Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Microfluidic платформа сверхвысокой пропускной способности для одной ячейки генома

Published: May 23, 2018 doi: 10.3791/57598
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2, 1,2,3
1Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, California Institute for Quantitative Biosciences, University of California, San Francisco, 2UC Berkeley-UCSF Graduate Program in Bioengineering, University of California, San Francisco, 3Chan Zuckerberg Biohub

Summary

Секвенирование одной ячейки показывает генотипическая гетерогенность в биологических системах, но современные технологии не хватает пропускной способности, необходимые для глубокого профилирования сообщества состав и функции. Здесь мы описываем microfluidic рабочего процесса для секвенирования > 50,000 одноклеточных геномов из различных мобильных популяций.

Abstract

Технологии виртуализации претерпели парадигмы от массовых резолюции одноклеточных в ответ на меняющиеся понимания роли гетерогенность клеточных в биологических системах. Однако одноклеточных секвенирования большого населения затрудняется ограничения в обработке геномов для виртуализации. В этой статье мы описываем метод для одной ячейки генома (SiC-seq) который использует капелька микрофлюидика изолировать, чтобы усилить и штрих геномов одиночных клеток. Инкапсуляция клеток в microgels позволяет разобщенным очищения и tagmentation ДНК, в то время как слияние microfluidic эффективно пары каждый генома с уникальной одноклеточных олигонуклеотида штрих-кода, позволяя > 50 000 единичных клеток секвенировать в перспективе. Данные последовательности demultiplexed по штрих-коду, создание групп гласит, происходящих из одной клетки. Как высокой пропускной способностью и низкой предвзятость метод секвенирования одноклеточных SiC-seq позволят более широкий спектр геномных исследований, ориентированных на различных клеточных популяций.

Introduction

Геном служит план сотовой идентичности и функции, содержащей весь организм программирования потенциал. Понимание на уровне генома клеточной биологии может объяснить наблюдаемое фенотипического разнообразия в гетерогенных клеточных популяций. Эта разнородность проявляется в биологических системах и имеет широкие последствия для здоровья человека и болезней. Например ген копии номер различия между опухолевые клетки связаны с эволюции и распространения рака1,2. В бактериальных инфекций острова патогенности, присутствующих в небольшую геномов могут передаваться по горизонтали и привести к распространению устойчивых к антибиотикам бактерий3,4. Основная задача по изучению геномов на уровне одной ячейки является низкое количество ДНК доступны, а также необходимость проанализировать тысячи клеток попробовать все разнообразие генотипов. По этим причинам ограничения в экспериментальной пропускной способности препятствуют эффективности исследований одноклеточных, стабилизатор результаты к наиболее распространенным клетки. Одноклеточных изоляции методы, такие как поток сортировки5,6, Оптический пинцет7, анкеровки в массовых гели8и микрофлюидика9 способны обработки сотен клеток для последовательности; Однако это только небольшая часть большинства образцов. Метод для одной ячейки генома с существенно более высокая пропускная способность позволит глубже и более полное профилирование клеточных популяций, тем самым изучение роли генотипической разнообразия в рамках этих общин.

Капелька микрофлюидика позволяет высок объём манипуляции клеток и биологических реагентов в миллионы пиколитр шкала реакторов. На сегодняшний день, микрокапель технологии были использованы для изучения шаблоны дифференциального выражений среди клеток из разнородных тканей10,11,12, глубоко последовательность длинные молекулы13,14 ,15и поведения хроматина иммунопреципитации последовательности (чип seq) анализ на отдельные ячейки16. Действительно microdroplets способны высокой пропускной способностью, разобщенным операций, что делает их поддаются приложений в одной ячейки геномики. Развитие этой технологии представляет свои собственные уникальные технологические проблемы, однако. Клетки должны лизированы, очищенная и усиливается с минимальным уклоном, чтобы равномерно образца клеточных популяций. Кроме того в отличие от polyadenylated мРНК стенограммы в mammalian клетках, существует без сопоставимых молекулярной мотив в геноме для облегчения захвата целевой нуклеиновой кислоты. По этим причинам одноклеточных генома было трудно осуществить в микрокапель платформах.

В этой работе мы предоставляем подробный протокол нашего сообщалось ранее одноклеточных microfluidic подход, способный секвенирования геномов десятки тысяч клеток в одном эксперимент17. С этой технологией, называется SiC-seq, бактериальные клетки инкапсулируются в мкм шкала гидрогелей и индивидуально лизированы, tagmented и объединена с микрокапель, содержащий уникальный олигонуклеотида штрих, который сращивания на геномной ДНК клетки через одного совпадения расширение полимеразной цепной реакции (ПЦР). Гидрогели служат изолированные контейнеры, в которых высокий молекулярный вес геномной ДНК труднодоступных помещены, позволяя мелких молекул, таких как моющие средства и литические ферменты для доступа и очищают ДНК до18штриховое кодирование. Этот протокол обрабатывает > 50 000 единичных клеток в течение нескольких часов, в результате в библиотеке перепутываются, готовы к последовательности. После виртуализации, читает demultiplexed согласно их одной ячейки штрих последовательность, что приводит к dataset состоит из миллионов гласит, каждый с индексом сотовой.

Protocol

1. Microfluidic устройство изготовление

  1. Подготовить microfluidic маска конструкции с использованием компьютерного проектирования (CAD) программное обеспечение (как. DWG; Просмотреть Дополнительные файлы). У этих конструкций, напечатаны поставщиком с разрешением 10 мкм на печатной плате фильм.
    Примечание: Для многослойных microfluidic приборы, соответствующие маски содержат меток выравнивания.
  2. Для каждого устройства изготовить следующим Су-8 мастер формы (рис. 1A).
    1. Подготовьте пластин кремния диаметром 3 - в, опрокинув примерно 1 мл Су-8 3025 фоторезиста на центре пластины. Закрепите пластины на спин coater Чак, применяя всасывания.
    2. Приведены в таблице 1 для получения перечня толщины слоя и спин скоростях для каждого устройства. Для всех устройств, начать спина покрытие с 30 s на 500 об/мин, после чего 30 s на указанной скорости.
    3. Удаление Су-8-кремниевой пластины из спин coater и мягкие выпекать его на конфорку, равным 135 ° C на 30 мин позволяют вафельные остыть до комнатной температуры после выпечки.
    4. Разоблачить Су-8-кремниевой пластины с соответствующим microfluidic маски под коллимированных 190 МВт, 365 Нм UV LED 3 мин.
    5. После экспозиции жесткий выпекать пластин на конфорку равным 135 ° C за 1 мин. После этого шага выпечки позволяют вафельные остыть до комнатной температуры.
    6. Для однослойных microfluidic устройства перейдите к шагу 1.2.7. Для многослойных microfluidic устройства повторите шаги 1.2.1 - 1.2.5 для второго слоя фоторезиста (рис. 1B).
    7. После первого жесткий испечь для устройства одного слоя (или второй жесткий испечь для многослойных устройства) разработка вафля, погружая его в ванну пропиленгликоля монометиловый эфир ацетата (PGMEA) за 30 мин.
    8. После развития пластин используйте шприц флакон, содержащий PGMEA для полоскания пластины. Затем промойте пластины с шприц флакон, содержащий изопропиловый спирт перед его размещением на конфорку 135 ° C за 1 мин для просушки.
    9. Поместите пластины (Далее мастер) в чашку Петри для литья с полиэфиром (PDMS).
  3. С капитаном, подготовленный на шаге 1.2 перейдите к выполнить изготовление устройства с PDMS литья.
    1. Подготовьте PDMS путем объединения силиконовой основе с отвердителя в соотношении 11:1 по массе. Смешайте силиконовая база и отвердителя вручную с палкой перемешать.
    2. Дега PDMS, поместив его в камеру дегазации и применяя вакуум. Разрешить PDMS Дега до тех пор, пока больше не видны пузырьки воздуха (обычно 30 мин).
    3. Осторожно залейте дегазацию PDMS мастер, до конечной толщины PDMS-слоя из примерно 5 мм. Дега PDMS снова для того, чтобы обеспечить устранение любых воздушных пузырьков.
    4. После дегазации, выпекать PDMS и мастер на 80 ° C для 80 мин.
    5. Тщательно акцизных вылечить PDMS плиты с запеченным мастер, с помощью лезвия бритвы. Убедитесь, что все разрезы на вершине кремниевой пластины.
      Примечание: Любые порезы, удрал кремниевой пластины может привести в губы, предотвращая форма связывания.
    6. Пунш впуски и выпуски с помощью биопсии удар 0,75 мм. Удалите пыль и бродячих PDMS с помощью ленты на стороне возможность устройства.
    7. До плазменной очистки устройства очистите слайд стекла 50 мм х 75 мм, ополаскивание изопропанолом и высыхания.
    8. Для плазменной обработки место PDMS перекрытий и стекла сползания тычковый плазмы с функциями вверх. Выполните плазменной обработки с использованием 1 мбар O2 плазмы, за 1 мин Бонд устройства к стеклу слайда путем привлечения подвергаются, или лицом вверх, сторон вместе.
    9. После плазменной обработки выпекать устройства при 80 ° C для 40 мин.
    10. Наконец придать стекла обработки поверхности жидкости в одной из бухт для отображения каналов microfluidic гидрофобных. Обеспечить все каналы полностью затоплены с решением и повторять инъекции для каждого dropmaker. Выпекать обработанных устройства при 80 ° C 10 мин лишний растворитель испарился.

