Summary
Det overordnede mål med polysome profilering teknik er analyse af translationel aktivitet af individuelle mRNAs eller transkriptom mRNAs under proteinsyntesen. Metoden er vigtigt, at undersøgelser af protein syntese forordning, oversættelse aktivering og undertrykkelse i sundhed og flere sygdomme hos mennesker.
Abstract
Ordentlig protein udtryk på det rigtige tidspunkt og i de rigtige mængder er grundlaget for normal cellefunktion og overlevelse i et hurtigt skiftende miljø. I lang tid, var gene expression undersøgelser domineret af forskning på det transkriptionel niveau. Men steady state niveauer af mRNAs korrelere ikke godt med protein produktion, og translatability af mRNAs varierer meget afhængigt af betingelserne. Nogle organismer, som parasit Leishmania, er protein udtryk reguleret for det meste på translationel niveau. Nylige undersøgelser påvist, at protein oversættelse dysregulering er forbundet med kræft, metabolisk, neurodegenerative og andre sygdomme hos mennesker. Polysome profilering er en kraftfuld metode til at studere protein oversættelse forordning. Det gør det muligt at måle individuelle mRNAs translationel status eller undersøge oversættelse på en genome-wide skala. Grundlaget for denne teknik er adskillelsen af polysomes, ribosomer, deres underenheder og gratis mRNAs under centrifugering af et cytoplasmatisk lysate gennem en saccharose gradient. Vi præsenterer her, en universal polysome profilering protokol brugt på tre forskellige modeller - parasit Leishmania store, dyrkede humane celler og animalsk væv. Leishmania celler vokse frit i suspension og dyrkede humane celler vokse i vedhængende éncellelag, mens musen testis repræsenterer en animalsk vævsprøve. Teknikken er således tilpasset til alle disse kilder. Protokol til analyse af polysomal brøker omfatter påvisning af individuelle mRNA niveauer af RT-qPCR, proteiner af vestlige skamplet og analyse af ribosomale RNA'er af elektroforese. Metoden kan udvides yderligere ved undersøgelse af mRNAs association med ribosomet på en transkriptom niveau af dyb RNA-FF. og analyse af ribosomet-associerede proteiner af masse spektroskopi af fraktioner. Metoden kan let justeres til andre biologiske modeller.
Introduction
Regulering af genekspression i celler styres af transcriptional, posttranskriptionelle og posttranslationelle mekanismer. Fremskridt i dyb RNA sekventering tillade studiet af steady-state mRNA niveauer på en genom-plan på et hidtil uset niveau. De seneste resultater viste imidlertid, at steady-state mRNA niveau ikke altid korrelerer med protein produktion1,2. Skæbnen, en individuel udskrift er meget kompleks og afhænger af mange faktorer som interne/eksterne stimuli, stress, osv. Regulering af genekspression under proteinsyntesen giver et ekstra lag af udtryk kontrol nødvendige for en hurtig reaktion på ændrede vilkår. Polysome (eller "polyribosome") profilering, adskillelse og visualisering af aktivt oversætte ribosomer, er en kraftfuld metode til at undersøge regulering af proteinsyntesen. Selv om sine første eksperimentelle programmer dukkede op i 1960s3, er polysome profilering i øjeblikket en af de vigtigste teknikker i protein oversættelse undersøgelser4. Enkelt mRNAs kan oversættes af mere end én ribosomet fører til dannelsen af en polysome. Udskrifter kan være gået i stå på ribosomer med cycloheximide5 og mRNAs der indeholder forskellige antal polysomes kan adskilles ved at polysome fraktionering af saccharose gradient ultracentrifugering6,7 , 8 , 9. RNA analyse af polysomal brøker derefter tillader måling af ændringer i individuelle mRNAs translationel staterne på genome-wide skala og under forskellige fysiologiske tilstande4,7, 10. metoden har været også bruges til at afsløre rollerne af 5' UTR og 3' UTR sekvenser i kontrol af mRNA translatability11, undersøge miRNAs i translationel undertrykkelse12rolle, afdækker defekter i ribosomet Biogenese13 , og forstår rollen af ribosomet-associerede proteiner med menneskelige sygdomme14,15. I det sidste årti, er en voksende rolle for reguleringen af genekspression under oversættelse opstået der illustrerer dens betydning i menneskers sygdomme. Beviserne for Translationel kontrol i kræft, metaboliske og neurodegenerative sygdomme er overvældende15,16,17,18. For eksempel dysregulering af eIF4E-afhængige Translationel kontrol bidrager til autisme relateret underskud15 og FMRP er involveret i stalling af ribosomer på mRNAs knyttet til autisme14. Polysomal profilering er således et meget vigtigt redskab til at studere defekter i translationel forordning i flere sygdomme hos mennesker.
Proteinanalyse af polysomal brøker under forskellige fysiologiske tilstande dissekerer funktion af faktorer i forbindelse med ribosomer under oversættelse. Polysome profilering teknikken er blevet brugt i mange arter, herunder gær, pattedyrceller, planter og protozoer10,19,20,21. Protozo parasitter som Trypanosoma og Leishmania udviser begrænset transcriptional kontrol af genekspression. Deres genomer er organiseret i polycistronic gen klynger, der mangler promotor-regulerede transskription22. Udviklingsmæssige genekspression styres i stedet overvejende på niveauet af protein oversættelse og mRNA stabilitet i trypanosomatid arter23,24. Derfor er forståelse af Translationel kontrol i mangel af transkriptionel regulering særlig vigtigt for disse organismer. Polysomal profilering er et kraftfuldt værktøj til at studere posttranskriptionelle regulering af genekspression i Leishmania25,26,27,28.
De seneste fremskridt i påvisning af individuelle mRNAs niveauer af real time kvantitativ PCR (RT-qPCR) og fuld transkriptom af næste generation sequencing, samt proteomics-teknologier, bringer opløsning og fordelene ved polysomal profilering til et nyt niveau. Brugen af disse metoder kan udvides yderligere ved analyse af enkelte polysomal fraktioner af dyb RNA sekventering kombineret med proteom analyse at overvåge translationel status af celler på en genome-wide skala. Dette giver mulighed for identifikation af nye molekylære spillere regulering oversættelse under forskellige fysiologiske og patologiske betingelser. Vi præsenterer her, en universal polysome profilering protokol, der bruges på tre forskellige modeller: parasit Leishmania store, dyrkede humane celler og animalsk væv. Vi præsenterer rådgivning om forberedelsen af cellelysater fra forskellige organismer, optimering af gradientbetingelserne, valg af RNase hæmmere og anvendelsen af RT-qPCR, vestlige skamplet og RNA elektroforese til at analysere polysome fraktioner i denne undersøgelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr behandlinger og håndtering af væv i undersøgelsen blev udført efter protokoller godkendt af institutionelle Animal Care og brug Udvalget på Texas Tech University Health Science Center i overensstemmelse med de nationale kontorer i Sundhed dyrevelfærd retningslinjer, protokolnummer 96005. Venligst ofre hvirveldyr og forberede væv ifølge retningslinjerne fra det institutionelle Animal Care og brug udvalg. Hvis mangler et sådant udvalg, henvises til National Institutes of Health dyrevelfærd retningslinjer. Voksen (> 60 dage gamle) C57BL/6 mus blev brugt. Alle dyr og væv blev fremstillet efter protokoller godkendt af institutionelle Animal Care og brug Udvalget på Texas Tech University Health Sciences Center i henhold til National Institutes of Health dyrevelfærd retningslinjer. For aktiv dødshjælp, en enkelt mus blev placeret i et lille kammer, og luften blev fordrevet gradvist med omkring 30% kuldioxid til bedøver og minimere nød af dyret. Efter ophør af vejrtrækning brugte vi cervikal dislokation for at bekræfte dyrets død før høsten væv.
