Summary
ポリソーム プロファイリング技術の全体的な目標は、タンパク質合成時に個々 の mRNAs のトランスクリプトーム Mrna 翻訳活性の分析です。メソッドは、タンパク質合成の制御、翻訳活性化と健康と複数の人間の病気の抑制の研究にとって重要です。
Abstract
右金額は、適切なタイミングで適切なタンパク質発現正常な細胞機能と急速に変化する環境での生存の基礎であります。長い間、遺伝子発現研究は、転写レベルでの研究によって支配されていた。しかし、Mrna の定常状態レベルは蛋白質の生産と相関がない、Mrna の翻訳可能性は条件によって大きく異なります。リーシュ マニア原虫寄生虫のようないくつかの生物の蛋白質の表現は翻訳のレベルではほとんど規制されています。最近の研究は、その蛋白質の翻訳調節不全、代謝、がん、神経変性疾患や他の疾患に関連付けられて示した。ポリソームのプロファイリングは、タンパク質翻訳規則を研究する強力な方法です。それは個々 の mRNAs の並進状態を測定したり、ゲノム規模での翻訳を確認することができます。この手法の基本は、ポリソーム、リボソームのサブユニットと無料 Mrna 遠心分離、細胞質の中にショ糖密度勾配による溶解分離です。ユニバーサル ポリソーム プロファイル使用されるプロトコルで 3 つの異なるモデル原虫リーシュ マニア原虫、ひと培養細胞、動物組織を紹介します。リーシュ マニア原虫の細胞は懸濁液の自由に成長し、動物組織サンプルを表しますマウス精巣培養細胞付着性単分子膜の成長します。したがって、技術はこれらの源すべてに適応です。Polysomal 分画の分析のためのプロトコルには、個々 の mRNA のレベル Rt-qpcr、によってに、西部のしみとリボソーム Rna 電気泳動による解析によるタンパク質の検出が含まれています。メソッドは、分数の質量分析法による深い RNA シーケンスによってトランスクリプトームのレベルにリボソームの Mrna 協会の検討とリボソームのタンパク質の解析によってさらに拡張できます。このメソッドは、他の生物学的モデルに簡単に調整できます。
Introduction
細胞の遺伝子発現制御は、転写、転写、翻訳のメカニズムによって制御されます。ディープの RNA シーケンスの進歩は、前例のないレベルでゲノム スケールで定常状態の mRNA のレベルの研究を許可します。しかし、最近の知見は、定常 mRNA レベルがない、常にタンパク質生産1,2と相関を明らかにしました。個々 のトラン スクリプトの運命は非常に複雑な内部/外部刺激、ストレスなどのような多くの要因によって異なります。タンパク質の生合成遺伝子発現の調節は、状況の変化にすばやく応答するために必要な式コントロールの別の層を提供します。ポリソーム (または"polyribosome") のプロファイリング、分離と積極的にリボソームの翻訳の可視化は、タンパク質合成の調節を研究する強力な方法です。最初の実験的応用は 1960 年代3に登場、ポリソームのプロファイリングは現在タンパク質翻訳研究4で最も重要なテクニックの 1 つ。単一の Mrna は、ポリソームの形成につながる 1 つ以上のリボソームで翻訳できます。成績証明書はシクロヘキシミド5リボソーム上停止することができ。、ショ糖勾配遠心6,7ポリソーム分別過程で Mrna はポリソームの別の番号を含むを分けることができます。,8,9. polysomal 分画の RNA 解析、により個々 の mRNAs の並進状態の変化の測定、ゲノム規模で、さまざまな生理的条件4,7,中10. メソッドは、5' UTR と 3' UTR シーケンス mRNA 訳し11の制御の役割を明らかにする、翻訳抑制12の Mirna の役割を調べる、リボソーム生合成13 の欠陥を明らかにも使用されています、および人間の病気14,15にリボソーム蛋白質の役割を理解します。過去 10 年間の中には、ヒトの疾患におけるその重要性を示す翻訳中に遺伝子発現の役割の拡大が浮上しています。がん、代謝における翻訳調節と神経変性疾患のための証拠は、圧倒的な15,16,17,18です。EIF4E 依存翻訳調節の調節不全に貢献するたとえば、自閉症関連の赤字15と FMRP14自閉症にリンクされている Mrna にリボソームの失速に関与しています。したがって、polysomal プロファイルは、複数の人間の病気の翻訳制御の欠陥を研究する非常に重要なツールです。
Polysomal 分数別の生理学的条件下での蛋白質の解析は、翻訳中のリボソームと関連因子の関数を暴き出します。ポリソーム プロファイリング手法は、酵母、哺乳類細胞、植物、原生動物10,19,20,21など多くの種で使用されています。原虫トリパノソーマリーシュ マニアなどの遺伝子発現の転写調節機構限定展示します。そのゲノムはプロモーター規制転写22を持たないコードする遺伝子クラスターに分類されます。代わりに、発達の遺伝子発現は主にタンパク質翻訳およびトリパノソーマ科種23,24で mRNA の安定性のレベルで制御されます。したがって、転写制御の不在で並進制御の理解はこれらの有機体のため特に重要です。Polysomal ・ プロファイリングは、リーシュ マニア25,26,27,28遺伝子発現の転写後調節を研究する強力なツールです。