2. Инкапсуляция клеток в Microgels агарозы

Примечание: Смотрите рисунок 2A.

  1. Готовим 1 мл 3% w/v легкоплавких агарозы температуры в 1 x буфер Tris-ЭДТА (TE). Держите агарозы решение на 90 ° C тепла блока непосредственно до загрузки шприц.
  2. Готовят суспензию клеток.
    Примечание: Этот протокол и его связанные microfluidic приборы протестированы для работы с бактериальной клетки, либо из замороженных акции или свежие подготовки. Mammalian клеток, в зависимости от типа клеток, может потребоваться корректировка microfluidic каналов измерений для размещения больших размеров ячеек.
    1. Ресуспензируйте клеток в 1 мл физиологического раствора фосфатного буфера (PBS).
    2. Подсчитать ячейки в Горяева или сортировки потока. 25 microgels мкм с коэффициентом инкапсуляции целевой ячейки 1 в 10 готовим 1 мл суспензии клеток в конечной концентрации 2.4 x 107 кл/мл.
    3. Спина клетки вниз на 3000 x g на 3 мин аспирата супернатант и Ресуспензируйте Пелле клеток в 1 мл 17% v/v плотность градиента среды (см. Таблицу материалы) в PBS. Держите его на льду до загрузки шприца.
  3. Загрузить 3 мл шприца с фторированный масляные (HFE) содержащий 2% w/w perfluoropolyether полиэтилен гликоль (PFPE-PEG) ПАВ, подходят с иглой 27 G и поместить его в шприцевой насос.
    Примечание: Подходят все шприцы с иглой 27 G для microfluidic шаги в этом протоколе. Чтобы снизить риск случайного прокалывания, держите шапки на все иглы до начала работы насоса.
  4. Загрузить суспензию клеток и расплавленный агарозы в 1-мл-шприцы, подходят оба с 27-го калибра иглы и поместите их в шприц насосов.
  5. Держите шприц агарозы и насос теплой с небольшой обогреватель для предотвращения агарозы гелеобразующего в шприц и впускной трубы. Установите обогреватель высокий и поместите его так, чтобы поверхность нагрева около 10 см от шприца. Убедитесь, что температура, измеренная в шприц приблизительно 80 ° C.
    Примечание: Пользователям рекомендуется поддерживать нагреватель на рекомендуемое расстояние от насосных аппарат для снижения риска повреждения оборудования, включая таяние труб.
  6. Генерировать 25 мкм microgel капель с помощью устройства dropmaking совместного потока.
    Примечание: Смотрите Рисунок 3A для схемы, указывающие местонахождение реагент входы и выход устройства.
    1. Иглы для шприцов соединиться microfluidic отверстия устройства, с помощью кусков труб из полиэтилена (ПЭ). Перед вставкой трубы в устройство, премьер насосы для удаления воздуха из строки.
    2. Подключите к розетке кусок трубы и свободный конец в 15 мл коллекции.
    3. Используйте следующие ставки (рекомендуется) потока для dropmaking: 800 мкл/ч для HFE 2% w/w PFPE-Пег; 200 мкл/ч для суспензии клеток в PBS; и 200 мкл/ч за 3% w/v агарозы.
  7. После dropmaking место сбора трубки на 4 ° C на 30 мин для обеспечения полной геля агарозы.

3. разрыв и промывки Microgels агарозы

  1. Удалите нижний слой нефти из коллекции трубки, используя шприц 3 мл с иглой 20 G, стараясь не нарушить верхнего слоя агарозы капель.
  2. Разбейте эмульсии с perfluorooctanol (PFO).
    1. Добавьте 1 мл 10% v/v PFO в HFE агарозы капли. Накапайте это решение вверх и вниз в течение 1 мин тщательно промазывать эмульсии.
      Примечание: Для всех microgel мыть шаги, пипетки решений с наконечником 1000 мкл. Microgel подвеска должна появиться однородной и свободной от сгустков после его закупорить.
    2. Спиновые конические пробки на 2000 x г за 1 мин для сбора microgels агарозы. Удалить супернатант PFO/HFE путем аспирации; microgels теперь свободны от их поверхностно слоя и появится ясно.
  3. Мыть microgels с ПАВ в гексане.
    Предупреждение: Гексан является летучих органических растворителей, и мыть в шаге 3.3 должна проводиться в зонта.
    1. Добавить 2 мл 1% v/v сорбитол, гидрогенкарбонат натрия моноолеат неионогенных поверхностно-активных веществ (см. Таблицу материалы) в гексане агарозы microgels. Накапайте вверх и вниз 10 x смешивать, обеспечивая полный распад microgel гранул.
    2. Вращайте трубу на 1000 x г за 1 мин для сбора microgels. Аспирационная супернатант удалить решение ПАВ/гексан.
    3. Повторите ПАВ/гексан мыть.
  4. Мыть microgels в водный буфера для удаления любого остаточного органического растворителя.
    1. Добавьте 5 мл тет буфера [0,1% v/v octylphenol ethoxylate неионных моющего средства (см. Таблицу материалы) в 1 x TE] конические трубы. Накапайте вверх и вниз 10 x смешивать.
    2. Спиновые конические пробки на 2000 x g для 2 минут для сбора microgels. Аспирационная супернатант удалить буфер тет.
    3. Повторите TET мыть 2 x.
    4. Добавьте 5 мл 1 x TE буфера для конической трубки. Накапайте вверх и вниз 10 x смешивать.
    5. Спиновые конические пробки на 2000 x g для 2 минут для сбора microgels. Аспирационная супернатант удалить буфер TE.
    6. Повторите TE мыть.
  5. Проверьте ячейки инкапсуляции в microgels под микроскопом при 400-кратном путем пятнать 10 мкл Алиготе гелей с 1 x нуклеиновых кислот пятна (см. Таблицу материалы).
    Примечание: Microgels появится ясно под прозрачный канал во время клеток ДНК будет флуоресцировать под GFP канал (497/520 Нм длины волны возбуждения/выбросов). Наложение каналов прозрачной и флуоресцентные покажет клетки в microgels, как показано на рисунке 4A.

4. lysis клеток в агарозном через литические ферменты

  1. Подготовка 1 мл литические фермента коктейль с использованием 800 мкл буфера TE (1 x), 2 мкл литические фермента дрожжей (5 U/мкл сток, 10 ед/мл окончательный), 30 мкл Дитиотреитол (1 М складе, 30 мм окончательный), 60 мг лизоцима (лиофилизированный порошок), 15 мкл ЭДТА (0,5 М складе окончательный 7,5 мм), 2 мкл mutanolysin (100 U/мкл сток, 200 ед/мл окончательный), 2 мкл lysostaphin (10 U/мкл акции, 20 ед/мл окончательный) и 30 мкл рабочего раствора NaCl (1 М складе, 30 мм окончательный).
  2. Добавьте дополнительные TE довести объем до 1 мл. Mix решение по vortexing.
  3. Добавьте всего 1 мл раствора литических ферментов не более 1 мл отмытых microgels. Смешайте дозирования 10 x. Инкубировать смесь при 37 ° C для > 2 ч в шейкере (максимум — ночь инкубации).

5. на основе моющих средств Microgel лечение

  1. После лизиса через литические ферменты (шаг 4) мыть microgels.
    1. Спин вниз microgels на 2000 x g на 2 мин и удалить супернатант. Капельки появится непрозрачный белый из-за мусора клетки рассеяны в гранулы.
    2. Ресуспензируйте microgels в 5 мл буфера Tris-HCl 10 мм и пипетки вверх и вниз 10 x смешивать.
    3. Спина смеси вниз на 2000 x g за 2 мин, а затем удалить супернатант путем аспирации.
  2. Выполните моющим средством лечения на microgels.
    1. Ресуспензируйте гели литий Додециловый сульфат (крышки) литического буфера (0,5% w/v крышки в 20 мм трис-HCl) и 60 мкл 0,5 М ЭДТА в окончательный объем 3 мл.
    2. 5 мкл фермента протеиназы K (800 ед/мл акций). Накапайте вверх и вниз 10 x перемешать, затем инкубировать смесь при 42 ° C на блоке тепла за 1 ч до солюбилизировать последнего клеточных мембран и переваривать белки.
  3. После моющим средством лечения мыть microgels.
    1. Спина коническая труба с microgels вниз на 2000 x g на 2 мин удалить супернатант путем аспирации.
    2. Мыть microgels с 10 мл 2% v/v Полисорбат 20 в воде. Накапайте вверх и вниз 10 x смешивать.
    3. Спиновые конические трубы вниз на 2000 x g на 2 мин, а затем удалить супернатант стремлением.
    4. Мыть microgels с 10 мл 100% этанола в инактивирует любые остаточные фермента. Накапайте вверх и вниз 10 x смешивать.
    5. Спиновые конические трубы вниз на 2000 x g на 2 мин, а затем удалить супернатант стремлением.
    6. Мыть microgels с 10 мл 0,02% v/v Полисорбат 20 в воде. Накапайте вверх и вниз 10 x смешивать.
    7. Спиновые конические трубы вниз на 2000 x g на 2 мин, а затем удалить супернатант стремлением.
    8. Повторите Полисорбат 20 мыть 3 x. Решение пройти через стрейнер ячейки 100 мкм до последнего мыть, чтобы удалить любые крупные сгустки.
  4. Ресуспензируйте microgels в 5 мл буфера Tris-HCl 10 мм для предотвращения деградации ДНК. Microgels может храниться при температуре 4 ° C до 1 недели до tagmentation (шаг 7).

6. Создание штрих-кодов капельки цифровой ПЦР

  1. Подготовьте запас 500-вечера бар грунтовка (Таблица 2) 1 x TE буфера в низкой привязка трубки. Перед каждым использованием размыть грунт для рабочего запас 1 pM и нагреть ее до 70 ° C за 1 мин на блоке тепла.
  2. Подготовка смесь реакции PCR 150 мкл с использованием 75 мкл высокой верности горячий старт мастер смесь (см. Таблицу материалы) (2 x), 42 мкл воды ПЦР класс, 3 мкл DNA_BAR праймера (10 мкм складе, 0,2 мкм окончательный), 3 мкл P7_BAR праймера (10 мкм фондовой 0,2 мкм окончательный), 6 мкл разбавления штрих-кодов (1 pM складе, 40 fM окончательный), 6 мкл Полисорбат 20 (50% v/v штока, 2% окончательного) и 15 мкл PEG 6 k (50% w/v штока, 5% окончательного). Смешайте закупорить вверх и вниз 10 x.
  3. Подготовить при поддержке HFE шприц, нарисовав 200 мкл HFE нефти в шприц и установите его с помощью иглы. Присоединить часть ПЭ трубы к иглы и премьер линии вручную. Вставьте конец трубы PE в целевые решения и аккуратно нарисуйте все 150 мкл, комплекса ПЦР в ПЭ трубы и шприц. Загрузите шприц в шприцевой насос.
  4. Загрузить 1 мл шприца с фторированный масляные (HFE) содержащий 2% w/w perfluoropolyether полиэтилен гликоль (PFPE-PEG) ПАВ, подходят с иглой и поместить его в шприцевой насос.
  5. Генерировать 25 мкм штрих капель с помощью устройства dropmaking совместного потока.
    Примечание: Смотрите Рисунок 3A для схемы, указывающие местонахождение реагент входы и выход устройства.
    1. Подключите входе клетки совместно потока dropmaker устройства с небольшой кусок свинца припой.
    2. Подключите шприцы, загружен с HFE и ПЦР смесь microfluidic отверстия устройства, с помощью кусков труб PE, используя входе Расплавленный агарозы для штрих-кода смесь ПЦР. Перед вставкой трубы в устройство, премьер насосы для удаления воздуха из строки.
    3. Подключите к розетке кусок трубы и свободный конец в 0.2 мл ПЦР-пробирку. Используйте следующие ставки (рекомендуется) потока для dropmaking: 600 мкл/ч для HFE 2% w/w PFPE-КОЛЫШЕК и 200 мкл/ч для смеси ПЦР. Сбор капель в ПЦР-пробирки с примерно 50 мкл капель в каждой тюбике.
  6. После dropmaking осторожно удалите нижний слой HFE нефти из эмульсии, используя гель загрузки накапайте советы и заменить его с маслом фторированные FC-40, содержащая 5% w/w PFPE-PEG ПАВ. Тепловой цикл с следующий протокол: 98 ° C в течение 3 мин, 40 x (98 ° C 10 s, 62 ° C в течение 20 сек, 72 ° C для 20 s), 72 ° C за 5 минут и затем провести на 12 ° C.
    Примечание: Тепловой циклическое капельки могут храниться при температуре 4 ° C до 1 дня.
  7. Проверьте уровень усиления и инкапсуляции штрих-кода.
    1. Подготовить 1 x нуклеиновых кислот пятна (см. Таблицу материалы) в HFE с 2% w/w PFPE-PEG ПАВ; пятно незначительно смешивается в HFE и будет привязан к ДНК в капли.
    2. 1 мкл тепловой циклическое штрих эмульсии, до 10 мкл окрашивание нефти. Инкубируйте их на 5 минут при комнатной температуре.
    3. Изображение капельки, флуоресцентной микроскопии (GFP канала, волны возбуждения/выбросов 497/520 Нм) на 200 крат и рассчитывать уровень инкапсуляции штрих-кода. Обратите внимание, что сигнал будет дискретные: капли, содержащие усиливается штрих-кодов будет флуоресцировать ярко, тогда как пустой капли появится темный (рис. 4В).

7. Tagmentation геномной ДНК в капельках

Примечание: Смотрите Рисунок 2B.

  1. Подготовка 500 мкл раствора tagmentation с использованием реагентов от подготовки следующего поколения последовательности библиотеки комплекта (см. Таблицу материалы). Использование 7 мкл tagmentation фермента, 250 мкл буфера tagmentation и 243 мкл воды ПЦР класса. Смешайте их с vortexing и спина смеси вниз для сбора. Загрузить это решение в HFE при поддержке нефти 1 мл шприц и установите его с помощью иглы.
  2. Подготовка microgels пласт.
    1. Спин вниз трубки microgel 2 мин на 2000 x g и удалить супернатант. Передать в верхней части при поддержке HFE шприц с кончиком пипетки гель Загрузка 200 мкл гелей и уплотнение сопла с небольшой кусок ленты.
    2. С помощью 3D-печати центрифуги адаптера (см. Дополнительные файлы 1 и 2), спина microgel шприц 3 мин на 3000 x g.
    3. Удалите жидкость супернатант из шприца с помощью кончика пипетки гель загрузки. Нажмите microgel слоя к основанию сопло шприц. Соответствовать шприц с иглой.
  3. Загрузить 3 мл шприца с фторированный масляные (HFE) содержащий 2% w/w perfluoropolyether полиэтилен гликоль (PFPE-PEG) ПАВ, подходят с иглой и поместить его в шприцевой насос.
  4. Повторно инкапсулировать microgels в капли, содержащие tagmentation реагентов.
    Примечание: Смотрите рисунок 3B для схемы, указывающие местонахождение реагент входы и выход устройства.
    1. Соедините шприцы, содержащие HFE, смесь tagmentation и microgels в отверстия устройства microfluidic, используя кусочки ПЭ трубы. Перед вставкой трубы в устройство, премьер насосы для удаления воздуха из строки.
    2. Подключите к розетке кусок трубы и свободный конец в пустой шприц 1 мл с плунжера, обращается к линии 1 мл.
    3. Используйте следующие ставки (рекомендуется) потока для dropmaking: 2000 мкл/ч для HFE 2% w/w PFPE-PEG, 200 мкл/ч для microgels и 500 мкл/ч для tagmentation смеси.
  5. Проверьте уровень инкапсуляции microgel под микроскопом света на 400 X увеличением. Примерно 80-90% капли должен содержать microgel, как показано на рисунке 4 c.
  6. Соответствовать содержащие tagmentation эмульсии с иглой шприца и инкубировать вертикально в блоке тепла или духовке в течение 1 ч при 55 ° C для фрагмента геномной ДНК.

8. одноклеточных штриховое кодирование Microfluidic двойной слияния

Примечание: Смотрите Рисунок 2 c.

  1. Подготовьте штрих капельки для слияния, заменив фракций нефти FC-40 с HFE 2% w/w PFPE-КОЛЫШЕК. Тщательно передавать эти капли в 1 мл шприц, подходят с иглой и поместить его в шприцевой насос.
  2. Загрузите коммерсантам и tagmented microgel капли шприц в шприцевой насос.
  3. Подготовка 500 мкл, комплекса ПЦР. Добавьте реагентов в следующем порядке для предотвращения формирования осадков: 140 мкл воды ПЦР класса, 10 мкл P5_DNA грунт (10 мкм складе, 0,2 мкм окончательный), 10 мкл P7_BAR грунт (10 мкм складе, 0,2 мкм окончательный), 50 мкл PEG 6k (50% w/v фондовой 5% окончательный), 50 мкл Полисорбат 20 (50% v/v штока, 5% окончательный), 250 мкл Taq Мастер микс (2 x) (см. Таблицу материалы), 10 мкл изотермический полимеразы (см. Таблицу материалы) и 10 мкл буфера нейтрализации (см. Таблицу материалы). Смешайте их закупорить вверх и вниз 10 x и спина смеси вниз, чтобы собрать его. Загрузить это решение в поддержке HFE 1 мл шприц, подходят с иглой и поместить его в шприцевой насос.
  4. Нагрузки три 3-мл шприцы с фторированный масляные (HFE) содержащий 2% w/w perfluoropolyether полиэтилен гликоль (PFPE-PEG) сурфактанта, подходят друг с иглой и поместите их в шприц насосов.
  5. Загрузить три шприцы 1 мл с 2 М NaCl, подходят друг с иглой и отложите их в сторону.
  6. Слияние штрих капли, капли геном tagmented, и ПЦР смешать с использованием двойной слияния устройства.
    Примечание: Для схемы, указывающие местонахождение реагента и электродом входы и выход устройства см.
    1. Подключите 3 NaCl Шприцы 2 электрод входов и один ров inletusing штук PE труб. Для электродов приложите давление к шприцы вручную до тех пор, пока электроды полностью заполнены раствором соли. После заполнения электродов, давление ручной ров шприца до тех пор, пока заполнен ров. Подключите свободный конец ров с небольшой кусок свинца припой.
    2. Подключите 3 HFE шприцы, монтируется на насосы 2 Распорка вводы для масла и dropmaking масла inletusing штук PE труб. Перед вставкой трубы в устройство, премьер насосы для удаления воздуха из строки.
    3. Подключите шприца смеси ПЦР, microgel капли шприц, и штрих-кодов падает шприца до их соответствующих входов с помощью трубы PE. Стрелять все капли пласт трубки с антистатической пистолет перед подключением их к иглы шприца; Антистатическая обработка уменьшает риск капелька коалесценции индуцированных статических зарядов на ПЭ трубы.
    4. Подключите к розетке кусок трубы PE и свободный конец в 0.2 мл ПЦР-пробирку.
    5. Подключите иглу шприца электрода к холодным катодом флуоресцентные инвертора с помощью Аллигатор клип. Установите инвертор постоянного тока 2 V.
    6. Запустите устройство двойной слияния с рекомендуемой расхода: 300 мкл/ч для tagmented microgel капель, 100 мкл/ч для капель штрих, 1500 мкл/ч для HFE 2% w/w PFPE-ПЭГ (dropmaking масло), 600 мкл/ч для амплификации смесь, 200 мкл/ч (PFPE-PEG HFE 2% w/w Штрих-код разделители нефти) и 700 мкл/ч для HFE 2% w/w PFPE-ПЭГ (microgel прокладку нефти). Сбор капель в ПЦР-пробирки с приблизительно 50 мкл эмульсии в каждой тюбике.
  7. До термальных Велоспорт, осторожно удалите нижний слой HFE нефти из эмульсии, используя гель загрузки накапайте советы и заменить их с маслом фторированные FC-40, содержащая 5% w/w PFPE-PEG ПАВ. Тепловой цикл с следующий протокол: 65 ° C за 5 мин., 95 ° C на 2 мин, 30 x (95 ° C в течение 15 сек, 60 ° C в течение 1 мин., 72 ° C в течение 1 мин), 72 ° C за 5 мин, затем провести на 12 ° C.
  8. Восстановить перепутываются ДНК от тепловой циклическое капельки.
    1. Бассейн капель в пробки microcentrifuge и разорвать с помощью 20 мкл PFO эмульсии. Вортекс для 10 s смешивать.
    2. Вращайте трубу на 10000 x g за 1 мин фракционировать смеси в водной (вверху) и фаз нефть (внизу). Осторожно удалите верхний водный слой из трубки с помощью пипетки и перенести его на новые пробки microcentrifuge. Отказаться от масляной фазы.
    3. Очистить продукт PCR перепутываются в спин столбца в зависимости от производителя протокол и элюировать в 20 мкл 1 x TE буфера.
    4. Перейти к выполненных последовательности и анализа согласно шаги 9 и 10.

9. Библиотека подготовка и последовательности

  1. Подготовьте библиотеку одной ячейки для виртуализации, следуя производителя протоколы для выбора размера фрагмента и количественной оценки.
  2. Последовательность в паре конец библиотека с химии по умолчанию для чтения 1 и 2 читать. Используйте пользовательский индекс 1 грунт I7_READ (Таблица 2) для 15-ВР индекс, читать, соответствующий одной ячейки штрих-кода.

10. одной ячейки данных анализа

Примечание: Пользовательские Python скриптов для контроля качества и предварительный анализ данных НИЦ seq можно загрузить с https://www.github.com/AbateLab/SiC-seq.

  1. Запустите сценарий «barcodeCleanup.py» для контроля качества на перепутываются читает и экспортировать данные одной ячейки в базе данных SQLite. Для управления эксперимента, использовать этот сценарий с «-выравнивание «флаг для выравнивания читает в известных справочных геномов.
  2. Анализ чистоты групп штрих-кодов (для эксперимента управления) с помощью сценария «purity.py» и подтвердите значения высокой чистоты, в соответствии с Рисунок 6B.

Representative Results

SiC-seq экспериментального рабочего процесса содержит 3 PDMS microfluidic приборы изготовлены с использованием мягкой литографии процедуры (рис. 1). Dropmaker совместного потока (рис. 3A) генерирует 25 мкм капелек цифровой штрих-кодов для маркировки геномной ДНК с уникальным идентификатором одноклеточных. Штрих-код олигонуклеотиды состоят из 15 bp вырожденный последовательности окружении ПЦР ручки для амплификации (Таблица 2, Бар грунт). Штрих-коды являются разбавляют до femtomolar концентрации для достижения одной молекулы инкапсуляция, и все капельки получить либо 0, либо 1 Штрих-код fragment(s). Капли, содержащие штрих усиливаются, приносит много копий ампликонов двунитевая штрих. Пятно нуклеиновая кислота используется для проверки успешного амплификации и количественно оценить уровень инкапсуляции фрагментов штрих-кодов (рис. 4B). Microgels создаются совместно течет бактериальной клетке подвеска и расплавленный агарозном геле на равных расхода (рис. 2A). Агарозы готовится в два раза желаемой конечной концентрации, как dropmaking процесс совместного потока эффективно разбавляет водные растворы с коэффициентом 2. Как агарозы охлаждается, она застывает в microgel диаметр 25 мкм, занимая сферический объем капли.

Ряд шагов мыть и lysis очищает высокий молекулярный вес геномной ДНК в microgels (рис. 2B). После разрыва эмульсии, водный моет осуществляется в больших объемах разбавлять из трассировки органических растворителей, которые могут препятствовать вниз по течению ферментативной обработки. Промывают microgels наблюдаются под микроскопом, чтобы проверить уровень инкапсуляции клеток (рис. 4A). Коктейль с широким литические активность ферментов добавляется к microgel подвеска переваривать клеточной стенки бактерий и эукариот микробы19. Второй лечение с протеиназы K и моющих средств ухудшает белков и solubilizes клеток мусора.

Tagmentation очищенная ДНК осуществляется в капли, чтобы избежать потенциальных кросс загрязнение в результате диффузии фрагментов ДНК малых tagmented между microgels18. Капелька инкапсуляции устройство (рис. 3B) compartmentalizes каждый microgel с буфера и tagmentation фермента, который одновременно фрагменты двуцепочечной ДНК, а также «меток» его с предустановленной олигонуклеотида20. Microgels загружаются в капли, как закрыть упакованы частицы, достижение инкапсуляции ставки приближается к 1 microgel за каждую каплю с несколько Дуплеты21 (рис. 4 c).

На последнем шаге microfluidic рабочего процесса (рис. 2 c) устройство выполняет операцию двойной слияния, объединения 1 капля штрих, 1 капля microgel содержащих и усиления смеси в контролируемых двухэтапный процесс. Во-первых капли, содержащие ПЦР реагента в паре и объединилась с каплей штрих в регионе, показанными желтым (рис. 5). Морская электродов в канале microfluidic производят высокое электрическое поле градиента, который вызывает капельки слияния. Аналогичным образом Первый Объединенный капелька в паре с microgel капли и объединены во второй раз в этом регионе, показаны красным цветом. Капли, собираются и тепловой циклическое Выкл чип в сингл перекрытие расширение (SOE) ПЦР. Перекрывающиеся взаимодополняющих концы штрих-кодов и tagmented геномной ДНК позволяют фьюжн и экспоненциальная амплификации только правильно перепутываются конструкций.

Последовательность данных сначала фильтруется путем чтения качества и затем анализируется путем группировки читает согласно их 15-ВР одной ячейки штрих последовательности. Для группы штрих-код будет считаться действительным он должен содержать минимальное количество операций чтения; Этот порог ограничивает анализ клеток с полезным объемом последовательность данных и удаляет ПЦР мутировал штрих-код «сирот» из набора данных. В этом примере Запуск минимум равным 7,5 кбит/с на группы (50 читает 150 bp каждый). Гистограмма отсчеты штрих против размера группы показывает, что значительная часть групп действует штрих чуть выше порогового размера (Рисунок 6A).

В эксперименте управления, где известен состав микробных сообществ чистоту и относительное изобилие метрики используются для оценки качества SiC-seq запуска. Здесь анализируется синтетических 10-клеточной сообщество, состоящее из 3 грамотрицательных бактерий, 5 грам-положительных бактерий и дрожжей 2. Чистоту данный штрих-код группы определяется как количество операций чтения, сопоставление с наиболее распространенными генома в группе, деленное на общее количество операций чтения в группе. Подавляющее большинство штрих-кодов групп имеют чистоты более 0,95 (Рисунок 6B). Относительное обилие типов клеток вычисляется путем подсчета сырье читает и подсчета групп штрих-кода, где группы назначаются ячейки типа, соответствующего консенсуса ее членов читает (рис. 6 c). Обилие читает и штрих-кодов групп трек в примерно в равных пропорциях, указав, что популяции клеток отбираются таким образом, что некоторые виды не содержатся в группах непропорционально малыми или большими штрих. Заговоре совокупного охвата всех штрих-кодов групп из одного вида указывает высокий охват через весь геном, с мало или совсем нет отсева регионами (рис. 7). Однородность покрытия могут быть проверены с частотного распределения значений нормализованного покрытия, с большинство вокруг среднего значения (рис. 7, вставка).

Figure 1
Рисунок 1 : Изготовление microfluidic приборы фотолитографии. (A) мастер формы с одной функции высоты изготавливаются спина, покрытие слоем Су-8 фоторезиста на кремниевой пластины. Фоторезист затем узором с офсетным маски и УФ-излучения, сшивки подвергаются Су-8. Наконец uncrosslinked Су-8 растворяется в ванну разработчика. Результирующая форма используется для приведения PDMS который тычковой стекла слайд производить полная microfluidic устройства. ()B) для устройства двойного слоя, изготовление аналогично начинается с спин покрытие и воздействия мер. Затем эти шаги повторяются для создания устройства два слоя. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: Обзор процесса SiC-seq. (A) A микробной подвеска совместно потекла с расплавленной агарозы в dropmaker устройства для инкапсуляции единичных клеток в microgels. (B) microgels подвергаются серии смывки для очистки бактериальной геномной ДНК. Литические ферменты дайджест клеточной стенки грамположительных бактерий и дрожжей, и моющего средства solubilizes сотовой мусора. Microgels повторно инкапсулированное в капельки для tagmentation для уменьшения загрязнения. (C) слияние microfluidic сочетает цифровой штрих ПЦР, геном microgel tagmented и усиления микс со скоростью > 1 кГц. -Чип SOE-ПЦР соединительные уникальный штрих одной ячейки на геном tagmented и выборочно усиливается полностью перепутываются конструкции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: Microfluidic приборы для dropmaking и microgel вновь инкапсуляции. (A) Эта группа показывает Сопредседатель потока dropmaker (25 мкм функция высоты). Клетки и расплавленный агарозы вводятся в устройство на равных расхода производить 25 мкм капельки на перекрестке 25 мкм x 25 мкм. Для цифровой штрих-код dropmaking входной ячейки подключен, и ПЦР смесь вводится в входе агарозы. (B) Эта группа показывает устройство повторно инкапсуляции microgel (25 мкм функция высоты). Microgels потока на входе, воронкообразные, поддерживать их Упакованные закрыть заказ и получить объем смеси tagmentation до повторного инкапсуляции на перекрестке 25 мкм x 30 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4 : Микроскопии капель и microgels. (A) Эта группа показывает промывают 25 мкм microgels до ферментативные lysis. Бактерии дневно витражи для количественной оценки уровень инкапсуляции. Статистика загрузки Пуассона диктовать, что клетки должен быть инкапсулированным в размере 1 в 10 капель или меньше, чтобы свести к минимуму частоту инкапсуляции нескольких событий. (B) Эта группа показывает образ микроскопии флуоресцирования капелек 25 мкм цифровой штрих относились с пятно нуклеиновых кислот. Капли, содержащие фрагменты амплифицированного штрихкода производят сильное флуоресценции сигнала. (C) Эта группа показывает microgels, повторно инкапсулирован в 50 мкм капель. Закрыть упаковка microgels позволяет для инкапсуляции ставки приближается 1 лари за падение с несколько Дуплеты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5 : Microfluidic двойной слияния устройство для одноклеточных генома штрихкодирования. Двух этапная операция слияния пары капель штрих с геном tagmented на высокой пропускной способностью. Капли смеси ПЦР впервые создается и объединена с капельку штрих в регионе, показанными желтым, используя электроды, соленой воды. Далее капли, содержащие microgel вводится и объединены во второй раз в этом регионе, показаны красным цветом. Вводы для масла позволяют для точного контроля расстояния между закачиваемый капельки. Палата пласт штрих-кода и его разделители нефти размещаются на слое короче 25 мкм, закрашены синим. Все другие функции устройства принадлежат к толще слой с 45 мкм общей высоты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 6
Рисунок 6 : Штрих групповых метрик для синтетических микробной сообщества 10-клеточной. (A) Эта группа показывает распределение штрих-код группы размеров. Количество групп заданного размера уменьшается экспоненциально, как увеличивается размер группы. Минимальный порог 7,5 кбит/с на группы ограничивает анализ групп с достаточным количеством информации и удаляет ПЦР мутировал последовательности «сирот». (B) Эта группа показывает распределение штрих группы чистоты. Подавляющее большинство (> 90%) групп являются весьма высокой чистоты (> 95%). (C) Эта группа показывает относительное обилие 10 видов, рассчитаны на уровне группы чтения и штрих-кодов. 2, подсчитывая методы производят аналогичные результаты, указывая, что штрих-код группы размеров последовательной различных видов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 7
Рисунок 7 : Совокупные геномной освещение Сенная палочка штрих-кодов групп. Читает из всех групп штрих, сопоставление с бактериями B. subtilis (N = 9,398) объединяются и анализируются в совокупности. Круговой охват Карта иллюстрирует однородности покрытия SiC-seq гласит, с регионами не наблюдаемый отсева. Пунктирная линия вокруг окружности указывает среднее покрытие (5,55 x). Врезные гистограмма относительные показатели охвата частот показывает, что основная часть основания покрыты на глубине около генома общесистемной среднем, представлены пунктирной линией. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Устройство 1 Высота слоя (мкм) 1-й слой спина скорость (об/мин) 2 Высота слоя (мкм) 2-й слой спина скорость (об/мин)
Совместное потока dropmaker 25 4000 Н/Д Н/Д
Повторное encapsulator гель 25 4000 Н/Д Н/Д
Двойной слияния 25 4000 20 5000

Таблица 1: Параметры изготовления устройств Microfluidic. Эта таблица показывает список microfluidic устройств, используемых в рабочем процессе SiC-seq с их требуемые скорости для фоторезиста спин покрытие (основанный на спецификации производителя для Су-8 3025).

Лейбл Последовательность (5' > 3')
БАР GCAGCTGGCGTAATAGCGAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGNNNNNNNNNNNNNNNTAAGCCAGCCCCGACACT
DNA_BAR CTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGACGTGTCGGGGCTGGCTTA
P7_BAR CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCAGCTGGCGTAATAGCG
P5_DNA AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGTCGGCAGCGTC
I7_READ GCCCACGAGACGTGTCGGGGCTGGCTTA

Таблица 2: Грунтовка последовательностей.

Дополнительный файл 1: Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 2: Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Discussion

SiC-seq microfluidic процесс производит одноклеточных геном последовательности данных из тысяч бактериальных клеток. Цифровая штрих, сращивания на геномы microgel инкапсулированные клетки позволяют в silico деконволюция NGS данных в группы гласит перепутываются, происходящих из той же клетке. Управления эксперимент с микробной сообщества известные композиции является необходимым для оценки чистоты штрих-кодов групп. Значительная часть групп низкой чистоты указывает, что ячейки инкапсуляции скорость слишком высока или что существует значительный капелька перекрестное загрязнение происходящих во время обработки microfluidic шаги. Согласно статистике Пуассона штрих-кодов и клетки должны инкапсулироваться в целевой соотношении 1 частиц на каждые 10 капель ограничить скорость несколько инкапсуляции событий до менее чем 5% всех непустых капель. Инкапсуляция ставки выше, чем это увеличивает ставки Дуплеты экспоненциально, поэтому проверка коэффициента инкапсуляции во время процесса dropmaking имеет решающее значение. Пользователи должны быть особенно осторожны инкапсуляции нескольких ячеек в одну microgel, потому что читает из различных клеток, совместного использования одной и той же последовательности штрих-код не может быть bioinformatically отдельно. В случае 1 ячейка получает 2 различных штрих-кодов, штрих-код группы чистоты не влияет, хотя обилие метрики являются перекос при подсчете последовательностью штрих.