Forsigtig: Alt arbejde med live Leishmania og dyrkede humane celler blev gjort i biosikkerhed kabinet i BSL-2 certificeret laboratorium.
1. forberedelse af cytoplasmatisk Lysates fra Leishmania store , dyrkede humane celler og mus væv
Bemærk: Der er flere forskelle i de lysate præparater fra de forskellige udgangsmaterialer. Andre foranstaltninger, herunder saccharose gradient forberedelse og polysomal fraktionering er identiske og afhænger ikke af prøven kilde.
-
Leishmania store cytoplasmatisk lysate forberedelse
- Podes Leishmania store (FV1 stamme) celler i 30 mL af 1 x M199 medium29 10% føtal bovin Serum (FBS) og penicillin/streptomycin blanding (100 enheder og 100 μg/mL tilsvarende)med tæthed af 1 x 105 celler/mL .
Bemærk: Alle skridt involverer Leishmania store celler skal føres i en biosikkerhed kabinet. - Placere celler i rugemaskinen og dyrke dem på 27 ° C indtil den logaritmiske fase (midten af log svarer til 5 x 106 celler/mL). Det tager normalt omkring to dage til at vokse.
- Føje cycloheximide til Leishmania store kultur til en endelig koncentration på 100 μg/mL, arrestere ribosomer på oversatte mRNAs. Placere celler tilbage i inkubatoren i 10 min på 27 ° C.
- Efter cycloheximide behandling er afsluttet, overfører celler til en 50 mL konisk slange og spin dem på 1.800 x g og 4 ° C i 8 min. Fjern supernatanten.
- Vaske cellerne med 30 mL Dulbeccos fosfatbufferet saltopløsning (DPBS). Centrifuger på 1.800 x g og 4 ° C i 8 min.
- Supernatanten. Resuspend celler i 1 mL DPBS.
- Tag en alikvot af celler og bland det med 3,5% formaldehyd løsning.
- Tælle celler af hemocytometer og bestemme deres koncentration. Overføre det ønskede antal celler i mikrofuge rør. Lysate fremstillet af 0.5x108-2 x 108 celler/mL er tilstrækkelig for en saccharose gradient lastning.
- Spin celler på 1.800 x g og 4 ° C i 8 min. supernatanten.
- Resuspenderes celle på is i 1 mL lysisbuffer indeholdende proteasehæmmere og RNase inhibitor (20 mM HEPES-KOH, pH 7,4, 100 mM KCl, 10 mM MgCl2, 2 mM DTT, 1% NP-40, 1 x protease hæmmer cocktail (EDTA-fri), 200 enheder/mL RNase hæmmer).
- Passere den lysate gennem en 23-gauge kanyle tre gange. Det lysate bør være gennemsigtig efter passage gennem nålen.
- Der centrifugeres ved 11.200 x g og 4 ° C i 10 min at afklare lysate. Overføre den klarede lysate til en frisk tube og holde den på køl indtil saccharose gradient ultracentrifugering.
- Indsamle 400-500 μl af den lysate som input (til at analysere senere), fryse det højre væk i flydende nitrogen for fremtidige proteinanalyse eller tilføje RNA oprensning reagens før frysning for RNA analyse.
- Podes Leishmania store (FV1 stamme) celler i 30 mL af 1 x M199 medium29 10% føtal bovin Serum (FBS) og penicillin/streptomycin blanding (100 enheder og 100 μg/mL tilsvarende)med tæthed af 1 x 105 celler/mL .
-
Cytoplasmatisk lysate forberedelse fra dyrkede humane HeLa celler
- Opdel HeLa celler og seed dem til 20 mL af DMEM medium indeholdende 10% FBS og penicillin/streptomycin blanding (100 enheder og 100 μg/mL tilsvarende) med celle tæller 2 x 105 celler/mL i en 15 cm plade.
- Vokse HeLa celler ved 37 ° C, 5% CO2 til 20-24 h. udføre plasmid DNA Transfektion ifølge producentens protokoller.
- Overfør celler i 24 timer efter Transfektion ved 37 ° C, 5% CO2.
- Føje cycloheximide til dyrket HeLa celler til en endelig koncentration på 100 μg/mL, arrestere ribosomer på oversatte mRNAs og inkuberes celler i 10 minutter ved 37 ° C, 5% CO2. Aspirat medium. Cellerne vaskes to gange med kold DPBS på is.
- Tilsæt 500 μL lysisbuffer (20 mM HEPES-KOH pH 7,4, 100 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 0,5% NP-40, 1 x protease hæmmer cocktail (EDTA-fri), 200 enheder/mL af RNase hæmmer eller 1 mg/mL heparin) til pladen og skrabe cellerne på is.
- Overføre de lysed celler til mikrofuge røret. Justere koncentrationen af NP-40 til 0,5% og MgCl2 til 5 mM ifølge den øgede mængde af prøven.
- Passere den lysate gennem en 23-gauge kanyle 3 - 6 gange.
- Spin på 11.200 x g og 4 ° C til 8 min til at afklare lysate. Efter centrifugering, skal du overføre supernatanten til en ny tube. Brug et spektrofotometer, til at evaluere celle lysis effektivitet og bestemme prøve beløb til lastning på farveforløbet. Tilføje 10 μl af prøven til 0,5 mL af 0,1% Sodium Dodecyl sulfat (SDS). Tom mod 0,1% SDS. Måling af absorbans på 260 nm. Forventede absorbans værdi er omkring 15-20 enheder/mL.
- Fortynd alle prøver med lysisbuffer til samme absorbans værdi før saccharose gradient centrifugering. Holde prøver på is indtil saccharose gradient centrifugering.
-
Cytoplasmatisk lysate forberedelse fra mus testis
- Dissekere mus testis. Gør et lille snit i tunica albuginea og indsamle de seminiferous tubules af testiklerne og overføre dem i en 15 mL konisk slange der indeholder 5 mL af DPBS suppleret med 0,1 mM phenylmethylsulfonyl fluorid (PMSF).
- Bland vævet kraftigt af invertere flere gange. Tillad væv til at bosætte sig på enhed tyngdekraft på is i 5 min.
- Fjern og kassér overskyet bufferen indeholder bindevæv celler og væv fragmenter. Gentag proceduren for 2-3 gange mere. De resterende hvide pellet er beriget til seminiferous tubules og kønsceller.
- Overføre seminiferous tubulus pellet til en 2 mL microcentrifuge tube og spin på 500 x g i 1 min. supernatanten.
- Tilføje 500 µL af lysisbuffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 100 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 0,5% NP-40, 1 x protease hæmmer cocktail (EDTA-fri), 1 mg/mL heparin eller 200 enheder/mL af RNase hæmmer) til tubuli. Bruge en pipette til hakkede væv.
- Overføre suspension til en lille (0,5-1,0 mL) Dounce homogeniseringsapparat. Forstyrre væv med syv til otte slag af glas pistil.
- Overførsel af lysate til en 1,5 mL microcentrifuge tube.
- Der centrifugeres prøve på 12.000 x g og 4 ° C i 8 min. til at klare den lysate. Overføre supernatanten til en ny tube og butik på is indtil lastning på saccharose gradient.
- Indsamle 50 μl af de lysate som input stikprøve, fryse det straks ved-80 ° C for fremtidige proteinanalyse; eller tilføje RNA oprensning reagens før frysning for RNA analyse.
2. saccharose Gradient forberedelse og ultracentrifugering
- Forbered to saccharose gradient løsninger (20 mM HEPES-KOH, pH 7,4, 100 mM KCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 1 x protease hæmmer cocktail), der indeholder enten 10% saccharose eller 50% saccharose. (Tris-HCl, pH 7,4, kan bruges i stedet for HEPES). Tilføje 200 enheder/mL RNase hæmmer eller 1 mg/mL heparin efter forsøgets udformning. Placer en ultracentrifuge tube for SW 41 rotoren i markør blok og tegne en streg langs den øverste niveau af blokken. Overføre røret i en stabil rack.
- Tag en 10-mL sprøjte med lagdeling enhed knyttet og fyld sprøjten med 10% rørsukkeropløsning (forberedt som ovenfor). Forsigtigt frigive det i bunden af ultracentrifuge rør, indtil den når mark på røret.
- Fyld en anden sprøjte med 50% rørsukkeropløsning og før den forsigtigt sin lagdeling enhed gennem 10% saccharose lag i bunden af røret. Forsigtigt frigøre rørsukkeropløsning starter fra bunden, indtil den når mark på røret. Forsegle røret med den medfølgende cap.
- For at forberede saccharose gradient, tænde enheden gradient maker ON. Niveau pladen med op eller ned knapperne og tryk på udført. Nivellering er vigtigt for lineariteten af gradient.
- Tryk på GRAD at åbne menuen gradient efter udjævning pladen. Gå til listen på den gradient menu og vælg SW 41 Ti rotoren. Vælg derefter den ønskede saccharose graduering fra listen i menuen ved hjælp af knapperne op og ned . Tryk på Brug.
- Sted indehaveren gradient rør på gradient maker pladen. Overføre røret ind i holderen. Op til 6 forløb kan tilberedes på samme tid. Pressen køre. Den gradient maker roterer rør ved den programmerede hastighed og vinkler danner en lineær gradient. Det vil tage kun et par minutter at tilberede gradienten.
- Når processen er fuldført, skal du placere rør i en rack. Tag caps. Fjerne den samme volumen som sample volumen fra toppen af ultracentrifuge rør.
- Omhyggeligt indlæses 400-500 μl lysate indeholdende 15-20 a260 enheder af polysomes på toppen. Sted rør i en rotor spande og afbalancere dem.
- Centrifuge på 260.000 x g og 4 ° C i 2 timer ved hjælp af SW 41 rotor.
3. polysome fraktionering og prøvetagning
Bemærk: Mens lysate præparater har nogle forskelle afhængigt af kilden, gradient forberedelse og polysome fraktionering protokoller er de samme for alle typer af lysates.
- Efter afslutningen af ultracentrifugering, skal du placere rotor spande med rør på is. Drej brøkdel collector og gradient fraktioneringskolonne ON. Klik på SCAN i menuen fraktioneringskolonne. Sætte en rack med 24 indsamling rør i brøkdel collector.
- Fylde en skyl reservoir på siden af fraktioneringskolonne med deioniseret vand. Tryk på tasten SKYL for 10 s at skylle pumpen på fraktioneringskolonne. Vedhæft et skyl adapter med sprøjte fyldt med vand for at stemplet for kalibrering.
- Åbn fraktioneringskolonne-softwaren på computeren. Tryk på KALIBRER. Brug standard indstillinger, og tryk på OK. Være klar til at injicere vand fra sprøjten.
- Tryk på OK for at gøre kalibrering. Straks begynde at injicere vand for de næste 5 s. I løbet af denne tid, vand vil strømme gennem UV detektor flow celle og instrumentet vil være kalibreret. Tegnet Nul kalibrering fuldført vises. Apparatet er klar til fraktionering.
- Fjerne Overgangsstikket skylles med sprøjten. Vedhæft et tip til stemplet af fraktioneringskolonne.
- Åbne den messing luft ventil og presse luft nøgle for 10 s til tørre slanger og flow celle. Luk luften ventil.
- Forsigtigt fjerne den gradient rør fra rotoren spanden og placere den i rack. Anvende tube holder cap til toppen af røret og omhyggeligt flytte røret ind i røret holderen og låse den i position.
- Sæt holderen under stemplet af fraktioneringskolonne. Polysomal bands kan ofte ses med det blotte øje. Indføre de ønskede indstillinger for brøkdel numre og lydstyrke (24 fraktioner på 500 μL/fraktion er normalt tilstrækkelig). Navngiv filen korrekt. Tryk på OK, og derefter Gå til GRAFEN knap. I det næste vindue, skal du trykke på START Skan. Indstillingerne vises, skal du trykke på OK. Solfangeren vil flytte fra rendestenen til den første brøkdel og stemplet vil flytte ind i røret. Når stemplet når toppen af gradient det vil bremse til den valgte hastighed og fraktioner indsamles. Når afsluttet, stemplet bevæger sig ud af den gradient rør.
- Den messing luft ventil og presse luft nøglen på fraktioneringskolonne hente den sidste brøkdel åbnes.
- Flytte rørene fra rack på is.
- Tilføj 2 bind af RNA oprensning reagens til hver fraktion og flash fryse i flydende nitrogen indtil RNA oprensning. Alternativt, hvis protein skal analyseres, tilføje trichloreddikesyre til den endelige koncentration på 10% til at koncentrere dem for Western blotting (Se afsnit 8).
4. fremstilling af syntetisk RNA In Vitro for normalisering af mRNAs niveauer under RT-qPCR dataanalyse
Bemærk: E. coli OmpA mRNA er brugt i denne protokol for normalisering. Andre RNA, der ikke har omfattende identitet med mRNAs studerede organismens (pattedyr eller Leishmania) kan bruges.
- Forberede OmpA DNA-fragment indeholdende SP6 promotor sekvens af en standard PCR reaktion fra et plasmid som indeholder OmpA gen30.
- Forberede 100 µL af blandingen: 80 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 16 mM MgCl2, 2 mM Spermidine, 10 mM DTT, 3 mM ATP, 3 mM CTP, 3 mM UTP, 3 mM GTP, 0,5 U/μL RNase inhibitor, 1 μg OmpA PCR DNA, 3 μL SP6 RNA polymerase , 0,005 U/μL pyrophosphatase.
- Der inkuberes ved 40 ° C i 2 timer.
- Rense RNA ved en RNA oprensning kit.
- Måler koncentrationen af Spektrofotometer og undersøge ved agarosegelelektroforese gelelektroforese.
5. RNA isolering fra Gradient brøker og cDNA forberedelse
Bemærk: Fortsæt direkte med denne protokol til RNA oprensning, hvis en RNase hæmmer blev brugt som en ribonuklease-inhibitor. Men når det bruges som en ribonuklease-inhibitor, heparin vil hæmme reverse transkriptase cDNA for udarbejdelse. Derfor, yderligere oprensning af RNA er nødvendig, hvis heparin blev brugt i lysisbuffer og gradient. Se afsnit 6 til at forberede cDNA syntese RNA, hvis heparin blev brugt.
- Optø de prøver, der indeholder RNA oprensning reagens, tilføje 20 ng af syntetisk RNA som intern kontrol for normalisering af RT-qPCR resultater. Fortsætte med RNA forberedelse efter producentens protokol undtagen én modifikation. Tilføj 1 µL af RNA grade glykogen (20 µg) forudgående isopropanol nedbør. Opløse RNA pellets i 20-25 µL af RNase-fri vand.
Bemærk: Glykogen fungerer som en transportør og hjælper med at undgå tab og visualisere RNA pellet under rensningen. OmpA mRNA bruges til yderligere normalisering i RT-qPCR reaktioner. - Måle RNA koncentration ved hjælp af spektrofotometret for at sikre tilstrækkeligt udbytte. Kombinere lige store mængder af RNA fraktioner der indeholder 40S, 60 'er og monosomes som prepolysomes. Fraktioner der indeholder 2-4 ribosomer kombinere som lys polysomes og fraktioner med 5-8 ribosomer kombinere som tunge polysomes.
- Bruge 5-10 µL af RNA fra kombineret fraktioner til at forberede cDNAs ved hjælp af et kit og efter fabrikantens anvisninger.
- Tilsættes 80 µL nukleasen gratis vand til 20 µL cDNA. Fryse cDNA prøver ved-20 ° C.
6. RNA oprensning fra Heparin forurening
Bemærk: Heparin hæmmer nukleinsyre forarbejdning enzymer såsom reverse transkriptase. Derfor, bruge denne yderligere rensning protokol når heparin bruges i lysisbuffer og/eller i farveforløbet.
- Føje LiCl til en 1 M endelige koncentration til de oprensede RNA prøver.
- Bland prøverne og inkuberes i isbad i 1 h.
- Spin prøver på 16.000 x g og 4 ° C i 15 min.
- Fjern supernatanten så fuldstændigt som muligt ved hjælp af en pipette.
- Lufttørre træpiller i ca 5 min.
- Genopslæmmes pellets i den oprindelige mængde af RNase-fri vand.
- Udføre spektrofotometrisk måling på 260 nm til at bestemme koncentrationen af RNA. Normalt, er tabet af prøven minimal.
7. RT-qPCR og dataanalyse af mRNA Distribution
- Kombinere 10.2 μl vand, 20 μL SYBR Green, 4,8 μL af genet specifikke primere (2,5 μM sæt), 5 μl cDNA, bland godt og læg 10 μl pr. brønd i tre i 384-godt plade.
- Dække plade med selvklæbende film stramt og centrifugeres plade på 1.800 x g i 5 min.
- Ved hjælp af en Real-Time PCR instrument oprettet qPCR reaktion på betingelser, der er vist i tabel 1.
- Ved hjælp af cyklus tærskel (CT) beregne værdier og den sammenlignende CT (ΔΔCT) metode31 procent (%) af mRNA distribution i prepolysomes, lys og tunge polysomes som beskrevet32 med én modifikation. Bruge syntetisk RNA (OmpA her) for yderligere oplysninger om datanormalisering i RT-qPCR dataanalyse. Syntetisk RNA giver en normalisering kontrol, gør det muligt at beregne relative mRNAs niveauer og Sammenlign dem i forskellige fraktioner af et forløb.
8. analyse af proteiner i Polysomal fraktioner af Western Blotting
- Fra en 100% (w/v) bestand, tilføje trichloreddikesyre (TCA) til de valgte fraktioner (500 μl) til en slutkoncentration på 10%, holde på køl i mindst 15 min., centrifugeres i et mikrofuge i 5 min, kassere supernatanten, vaskes to gange med iskold acetone og opløses i 25 μL af S DS-side prøve loading bufferen til elektroforese.
- Belastningen på SDS-PAGE og gennemføre standard elektroforese med følgende overførsel til PVDF membran. Fortsæt til Western blotting33.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne undersøgelse, vi beskriver anvendelsen af den polysomal profilering teknik til tre forskellige kilder: parasitære Leishmania store, dyrkede humane celler og mus testis. Leishmania celler vokse frit i den flydende medier i suspension, dyrkede humane celler vokse i den vedhængende éncellelag på plader, og musen testis repræsenterer en vævsprøve. Metoden kan let justeres til andre typer af frit dyrkede celler i suspension, forskellige typer af væv eller fra en anden organisme, og forskellige typer af dyrkede celler. Metoden består af fire hovedtrin: lysate forberedelse, saccharose gradient forberedelse og ultracentrifugering skridt, polysome fraktionering og prøvetagning efterfulgt af en analyse af fraktioner. Celler fra forskellige kilder er indsamlet, vasket og mængden i lysisbuffer ved passage gennem en nål eller Dounce homogeniseringsapparat. Centrifugering bruges til at fjerne celle debris, afklaring af lysate. Ordningen af gradient fraktionering er vist i figur 1A. En kontinuerlig saccharose gradient er dannet af en blanding af 10% og 50% saccharose løsninger i en gradient maker. Den lysate er indlæst på toppen af gradient. Ultracentrifugering adskiller mRNAs forbundet med et andet nummer af ribosomer, som er overvåget af en UV-detektor under fraktionering, danner et særskilt absorbans spektrum. Indsamlede fraktioner anvendes til RNA og protein analyse (figur 1B). RNA kan analyseres ved elektroforese efterfulgt af nordlige skamplet eller anvendes til cDNA produktion efterfulgt af en RT-qPCR reaktion til at analysere sammenslutningen af individuelle mRNAs med polysomes. Næste generation sequencing kan bruges til at analysere translationel status for mRNAs på en genome-wide skala7. Protein analyse af polysomal brøker, er proteiner udfældes med trikloreddikesyre at koncentrere dem. Proteiner er derefter analyseret ved Western blotting eller masse spektroskopi på niveauet proteomet.
En typisk polysomal profil genereret fra Leishmania store aktivt voksende kultur er vist i figur 2A. Absorbansen grafen for fraktionering har en særskilt figur med typisk toppe til ribosomet underenheder (40S og 60S), enkelt ribosomer (80 'er eller monosomes) og polysomes.
Kvantitativ RT-PCR (RT-qPCR) blev ansat til at opdage sammenslutning af individuelle Leishmania mRNAs med ribosomer og polysomes. Metoden sammenlignende CT (ΔΔCT)31 er en enkel og hensigtsmæssig tilgang til at studere relative mRNAs niveauer i cellerne. Denne metode kræver en intern kontrol (en stabil mRNA, der ikke ændrer udtryk under behandlinger eller betingelser for eksperimentet) til beregninger. Der er imidlertid ingen intern kontrol i polysomal brøker fordi niveauer af mRNA eller ribosomale RNA vil variere i fraktioner, afhængigt af deres tilknytning til ribosomer, polysomes mv. For at løse problemet med en intern kontrol, har vi brugt syntetiske bakteriel OmpA mRNA for normalisering af relative individuelle Leishmania mRNA niveauer i fraktioner. OmpA mRNA blev syntetiseret in vitro- og tilføjes i lige store mængder hver fraktion før RNA ekstraktioner. Tilsætning af syntetisk RNA er vigtigt, fordi det gør beregninger af RT-qPCR data mere præcis, der tjener som intern kontrol for beregninger af sammenlignende CT (ΔΔCT) metode.
Delprøver af gradient fraktioner var blandet ind i tre grupper: prepolysomes (underenheder og monosomes), light polysomes (bestående af 2-4 ribosomer) og tunge polysomes (bestående af 5-8 ribosomer). RT-qPCR blev udført på RNA fra kombineret fraktioner til at analysere mRNA fordeling mellem disse kombinerede fraktioner (figur 2B). 18s ribosomale RNA blev brugt som et kontrolelement. Dens relative niveauer bestemmes af RT-qPCR korreleret godt med den skønnede fordeling af de lille ribosomale underenheder (gratis underenheden, og som en del af monosomes og polysomes) på spektrum. RT-qPCR analyse afslørede, at enkelte mRNAs testet har en forskellig grad af engagement i oversættelse i logaritmiske fase af Leishmania vækst. Tubulin mRNA er fortrinsvis tilknyttet tunge polysomes, foreslår effektiv oversættelse. Derimod Sherp mRNA findes primært med prepolysomes og lys polysomes støtte mindre aktive oversættelse i forhold til tubulin mRNA.
Udtryk for rekombinante proteiner i kulturperler celler er en vigtig eksperimenterende tilgang i forskellige kategorier af undersøgelser. Vi præsenterer her, et eksempel på polysomal profilering af rekombinante protein mRNAs i en anden eksempelkilden, dyrkede humane celler. HeLa celler blev forbigående transfekteret med plasmider udtryk for rekombinante cystisk fibrose transmembrane ledningsevne regulator (CFTR)34 eller Norrie sygdom protein (NUP). Absorbansen spektre af polysome fraktionering fra disse to uafhængige kulturer var meget lignende og indeholdt forskellige toppe svarende ribosomale underenheder (40S og 60S), monosomes (80 ' erne) og polysomes (figur 3A). Ligheden i spektre fra disse eksperimenter viser reproducerbarhed af gradient fraktionering. Som i undersøgelserne, Leishmania , var fordelingen af mRNAs bestemt af RT-qPCR i de fraktioner, der repræsenterer prepolysomes, lette polysomes og tunge polysomes (figur 3B). Påvisning af små ribosomale subunit 18S RNA korreleret med deres anslåede distribution i spektre. NDP mRNAs var for det meste forbundet med lette og tunge polysomal brøker, mens CFTR mRNAs var for det meste findes i prepolysome brøker, tyder på, at NDP oversat mere effektivt. Mens NDP er et relativt lille protein, er CFTR et meget stort protein (1480 aminosyrerester) bestående af flere domæner, der folde uafhængigt under oversættelse35. Lavere engagementer af CFTR mRNA med polysomes kan afspejle langsommere oversættelse, der er nødvendig for cotranslational foldning af dens forskellige domæner.
Polysome fraktioner kan også anvendes til påvisning af proteiner. Påvisning af proteiner i de gradient fraktioner blev gennemført på eksemplet med ribosomale proteiner i HeLa celler (figur 4). Proteiner var koncentreret ved fældning med 10% TCA fra fraktioner og vestlige skamplet blev brugt til at opdage små subunit ribosomale protein RPS6 og store subunit ribosomale protein RPL11 (fig. 4, toppanelet). Deres distribution korreleret godt med de forskellige bjergtoppe på absorbans spektrum. Disse eksperimenter viser klart, at polysome fraktioner kan bruges til at analysere proteiner i dem.
Mange forskellige saccharose koncentrationer forløb (for eksempel 7-47%36, 5-50%7, 7-50%6 , 10-50%37, 15-50%8og andre) for polysomes fraktionering blev brugt. Her, sammenlignede vi to forløb 10-50% og 17-51% (figur 5). Selvom 17-51% produceret acceptable resultater, var adskillelse i 10-50% gradient generelt bedre.
Det er veldokumenteret, at chelatdannere, såsom EDTA, forstyrrer ribosomer og polysomes8,9. Som det er vist i figur 6, EDTA behandling af HeLa lysate før indlæsning på gradueringen, der fører til forsvinden af toppene, svarende til monosomes og polysomes, og betydelig stigning i ribosomet underenheder toppe. Dette eksperiment fungerede som en kontrol og viste, at de observerede toppe uden EDTA behandling er faktisk ribosomale monosomes og polysomes.
Figur 7 viser resultater af polysome fraktionering fra mus testiklerne. Absorbans spektrum har ligheder med dem fra Leishmania og HeLa celler: adskilte toppe ribosomale underenheder, monosomes og polysomes. Deres form og distribution producere et signaturudseende, der gør det let at identificere dem på forskellige polysomal spektre. Samlede RNA'er blev renset fra fraktioner og RNA'er fra udvalgte fraktioner blev analyseret af elektroforese i agarosegel (figur 7, toppanelet). Elektroforese viser typiske fordeling af 18S og 28S ribosomale RNA'er. Deres skarpe bands angive handelsformer af prøverne. Gelen kan anvendes til enkelte mRNAs påvisning af en følgende nordlige skamplet eller det kan bruges til at evaluere kvaliteten af prøverne før yderligere eksperimenter på RNA eller protein analyse - diffust ribosomale RNA'er bands angive RNA nedbrydning i prøverne.
Under vores undersøgelser brugte vi RNase inhibitor og Heparin som RNase hæmmere i lysates og saccharose gradienter. Mens dem begge givet tilfredsstillende resultater, var brugen af RNase hæmmer at foretrække for RNA analyse, fordi det ikke hæmmer cDNA og RT-qPCR reaktioner. Således er kræver det ikke ekstra RNA oprensning trin. Men hvis forskere beslutter at bruge heparin under polysome forberedelse, være klar over, at heparin hæmmer down-stream programmer som RT-qPCR og yderligere RNA oprensning trin er påkrævet (se protokollen afsnit 6).
Figur 1 . Polysome profilering. (A) ordningen af gradient forberedelse, polysome fraktionering og absorbans profil. (B) ordning for fraktion analyse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . Polysome profil analyse af Leishmania store kultur i logaritmiske fase af vækst. (A) Cytoplasmic lysate var fraktioneret i 10-50% saccharose gradient. (B) Relative fordeling af 18S RNA, tubulin og Sherp mRNAs (%) i prepolysomes, lette og tunge polysomes log celler analyseret af RT-qPCR. Fraktioner der indeholder 40S, blev 60S og monosomes samlet som prepolysomes. Fraktioner med 2-4 ribosomer blev kombineret som lys polysomes, mens fraktioner med 5-8 ribosomer dannet tunge polysomes. Syntetisk E. coli OmpA mRNA tilføjes fraktioner forudgående RNA udvinding fungerede som en normalisering kontrol i RT-qPCR. Sammenlignende CT (ΔΔCT)31 metode blev brugt til beregning af mRNA niveau. Fejllinjer udgør standard fejl. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 . Polysome fraktionering og analyse af rekombinant CFTR og NDP mRNAs association med ribosomer i HeLa celler transfekteret med plasmid DNAs. (A) Polysomal profil i HeLa celler transfekteret med CFTR og NDP plasmider. 10-50% saccharose forløb blev anvendt for at opnå separation af polysomes. Toppe til små (40S) samt store (60) subunits og monosome (80 ' erne) er angivet. Fraktioner var kombineres som vist på panelet A og anvendes til yderligere analyse. (B) Distribution af mRNAs CFTR og NDP i forskellige fraktioner. Påvisning af 18S af RT-qPCR blev brugt som kontrol for polysome fraktionering. RNA niveauer blev evalueret af RT-qPCR analyse. Data blev normaliseret, ved hjælp af syntetiske mRNA. Sammenlignende CT (ΔΔCT)31 metode blev brugt til beregning af mRNA niveau. Fejllinjer udgør standard fejl. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 . Påvisning af ribosomale proteiner i HeLa polysomal fraktioner. Hela celler lysate blev udsat ved 10% - 50% saccharose gradient centrifugering. Proteiner i udvalgte fraktioner var fældet med TCA og analyseret af elektroforese i 12% SDS-PAGE med følgende Western blotting ved hjælp af musen monoklonale RPS6 og kanin polyklonale RPL11 antistof som primære antistoffer og Peroxidase-Conjugated ged anti-mus eller anti-kanin sekundære antistoffer. Visualisering af signalerne blev udført af SuperSignal West Pico PLUS kemiluminescens substrat. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 . Sammenligning af HeLa polysomal profilering i 10% - 50% (sort) eller 17% - 51% (grå) saccharose gradienter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 . Effekt af EDTA behandling på polysomal profil i HeLa celler. Hela celler lysate blev behandlet med 10 mM EDTA i isbad i 10 min umiddelbart før saccharose gradient centrifugering. MgCl2 blev erstattet af 5 mM EDTA i saccharose gradient løsninger. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7 . Polysomal profil fra mus testis væv lysate. Fraktioner var udsat for RNA ekstraktion med en RNA oprensning reagens og analyseret af elektroforese i 1% agarosegel. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Fase | Trin | Betingelse |
| Hold | Trin 1 | Hæve temperaturen fra 25 til 50° C med 1,6 ° C/s |
| Der inkuberes ved 50° C i 2:00 min | ||
| Trin 2 | Øge temperatur fra 50 til 95° C med 1,6 ° C/s | |
| Der inkuberes ved 95° C til 10:00 min | ||
| PCR | Trin 1 | Der inkuberes ved 95° C i 00:15 min |
| Trin 2 | Mindske temperatur fra 95 til 60° C med 1,6 ° C / | |
| Inkuber ved 60° C i 1:00 min | ||
| Antal cyklusser 40 | ||
| Smelte kurve | Trin 1 | Hæve temperaturen fra 60 til 95° C med 1,6 ° C/s |
| Trin 2 | Mindske temperatur fra 95 til 60° C med 1,6 ° C/s | |
| Inkuber ved 60° C i 1:00 min | ||
| Trin 3 (dissociation) | Hæve temperaturen fra 60 til 95° C med 0,05 ° C/s | |
| Der inkuberes ved 95° C i 00:15 min | ||
Tabel 1. Betingelser for RT-qPCR
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Polysome fraktionering af saccharose gradient kombineret med RNA og proteinanalyse af brøker er en kraftfuld metode til at analysere translationel status for individuelle mRNAs eller hele translatome samt roller af protein faktorer regulering translationel maskiner under normale fysiologiske eller sygdom tilstand. Polysomal profilering er en specielt velegnet teknik til at studere translationel forordning i organismer såsom trypanosomatids herunder Leishmania hvor transcriptional kontrol er stort set fraværende og genregulering udtryk for det meste opstår under oversættelse.
Her, vi beskriver en polysome fraktionering protokol brugt på tre modeller: Leishmania parasitter, dyrkede humane celler og mus væv. Polysome fraktionering skridt er stort set den samme for forskellige organismer, der anvendes i denne undersøgelse; den lysate forberedelse har imidlertid nogle forskelle. Leishmania celler vokse i flydende kultur og er indsamlet ved centrifugering og celler tælles inden lysis at sikre lige indlæsning på farveforløbet. Menneskelige celler kan vaskes og mængden direkte på pladen. Lig lastning styres af optisk tæthed. Musen væv kræver en Dounce homogeniseringsapparat for effektiv lysis mens for Leishmania og humane celler, det er tilstrækkeligt at passere den 23-gauge kanyle.
Alle reagenser skal være RNase og protease gratis. Vi sammenlignede heparin og RNase hæmmer som hæmmere af RNase aktivitet i den cytoplasmatiske lysates. Vi fandt, at begge reagenser effektivt kan blokere RNase. Heparin påvirker imidlertid downstream applikationer såsom cDNA forberedelse og RT-qPCR. Som et resultat, kræver forberedelse af RNA en yderligere rensning trin anvendes heparin. Efter vores mening RNase-hæmmer er mere bekvemt valg og kan bruges effektivt i polysome profilering protokol.
Polysomal profilering er arbejdsintensive, som er en stor begrænsning af metoden. Op til seks forløb kan tilberedes på samme tid. Den gradient fraktioneringskolonne genererer 144 fraktioner, der skal behandles i en kort periode. Analyse af enkelte fraktioner kan være tidskrævende og dyre også. Derfor, kombinere enkelte fraktioner i pre polysomes, lette og tunge polysomes giver en hurtig og mindre besværlig måde at vurdere translationel aktivitet af individuelle mRNAs. Vores RT-qPCR resultater på de kombinerede fraktioner tillod os at identificere forskelle i translatability af forskellige mRNAs både i Leishmania og HeLa celler (tallene 2, 3). Men hvis finere opløsning kræves, derefter analyse af enkelte fraktioner kan udføres.
Ribosomet profilering er en anden metode til at studere translationel status af mRNA og er baseret på måling af protein produktion via sekventering af mRNA fragmenter beskyttet af ribosomet38. Denne teknologi giver kvantitative oplysninger knytter mRNA sekvenser med specifikke polysomal fraktioner bliver omsat i en prøve, og kan give præcise oplysninger på translationel status for mRNAs codon opløsning i sammenligning med polysome profilering teknologi. Dog polysome profilering kan bruges til både RNA og protein analyse, hvilket giver yderligere oplysninger om proteomet af polysomes og identificere faktorer, der bidrager til reguleringen af oversættelse.
Derfor er polysomal profilering en alsidig teknik, der kan bruges til at analysere translationel tilstand af individuelle mRNAs, undersøge ribosomet-associerede proteiner og studere translationel forordning i forskellige modelorganismer under forskellige eksperimentelle betingelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne takke Ching Lee hjælp til lydoptagelse. Forskningen blev støttet med midler fra opstart fra Texas Tech University Health Sciences Center og af Center of Excellence for Translationel neurovidenskab og Therapeutics (CTNT) give PN-CTNT 2017-05 AKHRJDHW A.L.K.; en del af NIH grant R01AI099380 K.Z. James C. Huffman og Kristen R. Baca var CISER (Center for Integration af STEM Uddannelse & forskning) lærde og blev støttet af programmet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments: | |||
| Gradient master | Biocomp Instruments Inc. | 108 | |
| Piston Gradient Fractionator | Biocomp Instruments Inc. | 152 | |
| Fraction collector | Gilson, Inc. | FC203B | |
| NanoDrop One | Thermo Scientific | NanoDrop One | |
| Nikon inverted microscope | Nikon | ECLIPSE Ts2-FL/Ts2 | |
| 2720 Thermal Cycler | Applied Biosystems by Life Technologies | 4359659 | |
| CO2 incubator | Panasonic Healthcare Co. | MCO-170A1CUV | |
| HERATHERM incubator | Thermo Scientific | 51028063 | |
| Biological Safety Cabinet, class II, type A2 | NuAire Inc. | NU-543-400 | |
| Revco freezer | Revco Technologies | ULT1386-5-D35 | |
| Beckman L8-M Ultracentifuge | Beckman Coulter | L8M-70 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Ultracentrifuge Rotor SW41 | Beckman Coulter | 331362 | |
| Swing-bucket rotor | Eppendorf | A-4-62 | |
| Fixed angle rotor | Eppendorf | F-45-30-11 | |
| Quant Studio 12K Flex Real-Time PCR machine 285880228 | Applied Biosystems by life technologies | 4470661 | |
| TC20 Automated cell counter | Bio-Rad | 145-0102 | |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 02-671-51B | |
| Software | |||
| Triax software | Biocomp Instruments Inc. | ||
| Materials: | |||
| Counting slides, dual chamber for cell counter | Bio-Rad | 145-0011 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Open-top polyclear centrifuge tubes, (14 mm x 89 mm) | Seton Scientific | 7030 | |
| Syringe, 5 mL | BD | 309646 | |
| BD Syringe 3 mL23 Gauge 1 Inch Needle | BD | 10020439 | |
| Nunclon Delta Surface plate, 14 cm | Thermo Scientific | 168381 | |
| Nunclon Delta Surface plate, 9 cm | Thermo Scientific | 172931 | |
| Nalgene rapid-flow 90mm filter unit, 500 mL, 0.2 aPES | Thermo Scientific | 569-0020 | |
| BioLite 75 cm3 flasks | Thermo Scientific | 130193 | |
| Nunc 50 mL conical centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339653 | |
| Chemicals: | |||
| Trizol LS | Ambion by Life Technologies | 10296028 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| Trizma base | Sigma | T1378-5KG | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium-high glucose (DMEM) | Sigma | D6429-500ML | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F0926-50ML | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | Sigma | P0781-100ML | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Sigma | D8537-500ML | |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2x6H2O) | Acros Organics | AC413415000 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma | P9541-500G | |
| Nonidet P 40 (NP-40) | Fluka (Sigma-Aldrich) | 74385 | |
| Recombinant Rnasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2511 | |
| Heparin sodium salt | Sigma | H3993-1MU | |
| cOmplete Mini EDTA-free protease inhibitors | Roche Diagnostics | 11836170001 | |
| Glycogen | Thermo Scientific | R0551 | |
| Water | Sigma | W4502-1L | |
| Cycloheximide | Sigma | C7698-1G | |
| Chloroform | Fisher Scientific | 194002 | |
| Dithiotreitol (DTT) | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| Ethidium Bromide | Fisher Scientific | BP-1302-10 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium dehydrate (EDTA) | Fisher Scientific | S316-212 | |
| Optimem | Life Technologies | 22600050 | |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma | P8833-100MG | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3KG | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | T4049-100ML | |
| Hgh Capacity cDNA Reverse Transcriptase Kit | Applied Biosystems by life technologies | 4368814 | |
| Power SYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems by life technologies | 4367659 | |
| HCl | Fisher Scientific | A144SI-212 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP26324 | |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma | 221473-500G | |
| Anti-RPL11 antibody | Abcam | ab79352 | |
| Ribosomal protein S6 (C-8) antibody | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-74459 | |
| 1xM199 | Sigma | M0393-10X1L | |
| Lithium cloride | Sigma | L-9650 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-500 | |
| Gel Loading Buffer II | Thermo Scientific | AM8546G | |
| UltraPure Agarose | Thermo Scientific | 16500-100 | |
| Trichloracetic acid (TCA) | Fisher Scientific | A322-100 | |
| SuperSignal West Pico PLUS chemiluminescent substrate | Thermo Scientific | 34580 | |
| Formaldehyde | Fisher Scientific | BP531-500 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma | L5750-1KG | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626-5G | |
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma | A1852-1VL | |
| Cytosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (CTP) | Sigma | C1506-250MG | |
| Uridine 5'-triphosphate trisodium salt hydrate (UTP) | Sigma | U6625-100MG | |
| Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate (GTP) | Sigma | G8877-250MG | |
| SP6 RNA Polymerase | NEB | M0207S | |
| Pyrophoshatase | Sigma | I1643-500UN | |
| Spermidine | Sigma | S0266-1G |
References
- Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
- Capewell, P., et al. Regulation of Trypanosoma brucei Total and Polysomal mRNA during Development within Its Mammalian Host. PLoS One. 8 (6), e67069 (2013).
- Warner, J. R., Knopf, P. M., Rich, A. A multiple ribosomal structure in protein synthesis. Proceedings of the National Academy of Science, USA. 49, 122-129 (1963).
- Piccirillo, C. A., Bjur, E., Topisirovic, I., Sonenberg, N., Larsson, O. Translational control of immune responses: from transcripts to translatomes. Nature Immunology. 15 (6), 503-511 (2014).
- Ennis, H. L., Lubin, M. Cycloheximide: Aspects of Inhibition of Protein Synthesis in Mammalian Cells. Science. 146 (3650), 1474-1476 (1964).
- Masek, T., Valasek, L., Pospisek, M. Polysome analysis and RNA purification from sucrose gradients. Methods in Molecular Biology. 703, 293-309 (2011).
- Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. Journal of Visualized Experiments. (87), (2014).
- Zuccotti, P., Modelska, A. Studying the Translatome with Polysome Profiling. Methods in Molecular Biology. 1358, 59-69 (2016).
- Chasse, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. Analysis of translation using polysome profiling. Nucleic Acids Research. 45 (3), e15 (2017).
- Arava, Y., et al. Genome-wide analysis of mRNA translation profiles in Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Science, USA. 100 (7), 3889-3894 (2003).
- Gandin, V., et al. nanoCAGE reveals 5' UTR features that define specific modes of translation of functionally related MTOR-sensitive mRNAs. Genome Research. 26 (5), 636-648 (2016).
- Bazzini, A. A., Lee, M. T., Giraldez, A. J. Ribosome profiling shows that miR-430 reduces translation before causing mRNA decay in zebrafish. Science. 336 (6078), 233-237 (2012).
- Zanchin, N. I., Goldfarb, D. S. Nip7p interacts with Nop8p, an essential nucleolar protein required for 60S ribosome biogenesis, and the exosome subunit Rrp43p. Molecular Cell Biology. 19 (2), 1518-1525 (1999).
- Darnell, J. C., et al. FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism. Cell. 146 (2), 247-261 (2011).
- Gkogkas, C. G., et al. Autism-related deficits via dysregulated eIF4E-dependent translational control. Nature. 493 (7432), 371-377 (2013).
- Robichaud, N., Sonenberg, N. Translational control and the cancer cell response to stress. Curr Opin Cell Biol. 45, 102-109 (2017).
- Gordon, B. S., Kelleher, A. R., Kimball, S. R. Regulation of muscle protein synthesis and the effects of catabolic states. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 45 (10), 2147-2157 (2013).
- Ishimura, R., et al. RNA function. Ribosome stalling induced by mutation of a CNS-specific tRNA causes neurodegeneration. Science. 345 (6195), 455-459 (2014).
- Petersen, C. P., Bordeleau, M. E., Pelletier, J., Sharp, P. A. Short RNAs repress translation after initiation in mammalian cells. Molecular Cell. 21 (4), 533-542 (2006).
- Juntawong, P., Girke, T., Bazin, J., Bailey-Serres, J. Translational dynamics revealed by genome-wide profiling of ribosome footprints in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Science, USA. 111 (1), E203-E212 (2014).
- Bunnik, E. M., et al. Polysome profiling reveals translational control of gene expression in the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Genome Biology. 14 (11), R128 (2013).
- De Gaudenzi, J. G., Noe, G., Campo, V. A., Frasch, A. C., Cassola, A.
- Alves, L. R., Goldenberg, S. RNA-binding proteins related to stress response and differentiation in protozoa. World Journal of Biological Chemistry. 7 (1), 78-87 (2016).
- De Pablos, L. M., Ferreira, T. R., Walrad, P. B. Developmental differentiation in Leishmania lifecycle progression: post-transcriptional control conducts the orchestra. Current Opinions in Microbiology. 34, 82-89 (2016).
- Soto, M., et al. Cell-cycle-dependent translation of histone mRNAs is the key control point for regulation of histone biosynthesis in Leishmania infantum. Biochemical Journal. 379, 617-625 (2004).
- McNicoll, F., et al. Distinct 3 '-untranslated region elements regulate stage-specific mRNA accumulation and translation in Leishmania. Journal of Biological Chemistry. 280 (42), 35238-35246 (2005).
- Folgueira, C., et al. The translational efficiencies of the two Leishmania infantum HSP70 mRNAs, differing in their 3 '-untranslated regions, are affected by shifts in the temperature of growth through different mechanisms. Journal of Biological Chemistry. 280 (42), 35172-35183 (2005).
- Dumas, C., Chow, C., Muller, M., Papadopoulou, B. A novel class of developmentally regulated noncoding RNAs in Leishmania. Eukaryotic Cell. 5 (12), 2033-2046 (2006).
- Kapler, G. M., Coburn, C. M., Beverley, S. M. Stable transfection of the human parasite Leishmania major delineates a 30-kilobase region sufficient for extrachromosomal replication and expression. Molecular Cell Biology. 10 (3), 1084-1094 (1990).
- Karamyshev, A. L., Johnson, A. E. Selective SecA association with signal sequences in ribosome-bound nascent chains: a potential role for SecA in ribosome targeting to the bacterial membrane. Journal of Biological Chemistry. 280 (45), 37930-37940 (2005).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).
- Panda, A. C., Martindale, J. L., Gorospe, M. Polysome Fractionation to Analyze mRNA Distribution Profiles. Bio Protocols. 7 (3), (2017).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
- Patrick, A. E., Karamyshev, A. L., Millen, L., Thomas, P. J. Alteration of CFTR transmembrane span integration by disease-causing mutations. Molecular Biology of the Cell. 22 (23), 4461-4471 (2011).
- Kleizen, B., van Vlijmen, T., de Jonge, H. R., Braakman, I. Folding of CFTR is predominantly cotranslational. Molecular Cell. 20 (2), 277-287 (2005).
- van den Elzen, A. M., Schuller, A., Green, R., Seraphin, B. Dom34-Hbs1 mediated dissociation of inactive 80S ribosomes promotes restart of translation after stress. EMBO Journal. 33 (3), 265-276 (2014).
- Morita, M., et al. mTOR Controls Mitochondrial Dynamics and Cell Survival via MTFP1. Molecular Cell. 67 (6), 922-935 (2017).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