現実では個々 の mRNAs レベルの検出の最近の進歩は時間 (RT qPCR) の量的な PCR とプロテオミクス技術と同様、次世代シーケンシングによるトランスクリプトーム、解像度、新しいレベルに polysomal プロファイルの利点をもたらします。これらのメソッドの使用は、ディープの RNA シーケンス細胞ゲノム規模での並進状態を監視するプロテオーム解析の併用による個々 の polysomal 分画の解析によってさらに拡張できます。これは、異なる生理学的および病理学的条件の下で翻訳を調節する新規分子プレイヤーの識別できます。ここでは、提案する 3 つのモデルで使用されるプロトコルをプロファイリング ユニバーサル ポリソーム: 原虫リーシュ マニア原虫、培養細胞、動物組織。異なった有機体、勾配条件の最適化、RNase 阻害剤の選択と本研究でポリソーム分数を分析する RT qPCR、西部のしみ、RNA の電気泳動の適用からのセル lysates の準備でのアドバイスを紹介します。
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Protocol
すべての動物の治療や研究で得られた組織の処理機関動物ケアおよび国立研究所に従ってテキサス工科大学健康科学センターで使用委員会によって承認されたプロトコルに従って行われました。健康家畜福祉ガイドライン、プロトコル番号 96005。脊椎動物を犠牲にし、機関動物ケアおよび使用委員会からガイドラインに従って組織を準備してください。このような委員会に欠けている、国立衛生研究所動物福祉ガイドラインを参照してください。アダルト (> 60 日古い) c57bl/6 マウスが使用されました。動物介護制度と国立衛生研究所動物福祉ガイドラインに従ってテキサス工科大学健康科学センターで使用の委員会によって承認されたプロトコルに従ってすべての動植物の組織が得られました。小部屋に置かれた単一のマウス、安楽死のと空気が約 30% と次第に転置された炭酸ガス麻酔、動物の苦痛を最小限に抑えます。次の呼吸の停止、組織を収穫前に動物の死を確認するのに頚部転位を使用しました。
注意: ライブリーシュ マニアとひと培養細胞のすべての作業は、バイオ セーフティ キャビネット BSL-2 認定研究室で行われました。
1. から細胞ライセートの調製リーシュ マニア主要な、培養ひと細胞およびマウス組織
注: 別のソース材料からライセート調製でいくつかの違いがあります。サッカロースの勾配の準備と polysomal の分別などを含むその他の手順は同一、サンプル ソースには依存しません。
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リーシュ マニア原虫細胞ライセート作製
- 1 x M199 中29 10% の胎仔ウシ血清 (FBS) とペニシリン/ストレプトマイシンの混合物を含む 30 mL のリーシュ マニア原虫(FV1 ひずみ) 細胞を接種する (100 単位と 100 μ g/mL 対応)1 x 105セル/ml の密度で.
注:リーシュ マニア原虫の細胞を含むすべての手順は、バイオ セーフティ キャビネットの実施する必要があります。 - インキュベーターにセルを配置し、27 ° C で対数段階まで育てて (ログ半ば 5 x 106セル/mL に相当します)。成長を約 2 日間かかります。
- シクロヘキシミドを最終濃度 100 μ g/mL 翻訳 Mrna にリボソームを逮捕するために主要なリーシュ マニア文化に追加します。27 ° c. で 10 分のインキュベーターにセルを配置します。
- シクロヘキシミド処理が完了した後、50 mL の円錐管にセルを転送し、1,800 x g と 8 分破棄上清の 4 ° C で、それらをスピンします。
- ダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) 30 mL でセルを洗浄します。8 分間 1,800 × g、4 ° C に遠心します。
- 上清を捨てます。DPBS の 1 mL の細胞を再懸濁します。
- セルの因数を取るし、3.5% ホルムアルデヒド液と混ぜます。
- 検定によってセルをカウントし、その濃度を測定します。および microfuge の管に必要な細胞数を転送します。0.5x108-2 × 108セル/mL から調製したライセート 1 つのショ糖勾配のローディングのために十分です。
- 1,800 x g でセルを回し、4 ° C で 8 分間は上澄みを廃棄します。
- プロテアーゼ阻害剤と RNase 阻害剤 (20 mM HEPES 島、pH 7.4 では、100 mM KCl、10 mM MgCl2、2 mM DTT、1% NP 40、1 x プロテアーゼ抑制剤のカクテル (EDTA 無添加)、200 単位/ml RNase 阻害剤) を含む換散バッファーの 1 mL に氷の上細胞ペレットを再懸濁します。
- ライセート 23 ゲージの針を通して 3 回渡します。液が透明になる針を通過した後。
- 11,200 x g で 4 ° C、ライセートを明らかにする 10 分遠心分離します。明らかにし転送に新鮮な lysate チューブし、ショ糖勾配遠心まで氷の上にそれを維持します。
- 収集 (後で分析) を入力としてライセートの 400-500 μ L は将来タンパク質解析用液体窒素ですぐにそれを凍結または RNA 解析のための凍結する前に RNA 精製試薬を追加します。
- 1 x M199 中29 10% の胎仔ウシ血清 (FBS) とペニシリン/ストレプトマイシンの混合物を含む 30 mL のリーシュ マニア原虫(FV1 ひずみ) 細胞を接種する (100 単位と 100 μ g/mL 対応)1 x 105セル/ml の密度で.
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ひと培養 HeLa 細胞から細胞ライセート作製
- HeLa 細胞を分割し、20 mL の 10 %fbs とペニシリン/ストレプトマイシンの混合物を含む DMEM 培地にそれらの種子 (100 単位と 100 μ g/mL 対応) セルをカウント 2 x 105セル/mL 15 cm プレート。
- 37 ° c、5% CO2製造元のプロトコルによると 20-24 h. 実行プラスミド DNA トランスフェクションの HeLa 細胞を成長します。
- 37 ° C、5% CO2でトランスフェクション後 24 h のための細胞に伝達します。
- シクロヘキシミドを最終濃度 100 μ g/mL 翻訳 Mrna にリボソームを逮捕し、37 ° C、5% CO2で 10 分のセルをインキュベートする成長の HeLa 細胞に追加します。培地を吸引します。氷の上の冷たい DPBS で 2 回細胞を洗ってください。
- プレートに換散バッファー (20 mM HEPES 島 pH 7.4 では、100 mM KCl、5 mM MgCl2、1 mM DTT、0.5% NP 40、1 x プロテアーゼ抑制剤のカクテル (EDTA 無添加) RNase 阻害剤または 1 mg/mL のヘパリンの 200 単位/ml) の 500 μ L を追加し、氷の上の細胞をこすり。
- および microfuge の管分離セルに転送します。0.5% と増加量のサンプルによると 5 mm MgCl2 NP 40 の濃度を調整します。
- ライセート 23 ゲージの針を通して 3-6 回渡します。
- スピン 11,200 x g と 4 ° C、8 分ライセートを明らかにします。遠心分離の後上清を新しいチューブに転送します。分光光度計を使用して、セル換散の効率を評価して、グラデーションの読み込みのサンプル量を決定します。0.1% の 0.5 mL にサンプルの 10 μ L を追加ナトリウム Dodecyl 硫酸塩 (SDS)。0.1 %sds に対しては空白です。測定吸光度 260 nm。予想される吸光度値は 15-20 単位/mL。
- ショ糖勾配遠心前に同じ吸光度値に換散バッファーのすべてのサンプルを希釈します。ショ糖勾配遠心まで氷のサンプルを保ちます。
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マウス精巣から細胞ライセート作製
- マウス精巣を解剖します。逃げずに小さな切開を行うと、精巣の精細管を収集し、0.1 mM 特異フッ化物 (PMSF) を添加した DPBS 5 mL を含む 15 mL の円錐管にそれらを転送します。
- 数回の反転によって積極的に組織をミックスします。5 分間氷の上単位重力を解決する組織を許可します。
- 削除し、結合細胞や組織片を含む曇りバッファーを破棄します。回手順 2-3 を繰り返します。精細管と生殖細胞の残りの白いペレットが濃縮されています。
- 精細管のペレットを 2 mL 遠心チューブに転送、500 x g で 1 分間でスピンが上澄みを廃棄します。
- 細管に換散バッファー (20 mM トリス-HCl、pH 7.4 では、100 mM KCl、5 mM MgCl2、1 mM DTT、0.5% NP 40、1 x プロテアーゼ抑制剤のカクテル (EDTA 無添加)、1 mg/mL のヘパリンまたは RNase 阻害剤の 200 単位/ml) 500 μ L を追加します。組織をカップ刻んだピペットを使用します。
- 小さなに懸濁液を転送 (0.5 〜 1.0 mL) Dounce ホモジナイザーです。ガラスの乳棒の 7 ~ 8 ストロークで組織を混乱させます。
- 1.5 mL 遠心チューブに液を転送します。
- 12,000 × g とライセートをオフに 8 分間、4 ° C でサンプルを遠心します。新しいチューブとストアにショ糖密度勾配にロードするまでの氷の上清を転送します。
- 50 μ L の入力サンプルとしてライセートを収集、将来のタンパク質分析-80 ° C ですぐにそれを凍結または RNA 解析のための凍結する前に RNA 精製試薬を追加します。
2. ショ糖勾配作製と超遠心法
- 2 スクロース グラデーション ソリューション (20 mM HEPES 島、pH 7.4 では、100 mM KCl、10 mM MgCl2、1 mM DTT、1 x プロテアーゼ抑制剤のカクテル)、10% ショ糖溶液または 50% ショ糖を含むを準備します。(トリス-HCl、pH 7.4 では HEPES の代わりに使用できます。)200 単位/ml 実験デザインによると RNase 阻害剤または 1 mg/mL のヘパリンを追加します。マーカー ブロックに SW 41 ローターの遠心管を置き、ブロックの上位レベルに沿って線を描画します。安定したラックにチューブを転送します。
- 接続層デバイス 10 mL 注射器を取るし、(上記準備) 10% ショ糖液と注射器を埋めます。チューブのマークに到達するまで軽く遠心管の下部にそれをリリースします。
- 50% ショ糖溶液による別の注射器を記入し、慎重にチューブの下に 10% ショ糖層を介してそのレイヤー デバイスを挿入します。優しくリリース ショ糖液チューブのマークに到達するまでから、下から開始。付属のキャップとチューブをシールします。
- ショ糖密度勾配を準備、グラデーション メーカー デバイスを有効にします。レベルの上または下ボタンを使用してプレートし、 DONEを押します。平準化は、勾配の直線性のために重要です。
- プレートを平準化後卒業生グラデーション メニューを開くを押します。グラデーション メニューのリストに移動し、SW 41 Ti ローターを選択します。上下のボタンを使用してメニューのリストから目的のショ糖密度勾配を選択します。押して使用。
- グラデーション メーカー プレートに勾配管ホルダーを配置します。ホルダーにチューブを転送します。6 グラデーションまで同時に準備できます。実行キーを押します。グラデーションのメーカーは、プログラムの速度と線形グラデーションを形成する角度でチューブを回転させます。グラデーションを準備する数分をかかります。
- プロセスが完了すると、ラックにチューブを置きます。キャップを脱ぐ。超遠心機チューブの上部からサンプル ボリュームと同じボリュームを削除します。
- ライセートを含む上にポリソームの 15-20260単位の 400-500 μ L を慎重にロードします。ローター バケツにチューブを置き、バランスをとる。
- 遠心 260,000 × g、4 ° C 2 時間 SW 41 ローターを使用しています。
3. ポリソーム分別およびサンプル コレクション
メモ: ライセート準備ソースによっていくつかの違いがありますが、グラデーションの準備とポリソームの分別のプロトコルは、同じ lysates のすべてのタイプの。
- 遠心の完了後、氷の上管とローター バケットを配置します。一部コレクターとグラデーション分留に電源を入れます。分留メニューをスキャンをクリックします。一部のコレクターに 24 のコレクション チューブをラックを置きます。
- 脱イオン水で分留側にリンス貯水池を埋めます。10 のリンスキーを押す s 分留にポンプを洗浄します。校正のためピストンに水で満たされた注射器洗浄アダプターを接続します。
- コンピューターの分留ソフトウェアを開きます。校正キーを押します。既定の設定を使用し、 [ok]を押します。注射器から水を注入する準備ができてください。
- キャリブレーションを行うに[ok]を押します。すぐに次の 5 のための水を注入する s。この時間の間に水が UV 検出器のフローセルを通過し、計測器が校正されます。記号ゼロ校正完了が表示されます。楽器は分別可能です。
- 注射器と洗浄アダプターを削除します。ヒントを分留のピストンに接続します。
- 10 の真鍮の空気のバルブを押し空気のキーを開く乾燥チューブとフロー ・ セルに s。空気バルブを閉じます。
- 優しくローター バケツから勾配管を削除し、それをラックに配置。管の上部にチューブ ホルダー キャップを適用し慎重にチューブ ホルダーにチューブを移動し、位置でロックします。
- プレース ホルダー、分留のピストンの下で。多くの場合、polysomal バンドは、目で見ることができます。分数とボリュームの必要な設定を紹介 (500 μ L/分画、24 画は、通常十分な)。適切なファイルを名前します。[Ok]をクリックし、グラフに行くボタンを押します。次のウィンドウでは、スキャンの開始を押します。OKを押して設定が表示されます。コレクターが最初の分数に樋から移動し、ピストンがチューブに移動します。ピストン グラデーションの上に達するとき、それは選択された速度まで減速して分数が収集されます。完了すると、ピストンは勾配管から移動します。
- 最後の分数を取得する分留に真鍮の空気のバルブを押し空気のキーを開きます。
- 氷の上には、ラックからチューブを移動します。
- RNA 精製試薬各分数とフラッシュの 2 つの容積は RNA の浄化まで液体窒素で凍結を追加します。また、蛋白質を分析する場合は、西部 (参照セクション 8) しみのそれらを集中する 10% の最終的な集中にトリクロロ酢酸を追加します。
4. Mrna RT qPCR データ解析中にレベルの正規化のため合成 RNA体外の準備
メモ:エシェリヒア属大腸菌OmpA mRNA は、正規化のこのプロトコルで使用されます。研究生物の Mrna と豊富な id を持たない他の RNA (哺乳類やリーシュ マニア) 使用することができます。
- OmpA 遺伝子30を含んでいるプラスミッドから標準 PCR の反作用によって SP6 プロモーターを含む OmpA DNA フラグメントを準備します。
- 100 μ L の混合物の準備: 80 mM HEPES 島、pH 7.5、16 mM MgCl2, 2 mM 3 mM GTP 10 mM DTT、3 mM 3 mM CTP、ATP 3 mM UTP、スペルミジン、0.5 U/μ L RNase 阻害、3 μ L SP6 RNA ポリメラーゼ DNA PCR OmpA の 1 μ g、0.005 U/μ L ピロホスファターゼ。
- 2 h 40 ° C で孵化させなさい。
- RNA 精製キットによって RNA を浄化します。
- 分光光度計による濃度を測定し、agarose のゲルの電気泳動で確認します。
5 グラデーションの分数と cDNA 作製から RNA の隔離
メモ: は、リボヌクレアーゼ阻害剤はリボヌクレアーゼ阻害剤として使用した場合、このプロトコルの RNA の浄化のために直接進みます。ただし、リボヌクレアーゼ阻害剤として使用する場合、ヘパリンは逆転写酵素 cDNA の準備で使用を抑制します。したがって、換散バッファーとグラデーションでヘパリンを使用していた場合、RNA の浄化を追加は必要となります。ヘパリンを使用していた場合、cDNA 合成 RNA を準備するセクション 6 を参照してください。
- RNA 精製試薬サンプルを解凍、20 を追加 RT qPCR 結果の正規化のための内部統制として合成 RNA の ng。1 つの変更を除いてメーカーのプロトコルに従って RNA の準備を進めます。1 μ L の RNA グレード グリコーゲン (20 μ g) 事前のイソプロパノールの沈殿物を追加します。RNase フリー水の 20-25 μ L の RNA ペレットを溶解します。
注: グリコーゲンはキャリアとして機能し、損失を回避し、浄化の間に RNA の餌を視覚化するのに役立ちます。OmpA mRNA は、RT qPCR 反応でさらなる正常化に使用されます。 - 十分な収量を確保するため、分光光度計を用いた RNA 濃度を測定します。40 代、60 代と prepolysomes として monosomes を含有する RNA 画分の平等なボリュームを兼ね備えてください。2-4 リボゾームを含む分数を光ポリソームと組み合わせるし、重いポリソームと分数の 5-8 のリボソーム結合します。
- 合計分数からの RNA の 5-10 μ L を使用すると、キットを使用して、製造元の推奨事項を次の Cdna を準備できます。
- ヌクレアーゼ フリー水の 80 μ L を cDNA の 20 μ L に追加します。-20 ° C で cDNA サンプルを凍結します。
6. RNA 精製ヘパリン汚染から
注: ヘパリンは核酸逆転写酵素などの酵素の処理を抑制します。したがって、換散バッファーおよび/またはグラデーションにヘパリンを使用する場合は、この追加の浄化のプロトコルを使用します。
- 浄化された RNA サンプルを 1 M 最終濃度 LiCl を追加します。
- サンプルをミックスし、氷上で 1 時間インキュベートします。
- 16,000 x g でおよび 4 ° C、15 分のサンプルをスピンします。
- ピペットを使用して可能な限り完全上清を除去します。
- 約 5 分のペレットを風乾します。
- 再 RNase フリーの水の最初のボリュームでペレットを中断します。
- 260 吸光光度測定を行う RNA 濃度を決定するための nm。通常、サンプルの損失は最小限です。
7. RT qPCR と mRNA の分布のデータ解析
- 10.2 μ L の水、SYBR グリーンの 20 μ L、遺伝子特異的プライマー (2.5 μ M の各セット) の 4.8 μ L、5 μ L の cDNA を組み合わせて、よく混ぜ、384 ウェル プレートにトリプリケートの井戸あたり 10 μ L を読み込みます。
- 粘着フィルムでプレートをしっかりとカバーし、5 分 1,800 x g でプレートを遠心分離機します。
- リアルタイム PCR 装置を用いて qPCR 反応表 1に示すように条件を設定します。
- 値と比較 CT (ΔΔCT) 法31は説明32変更の 1 つとして prepolysomes、ライトおよび重いポリソームで mRNA の分布の割合 (%) を計算サイクルしきい値 (CT) を使用します。RT qPCR データ解析におけるデータの正規化合成 RNA (OmpA ここ) を使用します。合成 RNA は、相対的な Mrna レベルを計算し、グラデーションの異なる分数でそれらを比較することができます正規化コントロールを提供します。
8. 西部にしみが付くことによって Polysomal 分画におけるタンパク質の解析
- 株式 100% (w/v) から最終濃度 10% を選択した画分 (500 μ L) にトリクロロ酢酸 (TCA) を追加、少なくとも 15 分間、5 分間遠心する、および microfuge の氷の上を保つ、上澄みを廃棄、氷冷アセトンで 2 回洗浄、S の 25 μ L に溶解電気泳動用 DS ページ サンプル読み込みバッファー。
- SDS ページの読み込み、次の転送 PVDF 膜に標準的な電気泳動を行います。ウエスタンブロット33に進みます。
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Representative Results
この研究では、3 つの異なるソースの polysomal のプロファイリング技術の応用について述べる: 寄生リーシュ マニア原虫、培養ひと細胞およびマウス精巣。リーシュ マニア原虫の細胞は自由に懸濁液中の液体媒体の成長、ひと培養細胞はプレートに付着性単分子膜の成長し、マウス精巣組織サンプルを表します。メソッドは、懸濁液、組織、または別の有機体からさまざまな種類および培養細胞の種類で自由に成長した細胞の他のタイプを簡単に調整できます。アプローチは、4 つの主要な手順で構成されています: ライセート調製、サッカロースの勾配の準備と遠心手順、ポリソーム分別およびサンプル コレクション画分の分析が続きます。さまざまなソースからの細胞は、収集および洗浄針や Dounce ホモジナイザーを通過に換散バッファーの分離します。遠心分離、ライセートを明らかに細胞の残骸を削除する使用されます。勾配分画法の方式は、図 1 aに表示されます。連続ショ糖密度勾配は、勾配メーカーで 10% と 50% の糖溶液の混合によって形成されます。ライセートはグラデーションの上に読み込まれます。遠心分離 Mrna は、リボソームの分画中に UV 検出器でモニターされます別の番号に関連付けられている異なる吸光度スペクトルを形成します。収集した分数は、RNA および蛋白質の分析 (図 1 b) に使用されます。RNA は、続いて北のしみまたはポリソームと個々 の mRNAs の関連を分析する RT qPCR 反応に続いて cDNA 生産用電気泳動によって分析できます。次世代シーケンサーは、ゲノム規模7に存在する Mrna の翻訳のステータスを分析する使用できます。Polysomal 分数の蛋白質解析、タンパク質はそれらを集中するトリクロロ酸で沈殿させた。西部のしみが付くことはプロテオーム レベルで質量分析によって、タンパク質は分析しています。
リーシュ マニア原虫の文化を積極的に成長してから生成した典型的な polysomal プロファイルを図 2 aに示します。分別の吸光度のグラフは、リボソームのサブユニット (40 代と 60 代)、単一リボゾーム (80 年代または monosomes) とポリソームの典型的なピークを持つ異なる形状を有しています。
定量的 RT-PCR (RT qPCR) を用いてリボゾーム、ポリソームとリーシュ マニアの個々 の mRNAs の関連を検出します。比較 CT (ΔΔCT)31メソッドは、セルの相対 Mrna レベルを勉強するシンプルで適切なアプローチです。このメソッドでは、計算のため内部統制 (、安定した mRNA、治療や実験の条件の中に表現を変更しない) 必要があります。ただし、内部統制に無い polysomal 分数リボゾーム、ポリソームなどとの関連付けによって、分数のリボソーム RNA、mRNA のレベルが変化するため。内部統制の問題を解決するために相対的な個々リーシュ マニアmRNA のレベルの分数の正規化の合成細菌 OmpA mRNA を使いました。OmpA mRNA 合成の in vitro RNA の抽出の前に各分画に等しい量で追加.合成 RNA の添加は、RT qPCR データの計算をより正確に、比較 CT (ΔΔCT) による計算のための内部統制を務めかなってので重要です。
グラデーションの分数の因数は 3 つのグループに混合された: prepolysomes (サブユニットと monosomes)、光のポリソーム (2-4 リボゾームから成る) と重いポリソーム (5-8 リボゾームから成る)。RT qPCR はこれらの合計分数 (図 2 b) の間の mRNA の分布を分析する合計分数から RNA を行った.18 s リボソーム RNA は、コントロールとして使用されました。小さい ribosomal 亜単位の推定分布とよく相関した RT qPCR によって決まりますその相対的なレベル (無料サブユニットと monosomes とポリソームの一部として) スペクトルの。RT qPCR 分析テスト個々 の mRNAs がリーシュ マニア成長の段階で対数変換で婚約の異なる学位を持っていることを明らかにしました。チューブリン mRNA は、効率的な翻訳を示唆して重いポリソームに優先的に関連付けられます。対照的に、Sherp mRNA は主に prepolysomes と光のポリソーム チューブリンと比較して少ないアクティブな変換をサポートある mRNA。
培養細胞における組換え蛋白質の表現は、研究の多様な部門での重要な実験的アプローチです。別のサンプル ソース、ひと培養細胞における組換えタンパク質 Mrna の polysomal プロファイルの例を紹介します。HeLa 細胞が一過性組換え嚢胞性線維症膜コンダクタンス レギュレータ (CFTR)34またはノリエ病タンパク質 (NDP) を表現するプラスミドをトランスフェクトしました。これらの 2 つの独立した文化からポリソーム分別の吸光度スペクトルは対応する ribosomal 亜単位 (40 代と 60 代)、monosomes (80 年代) やポリソーム (図 3 a) 非常に類似し、含まれている明確なピークだったこれらの実験からスペクトルの類似性は、グラデーションの分別の再現性を示しています。ようなリーシュ マニア原虫研究で Mrna の分布によって決定された RT qPCR prepolysomes、光ポリソームと重いポリソーム (図 3 b) を表す分数で。リボソーム小サブユニット 18 s RNA の検出は、スペクトルの推定分布と相関。NDP Mrna CFTR Mrna が NDP がより効率的に翻訳されることを示唆 prepolysome の分画で発見されたほとんど、光と重い polysomal 分数と関連していた主。NDP は比較的小さい蛋白質、CFTR は翻訳35中に独立していないがフォールド複数のドメインから構成される非常に大きい蛋白質 (1480 アミノ酸残基)。ポリソームと CFTR mRNA の低い契約反映その異なるドメインの翻訳共役折りたたみに必要なより遅い翻訳するかもしれません。
ポリソーム分数は、蛋白質の検出にも使用できます。HeLa 細胞 (図 4) のリボソームタンパク質の例のグラデーション画分中のタンパク質の検出を行った。タンパク質画分および西部のしみから TCA が小サブユニット リボソームタンパク質 RPS6 と大サブユニット リボソームタンパク質 RPL11 を検出する使用された 10% の沈殿物によって集中していた (図 4、上部パネル)。その分布の吸光度スペクトルのピークとよく相関しました。これらの実験は、それらのタンパク質の分析ポリソーム分数を使用ことができることを明確に示します。
ポリソーム分別のため多く異なるショ糖濃度勾配 (たとえば、7-47365-5077-506 10-503715-508, など) が使用されました。ここでは、2 つのグラデーション 10-50%、17-51% (図 5) を比較しました。とはいえ、17-51% には、許容可能な結果が生成される、10-50% の勾配での分離はより全体的なだった。
リボゾームとポリソーム8,9する EDTA などのキレート剤が中断されています。図 6の hela 細胞ライセート グラデーションの読み込み monosomes、ポリソームに対応するピークの消失につながるし、リボソームのサブユニットの大幅な増加のピーク前に EDTA 処理で表示されます。この実験はコントロールとして提供しています、EDTA 処理せず観測のピークは、実際にリボソーム monosomes ポリソームを示した。
マウス精巣からポリソーム分別の結果を図 7に示します。吸光度スペクトルリーシュ マニアと HeLa 細胞からのものと類似しています: ribosomal 亜単位、monosomes、ポリソームの明確なピーク。その形状や分布 polysomal の異なるスペクトルのそれらを識別するために容易にする署名の外観を生成します。総 Rna 画分精製したものし、選択した一部分から Rna が agarose のゲル (図 7、上部パネル) の電気泳動によって分析されました。電気泳動は、18 s、28 s リボソーム Rna の典型的な分布を示しています。そのシャープなバンドを示すサンプルの厳守。ゲルは次の北のしみによって個々 の mRNAs の検出のために使用されるかもしれないまたは RNA または蛋白質分析 - 拡散のリボソーム Rna のバンドを示すサンプルの RNA の劣化のさらなる実験前にサンプルの品質を評価する使用することができます。
私たちの研究の中に溶解液とショ糖のグラデーションで RNase 阻害剤として RNase 阻害剤、ヘパリンを使いました。それらの両方は、満足のいく結果を提供、cDNA と RT qPCR 反応を阻害しないため RNase 阻害剤の使用は RNA 解析のために望ましかった。したがって、RNA 精製の追加の手順は必要ありませんでした。ただし、研究者がポリソームの準備中にヘパリンを使用する場合は、留意してヘパリンを阻害する RT qPCR などダウン ストリーム アプリケーション (プロトコル セクション 6 を参照してください) その他の RNA の精製ステップが必要です。
図 1.ポリソーム プロファイリングします。(A)勾配の準備法ポリソームの分別及び吸光度のプロファイル。(B)分画分析の方式です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2.ポリソーム プロフィール分析の成長の対数段階でリーシュ マニア原虫文化します。(A)ライセート細胞質で 10-50% ショ糖密度勾配分画しました。(B) 18 s RNA、チューブリンと prepolysomes における Sherp Mrna (%) の相対分布、RT qPCR による分析ログ細胞の光と重いポリソーム。40 代を含む分数、60 年代、monosomes は、prepolysomes として結合されました。2 4 リボゾームと分数は、分数の 5-8 リボソーム形成重いポリソーム中光ポリソームと結合されました。合成大腸菌OmpA mRNA は、RT qPCR で正規化コントロールを務めた分数前 RNA の抽出に追加されます。比較 CT (ΔΔCT)31メソッドは、mRNA のレベルの計算に使用されました。誤差は、標準誤差を表しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3.ポリソーム分別と HeLa 細胞のリボソームと組換え CFTR と NDP Mrna 協会の分析プラスミド Dna をトランスフェクトした。(A) HeLa 細胞における Polysomal プロファイル CFTR と NDP プラスミドをトランスフェクトしました。10%-50% ショ糖密度勾配はポリソームの分離を達成するために適用されました。小さい (40 代) 大型 (60) サブユニットと monosome (80 年代) のピークが示されます。分数は、パネルAに示すように、結合し、さらに分析に使用します。(B) CFTR の NDP の異なる画分での Mrna の分布。18 歳の RT qPCR による検出はポリソーム分別のコントロールとして使用されました。RNA レベルは、RT qPCR 解析によって評価されました。MRNA 合成を使用して、データが正規化されています。比較 CT (ΔΔCT)31メソッドは、mRNA のレベルの計算に使用されました。誤差は、標準誤差を表しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4.Hela 細胞 polysomal 分数のリボソームタンパク質の検出。10%-50% のショ糖勾配遠心法によって hela 細胞ライセートを受けた。選択した分数蛋白質と TCA 沈殿され、12% の電気泳動によって分析次の用いたウェスタンブロッテイング SDS-PAGE マウス モノクローナル RPS6 とウサギ抗体 RPL11 一次抗体と Peroxidase-Conjugated ヤギ抗マウスまたは抗家兎の二次抗体。SuperSignal 西ピコ プラス化学発光基質によって信号の可視化が行われました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5.Polysomal 10%-50% (黒) または 17-51% (グレー) サッカロースの勾配のプロファイリング hela 細胞の比較。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6.HeLa 細胞における polysomal のプロファイルに対する EDTA 処理の影響。Hela 細胞ライセートは 10 mM EDTA のショ糖勾配遠心法直前 10 分間氷の上で処理しました。MgCl2は 5 mM EDTA ショ糖勾配ソリューションによって置き換えられました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 7.マウス精巣組織ライセートから polysomal プロファイル。分数は、RNA 精製試薬と RNA の抽出を受けるし、1% の agarose のゲルの電気泳動によって分析します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| ステージ | ステップ | 条件 |
| ホールド | ステップ 1 | 25 から 1.6 ° C/s で 50 ° c の温度を上昇します。 |
| 50 ° C 2:00 分インキュベートします。 | ||
| ステップ 2 | 50 から 95 ° c 1.6 ° C/s の温度を上昇します。 | |
| 95 ° C 10:00 分インキュベートします。 | ||
| PCR | ステップ 1 | 00:15, 95 ° C で分 |
| ステップ 2 | 95 から 60 ° C 1.6 ° C への温度/ | |
| 1:00 分の 60 ° C で孵化させなさい | ||
| 40 のサイクル数 | ||
| 曲線を溶かす | Step1 | 60 から 95 ° c 1.6 ° C/s の温度を上昇します。 |
| ステップ 2 | 95 から 1.6 ° C/s の 60 ° C への温度します。 | |
| 1:00 分の 60 ° C で孵化させなさい | ||
| ステップ 3 (解離) | 60 から 0.05 ° C/s 95 ° C への温度を増加します。 | |
| 00:15, 95 ° C で分 | ||
表 1。RT qPCR の条件
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Discussion
ショ糖密度勾配によるポリソーム分別が RNA と結合し、タンパク質画分の分析は個々 の mRNAs または全体 translatome の並進状態だけでなく、並進を規定する蛋白質の要因の役割を分析するための強力な方法通常の生理や病気の状態の間に機械。Polysomal プロファイリングリーシュ マニア転写制御は主として不在、遺伝子発現制御が主に発生しますを含む trypanosomatids などの生物の翻訳制御の研究に特に適している手法は、します。中に翻訳します。
ここでは、3 つのモデルで使用されるポリソーム分別のプロトコルについて述べる:リーシュ マニア寄生虫、ひと培養細胞およびマウス組織。ポリソーム分別手順は本質的にこの試験で使用される異なった有機体のための同じただし、lysate の準備いくつかの違いがあります。リーシュ マニア原虫の細胞液体文化で育つし、セルがカウントされますように溶解前にグラデーションの読み込みと同じ遠心分離によって収集されます。人間の細胞を洗浄し、直接板の上に分離できます。等しい荷重は、光学濃度によって制御されます。マウス組織 Dounce ホモジナイザーを必要とする効率的な換散のためリーシュ マニアとひと細胞の場合は 23 ゲージの針を通してそれらを合格に十分な。
使用すべての試薬は、RNase とプロテアーゼ無料にする必要があります。細胞溶解液に RNase 活性の阻害剤としてヘパリンと RNase 阻害剤を比較しました。両方の試薬が RNase を効果的にブロックすることができますがわかった。しかし、ヘパリンは cDNA の調製と Rt-qpcr など下流のアプリケーションを影響します。その結果、RNA の準備ではヘパリンを使用する場合、追加精製ステップが必要です。我々 の意見で RNase 阻害剤はより便利な選択は、およびプロトコルをプロファイリング ポリソームで効果的に使用することができます。
Polysomal プロファイリング法の主要な制限である労働集約的です。6 グラデーションまで同時に準備できます。グラデーションの分留は、短時間で処理する必要があります 144 分数を生成します。各分画の解析は時間がかかり、高価なもすることができます。したがって、前ポリソームに留分を組み合わせ、光と重いポリソームは個々 の mRNAs の橋渡し活動を推定する高速かつ少ない骨の折れる方法を提供します。合計分数の RT qPCR 結果異なる Mrnaリーシュ マニアと HeLa 細胞 (図 2 3) の両方の翻訳可能性の違いを識別することができました。ただし、細かい分解能が必要な場合、各分画の解析を実行できます。
リボソームのプロファイリング mRNA の並進状態を研究する別の方法は、リボソーム38によって保護されて mRNA フラグメントのシーケンスを介してタンパク質生産の測定に基づいています。この技術は mRNA シーケンスを関連付けるサンプル翻訳されている特定の polysomal 分画の量的な情報し、でコドン解像度で比較する Mrna の並進状態に関する正確な情報を提供ポリソーム プロファイリング技術。しかし、ポリソーム プロファイリングしたがってポリソームのプロテオームに関する追加情報を提供、RNA および蛋白質の分析に使用することができます、翻訳制御への貢献の要因を識別します。
したがって、polysomal プロファイルは個々 の mRNAs の並進状態を分析するために使用できる汎用性の高いテクニック リボソーム蛋白質を調べるし、異なる別のモデル生物実験における翻訳制御の研究条件。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
著者はチン ・ リーのオーディオ録音との助けをありがちましょう。テキサス工科大学医療科学センターからスタートアップ資金によって支えられたし、神経科学研究と治療 (CTNT) のための卓越性のセンター A.L.K.; に PN CTNT 2017-05 AKHRJDHW を与える研究NIH グラントによって部分的に K.Z. ジェームス c. ハフマンとクリステン ・ r ・ デバカ R01AI099380 CISER (幹統合教育研究センター) 学者、プログラムによってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments: | |||
| Gradient master | Biocomp Instruments Inc. | 108 | |
| Piston Gradient Fractionator | Biocomp Instruments Inc. | 152 | |
| Fraction collector | Gilson, Inc. | FC203B | |
| NanoDrop One | Thermo Scientific | NanoDrop One | |
| Nikon inverted microscope | Nikon | ECLIPSE Ts2-FL/Ts2 | |
| 2720 Thermal Cycler | Applied Biosystems by Life Technologies | 4359659 | |
| CO2 incubator | Panasonic Healthcare Co. | MCO-170A1CUV | |
| HERATHERM incubator | Thermo Scientific | 51028063 | |
| Biological Safety Cabinet, class II, type A2 | NuAire Inc. | NU-543-400 | |
| Revco freezer | Revco Technologies | ULT1386-5-D35 | |
| Beckman L8-M Ultracentifuge | Beckman Coulter | L8M-70 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Ultracentrifuge Rotor SW41 | Beckman Coulter | 331362 | |
| Swing-bucket rotor | Eppendorf | A-4-62 | |
| Fixed angle rotor | Eppendorf | F-45-30-11 | |
| Quant Studio 12K Flex Real-Time PCR machine 285880228 | Applied Biosystems by life technologies | 4470661 | |
| TC20 Automated cell counter | Bio-Rad | 145-0102 | |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 02-671-51B | |
| Software | |||
| Triax software | Biocomp Instruments Inc. | ||
| Materials: | |||
| Counting slides, dual chamber for cell counter | Bio-Rad | 145-0011 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Open-top polyclear centrifuge tubes, (14 mm x 89 mm) | Seton Scientific | 7030 | |
| Syringe, 5 mL | BD | 309646 | |
| BD Syringe 3 mL23 Gauge 1 Inch Needle | BD | 10020439 | |
| Nunclon Delta Surface plate, 14 cm | Thermo Scientific | 168381 | |
| Nunclon Delta Surface plate, 9 cm | Thermo Scientific | 172931 | |
| Nalgene rapid-flow 90mm filter unit, 500 mL, 0.2 aPES | Thermo Scientific | 569-0020 | |
| BioLite 75 cm3 flasks | Thermo Scientific | 130193 | |
| Nunc 50 mL conical centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339653 | |
| Chemicals: | |||
| Trizol LS | Ambion by Life Technologies | 10296028 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| Trizma base | Sigma | T1378-5KG | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium-high glucose (DMEM) | Sigma | D6429-500ML | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F0926-50ML | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | Sigma | P0781-100ML | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Sigma | D8537-500ML | |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2x6H2O) | Acros Organics | AC413415000 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma | P9541-500G | |
| Nonidet P 40 (NP-40) | Fluka (Sigma-Aldrich) | 74385 | |
| Recombinant Rnasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2511 | |
| Heparin sodium salt | Sigma | H3993-1MU | |
| cOmplete Mini EDTA-free protease inhibitors | Roche Diagnostics | 11836170001 | |
| Glycogen | Thermo Scientific | R0551 | |
| Water | Sigma | W4502-1L | |
| Cycloheximide | Sigma | C7698-1G | |
| Chloroform | Fisher Scientific | 194002 | |
| Dithiotreitol (DTT) | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| Ethidium Bromide | Fisher Scientific | BP-1302-10 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium dehydrate (EDTA) | Fisher Scientific | S316-212 | |
| Optimem | Life Technologies | 22600050 | |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma | P8833-100MG | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3KG | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | T4049-100ML | |
| Hgh Capacity cDNA Reverse Transcriptase Kit | Applied Biosystems by life technologies | 4368814 | |
| Power SYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems by life technologies | 4367659 | |
| HCl | Fisher Scientific | A144SI-212 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP26324 | |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma | 221473-500G | |
| Anti-RPL11 antibody | Abcam | ab79352 | |
| Ribosomal protein S6 (C-8) antibody | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-74459 | |
| 1xM199 | Sigma | M0393-10X1L | |
| Lithium cloride | Sigma | L-9650 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-500 | |
| Gel Loading Buffer II | Thermo Scientific | AM8546G | |
| UltraPure Agarose | Thermo Scientific | 16500-100 | |
| Trichloracetic acid (TCA) | Fisher Scientific | A322-100 | |
| SuperSignal West Pico PLUS chemiluminescent substrate | Thermo Scientific | 34580 | |
| Formaldehyde | Fisher Scientific | BP531-500 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma | L5750-1KG | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626-5G | |
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma | A1852-1VL | |
| Cytosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (CTP) | Sigma | C1506-250MG | |
| Uridine 5'-triphosphate trisodium salt hydrate (UTP) | Sigma | U6625-100MG | |
| Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate (GTP) | Sigma | G8877-250MG | |
| SP6 RNA Polymerase | NEB | M0207S | |
| Pyrophoshatase | Sigma | I1643-500UN | |
| Spermidine | Sigma | S0266-1G |
References
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