Капелька перекрестного загрязнения могут также возникнуть из-за условий субоптимальные слияния. Во время успешной операции microfluidic слияния устройство (рис. 5) можно controllably пара 1 капля штрих-код с 1 microgel и объем реагента ПЦР. Скорости потока non идеал приведет к капельку сопряжения на неправильное соотношение: 1 Штрих-код может быть в паре с 2 microgels, например. Все скорости потока, перечисленных в протоколе предназначены для оценки и может должны быть скорректированы в зависимости от незначительные колебания в размерах геометрии и капелька устройства. Пользователи с доступом к камерам с возможностями высокоскоростной записи (> 10 000 кадров в секунду) следует проверить правильный капелька слияния в начале и в течение microfluidic операции. Пользователи, не имеющие доступа к высокоскоростной камеры можно собрать небольшой объем слияния вывода и вручную измерения размеров капли под микроскопом. Размер капли должны быть однородным: избыток Необъединенное штрих-кодов или капли microgel указывает, что пласт ставки должна быть уменьшена соответственно.

Некоторые общие меры предосторожности следует при обработке microgels и microdroplets для сохранения их целостности. Microgels, хотя механически прочный, должны достаточно остынет до ломать и мытье шаги для обеспечения полной гелеобразование. Несферические microgels являются свидетельством того, что агарозы не было предоставлено достаточное время для затвердеть. При стирке microgels, спина суспензий вниз на требуемые скорости, чтобы избежать потери продукта. Гидрогель агарозы имеет преломления тесно соответствие воды и может быть трудно увидеть в трубку22, так что пользователям следует тщательно определить границы гель жидкость до аспирации. Капельки воды в нефти подвержены коалесценции наращивание статические силы23 на лабораторных перчаток и труб. По этой причине мы рекомендуем загрузки капелька пласт шприцы с голыми руками и лечения все линии пласт с пушкой антистатические до грунтовки насоса. Большое объединенное капельки могут быть удалены, медленно вращающийся эмульсии в шприц и вручную аспирационных большие капли, которые накапливаются в верхней из-за их больших сила.

SiC-seq является первой технологии для демонстрации одной ячейки генома из > 50,000 бактериальной клетки. Эта платформа предлагает значительные преимущества в пропускной способности на существующих подходов и позволяет глубже выборки гетерогенных микробных сообществ. На сегодняшний день microfluidic технологии для одной ячейки генома использовали microchambers9 и microwells24 ячейки изоляции и усиления, но с производительностью в диапазоне только десятков до сотен клеток. Сортировки потока одиночных клеток в wellplates5,6 требует не специализированные microfluidic приборы, но обладает аналогичным образом низкую пропускную способность. Учитывая, что образцы почвы и воды от окружающей среды обычно имеют альфа разнообразности > 1000 видов на уровне25,26, SiC-seq очень выгодно, в силу своей способности к образцу гораздо большее количество организмов. SiC-seq рабочий процесс адаптации клетки входы от Лаборатория культуры, окружающей среды или живые принимающей. Образец клеток нужно только быть в водной суспензии и свободной от крупных частиц (> 10 мкм) чтобы быть пригодным для инкапсуляции microfluidic. Например метод был применен ранее к выборке из морской воды с помощью ряда мыть и фильтрации шаги, чтобы предварительно обработать клетки до инкапсуляции17.

SiC-seq протокол создает сравнительно разреженные количество последовательности данных из каждой одной ячейки и не могут быть пригодны для всех приложений. Некоторые алгоритмы биоинформатики например de novo генома Ассамблеи или единичных нуклеотидных вариант (SNV) вызова требуют большей глубины охвата для эффективной работы. Вместо этого штрих-код группы могут быть кластеризованный в silico таксономических биннинга методы27 так что алгоритмы могут быть применены на большие наборы гласит. Относительно низкая эффективность штриховое кодирование SiC-seq рабочего процесса могут также представлять проблемы в тех случаях, когда наличие образца ввода является низким. НИЦ seq опирается на шаг инкапсуляции Пуассона распределены штрих, поэтому примерно 10% клеток получают молекулярной штрих-кодов и усиливаются на этапе подготовки окончательного библиотеки. Хотя это сопоставима с других схем на основе микрокапель штриховое кодирование10, пользователи, работающие с драгоценными клеток образцов могут испытывать трудности в достижении адекватного библиотека доходность для секвенирования и может потребоваться увеличить число циклов PCR в финале шаг амплификации. Другим потенциальным решение для пользователей с microfluidic опыт является сортировка положительных штрих капельки после этапа цифровой ПЦР, результате чего общей эффективности штриховое кодирование > 85%28.

Потенциального будущего направления для технологии SiC-seq адаптация рабочего процесса для использования с mammalian клеток, проложив путь для новых клинических исследований одноклеточных. Например, анализ числа вариаций копии среди один рак клеток мая далее наше понимание роли гетерогенность рака патологии2. Кроме того интеграции с существующими методами зонда и обогатить последовательностей ДНК интерес29 SiC-seq позволит Целевой последовательности одноклеточных субпопуляций или редких штаммов клеток. С экологические пробы гены от в пределах известных метаболический путь может целевых и контекстуально проанализированы вместе с соседней генов для выявления роман геномной острова. Из внутри человека хост-среды, низкий титр патогенных бактерий образцы могут быть изолированы и виртуализации на уровне одной ячейки для изучения более тесно их генотипической происхождение вирулентности.

Disclosures

Патентов, относящихся к этот рабочий процесс может быть лицензированы для био миссии, из которой Abate р. Адам является акционером.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана национального научного фонда через CAREER Award (номер гранта DBI-1253293); Национальные институты здравоохранения (NIH) (Грант № HG007233-01, R01-EB019453-01, 1R21HG007233, DP2-AR068129-01, R01-HG008978); и обороны передовых исследовательских проектов Агентства живущих литейные программа (номера контрактов, Номера HR0011-12-C-0065, N66001-12-C-4211, HR0011-12-C-0066).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3" silicon wafers, P type, virgin test grade University Wafers 447
SU-8 3025 photoresist Microchem 17030192
Spin coater Specialty Coating Systems G3P-8
Photomasks CadArt Servcies (custom) See Supplemental Files for mask designs
PGMEA developer Sigma-Aldrich 484431
Isopropanol Sigma-Aldrich 109827
Sylgard 184 silicone elastomer kit Krayden 4019862
Degassing chamber Bel-Art 42025
0.75 mm biopsy punch World Precision Instruments 504529
Glass microscope slides (75 mm x 50 mm) Corning 294775X50
Aquapel (hydrophobic glass treatment) Pittsburgh Glass Works 47100
PE-2 polyethylene tubing Scientific Commodities B31695-PE/2
1 mL syringes BD 309628
27 gauge needles BD 305109
Syringe pump New Era Pump Systems NE-501
Novec HFE-7500 fluorinated oil (HFE) 3M 98-0212-2928-5
FC-40 fluorinated oil Sigma-Aldrich F9755
PEG-PFPE surfactant Ran Biotechnologies 008-FluoroSurfactant
Space heater Lasko  CD09250 
Agarose, low gelling temperature Sigma-Aldrich a9414
TE (10X) Rockland mb-007
PBS 1X, pH 7.4 E&K Scientific Products EK-65083
OptiPrep (density gradient medium) Sigma-Aldrich d1556
1H,1H,2H-Perfluoro-1-Octanol (PFO) Sigma-Aldrich 370533
Span 80 (sorbitane monooleate) Sigma-Aldrich s6760
Hexane Sigma-Aldrich 139386
Tween 20 (polysorbate 20) Sigma-Aldrich p2287
Lysozyme Type IV MP Biomedicals 195303
Mutanolysin Sigma-Aldrich M9901
Zymolyase (yeast lytic enzyme) Zymo Research e1004
Lysostaphin Sigma-Aldrich L7386
Sodium chloride Sigma-Aldrich S9888
EDTA Sigma-Aldrich E6758
Tris-HCl, pH 7.5, 1M Invitrogen 15567-027
Dithiothreitol (DTT) Teknova d9750
Lithium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich L9781
Proteinase K New England Biosciences P8107S
Ethanol, 200 Proof (100%) Koptec V1001
SYBR Green I (nucleic acid stain) Invitrogen S7563
PEG 6k Sigma-Aldrich 81260
Triton X-100 (octylphenol ethoxylate) Sigma-Aldrich t8787
Nextera DNA Library Prep Kit Illumina FC-121-1030
Phusion Hot Start Flex Master Mix (High-Fidelity Hot Start Master Mix) New England Biosciences m05365
Platinum Multiplex PCR Master Mix (Taq Master Mix) Applied Biosystems 4464263
Warmstart 2.0 Bst Polymerase (isothermal polymerase) New England Biosciences m0538m
NT buffer from Nextera XT kit (neutralization buffer) Illumina FC-131-1024
Cold cathode fluorescent inverter (custom) (custom)
DC power supply Mastech HY1503D
Zerostat 3 anti-static gun Milty 5036694022153
3D-printed centrifuge syringe holder (custom) (custom) See Supplemental Files for 3D print file
Zymo DNA Clean & Concentrator-5 Zymo Research D4003

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Navin, N., et al. Tumour evolution inferred by single-cell sequencing. Nature. 472 (7341), 90-94 (2011).
  2. Ni, X., et al. Reproducible copy number variation patterns among single circulating tumor cells of lung cancer patients. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 21083-21088 (2013).
  3. Schmidt, H., Hensel, M. Pathogenicity islands in bacterial pathogenesis. Clinical Microbiology Reviews. 17, 14-56 (2004).
  4. Martínez, J. L., Baquero, F. Interactions among strategies associated with bacterial infection: pathogenicity epidemicity, and antibiotic resistance. Clinical Microbiology Reviews. 15 (4), 647-679 (2002).
  5. Rinke, C., et al. Obtaining genomes from uncultivated environmental microorganisms using FACS-based single-cell genomics. Nature Protocols. 9 (5), 1038-1048 (2014).
  6. Rinke, C., et al. Insights into the phylogeny and coding potential of microbial dark matter. Nature. 499 (7459), 431-437 (2013).
  7. Zhang, H., Liu, K. K. Optical tweezers for single cells. Journal of the Royal Society Interface. 5 (24), 671-690 (2008).
  8. Xu, L., Brito, I. L., Alm, E. J., Blainey, P. C. Virtual microfluidics for digital quantification and single-cell sequencing. Nature Methods. 13 (9), 759-762 (2016).
  9. Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. Dissecting the clonal origins of childhood acute lymphoblastic leukemia by single-cell genomics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (50), 17947-17952 (2014).
  10. Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  11. Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
  12. Rotem, A., et al. High-throughput single-cell labeling (Hi-SCL) for RNA-Seq using drop-based microfluidics. PLoS One. 10 (5), 1-14 (2015).
  13. Amini, S., et al. Haplotype-resolved whole-genome sequencing by contiguity-preserving transposition and combinatorial indexing. Nature Reviews Genetics. 46 (12), 1343-1349 (2014).
  14. Zheng, G. X. Y., et al. Haplotyping germline and cancer genomes with high-throughput linked-read sequencing. Nature Biotechnology. 34 (3), 303-311 (2016).
  15. Lan, F., Haliburton, J. R., Yuan, A., Abate, A. R. Droplet barcoding for massively parallel single-molecule deep sequencing. Nature Communications. 7, 11784 (2016).
  16. Rotem, A., et al. Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state. Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).
  17. Lan, F., Demaree, B., Ahmed, N., Abate, A. R. Single-cell genome sequencing at ultra-high-throughput with microfluidic droplet barcoding. Nature Biotechnology. 35 (7), 640-646 (2017).
  18. Novak, R., et al. Single-cell multiplex gene detection and sequencing with microfluidically generated agarose emulsions. Angewandte Chemie Internation Edition. 50 (2), 390-395 (2011).
  19. Gill, C., Van De Wijgert, J. H. H. M., Blow, F., Darby, A. C. Evaluation of lysis methods for the extraction of bacterial DNA for analysis of the vaginal microbiota. PLoS One. 11 (9), 1-16 (2016).
  20. Picelli, S., et al. Tn5 transposase and tagmentation procedures for massively scaled sequencing projects. Genome Research. 24 (12), 2033-2040 (2014).
  21. Abate, A. R., Chen, C. H., Agresti, J. J., Weitz, D. A. Beating Poisson encapsulation statistics using close-packed ordering. Lab on a Chip. 9 (18), 2628 (2009).
  22. Jain, A., Yang, A. H. J., Erickson, D. Gel-based optical waveguides with live cell encapsulation and integrated microfluidics. Optic Letters. 37 (9), 1472 (2012).
  23. Karbaschi, M., Shahi, P., Abate, A. R. Rapid chemical-free breaking of microfluidic emulsions with a hand-held antistatic gun. Biomicrofluidics. 11 (4), 1-6 (2017).
  24. Gole, J., et al. Massively parallel polymerase cloning and genome sequencing of single cells using nanoliter microwells. Nature Biotechnology. 31 (12), 1126-1132 (2013).
  25. Chao, Y., et al. Metagenomic analysis reveals significant changes of microbial compositions and protective functions during drinking water treatment. Scientific Reports. 3 (1), 3550 (2013).
  26. Fierer, N., et al. Cross-biome metagenomic analyses of soil microbial communities and their functional attributes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (52), 21390-21395 (2012).
  27. Mande, S. S., Mohammed, M. H., Ghosh, T. S. Classification of metagenomic sequences: methods and challenges. Briefings in Bioinformatics. 13 (6), 669-681 (2012).
  28. Eastburn, D. J., et al. Microfluidic droplet enrichment for targeted sequencing. Nucleic Acids Research. 43 (13), e86 (2015).
  29. Clark, I. C., Abate, A. R. Finding a helix in a haystack: nucleic acid cytometry with droplet microfluidics. Lab on a Chip. 17 (12), 2032-2045 (2017).

Tags

Биоинженерия выпуск 135 микрофлюидика microdroplets одноклеточных геномики метагеномики секвенирование нового поколения молекулярные штриховое кодирование
Microfluidic платформа сверхвысокой пропускной способности для одной ячейки генома
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Demaree, B., Weisgerber, D., Lan,… More

Demaree, B., Weisgerber, D., Lan, F., Abate, A. R. An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing. J. Vis. Exp. (135), e57598, doi:10.3791/57598 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter