد الوطنية للصحة (NIH) (أرقام المنح HG007233-01، R01-EB019453-01، 1R21HG007233، DP2-AR068129-01، R01-HG008978)؛ و "الدفاع المتقدم البحث مشاريع الوكالة يعيشون المسابك البرنامج" (العقد رقم HR0011-12-ج-0065، N66001-12-ج-4211، HR0011-12-ج-0066).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3" silicon wafers, P type, virgin test grade University Wafers 447
SU-8 3025 photoresist Microchem 17030192
Spin coater Specialty Coating Systems G3P-8
Photomasks CadArt Servcies (custom) See Supplemental Files for mask designs
PGMEA developer Sigma-Aldrich 484431
Isopropanol Sigma-Aldrich 109827
Sylgard 184 silicone elastomer kit Krayden 4019862
Degassing chamber Bel-Art 42025
0.75 mm biopsy punch World Precision Instruments 504529
Glass microscope slides (75 mm x 50 mm) Corning 294775X50
Aquapel (hydrophobic glass treatment) Pittsburgh Glass Works 47100
PE-2 polyethylene tubing Scientific Commodities B31695-PE/2
1 mL syringes BD 309628
27 gauge needles BD 305109
Syringe pump New Era Pump Systems NE-501
Novec HFE-7500 fluorinated oil (HFE) 3M 98-0212-2928-5
FC-40 fluorinated oil Sigma-Aldrich F9755
PEG-PFPE surfactant Ran Biotechnologies 008-FluoroSurfactant
Space heater Lasko  CD09250 
Agarose, low gelling temperature Sigma-Aldrich a9414
TE (10X) Rockland mb-007
PBS 1X, pH 7.4 E&K Scientific Products EK-65083
OptiPrep (density gradient medium) Sigma-Aldrich d1556
1H,1H,2H-Perfluoro-1-Octanol (PFO) Sigma-Aldrich 370533
Span 80 (sorbitane monooleate) Sigma-Aldrich s6760
Hexane Sigma-Aldrich 139386
Tween 20 (polysorbate 20) Sigma-Aldrich p2287
Lysozyme Type IV MP Biomedicals 195303
Mutanolysin Sigma-Aldrich M9901
Zymolyase (yeast lytic enzyme) Zymo Research e1004
Lysostaphin Sigma-Aldrich L7386
Sodium chloride Sigma-Aldrich S9888
EDTA Sigma-Aldrich E6758
Tris-HCl, pH 7.5, 1M Invitrogen 15567-027
Dithiothreitol (DTT) Teknova d9750
Lithium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich L9781
Proteinase K New England Biosciences P8107S
Ethanol, 200 Proof (100%) Koptec V1001
SYBR Green I (nucleic acid stain) Invitrogen S7563
PEG 6k Sigma-Aldrich 81260
Triton X-100 (octylphenol ethoxylate) Sigma-Aldrich t8787
Nextera DNA Library Prep Kit Illumina FC-121-1030
Phusion Hot Start Flex Master Mix (High-Fidelity Hot Start Master Mix) New England Biosciences m05365
Platinum Multiplex PCR Master Mix (Taq Master Mix) Applied Biosystems 4464263
Warmstart 2.0 Bst Polymerase (isothermal polymerase) New England Biosciences m0538m
NT buffer from Nextera XT kit (neutralization buffer) Illumina FC-131-1024
Cold cathode fluorescent inverter (custom) (custom)
DC power supply Mastech HY1503D
Zerostat 3 anti-static gun Milty 5036694022153
3D-printed centrifuge syringe holder (custom) (custom) See Supplemental Files for 3D print file
Zymo DNA Clean & Concentrator-5 Zymo Research D4003

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Navin, N., et al. Tumour evolution inferred by single-cell sequencing. Nature. 472 (7341), 90-94 (2011).
  2. Ni, X., et al. Reproducible copy number variation patterns among single circulating tumor cells of lung cancer patients. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 21083-21088 (2013).
  3. Schmidt, H., Hensel, M. Pathogenicity islands in bacterial pathogenesis. Clinical Microbiology Reviews. 17, 14-56 (2004).
  4. Martínez, J. L., Baquero, F. Interactions among strategies associated with bacterial infection: pathogenicity epidemicity, and antibiotic resistance. Clinical Microbiology Reviews. 15 (4), 647-679 (2002).
  5. Rinke, C., et al. Obtaining genomes from uncultivated environmental microorganisms using FACS-based single-cell genomics. Nature Protocols. 9 (5), 1038-1048 (2014).
  6. Rinke, C., et al. Insights into the phylogeny and coding potential of microbial dark matter. Nature. 499 (7459), 431-437 (2013).
  7. Zhang, H., Liu, K. K. Optical tweezers for single cells. Journal of the Royal Society Interface. 5 (24), 671-690 (2008).
  8. Xu, L., Brito, I. L., Alm, E. J., Blainey, P. C. Virtual microfluidics for digital quantification and single-cell sequencing. Nature Methods. 13 (9), 759-762 (2016).
  9. Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. Dissecting the clonal origins of childhood acute lymphoblastic leukemia by single-cell genomics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (50), 17947-17952 (2014).
  10. Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  11. Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
  12. Rotem, A., et al. High-throughput single-cell labeling (Hi-SCL) for RNA-Seq using drop-based microfluidics. PLoS One. 10 (5), 1-14 (2015).
  13. Amini, S., et al. Haplotype-resolved whole-genome sequencing by contiguity-preserving transposition and combinatorial indexing. Nature Reviews Genetics. 46 (12), 1343-1349 (2014).
  14. Zheng, G. X. Y., et al. Haplotyping germline and cancer genomes with high-throughput linked-read sequencing. Nature Biotechnology. 34 (3), 303-311 (2016).
  15. Lan, F., Haliburton, J. R., Yuan, A., Abate, A. R. Droplet barcoding for massively parallel single-molecule deep sequencing. Nature Communications. 7, 11784 (2016).
  16. Rotem, A., et al. Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state. Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).
  17. Lan, F., Demaree, B., Ahmed, N., Abate, A. R. Single-cell genome sequencing at ultra-high-throughput with microfluidic droplet barcoding. Nature Biotechnology. 35 (7), 640-646 (2017).
  18. Novak, R., et al. Single-cell multiplex gene detection and sequencing with microfluidically generated agarose emulsions. Angewandte Chemie Internation Edition. 50 (2), 390-395 (2011).
  19. Gill, C., Van De Wijgert, J. H. H. M., Blow, F., Darby, A. C. Evaluation of lysis methods for the extraction of bacterial DNA for analysis of the vaginal microbiota. PLoS One. 11 (9), 1-16 (2016).
  20. Picelli, S., et al. Tn5 transposase and tagmentation procedures for massively scaled sequencing projects. Genome Research. 24 (12), 2033-2040 (2014).
  21. Abate, A. R., Chen, C. H., Agresti, J. J., Weitz, D. A. Beating Poisson encapsulation statistics using close-packed ordering. Lab on a Chip. 9 (18), 2628 (2009).
  22. Jain, A., Yang, A. H. J., Erickson, D. Gel-based optical waveguides with live cell encapsulation and integrated microfluidics. Optic Letters. 37 (9), 1472 (2012).
  23. Karbaschi, M., Shahi, P., Abate, A. R. Rapid chemical-free breaking of microfluidic emulsions with a hand-held antistatic gun. Biomicrofluidics. 11 (4), 1-6 (2017).
  24. Gole, J., et al. Massively parallel polymerase cloning and genome sequencing of single cells using nanoliter microwells. Nature Biotechnology. 31 (12), 1126-1132 (2013).
  25. Chao, Y., et al. Metagenomic analysis reveals significant changes of microbial compositions and protective functions during drinking water treatment. Scientific Reports. 3 (1), 3550 (2013).
  26. Fierer, N., et al. Cross-biome metagenomic analyses of soil microbial communities and their functional attributes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (52), 21390-21395 (2012).
  27. Mande, S. S., Mohammed, M. H., Ghosh, T. S. Classification of metagenomic sequences: methods and challenges. Briefings in Bioinformatics. 13 (6), 669-681 (2012).
  28. Eastburn, D. J., et al. Microfluidic droplet enrichment for targeted sequencing. Nucleic Acids Research. 43 (13), e86 (2015).
  29. Clark, I. C., Abate, A. R. Finding a helix in a haystack: nucleic acid cytometry with droplet microfluidics. Lab on a Chip. 17 (12), 2032-2045 (2017).

Tags

الهندسة الحيوية، 135 قضية، ميكروفلويديكس، ميكرودروبليتس، الجينوميات خلية واحدة، ميتاجينوميكس، تسلسل الجيل القادم، المتوازية الجزيئية
منصة موائع جزيئية أولتراهيغ الإنتاجية لتسلسل جينوم خلية واحدة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Demaree, B., Weisgerber, D., Lan,… More

Demaree, B., Weisgerber, D., Lan, F., Abate, A. R. An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing. J. Vis. Exp. (135), e57598, doi:10.3791/57598 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter