Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Een met-throughput Microfluidic Platform voor eencellige genoom Sequencing

Published: May 23, 2018 doi: 10.3791/57598
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2, 1,2,3
1Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, California Institute for Quantitative Biosciences, University of California, San Francisco, 2UC Berkeley-UCSF Graduate Program in Bioengineering, University of California, San Francisco, 3Chan Zuckerberg Biohub

Summary

Eencellige sequencing blijkt genotypische heterogeniteit in biologische systemen, maar de huidige technologieën ontbreken de doorvoer die nodig zijn voor de diepe profilering van communautaire samenstelling en functie. Hier beschrijven we een microfluidic workflow voor het rangschikken > 50.000 eencellige genomen uit verschillende cel populaties.

Abstract

Sequencing technologieën hebben ondergaan een paradigmaverschuiving van bulk naar eencellige resolutie naar aanleiding van een evoluerend begrip van de rol van cellulaire heterogeniteit in biologische systemen. Eencellige sequentiebepaling van grote populaties heeft echter belemmerd door beperkingen in verwerkt genoom voor het rangschikken. In deze paper beschrijven we een methode voor eencellige genoom sequencing (SiC-seq), die gebruik maakt van druppel microfluidics te isoleren, te versterken en barcode het genoom van afzonderlijke cellen. Cel inkapseling in microgels staat de verzuilde zuivering en de tagmentation van DNA, terwijl een fusie microfluidic efficiënt elke genoom met een unieke eencellige oligonucleotide barcode paren, waardoor > 50.000 afzonderlijke cellen te worden sequenced per run. De gegevens rangschikken is door barcode, genereren van groepen die afkomstig zijn van afzonderlijke cellen leest demultiplexed. Als een hoge-doorvoer en lage-bias methode van eencellige sequencing kunnen SiC-seq een breder scala van genomic studies gericht op verschillende cel populaties.

Introduction

Het genoom dient als een blauwdruk van cellulaire identiteit en functie, met het geheel van een organisme is potentieel codering. Een goed begrip van cellulaire biologie op het niveau van het genoom kan verklaren de waargenomen fenotypische verscheidenheid binnen heterogene cel populaties. Deze heterogeniteit is herkenbaar in biologische systemen en heeft brede implicaties voor de menselijke gezondheid en ziekte. Bijvoorbeeld, zijn exemplaar nummer variaties van het gen onder tumorcellen gekoppeld aan de evolutie en de verspreiding van kanker1,2. In bacteriële infecties, pathogeniteit eilanden aanwezig zijn in een klein deel van het genoom horizontaal kunnen worden overgedragen en leiden tot de verspreiding van antibiotica-resistente bacteriën3,4. Een primaire uitdaging in het genoom eencellige niveau studeren is de lage hoeveelheden DNA beschikbaar, evenals de noodzaak om te analyseren van duizenden cellen om te proeven van de volledige diversiteit van genotypen. Om deze redenen hebben beperkingen in experimentele doorvoer belemmerd de effectiviteit van eencellige studies, vertekenende resultaten naar de meest voorkomende cellen. Eencellige isolatie technieken zoals stroom sorteren5,6, optisch pincet7, verankering in bulk gels8, en microfluidics9 oplossingen kunnen verwerken van honderden cellen voor het rangschikken; Dit is echter slechts een klein deel van de meeste monsters. Een methode voor eencellige genoom sequencing met aanzienlijk hogere doorvoer zou dieper en meer volledig profilering van cel populaties, waardoor het ophelderen van de rol van de genotypische verscheidenheid binnen deze Gemeenschappen.

Druppel microfluidics kunt de manipulatie van de high-throughput van cellen en biologische reagentia binnen miljoenen picoliter-schaal reactoren. Tot op heden, microdroplet technologieën zijn gebruikt voor het bestuderen van differentiële expressiepatronen onder cellen van heterogene weefsels10,11,12, diep volgnummer lange moleculen13,14 ,15, en gedrag chromatine immunoprecipitation sequencing (ChiP-seq) analyses over de afzonderlijke cellen16. Inderdaad, microdruppels zijn geschikt voor high-throughput, verzuilde operaties, waardoor ze zich lenen voor toepassingen in de eencellige genomica. De ontwikkeling van deze technologie presenteert haar eigen unieke technologische uitdagingen, echter. Cellen moeten worden lysed, gezuiverd en versterkt met minimale bias, uniform monster cel populaties. Bovendien, in tegenstelling tot polyadenylated mRNA afschriften in zoogdiercellen is er geen vergelijkbare moleculaire motief in het genoom ter vergemakkelijking van de opname van het doel nucleic zuur. Eencellige genoom sequencing is al deze redenen moeilijk uit te voeren in microdroplet platformen.

In dit werk bieden wij een gedetailleerd protocol van onze eerder gemelde eencellige microfluidic aanpak staat rangschikkend het genoom van tientallen duizenden van cellen in een enkele experiment17. Met deze technologie, genaamd SiC-seq, bacteriële cellen zijn ingekapseld in micron-schaal hydrogels individueel lysed, tagmented, en samengevoegd met een microdroplet met een unieke oligonucleotide barcode, die is verbinding aan de randen aan de genomic DNA van de cel via een één overlapping extensie polymerase-kettingreactie (PCR). De hydrogels dienen als geïsoleerde containers waarin hoog-moleculair-gewicht genomic DNA is sterically ingekapseld, waardoor kleinere moleculen zoals detergenten en lytische enzymen te openen en te zuiveren van DNA vóór barcoding18. Dit protocol verwerkt > 50.000 afzonderlijke cellen in een kwestie van uren, wat resulteert in een barcoded bibliotheek klaar voor het rangschikken. Na de sequencing zijn de leest demultiplexed volgens hun eencellige barcode volgorde, wat resulteert in een dataset bestaat uit miljoenen leest, elk met een cellulaire index.

Protocol

1. Microfluidic apparaat Fabrication

  1. Bereiden van het microfluidic masker ontwerpen met behulp van computer aided design (CAD) software (geleverd als. DWG; Zie Aanvullende bestanden). Hebben deze ontwerpen gedrukt door de leverancier met een resolutie van 10 µm op een Printplaat film.
    Opmerking: Voor multi-gelaagde microfluidic apparaten bevatten de overeenkomstige maskers uitlijning merken.
  2. Voor elk apparaat de SU-8 meester mal (figuur 1A) als volgt te fabriceren.
    1. Bereid een 3 - in diameter silicium wafer door gieten ongeveer 1 mL van SU-8 3025 fotoresist in het midden van het zegel. Beveilig het zegel op de spin-coater chuck door zuigkracht toe te passen.
    2. Zie tabel 1 voor een overzicht van de laagdiktes en snelheden voor elk apparaat draaien. Voor alle apparaten, beginnen de spin coating met 30 s bij 500 rpm, gevolgd door 30 s bij de aangegeven snelheid.
    3. Verwijder de SU-8-silicium wafer uit de spin coater en zachte bak het op een kookplaat ingesteld op 135 ° C gedurende 30 min. toestaan de wafer afkoelen tot kamertemperatuur na het bakken.
    4. Bloot de SU-8-silicium wafer met het masker van de juiste microfluidic onder een collimated 190-mW, 365 nm UV LED gedurende 3 minuten.
    5. Na de blootstelling, bak hard het zegel op een kookplaat ingesteld op 135 ° C gedurende 1 minuut. Na deze bakken stap, toestaan de wafer afkoelen tot kamertemperatuur.
    6. Voor een single-gelaagde microfluidic apparaat, gaat u naar stap 1.2.7. Voor een multi-gelaagde microfluidic apparaat, herhaalt u stap 1.2.1 - 1.2.5 voor de tweede laag van de fotoresist (figuur 1B).
    7. Na de eerste vaste bakken voor een enkellaags apparaat (of de tweede harde bak voor een multi-gelaagde apparaat), het zegel te ontwikkelen door het onder te dompelen in een bad van propyleenglycol monomethylether ether acetaat (PGMEA) voor 30 min.
    8. Gebruik na het zegel van de ontwikkeling, een spuit fles met PGMEA te spoelen de wafer. Spoel de wafer met een spuit fles met isopropanol alvorens het te plaatsen op een kookplaat 135 ° C voor 1 min te drogen.
    9. Plaats de wafer (voortaan aangeduid als de meester) in een petrischaal voor het gieten met Polydimethylsiloxaan (PDMS).
  3. Met de kapitein bereid in stap 1.2, gaat u verder met het uitvoeren van de fabricage van apparaat met een PDMS gieten.
    1. Bereiden de PDMS door het combineren van een siliconen basis met een uithardende agent in een 11:1-verhouding van de massa. Meng de silicone base en genezen agent met de hand met een roer stokje.
    2. Ontgas het PDMS door het plaatsen van het in een ontgassen kamer en het toepassen van een vacuüm. Toestaan dat de PDMS aan ontgas totdat luchtbellen niet langer zichtbaar zijn (meestal 30 min).
    3. Zorgvuldig giet de ontgaste PDMS de kapitein, een definitieve PDMS-laagdikte van ongeveer 5 mm. Degas het PDMS opnieuw om het verwijderen van alle luchtbellen.
    4. Na de ontgassing, bak de PDMS en de master bij 80 ° C gedurende 80 min.
    5. Zorgvuldig accijnzen de uitgeharde PDMS plaat van de gebakken meester met behulp van een scheermesje. Ervoor zorgen dat alle bezuinigingen op de top van de silicium wafer.
      Opmerking: Bezuinigingen uit de silicium wafer kunnen resulteren in een lip voorkomen een uniforme hechting.
    6. De inhammen en verkooppunten met behulp van een 0,75 mm biopsy punch Punch. Verwijder alle stof en losse PDMS met behulp van een verpakkingstape aan de kant van de functie van het apparaat.
    7. Voorafgaand aan plasma behandeling van het apparaat, maakt u schoon een glasplaatje 50 x 75 mm het spoelen met isopropanol en drogen.
    8. Voor de behandeling van plasma, plaatst u de PDMS slab en glas dia in het plasma bonder met de functies naar boven. De plasma behandeling met behulp van 1 mbar O2 plasma voor 1 min. Bond het apparaat aan het glas schuif doordat de blootgestelde, of trotseren, samen zijden uitvoeren.
    9. Na de behandeling van plasma, bak het apparaat bij 80 ° C voor 40 min.
    10. Ten slotte, injecteren glas oppervlaktebehandeling vloeistof in een van de inhammen te maken van de microfluidic kanalen hydrofobe. Controleer alle kanalen zijn volledig overstroomd met de oplossing en de injectie te herhalen voor elke dropmaker. Bak de behandelde apparaat bij 80 ° C gedurende 10 min te verdampen van teveel oplosmiddel.

2. de inkapseling van de cellen in de Agarose Microgels

Opmerking: Zie figuur 2A.

  1. Bereiden 1 mL 3% w/v laag-smelten temperatuur agarose in 1 x Tris-EDTA (TE) buffer. Bewaar de agarose-oplossing op een 90 ° C warmte blok tot op het ogenblik de spuit laden.
  2. Voorbereiden van de celsuspensie.
    Opmerking: Dit protocol en de bijbehorende microfluidic apparaten zijn gevalideerd om te werken met bacteriële cellen, hetzij uit een voorraad van de bevroren of vers preparaat. Cellen van zoogdieren, afhankelijk van het celtype, mogelijk een aanpassing van de microfluidic kanaal afmetingen geschikt voor de grotere maten van de cel.
    1. Resuspendeer de cellen in 1 mL-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
    2. De cellen in een hemocytometer of door te stromen sorteren te tellen. Voorbereiden voor 25 µm microgels met een streefpercentage voor het inkapselen van cel 1: 10, 1 mL celsuspensie op een eindconcentratie van 2.4 x 107 cellen/mL.
    3. Draai de cellen naar beneden bij 3000 x g gedurende 3 min. Aspirate het supernatant en resuspendeer de cel pellet in 1 mL van 17% v/v dichtheid kleurovergang medium (Zie Tabel van materialen) in PBS. Houd het op het ijs tot het laden van de spuit.
  3. Laden van een 3-mL injectiespuit met gefluoreerde olie (HFE) met een 2% w/w Perfluorpolyether-polyethyleen glycol (PFPE-PEG) oppervlakteactieve stof past met een 27 G naald en leg deze in een spuitpomp.
    Opmerking: Passen alle spuiten met een 27 G naald voor de microfluidic stappen in dit protocol. Om het risico van accidentele prikken, houd u caps op alle naalden totdat de werking van de pomp begint.
  4. Laden van de celsuspensie en gesmolten agarose in 1 mL spuiten, beide met 27-gauge naalden passen en plaats deze in injectiespuit pompen.
  5. Houd de agarose spuit en de pomp warm met een kleine kachel om te voorkomen dat de agarose gelerend in de spuit en de inlaat buizen. De kachel op hoog ingesteld en plaats het zo dat de verwarming oppervlak ongeveer 10 cm van de spuit is. Zorgen dat de temperatuur gemeten op de spuit ongeveer 80 ° C. is
    Opmerking: Gebruikers worden geadviseerd om de kachel op de aanbevolen afstand van de pompen toestel niet blootstellen aan het risico van schade aan apparatuur, inclusief smelten van de buis.
  6. Genereren van 25 µm microgel druppels met behulp van het co stroom dropmaking apparaat.
    Opmerking: Zie figuur 3A voor een apparaat schematische met vermelding van de locatie van het reagens inhammen en uitlaat.
    1. De spuit naalden verbinden met het microfluidic apparaat inhammen met stukjes polyethyleen (PE) slang. Prime voordat u invoegt de buizen in het apparaat, de pompen om de lucht te verwijderen uit de lijn.
    2. Een stukje buis sluit aan op de wandcontactdoos en plaats het vrije uiteinde in een tube van 15 mL collectie.
    3. Gebruik de volgende (aanbevolen) debiet voor dropmaking: 800 µL/h voor de HFE 2% w/w PFPE-PEG; 200 µL/h voor de celsuspensie in PBS; en 200 µL/h voor de 3% w/v agar.
  7. Na de dropmaking, plaats u de collectie buis bij 4 ° C gedurende 30 minuten om ervoor te zorgen de volledige gelering van het agarose.

3. breken en wassen van het Agarose-Microgels

  1. Verwijder de onderste laag van olie uit de collectie buis met behulp van een 3 mL spuit uitgerust met een naald van 20 G, niet te storen van de bovenste laag van de druppels agarose verzorgen.
  2. Breken de emulsies met perfluorooctanol (PFO).
    1. 1 mL 10% v/v PFO in HFE aan de agarose druppels toevoegen. Pipetteer deze oplossing op en neer voor 1 min grondig jas de emulsies.
      Opmerking: Voor alle de microgel wassen stappen, Pipetteer de oplossingen met een 1.000 µL-tip. De schorsing van de microgel moet verschijnen homogeen en vrij van klontjes na het pipetteren.
    2. Draai de conische buis bij 2.000 x g gedurende 1 minuut voor het verzamelen van het agarose microgels. Verwijder het supernatant PFO/HFE door aspiratie; de microgels zijn nu vrij van hun oppervlakteactieve stof laag en duidelijk zal verschijnen.
  3. De microgels met een oppervlakteactieve stof wassen in hexaan.
    Let op: Hexaan is een vluchtige organische oplosmiddelen, en het wassen in stap 3.3 moet plaatsvinden in een zuurkast.
    1. Voeg toe 2 mL 1% v/v Sorbitaan Propyleenglycolmonooleaat nonionic oppervlakteactieve stof (Zie Tabel van materialen) in hexaan aan de agarose microgels. Pipetteer op en neer 10 x te mengen, zorgen voor het complete uiteenvallen van de microgel pellet.
    2. Draai de buis bij 1.000 x g gedurende 1 minuut voor het verzamelen van de microgels. De bovendrijvende substantie als u wilt verwijderen van de oppervlakteactieve stof/hexaan-oplossing gecombineerd.
    3. Herhaal de oppervlakteactieve stof/hexaan wassen.
  4. De microgels in een waterige buffer te verwijderen van alle resterende oplosmiddel te wassen.
    1. Voeg 5 mL TET buffer [0,1% v/v octylfenol ethoxylaat nonionic wasmiddel (Zie Tabel van materialen) in 1 x TE] aan de conische buis. Pipetteer op en neer 10 x te mengen.
    2. Draai de conische buis bij 2.000 x g gedurende 2 min voor het verzamelen van de microgels. De bovendrijvende substantie als u wilt verwijderen van de TET buffer gecombineerd.
    3. Herhaal de TET wassen 2 x.
    4. Voeg 5 mL 1 x TE buffer aan de conische buis. Pipetteer op en neer 10 x te mengen.
    5. Draai de conische buis bij 2.000 x g gedurende 2 min voor het verzamelen van de microgels. Gecombineerd het supernatant om de buffer TE verwijderen.
    6. Herhaal het TE wassen.
  5. Controleer of de inkapseling van de cel in de microgels onder een microscoop bij een 400 X vergroting door kleuring van een hoeveelheid van 10 µL van gelen met 1 x nucleïnezuur vlek (Zie Tabel van materialen).
    Opmerking: Microgels verschijnt duidelijk onder het transparant kanaal terwijl cel die DNA onder het GFP-kanaal (497/520 nm excitatie/emissie golflengten fluoresceren). Een overlay van transparante en fluorescerende kanalen zal wijzen naar de cellen in de microgels zoals aangegeven in figuur 4A.

4. lysis van cellen in de Agarose via lytische enzymen

  1. Bereiden 1 mL van een cocktail met behulp van 800 µL van TE buffer (1 x), 2 µL van gist lytische enzym (5 U/µL stock, 10 U/mL definitief), 30 µL van dithiothreitol (1 M voorraad, 30 mM definitieve) 60 mg lysozyme (gelyofiliseerd poeder), 15 µL van EDTA (0.5 M voorraad lytische enzym 7.5 mM definitieve), 2 µL van mutanolysin (100 U/µL stock, 200 laatste U/mL), 2 µL van lysostaphin (10 U/µL stock, 20 U/mL final) en 30 µL van NaCl (1 M stock, 30 mM definitieve).
  2. Voeg extra TE om het volume aan 1 mL. Meng de oplossing door vortexing.
  3. De gehele 1 mL van de oplossing lytische enzym aan niet meer dan 1 mL van de gewassen microgels toevoegen. Meng door pipetting 10 x. Incubeer het mengsel bij 37 ° C gedurende > 2 h in een shaker (het maximum is overnachting incubatie).

5. wasmiddel gebaseerde Microgel behandeling

  1. Wassen na de lysis via lytische enzymen (stap 4), de microgels.
    1. Spin down de microgels bij 2.000 x g gedurende 2 min en het supernatant gecombineerd. De druppels verschijnt ondoorzichtig wit als gevolg van cel puin verspreid in de pellet.
    2. Resuspendeer de microgels in 5 mL van 10 mM Tris-HCl buffer en Pipetteer op en neer 10 x te mengen.
    3. Draai van het mengsel naar beneden bij 2.000 x g gedurende 2 min en deze vervolgens verwijdert het supernatant door aspiratie.
  2. Voer een wasmiddel behandeling op de microgels.
    1. Resuspendeer de gels in een lithium dodecyl sulfaat (deksels) lysis-buffermengsel (0,5% w/v deksels in 20 mM Tris-HCl) en 60 µL van het EDTA 0.5 M tot een eindvolume van 3 mL.
    2. Voeg 5 µL van een enzym proteïnase K (800 U/mL stockoplossing). Pipetteer op en neer 10 x te mengen, incubeer vervolgens het mengsel bij 42 ° C op een warmte blok voor 1 h solubilize van de celmembranen en de eiwitten te verteren.
  3. Wassen na het wasmiddel behandeling, de microgels.
    1. Draai de conische buis met de microgels naar beneden bij 2.000 x g gedurende 2 min. verwijderen het supernatant door aspiratie.
    2. De microgels met 10 mL 2% v/v Polysorbaat 20 in water wassen. Pipetteer op en neer 10 x te mengen.
    3. Draai de conische buis naar beneden bij 2.000 x g gedurende 2 min en deze vervolgens verwijdert het supernatant door aspiratie.
    4. Wassen van de microgels met 10 mL voor 100% ethanol tot de inactivering van eventuele resterende enzym. Pipetteer op en neer 10 x te mengen.
    5. Draai de conische buis naar beneden bij 2.000 x g gedurende 2 min en deze vervolgens verwijdert het supernatant door aspiratie.
    6. De microgels met 10 mL van 0,02% v/v Polysorbaat 20 in water wassen. Pipetteer op en neer 10 x te mengen.
    7. Draai de conische buis naar beneden bij 2.000 x g gedurende 2 min en deze vervolgens verwijdert het supernatant door aspiratie.
    8. Herhaal de Polysorbaat 20 wassen 3 x. Laat de oplossing door een 100-µm cel zeef voorafgaand aan de laatste wassen om eventuele grote bosjes.
  4. Resuspendeer de microgels in 5 mL 10 mM Tris-HCl buffer om te voorkomen dat de aantasting van het DNA. De microgels kunnen bij 4 ° C worden bewaard voor maximaal 1 week vóór de tagmentation (stap 7).

6. het genereren van Barcode druppeltjes door digitale PCR

  1. Een 500-pM voorraad van BAR primer (tabel 2) in een 1 x TE buffer in een lage-bind buis bereiden. Vóór elk gebruik, Verdun de primer een werken-voorraad 1 pM en verwarmen tot 70 ° C voor 1 min op een warmte-blok.
  2. Bereiden van een 150-µL PCR reactie mix met behulp van 75 µL van HiFi-warme start meester mix (Zie Tabel van materialen) (2 x), 42 µL van het PCR-grade water, 3 µL DNA_BAR primer (10 µM voorraad, 0,2 µM finale), 3 µL P7_BAR primer (10 µM voorraad 0,2 µM definitief), 6 µL van barcode verdunning (1 pM voorraad, 40 fM finale), 6 µL van Polysorbaat 20 (50% (v/v): voorraad, 2% laatste) en 15 µL van PEG 6 k (50% w/v voorraad, 5% laatste). Meng door pipetteren op en neer 10 x.
  3. Bereiden van een HFE-backed spuit door te tekenen van 200 µL van HFE olie in een spuit en passen met een naald. Een sectie van de PE buis hechten aan de naald en de regel met de hand prime. Steek het uiteinde van de PE-buis in de target-oplossing en zorgvuldig trekken alle 150 µL van het PCR-mix in de PE slang en spuiten. De spuit in een spuitpomp laden.
  4. Laden van een spuit van 1 mL met gefluoreerde olie (HFE) met een 2% w/w Perfluorpolyether-polyethyleen glycol (PFPE-PEG) oppervlakteactieve stof past met een naald en leg deze in een spuitpomp.
  5. Genereren van 25 µm barcode druppels met behulp van het co stroom dropmaking apparaat.
    Opmerking: Zie figuur 3A voor een apparaat schematische met vermelding van de locatie van het reagens inhammen en uitlaat.
    1. Sluit de inlaat van de cellen van een co stroom dropmaker apparaat met een klein stukje lood soldeer.
    2. Sluit de spuiten geladen met HFE en PCR mix aan het microfluidic apparaat inhammen met stukjes PE buis, met behulp van de Gesmolten Agarose inlaat voor de streepjescode PCR-mix. Prime voordat u invoegt de buizen in het apparaat, de pompen om de lucht te verwijderen uit de lijn.
    3. Een stukje buis sluit aan op de wandcontactdoos en plaats het vrije uiteinde in een tube van 0,2 mL PCR. Gebruik de volgende (aanbevolen) debiet voor dropmaking: 600 µL/h voor de HFE 2% w/w PFPE-PEG en 200 µL/h voor de PCR-mix. De druppels in de PCR-buizen met ongeveer 50 µL druppels in elke buis te verzamelen.
  6. Na de dropmaking, zorgvuldig verwijderen van de onderste laag van HFE olie uit de emulsies met behulp van gel-laden Pipetteer tips en FC-40 gefluoreerde olie met een 5% w/w PFPE-PEG oppervlakteactieve stof te vervangen. Thermische cyclus met het volgende protocol: 98 ° C gedurende 3 minuten, 40 x van (98 ° C gedurende 10 s, 62 ° C gedurende 20 s, 72 ° C gedurende 20 s), 72 ° C gedurende 5 minuten en houdt ingedrukt bij 12 ° C.
    Opmerking: De druppels thermische-en weer aangezet kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C voor maximaal 1 dag.
  7. Controleer of de streepjescode versterking en inkapseling tarief.
    1. Bereiden van een nucleïnezuur 1 x vlek (Zie Tabel van materialen) in HFE met 2% w/w PFPE-PEG oppervlakteactieve stof; de vlek is marginaal mengbaar in HFE en wordt gebonden aan het DNA in de druppels.
    2. Voeg 1 µL van thermisch-fietste barcode emulsie aan 10 µL van kleuring olie. Laat ze gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur inwerken.
    3. Beeld van druppeltjes door fluorescent microscopie (GFP kanaal, 497/520 nm excitatie/emissie golflengten) bij een 200 X vergroting en de barcode inkapseling tarief rekenen. Merk op dat het signaal discrete zijn zal: de druppels met versterkte barcodes fluoresceren helder, terwijl de lege druppels donkere verschijnt (figuur 4B).

7. Tagmentation van Genomic DNA in druppels

Opmerking: Zie figuur 2B.

  1. Bereiden van 500 µL van tagmentation oplossing met behulp van reagentia van de voorbereiding van een volgende generatie sequencing bibliotheek kit (Zie Tabel van materialen). 7 µL van tagmentation enzym, 250 µL van tagmentation buffer en 243 µL van het PCR-grade water gebruiken. Meng ze door vortexing en draai het mengsel naar beneden om te verzamelen. Laad deze oplossing in een HFE olie-backed 1 mL spuit en passen met een naald.
  2. De microgels voorbereiden op de herinjectie.
    1. Draai naar beneden de buis van de microgel gedurende 2 minuten bij 2.000 x g en het supernatant gecombineerd. Breng 200 µL van gelen naar de top van een HFE-backed spuit met een gel-laden Pipetteer tip en verzegel de verstuiver schoon met een stukje tape.
    2. Met behulp van een 3D-gedrukte centrifuge-adapter (Zie aanvullende bestanden 1 en 2), draai de microgel spuit gedurende 3 minuten op 3000 x g.
    3. Verwijder het vloeibare supernatant van de spuit met behulp van een gel-laden Pipetteer tip. Duw de microgel laag aan de basis van de verstuiver van de spuit. Passen de injectiespuit met een naald.
  3. Laadt een 3 mL injectiespuit met gefluoreerde olie (HFE) met een 2% w/w Perfluorpolyether-polyethyleen glycol (PFPE-PEG) oppervlakteactieve stof past met een naald en leg deze in een spuitpomp.
  4. Opnieuw kapselen de microgels in de druppeltjes met tagmentation reagentia.
    Opmerking: Zie figuur 3B voor een apparaat schematische met vermelding van de locatie van het reagens inhammen en uitlaat.
    1. Sluit de spuiten met HFE, tagmentation mix en microgels aan de microfluidic apparaat inhammen met stukjes PE buis. Prime voordat u invoegt de buizen in het apparaat, de pompen om de lucht te verwijderen uit de lijn.
    2. Een stukje buis sluit aan op de wandcontactdoos en plaats het vrije uiteinde in een lege spuit van 1 mL met de plunjer getrokken naar de regel van 1 mL.
    3. Gebruik de volgende (aanbevolen) debiet voor dropmaking: 2.000 µL/h voor de HFE 2% w/w PFPE-PEG, 200 µL/h voor de microgels en 500 µL/h voor de tagmentation mix.
  5. Controleer of het tarief van de inkapseling microgel onder een lichte Microscoop bij een 400 X vergroting. Ongeveer 80-90% van de druppels moet bevatten een microgel, zoals getoond in figuur 4C.
  6. Passen de spuit met de tagmentation-emulsies met een naald en Incubeer het rechtop in een warmte blok of oven gedurende 1 uur bij 55 ° C aan de genomic DNA fragment.

8. eencellige Barcoding door Microfluidic Double fusie

Opmerking: Zie figuur 2C.

  1. De barcode druppels voorbereiden door de fusie door vervanging van de FC-40 olie breuk met HFE 2% w/w PFPE-PEG. Zorgvuldig deze dalingen overboeken naar een spuit van 1 mL, past met een naald, en plaats deze in een spuitpomp.
  2. Laad de bebroede en tagmented microgel druppel spuit in een spuitpomp.
  3. Het bereiden van 500 µL van het PCR-mix. Voeg de reagentia in de onderstaande volgorde om te voorkomen dat precipitaten vormen: 140 µL van het PCR-grade water 10 µL van P5_DNA primer (10 µM voorraad, 0,2 µM definitief), 10 µL van P7_BAR primer (10 µM voorraad, 0,2 µM definitief), 50 µL van PEG 6k (50% w/v voorraad laatste 5%), 50 µL van Polysorbaat 20 (50% v/v voorraad, 5% definitief), 250 µL van Taq Master Mix (2 x) (Zie Tabel of Materials), 10 µL van isothermische polymerase (Zie Tabel of Materials), en 10 µL van neutralisatie buffer (Zie Tabel van materialen). Meng ze door op en neer 10 x pipetteren en draai het mengsel naar beneden te verzamelen. Deze oplossing in een HFE-backed 1 mL spuit laden, past met een naald en leg deze in een spuitpomp.
  4. Belasting drie 3-mL spuiten met gefluoreerde olie (HFE) met een 2% w/w Perfluorpolyether-polyethyleen glycol (PFPE-PEG) surfactant, elk met een naald past en plaats ze in injectiespuit pompen.
  5. Laden van de drie 1 mL spuiten met 2 M NaCl, passen elk met een naald en zet ze opzij.
  6. Samenvoegen van de barcode druppels, tagmented genoom druppels, en PCR meng met behulp van de dubbele fusie-apparaat.
    Opmerking: Zie Figuur 5 voor een apparaat schematische met vermelding van de locatie van het reagens en elektrode inhammen en uitlaat.
    1. De 3 NaCl spuiten verbinden met de 2 elektrode inhammen en een enkele gracht inletusing stukjes PE buis. Voor de elektroden, druk uitoefenen op de spuiten handmatig totdat de elektroden zijn volledig gevuld met zoutoplossing. Na het vullen van de elektroden, manuele druk uitoefenen op de gracht spuit totdat de gracht is gevuld. Sluit het vrije uiteinde van de gracht met een klein stukje lood soldeer.
    2. Sluit de 3 HFE spuiten op pompen om de 2 spacer olie inhammen en dropmaking olie inletusing stukjes van PE buis gemonteerd. Prime voordat u invoegt de buizen in het apparaat, de pompen om de lucht te verwijderen uit de lijn.
    3. Verbinding maken met de PCR-mix spuit, microgel drops spuit en barcode daalt spuit tot hun respectieve inhammen met PE buis. Schiet alle druppel herinjectie buizen met een antistatische pistool voordat u ze aansluit op de injectiespuit naalden; de antistatische behandeling vermindert het risico van droplet coalescence geïnduceerd door statische ladingen op de PE-buis.
    4. Een stuk van PE buis sluit aan op de wandcontactdoos en plaats het vrije uiteinde in een tube van 0,2 mL PCR.
    5. De naald van de spuit elektrode verbinden met een koude kathode TL omvormer met behulp van een alligator-clip. Instellen van de omvormer DC voeding met 2 V.
    6. Uitvoeren van het dubbele fusie-apparaat met de aanbevolen debiet: 300 µL/h voor de tagmented microgel druppels, 100 µL/h voor de barcode druppels, 1500 µL/h voor de HFE 2% w/w PFPE-PEG (dropmaking olie), 600 µL/h voor de versterking mix, 200 µL/h voor de HFE 2% w/w PFPE-PEG ( barcode spacer olie), en 700 µL/h voor de HFE 2% w/w PFPE-PEG (microgel spacer olie). De druppels in PCR buizen met ongeveer 50 µL van emulsie in elke buis te verzamelen.
  7. Voorafgaand aan de temperatuurcycli, zorgvuldig verwijderen van de onderste laag van HFE olie uit de emulsies met behulp van gel-laden Pipetteer tips en vervang ze met FC-40 gefluoreerde olie met een 5% w/w PFPE-PEG oppervlakteactieve stof. Thermische cyclus met het volgende protocol: 65 ° C gedurende 5 min, 95 ° C gedurende 2 min, 30 x (95 ° C gedurende 15 s, 60 ° C gedurende 1 min, 72 ° C gedurende 1 min), 72 ° C gedurende 5 minuten, dan greep bij 12 ° C.
  8. Herstelt de barcoded DNA van de druppels thermische-en weer aangezet.
    1. Zwembad de druppels in een microcentrifuge buis en breken de emulsies met behulp van 20 µL van PFO. Vortex hen voor 10 s te mengen.
    2. Draai de buis bij 10.000 x g gedurende 1 minuut aan fractionate van het mengsel in waterige (top) en olie (onder) fasen. Zorgvuldig verwijderen van de bovenste laag van waterige uit de buis met behulp van een pipet en overbrengen naar een nieuwe microcentrifuge buis. Gooi de olie-fase.
    3. Zuiveren van het PCR-product van barcoded in een kolom van de spin volgens protocol van de fabrikant en elueer het in 20 µL van 1 x TE buffer.
    4. Ga verder met de uitgevoerde sequencing en analyse per stap 9 en 10.

9. bibliotheek voorbereiding en Sequencing

  1. De bibliotheek van eencellige voorbereiden door de volgorde door het volgen van de fabrikant protocollen voor fragment grootte-selectie en kwantificering.
  2. Volgorde de gepaarde-einde bibliotheek met standaard chemie voor lezen 1 en 2 lezen. Gebruik de aangepaste Index 1 primer I7_READ (tabel 2) voor een index van de 15-bp lezen, overeenkomt met de eencellige-barcode.

10. eencellige gegevensanalyse

Opmerking: Aangepaste Python scripts voor kwaliteitscontrole en voorlopige analyse van SiC-seq gegevens kunnen worden gedownload van https://www.github.com/AbateLab/SiC-seq.

  1. Voer het script "barcodeCleanup.py" te voeren kwaliteitscontrole op de barcoded leest en de eencellige-gegevens exporteren naar een SQLite database. Voor een controle-experiment, gebruikt u dit script met de "-uitlijnen" vlag is ingesteld op het uitlijnen van de staat aan bekende referentie genomen.
  2. Analyseren van de zuiverheid van de groepen van de barcode (voor een controle-experiment) met behulp van het script "purity.py" en bevestig de hoge zuiverheid waarden overeen met figuur 6B.

Representative Results

De experimentele workflow van SiC-seq bevat 3 PDMS microfluidic apparaten vervaardigd met behulp van een zachte lithografie procedure (Figuur 1). Een co stroom dropmaker (figuur 3A) genereert 25 µm van digitale barcode druppels voor het labelen van genomic DNA met een unieke id van de eencellige. De barcode oligonucleotides bestaan uit een 15 bp gedegenereerde reeks geflankeerd door PCR grepen voor amplificatie (tabel 2, BAR primer). De streepjescodes zijn verdund tot de concentratie van een femtomolar om de single-molecuul inkapseling, en alle druppels ontvangen ofwel 0 of 1 barcode-fragment(s). De druppels met een streepjescode worden versterkt, vele kopieën van double-stranded barcode waarbij oplevert. Een nucleïnezuur vlek wordt gebruikt om te controleren of de succesvolle versterking en kwantificeren van het tarief van de inkapseling van de barcode fragmenten (figuur 4B). De microgels worden gegenereerd door mede stroomt een bacteriële celsuspensie en een gesmolten agarose gel op gelijke debiet (figuur 2A). De agar bereid is op twee maal de gewenste eindconcentratie, zoals de co stroom dropmaking proces effectief de waterige oplossingen met een factor 2 verdunt. Als de agarose afkoelt, dan stolt het in een 25 µm diameter microgel bezetten de sferische omvang van de druppel.

Een reeks van lysis en wassen stappen zuivert de genomic DNA van hoog-moleculair-gewicht in het microgels (figuur 2B). Na het breken van de emulsies, zijn waterige wast uitgevoerd in grote volumes om te verdunnen uit trace organische oplosmiddelen die de downstream enzymatische behandelingen kunnen remmen. De gewassen microgels worden waargenomen onder een microscoop om te controleren of de snelheid inkapseling cel (figuur 4A). Een cocktail van enzymen met brede lytische activiteit wordt toegevoegd aan de schorsing van de microgel om te verteren de celwanden van de bacteriën en eukaryoten microben19. Een tweede behandeling met proteïnase K en afwasmiddel degradeert de eiwitten en lost cel puin.

Tagmentation van het gezuiverde DNA wordt uitgevoerd in druppels om te voorkomen dat potentiële kruisbesmetting ten gevolge van de verspreiding van kleine tagmented DNA-fragmenten tussen de microgels-18. Een droplet inkapseling apparaat (figuur 3B) compartmentalizes elk microgel met een buffer en tagmentation enzym, die gelijktijdig double-stranded DNA fragmenten terwijl ook "tagging" het met een voorgeladen oligonucleotide20. De microgels worden geladen in de druppels als sluiten boordevol deeltjes, bereiken van inkapseling tarieven naderen van 1 microgel voor elke druppel met enkele paren21 (figuur 4C).

In de laatste stap van de workflow van de microfluidic (figuur 2C) bewerking een apparaat een dubbele fusie combineren 1 barcode druppel, 1 microgel-bevattende drop en de versterking mix in een gecontroleerde stappen. Eerst is een droplet met PCR reagens gekoppeld en samengevoegd met een daling van de streepjescode in de regio weergegeven in geel (Figuur 5). Zoutwater elektroden in het kanaal microfluidic produceren een hoog elektrisch veld verloop die de druppel fusie triggers. Op een vergelijkbare manier, is de eerste samengevoegde druppel gecombineerd met een druppel microgel en een tweede keer samengevoegd in de regio in het rood weergegeven. De druppels zijn verzameld en thermische fietste off-chip in een single-overlapping extensie (SOE) PCR. De overlappende complementaire uiteinden van de barcode en de genomic DNA van tagmented toestaan kernversmelting en de exponentiële versterking van alleen goed barcoded constructies.

De gegevens rangschikken is eerst gefilterd door een lees kwaliteit en vervolgens geparseerd door groepering van het luidt volgens de volgorde van hun 15-bp eencellige barcode. Voor een fractie van de barcode aan als geldig worden beschouwd, moet daarin een minimumaantal leest; Deze drempelmethode beperkt de analyse op cellen met een nuttige hoeveelheid sequencing gegevens en verwijdert de PCR-gemuteerd barcode "wezen" van de dataset. In dit voorbeeld uitvoert, het minimum is ingesteld op 7,5 kbps per groep (50 leest van 150 bp elk). Een histogram van de graven van de barcode ten opzichte van de grootte van de groep blijkt dat een aanzienlijk deel van de geldige barcode groepen net boven de grootte van de drempel (figuur 6A).

In een controle-experiment waar de samenstelling van de microbiële Gemeenschap is bekend, worden de zuiverheid en de relatieve overvloed statistieken gebruikt om te evalueren van de kwaliteit van een SiC-seq uitvoeren. Hier, wordt een synthetische 10-cel-Gemeenschap, bestaande uit 3 gram-negatieve bacteriën, 5 gram-positieve bacteriën, en 2 gisten geanalyseerd. De zuiverheid van de groep van een bepaald streepjescode wordt gedefinieerd als het aantal leest toewijzen aan de meest voorkomende genoom in de groep gedeeld door het totale aantal leest in de groep. De overgrote meerderheid van de barcode-groepen hebben purities groter dan 0.95 (figuur 6B). Relatieve abundantie van de celtypes wordt berekend door het tellen van de ruwe leest en door het tellen van de barcode-groepen, waar de groepen een celtype overeenkomt aan de consensus van zijn lid luidt als volgt (Figuur 6 c) zijn toegewezen. De overvloed van leest en barcode groepen bijhouden in ongeveer dezelfde verhoudingen, die aangeeft dat de populaties van de cel wordt bemonsterd zodanig dat bepaalde soorten niet in onevenredig klein of groot barcode groepen zijn opgenomen. Uitzetten van de statistische dekking van alle groepen van de barcode van een soort geeft een hoge dekking over het gehele genoom, met weinig of geen uitval regio's (Figuur 7). De uniformiteit van de dekking kan worden gecontroleerd met een frequentieverdeling van genormaliseerde dekking waarden, met de meeste waarden gecentreerd rond het gemiddelde (Figuur 7, inzet).

Figure 1
Figuur 1 : Fabricage van microfluidic apparaten door fotolithografie. (A) Master mallen met een hoogte van één functie zijn vervaardigd door spin coating van een laag van SU-8 fotoresist op een silicium wafer. De fotoresist is vervolgens patroon met een photolithographic masker en UV-licht, crosslinking de blootgestelde SU-8. Tot slot, uncrosslinked SU-8 wordt opgelost in een bad van de ontwikkelaar. De resulterende schimmel wordt te werpen PDMS die is gebonden aan een glasplaatje te produceren het volledige microfluidic-apparaat gebruikt. ()B) voor een dubbellaags apparaat, de fabricage ook begint met spin coating en blootstelling stappen. Deze stappen worden vervolgens herhaald om een twee-laag-apparaat te creëren. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: Overzicht van de werkstroom SiC-seq. (A) A microbiële schorsing is mede vloeide met gesmolten agarose in een dropmaker apparaat om in te kapselen afzonderlijke cellen in microgels. (B) de microgels zijn onderworpen aan een reeks wasbeurten te zuiveren van de bacteriële genomic DNA. Lytische enzymen verteren de celwanden van gram-positieve bacteriën en gisten en wasmiddel lost het cellulaire puin. De microgels zijn opnieuw ingekapselde in druppels voor de tagmentation om de kruisbesmetting. (C) de microfluidic-fusie combineert een digitale PCR barcode, een tagmented microgel genoom en een mix van versterking een tempo > 1 kHz. Off-chip SOE-PCR Splits een unieke eencellige barcode op het tagmented genoom en selectief versterkt volledig barcoded constructies. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: Microfluidic apparaten voor de inkapseling van dropmaking en microgel opnieuw. (A) dit paneel toont een co stroom dropmaker (25 µm van functie hoogte). Cellen en gesmolten agarose zijn ingevoerd in het apparaat op gelijk debiet tot 25 µm druppels afslag een 25 µm x 25 µm. Voor de digitale barcode dropmaking, de inlaat van de cel is aangesloten en een PCR-mix wordt binnengebracht in de agarose inlaat. (B) dit paneel toont een microgel opnieuw inkapseling apparaat (25 µm van functie hoogte). De microgels uitmonden in een trechtervormige inlaat te handhaven hun sluiten boordevol bestellen en ontvangen van een volume van tagmentation mix voorafgaand aan de nieuwe inkapseling op een kruispunt van 25 µm x 30 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4 : Microfoto van druppels en microgels. (A) dit paneel toont 25 µm microgels voorafgaand aan de lysis van de enzymatische gewassen. De bacteriën zijn fluorescently gekleurd voor de kwantificering van de inkapseling tarief. Poisson laden statistieken dicteren dat de cellen moeten ingekapseld met een snelheid van 1: 10 druppels of minder om te minimaliseren van de frequentie van meerdere-inkapseling gebeurtenissen. (B) dit paneel toont een fluorescentie microscopie beeld van 25 µm digitale barcode druppels behandeld met een vlek van nucleïnezuur. De druppels met versterkte barcode fragmenten produceren een sterke fluorescentie-signaal. (C) dit paneel toont microgels opnieuw ingekapseld in 50 µm dalingen. De sluiten-verpakking van de microgels zorgt voor inkapseling tarieven 1 gel per druppel met enkele paren naderen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5 : Microfluidic dubbele fusie apparaat voor eencellige genoom barcoding. Een bewerking in twee fasen fusie paren barcode druppels met tagmented genomen op een hoge gegevensdoorvoer. Een druppel van de PCR-mix is eerst gegenereerd en samengevoegd met een barcode-droplet in de regio weergegeven in geel met zoutwater elektroden. Vervolgens is een droplet met een microgel ingevoerd en een tweede keer samengevoegd in de regio in het rood weergegeven. Olie inhammen zorgen voor nauwkeurige controle van de afstand tussen de reinjected druppels. De barcode herinjectie kamer en haar spacer olie worden geplaatst op de kortere laag van 25 µm, blauw gearceerd. Alle andere functies van het apparaat behoren tot de dikkere laag met 45 µm van totale hoogte. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6 : Barcode groep statistieken voor een 10-cel synthetische microbiële Gemeenschap. (A) dit paneel toont de verdeling van de streepjescode groep maten. Het aantal groepen van een gegeven grootte afneemt exponentieel naarmate de groep groter. Een minimum van 7,5 kbps per groep beperkt de analyse aan groepen met een voldoende hoeveelheid informatie en verwijdert de volgorde van PCR-gemuteerd "wezen." (B) dit paneel toont de verdeling van de barcode groep purities. De overgrote meerderheid (> 90%) groepen zijn van zeer hoge zuiverheid (> 95%). (C) dit paneel toont de relatieve overvloed van 10 soorten berekend op groepsniveau Lees- en barcode. De 2 tellen methoden geven vergelijkbare resultaten, die aangeeft dat de grootte van de groep streepjescode over soorten stroken. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 7
Figuur 7 : Aggregate genomic dekking van Bacillus subtilis barcode groepen. Het lezen van alle de barcode-groepen toewijzen aan de bacterie B. subtilis (N = 9,398) worden samengevoegd en geanalyseerd in totaal. Een circulaire dekking kaart illustreert de uniformiteit van de dekking van de SiC-seq luidt, met geen waarneembare dropout regio's. Een onderbroken lijn rond de omtrek geeft aan de gemiddelde dekking (5,55 x). Het histogram van de inzet van de frequenties van de relatieve dekking geeft dat een bulk van de basissen vallen op een diepte in de buurt van het genoom-brede gemiddelde, vertegenwoordigd door de stippellijn. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Apparaat 1ste laaghoogte (µm) 1e laag Spin snelheid (rpm) 2de laaghoogte (µm) 2de laag Spin snelheid (rpm)
Co stroom dropmaker 25 4000 N/B N/B
Gel re encapsulator 25 4000 N/B N/B
Dubbele fusie 25 4000 20 5000

Tabel 1: Microfluidic apparaat fabricage parameters. Deze tabel toont een overzicht van de apparaten van de microfluidic die worden gebruikt in de workflow van de SiC-seq met hun vereiste snelheden voor fotoresist spin coating (gebaseerd op de specificaties van de fabrikant voor SU-8 3025).

Label Volgorde (5' > 3')
BAR GCAGCTGGCGTAATAGCGAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGNNNNNNNNNNNNNNNTAAGCCAGCCCCGACACT
DNA_BAR CTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGACGTGTCGGGGCTGGCTTA
P7_BAR CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCAGCTGGCGTAATAGCG
P5_DNA AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGTCGGCAGCGTC
I7_READ GCCCACGAGACGTGTCGGGGCTGGCTTA

Tabel 2: Primer sequenties.

Aanvullende bestand 1: Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende bestand 2: Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

De SiC-seq microfluidic workflow produceert eencellige genoom sequencing gegevens uit duizenden bacteriecellen. Digitale barcodes verbinding aan de randen op het genoom van microgel-ingekapseld cellen toestaan voor de deconvolutie in silico NGS gegevens in groepen van barcoded luidt die afkomstig zijn uit dezelfde cel. Een controle-experiment met een microbiële Gemeenschap van waarvan de samenstelling bekend is noodzakelijk voor de evaluatie van de zuiverheid van de barcode-groepen. Een groot deel van de laag-zuiverheid groepen geeft aan dat de cel inkapseling tarief te hoog is of dat er belangrijke druppel kruisbesmetting optreedt tijdens de verwerking van de microfluidic stappen. Volgens de statistieken van de Poisson, moeten de barcodes en cellen worden ingekapseld met een doel-verhouding van 1 deeltje voor elke 10 druppels te beperken van het aantal meerdere inkapseling gebeurtenissen tot minder dan 5% van alle niet-lege druppels. Een inkapseling tarief hoger is dan dit verhoogt de tarieven van paren exponentieel, zodat de verificatie van de inkapseling verhouding tijdens het dropmaking van cruciaal belang is. Gebruikers moeten bijzonder voorzichtig zijn van de inkapseling van meerdere cellen in een enkele microgel omdat leest uit verschillende cellen delen dezelfde barcode volgorde kunnen niet bioinformatically gescheiden worden. In het geval dat 1 cel ontvangt 2 verschillende barcodes, de barcode groep zuiverheid wordt beïnvloed, hoewel de overvloed statistieken zijn scheef wanneer tellen door barcode opeenvolging.

Druppel kruisbesmetting kan ook ontstaan als gevolg van suboptimaal fusie voorwaarden. Tijdens een succesvolle operatie, kan het apparaat fusie microfluidic (Figuur 5) controllably koppel 1 druppel van de barcode met 1 microgel en een volume van PCR reagens. Niet-ideale debiet zal resulteren in een droplet koppeling op onjuiste verhoudingen: 1 barcode kan worden gecombineerd met 2 microgels, bijvoorbeeld. Alle stroomsnelheid vermeld in het protocol zijn bedoeld om te worden schattingen en moet mogelijk worden aangepast afhankelijk van lichte variaties in het apparaat geometrie en druppel maten. Gebruikers met toegang tot camera's met snelle opnamemogelijkheden (> 10.000 frames/s) moet controleren of de juiste druppel fusie aan het begin en in de loop van de microfluidic werking. Gebruikers zonder toegang tot een high-speed camera kunnen verzamelen van een klein volume van de samengevoegde output en handmatig de grootte van de druppel onder een microscoop te meten. De grootte van de druppel moeten uniform: een teveel aan niet-samengevoegde barcodes of microgel druppels geeft aan dat de tarieven voor herinjectie dienovereenkomstig moeten worden verminderd.

Enkele algemene voorzorgen moeten worden genomen bij de behandeling van microgels en microdruppels om hun integriteit te behouden. Microgels, moeten hoewel mechanisch robuust, worden voldoende afgekoeld voordat het breken en wassen stappen om ervoor te zorgen volledige gelering. Niet-bolvormige microgels zijn een indicatie dat de agarose niet was voldoende tijd krijgen om te stollen. Bij het wassen van microgels, draaien de schorsingen neer op de vereiste snelheden om te voorkomen dat een verlies van product. Agarose hydrogel kan heeft een brekingsindex nauw overeenkomen met die van water en moeilijk te zien in een buis22, zodat gebruikers zorgvuldig de grens van de gel-liquid vóór aspiratie herkennen moeten. Water-in-olie druppels zijn vatbaar voor samenvoeging door de opbouw van statische krachten23 op laboratorium handschoenen en buizen. Voor deze reden raden wij laden de druppel herinjectie spuiten met blote handen en het behandelen van alle lijnen van de herinjectie met een anti-statische pistool voorafgaand aan de pomp zelfaanzuigende. Grote samengevoegd druppels kunnen worden verwijderd door langzaam draaien de emulsies in een spuit en handmatig aspirating de grotere druppels, die zich in de buurt van de top als gevolg van hun grotere uitbundige kracht ophopen.

SiC-seq is de eerste technologie om aan te tonen van eencellige genoom sequentiebepaling van > 50.000 bacteriecellen. Dit platform biedt aanzienlijke voordelen in doorvoer ten opzichte van de bestaande benaderingen en stelt gebruikers van een diepere bemonstering van heterogene microbiële gemeenschappen. Tot op heden hebben microfluidic technologieën voor eencellige genoom sequencing werkzaam microchambers9 en microwells24 voor cel isolatie en versterking, maar met doorvoercapaciteit in het bereik van slechts tientallen tot honderden van cellen. Het sorteren van de stroom van afzonderlijke cellen in wellplates5,6 vereist geen gespecialiseerde microfluidic instrumentatie maar bezit een eveneens lage doorvoersnelheid. Gezien het feit dat de bodem- en watermonsters in de omgeving hebben vaak Alfa diversiteit van > 1000 op de soorten niveau25,26, SiC-seq is zeer gunstig op grond van haar vermogen om te genieten van een veel groter aantal organismen. De SiC-seq workflow is aangepast aan cel ingangen van laboratoriumcultuur, het natuurlijke milieu of een levende gastheer. Een cel monster moet alleen in een waterige suspensie en vrij van grote deeltjes (> 10 µm) geschikt voor de inkapseling van de microfluidic. De methode heeft bijvoorbeeld eerder toegepast op een steekproef uit zeewater met behulp van een reeks van wassen en filteren van de stappen voor het vooraf verwerken van de cellen vóór de inkapseling17.

Het SiC-seq-protocol genereert een relatief geringe hoeveelheid sequencing gegevens van elke eencellige en mogelijk niet geschikt voor alle toepassingen. Sommige bioinformatics algoritmen zoals DOVO genoom vergadering of één nucleotide variant (SNV) roepen vereisen hogere dekking diepten om effectief te werken. In plaats daarvan, barcode groepen kunnen geclusterde in silico door taxonomische weggooien methoden27 zodat algoritmen kunnen worden toegepast op grotere sets van luidt als volgt. De relatief lage barcoding totaalrendement van de SiC-seq-werkstroom kan ook uitdagingen presenteren in gevallen waarin de beschikbaarheid van het input monster laag is. SiC-seq berust op een Poisson-verdeelde barcode inkapseling stap, dus ongeveer 10% van de cellen een moleculaire barcode ontvangen en worden versterkt tijdens de definitieve bibliotheek voorbereiding stap. Terwijl dit vergelijkbaar met andere regelingen op basis van microdroplet barcoding10 is, gebruikers die werken met kostbare celsteekproeven kunnen ondervindt bij het bereiken van de opbrengst van de voldoende bibliotheek voor het rangschikken en wellicht te verhogen van het aantal cycli van PCR in de finale versterking stap. Een andere mogelijke oplossing voor gebruikers met microfluidic expertise is positieve barcode druppels na de digitale PCR stap, waardoor de algehele efficiëntie van de barcoding te sorteren > 85%28.

Een mogelijke toekomstige koers voor SiC-seq-technologie is de aanpassing van de werkstroom voor gebruik met zoogdiercellen, de weg vrijmaakt voor nieuwe klinische eencellige studies. Als voorbeeld, een analyse van de kopie nummer variatie onder één kanker cellen mei verder van ons begrip van de rol van heterogeniteit in kanker pathologie2. U kunt ook zouden SiC-seq integreren met bestaande methoden voor de sonde en verrijken van de opeenvolgingen van DNA van belang29 de gerichte eencellige sequencing van subpopulaties of zeldzame soorten cellen. Met milieu monsters, kon genen van binnen een bekende metabolische weg worden gericht en contextueel geanalyseerd samen met naburige genen te identificeren roman genomic eilanden. Vanuit een menselijke gastheer-omgeving, laag-titer pathogene bacteriën monsters kunnen worden geïsoleerd en sequenced op het niveau van de eencellige te onderzoeken meer nauw hun genotypische oorsprong van virulentie.

Disclosures

Octrooien met betrekking tot deze werkstroom kunnen worden is in licentie gegeven aan missie Bio, van welke Adam R. Abate een aandeelhouder.

Acknowledgments

Dit werk werd gesteund door de National Science Foundation via een CAREER Award (subsidie nummer DBI-1253293); de National Institutes of Health (NIH) (subsidie nummers HG007233-01, R01-EB019453-01, 1R21HG007233, DP2-AR068129-01, R01-HG008978); en de Defense Advanced Research projecten Agentschap wonen gieterijen Program (contractnummers HR0011-12-C-0065, N66001-12-C-4211, HR0011-12-C-0066).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3" silicon wafers, P type, virgin test grade University Wafers 447
SU-8 3025 photoresist Microchem 17030192
Spin coater Specialty Coating Systems G3P-8
Photomasks CadArt Servcies (custom) See Supplemental Files for mask designs
PGMEA developer Sigma-Aldrich 484431
Isopropanol Sigma-Aldrich 109827
Sylgard 184 silicone elastomer kit Krayden 4019862
Degassing chamber Bel-Art 42025
0.75 mm biopsy punch World Precision Instruments 504529
Glass microscope slides (75 mm x 50 mm) Corning 294775X50
Aquapel (hydrophobic glass treatment) Pittsburgh Glass Works 47100
PE-2 polyethylene tubing Scientific Commodities B31695-PE/2
1 mL syringes BD 309628
27 gauge needles BD 305109
Syringe pump New Era Pump Systems NE-501
Novec HFE-7500 fluorinated oil (HFE) 3M 98-0212-2928-5
FC-40 fluorinated oil Sigma-Aldrich F9755
PEG-PFPE surfactant Ran Biotechnologies 008-FluoroSurfactant
Space heater Lasko  CD09250 
Agarose, low gelling temperature Sigma-Aldrich a9414
TE (10X) Rockland mb-007
PBS 1X, pH 7.4 E&K Scientific Products EK-65083
OptiPrep (density gradient medium) Sigma-Aldrich d1556
1H,1H,2H-Perfluoro-1-Octanol (PFO) Sigma-Aldrich 370533
Span 80 (sorbitane monooleate) Sigma-Aldrich s6760
Hexane Sigma-Aldrich 139386
Tween 20 (polysorbate 20) Sigma-Aldrich p2287
Lysozyme Type IV MP Biomedicals 195303
Mutanolysin Sigma-Aldrich M9901
Zymolyase (yeast lytic enzyme) Zymo Research e1004
Lysostaphin Sigma-Aldrich L7386
Sodium chloride Sigma-Aldrich S9888
EDTA Sigma-Aldrich E6758
Tris-HCl, pH 7.5, 1M Invitrogen 15567-027
Dithiothreitol (DTT) Teknova d9750
Lithium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich L9781
Proteinase K New England Biosciences P8107S
Ethanol, 200 Proof (100%) Koptec V1001
SYBR Green I (nucleic acid stain) Invitrogen S7563
PEG 6k Sigma-Aldrich 81260
Triton X-100 (octylphenol ethoxylate) Sigma-Aldrich t8787
Nextera DNA Library Prep Kit Illumina FC-121-1030
Phusion Hot Start Flex Master Mix (High-Fidelity Hot Start Master Mix) New England Biosciences m05365
Platinum Multiplex PCR Master Mix (Taq Master Mix) Applied Biosystems 4464263
Warmstart 2.0 Bst Polymerase (isothermal polymerase) New England Biosciences m0538m
NT buffer from Nextera XT kit (neutralization buffer) Illumina FC-131-1024
Cold cathode fluorescent inverter (custom) (custom)
DC power supply Mastech HY1503D
Zerostat 3 anti-static gun Milty 5036694022153
3D-printed centrifuge syringe holder (custom) (custom) See Supplemental Files for 3D print file
Zymo DNA Clean & Concentrator-5 Zymo Research D4003

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Navin, N., et al. Tumour evolution inferred by single-cell sequencing. Nature. 472 (7341), 90-94 (2011).
  2. Ni, X., et al. Reproducible copy number variation patterns among single circulating tumor cells of lung cancer patients. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 21083-21088 (2013).
  3. Schmidt, H., Hensel, M. Pathogenicity islands in bacterial pathogenesis. Clinical Microbiology Reviews. 17, 14-56 (2004).
  4. Martínez, J. L., Baquero, F. Interactions among strategies associated with bacterial infection: pathogenicity epidemicity, and antibiotic resistance. Clinical Microbiology Reviews. 15 (4), 647-679 (2002).
  5. Rinke, C., et al. Obtaining genomes from uncultivated environmental microorganisms using FACS-based single-cell genomics. Nature Protocols. 9 (5), 1038-1048 (2014).
  6. Rinke, C., et al. Insights into the phylogeny and coding potential of microbial dark matter. Nature. 499 (7459), 431-437 (2013).
  7. Zhang, H., Liu, K. K. Optical tweezers for single cells. Journal of the Royal Society Interface. 5 (24), 671-690 (2008).
  8. Xu, L., Brito, I. L., Alm, E. J., Blainey, P. C. Virtual microfluidics for digital quantification and single-cell sequencing. Nature Methods. 13 (9), 759-762 (2016).
  9. Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. Dissecting the clonal origins of childhood acute lymphoblastic leukemia by single-cell genomics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (50), 17947-17952 (2014).
  10. Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  11. Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
  12. Rotem, A., et al. High-throughput single-cell labeling (Hi-SCL) for RNA-Seq using drop-based microfluidics. PLoS One. 10 (5), 1-14 (2015).
  13. Amini, S., et al. Haplotype-resolved whole-genome sequencing by contiguity-preserving transposition and combinatorial indexing. Nature Reviews Genetics. 46 (12), 1343-1349 (2014).
  14. Zheng, G. X. Y., et al. Haplotyping germline and cancer genomes with high-throughput linked-read sequencing. Nature Biotechnology. 34 (3), 303-311 (2016).
  15. Lan, F., Haliburton, J. R., Yuan, A., Abate, A. R. Droplet barcoding for massively parallel single-molecule deep sequencing. Nature Communications. 7, 11784 (2016).
  16. Rotem, A., et al. Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state. Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).
  17. Lan, F., Demaree, B., Ahmed, N., Abate, A. R. Single-cell genome sequencing at ultra-high-throughput with microfluidic droplet barcoding. Nature Biotechnology. 35 (7), 640-646 (2017).
  18. Novak, R., et al. Single-cell multiplex gene detection and sequencing with microfluidically generated agarose emulsions. Angewandte Chemie Internation Edition. 50 (2), 390-395 (2011).
  19. Gill, C., Van De Wijgert, J. H. H. M., Blow, F., Darby, A. C. Evaluation of lysis methods for the extraction of bacterial DNA for analysis of the vaginal microbiota. PLoS One. 11 (9), 1-16 (2016).
  20. Picelli, S., et al. Tn5 transposase and tagmentation procedures for massively scaled sequencing projects. Genome Research. 24 (12), 2033-2040 (2014).
  21. Abate, A. R., Chen, C. H., Agresti, J. J., Weitz, D. A. Beating Poisson encapsulation statistics using close-packed ordering. Lab on a Chip. 9 (18), 2628 (2009).
  22. Jain, A., Yang, A. H. J., Erickson, D. Gel-based optical waveguides with live cell encapsulation and integrated microfluidics. Optic Letters. 37 (9), 1472 (2012).
  23. Karbaschi, M., Shahi, P., Abate, A. R. Rapid chemical-free breaking of microfluidic emulsions with a hand-held antistatic gun. Biomicrofluidics. 11 (4), 1-6 (2017).
  24. Gole, J., et al. Massively parallel polymerase cloning and genome sequencing of single cells using nanoliter microwells. Nature Biotechnology. 31 (12), 1126-1132 (2013).
  25. Chao, Y., et al. Metagenomic analysis reveals significant changes of microbial compositions and protective functions during drinking water treatment. Scientific Reports. 3 (1), 3550 (2013).
  26. Fierer, N., et al. Cross-biome metagenomic analyses of soil microbial communities and their functional attributes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (52), 21390-21395 (2012).
  27. Mande, S. S., Mohammed, M. H., Ghosh, T. S. Classification of metagenomic sequences: methods and challenges. Briefings in Bioinformatics. 13 (6), 669-681 (2012).
  28. Eastburn, D. J., et al. Microfluidic droplet enrichment for targeted sequencing. Nucleic Acids Research. 43 (13), e86 (2015).
  29. Clark, I. C., Abate, A. R. Finding a helix in a haystack: nucleic acid cytometry with droplet microfluidics. Lab on a Chip. 17 (12), 2032-2045 (2017).

Tags

Bioengineering kwestie 135 Microfluidics microdruppels eencellige genomics metagenomics next-generation sequencing moleculaire barcoding
Een met-throughput Microfluidic Platform voor eencellige genoom Sequencing
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Demaree, B., Weisgerber, D., Lan,… More

Demaree, B., Weisgerber, D., Lan, F., Abate, A. R. An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing. J. Vis. Exp. (135), e57598, doi:10.3791/57598 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter