Summary
تحديد المتغيرات الجينية المساهمة في الأمراض البشرية المعقدة يسمح لنا بتحديد آليات جديدة. وهنا، علينا أن نظهر نهجاً متعدد الوراثي للجينات المرشحة أو تحليل مسار الجين الذي يزيد من تغطية تكلفة منخفضة وهي قابلة للدراسات الفوجية.
Abstract
وكثيراً ما تستند الأمراض المعقدة متعددة المتغيرات الجينية المشتركة التي تسهم في قابلية المرض. هنا، يمكننا وصف نهج تعدد الأشكال (SNP) النوكليوتيدات واحدة علامة فعالة من حيث التكلفة باستخدام فحص الوراثي متعدد مع الكتلي، للتحقيق في الجينات الطريق رابطات في الأفواج السريرية. نحن التحقيق موضع المرشح الحساسية الغذائية Interleukin13 (IL13) على سبيل مثال. هذا الأسلوب كفاءة تكبير التغطية بالاستفادة من اختلال الصلة المشتركة (LD) داخل منطقة. المحدد LD بطانات ثم صممت في تحليل متعدد، تمكين بطانات مختلفة تصل إلى 40 يتم تحليلها في الوقت نفسه، تعزيز الفعالية من حيث التكلفة. تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) تستخدم لتضخيم المكاني هدفا، يليه النوكليوتيدات واحدة، وتقاس في أمبليكونس ثم استخدام الليزر ساعد مصفوفة الامتزاز/التأين-الوقت من flight(MALDI-TOF) الكتلي. ويتم تحليل الناتج الخام مع النمط الوراثي تطلق على البرمجيات، واستخدام تعريفات مراقبة الجودة الصارمة وانقطاع، وتحدد الأنماط الجينية الاحتمالية العالية والإخراج لتحليل البيانات.
Introduction
في الأمراض البشرية المعقدة، المتغيرات الجينية تساهم قابلية المرض والتحديد الكمي لهذه المتغيرات قد تكون مفيدة لفهم الآلية المرضية، تحديد مجموعات المرضى عالية المخاطر، ومعاملة المستجيبين. في الواقع، الوعد بدقة الطب تعتمد على الاستفادة من المعلومات الجينية لتحديد مجموعات فرعية المريض1. ولسوء الحظ، داخل الفضاء بيولوجيا الأمراض المعقدة، حيث تعمل المرض هي مدعومة بالتغاير الوراثي الكبير، بينيترانسي منخفضة، والتعبيرية متغير، الفوج حجم الاحتياجات للنهج الشاملة للجينوم التعرف على الرواية المرشحين غالباً ما تكون باهظة كبيرة2. بدلاً من ذلك، يبدأ نهج جينات مستهدفة مرشح بداهة فرضية حول الجينات/مسارات محددة في مسببات المرض3. أدوات تحليل المسار تستخدم عادة للتحقيق في الفسيولوجيا المرضية المكاني الهدف المحدد، توليد عدة مسارات المرشح استكشاف. علينا أن نظهر هنا نهجاً متعدد التنميط يسمح لتحقيق عشرات ومئات بطانات بمقايسة واحدة، مناسبة ل الدراسات الفوجية البشرية4. وهذا النهج مرتفع نسبيا من خلال، ضع، السماح لمئات آلاف عينات الحمض النووي لتكون جينوتيبيد لدراسات اكتشاف الرواية والتحقيق في مسارات محددة. الأساليب المذكورة هنا مفيدة لتحديد المخاطر الآليلات وروابطها مع السمات السريرية بطريقة سريعة وغير مكلفة نسبيا. وكان هذا المنهاج مفيد جداً للفحص والتشخيص أغراض5،6، وأكثر في الآونة الأخيرة، للعدوى الميكروبية7 و8من فيروس الورم الحليمي البشري.
ويبدأ هذا البروتوكول مع اختيار مجموعة من الجينات للتحقيق، أي.، المناطق المستهدفة، عادة ما تحدد من خلال البحث في الأدب، أو فرضيات مسبقاً للمشاركة في عملية المرض؛ أو ربما المحدد للنسخ المتماثل كالرابطات الرائدة لدراسة الجينوم على نطاق الرابطة (GWA) اكتشاف. من مجموعة الجينات، وسوف حدد الباحث قائمة العلامة بطانات المكرر. هو اختلال الربط (دينار)، أو العلاقة بين المتغيرات في المنطقة يستخدم لتحديد ممثل 'الوسم SNP' لمجموعة من بطانات في LD عالية، المعروف باسم هابلوتيبي. LD عالية في المنطقة يعني أن بطانات غالباً موروثة معا من التنميط SNP واحدة غير كافية لتمثل الاختلاف في بطانات جميع في هابلوتيبي أن. بدلاً من ذلك، إذا كانت متابعة قائمة نهائية من بطانات من العديد من المناطق، على سبيل المثال-، النسخ المتماثل لدراسة GWA، قد تكون هذه العملية غير ضرورية. للتنميط متعدد، ثم ينبغي تصميم مقايسة حول هذه الأهداف الإشعال التضخيم من اختلاف الجماعية لتلك كبسولة تفجير ملحق والمنتجات لإنتاج التفسير الشامل الأطياف. وتنفذ هذه المعلمات بسهولة بتصميم أداة فحص الوراثي متعدد. سيتم استخدام الإشعال إلى الأمام وعكس من هذا التصميم لاستهداف علامات الاهتمام وتضخيم تسلسل يحتوي على الحزب الوطني اﻻسكتلندي. كبسولة تفجير ملحق إرفاق الدانية مباشرة إلى بطانات وإضافة قاعدة واحدة، وكتلة معدلة، 'المدمر' مكملة للحزب الوطني اﻻسكتلندي. كذلك يمنع قاعدة المنهي التمديد للحمض النووي. الكتلة--تعديل القاعدة تمكن أجزاء مختلفة من قاعدة واحدة الكشف عنها بواسطة الطيف الكتلي. ثم يتم تطبيق لوحة تحتوي على مادة الكيمياء الوراثي لشريحة للقياس على منصة الكتلي. بعد تطبيق ضوابط الجودة المناسبة لدعوات التنميط الخام الكشف عنها بواسطة النظام، يمكن تصدير البيانات ويستخدم للتحليل الإحصائي لاختبار الارتباط مع المرض تعمل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
المواد الجينية المستخدمة هنا أخلاقيا وأقر لاستخدام المكتب "الأطفال هريك" (لجنة أخلاقيات البحوث البشرية) (قوات الدفاع المدني/07/492)، إدارة هريك الخدمات البشرية (10/07) ومستشفى (RCH الأطفال الملكي) هريك (27047).
1-تصميم التحليل متعدد
- إعداد قائمة الحزب الوطني اﻻسكتلندي لتصميم المقايسة.
- إدخال المنطقة المستهدفة في وظيفة بلغة هابلوفيو (https://www.broadinstitute.org/haploview/downloads). استخدم LD (الارتباط، ص2) بين بطانات تمتد المنطقة المستهدفة لإنشاء قائمة البرامج، التي توفر تغطية كاملة للمنطقة المطلوب مع أقل عدد من المتغيرات المطلوبة. إنشاء قائمة ببطانات أن ترتبط كل الآليلات ليتم القبض على عتبة المعرفة من قبل المستخدم (على سبيل المثال.، ≥0.8 ص2 ).
- تحديد تسلسل مناسب للإشعال إلى الأمام، وعكس، والتمديد
- إدخال القائمة التي تم إنشاؤها من بطانات في أداة تصميم المقايسة للاختيار.
ملاحظة: يتم تطبيق الإرشادات التالية لتحليل تصميم أداة تستخدم لتوليد نتائج الممثل، كما هو محدد في الجدول للمواد. - مرة واحدة قد بدأ تصميم أداة الفحص، حدد التصميم الوراثي الجديد. أدخل اسماً لتصميم المقايسة في حقل اسم التصميم .
- توفر القائمة SNP التي تم إنشاؤها في الخطوة 1.1.1 بالنقر فوق الزر المسمى تحرير إدخال النص مع تعليمات روبية أو فاستا إلى يسار الزر.
ملاحظة: بطانات يمكن إدخالها كنص قائمة بالمراجع (rs) معرفات SNP أو تحميلها في شكل فاستا، أو تنسيق الملف SNP المجموعة المستخدمة من قبل الأداة. لتحميل الملفات في التنسيقات، حدد الزر تحميل الملف . الحد الأعلى للمتغيرات التي يمكن أن تصمم في مقايسة واحد، يسمى 'جيدا،' هو بطانات 40. فمن الممكن لتحديد بطانات التي تشكل أولوية بالنسبة للتصميم قبل البدء في التشغيل؛ وسيتم تصميم هذه أولاً. يمكن أن يتم تعيين عنصر التحكم بطانات: على سبيل المثال، تمت إضافة فحص للكشف عن نوع الجنس في حالة شكا مزيج من نموذج أو عنصر تحكم لتحديد القالب كافية إذا كان يعمل مع جودة منخفضة أو الفقيرة الحمض النووي. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن استخدام بطانات التحكم والأولوية يمكن أن تقلل من عدد البرامج التي يمكن أن تكون مصممة بشكل جيد في واحدة. - من القائمة مسبقاً ، حدد خيار إعداد مسبق للقراءة "المتنوعة عالية" . من القائمة الكائن ، حدد الكائن الحي التي يستمد منها الحمض النووي لتكون جينوتيبيد. للممثل النتائج المعروضة هنا، وكان هذا الإنسان.
ملاحظة: الماوس والأبقار من الكائنات أيضا متوافقة مع الأداة. واحد كما يمكنك تحديد الأخرى إذا كان العمل مع كائن بديل مثل مصنع أو ميكروب؛ بيد الخطوات الآلي لإيجاد المناطق التمهيدي الأمثل وبطانات الدانية لن تتوفر نظراً لعدم وجود الجينوم الإشارة. - في القائمة قاعدة البيانات ، حدد بناء أحدث من الجينوم، أو بنية بديلة إذا لزم الأمر، من القائمة الكيمياء . حدد القراءة وإدخال للحقل متعدد المستوى ، على أعلى مستوى من مضاعفة: 40. الآن، حدد بدء تشغيل. "الخطوة 1" من الأداة سوف تبدأ.
ملاحظة: أثناء الخطوة 1، الأداة استرداد وتنسيقات تسلسل SNP. هنا، قد تتضمن أخطاء تنسيق ملف فاستا الذي ينبغي فحص حالة الملف FASTA وإخراجها حسب الضرورة. خطأ آخر هو SNP rs الأرقام التي تم دمجها مع عدد آخر من جمهورية صربسكا، التي يجب البحث فيها القضية عدد روبية في قاعدة SNP مثل dbSNP نكبي لتحديد عدد rs SNP الجديدة. يتم تسلسل حول SNP البحث عن أي بطانات الدانية المعروفة التي يمكن أن تتداخل مع التصميم التمهيدي. تتم مقارنة المواقع التمهيدي PCR المحتملة ضد الجينوم لتجنب التضخيم غير محددة نظراً لمرات متعددة في الجينوم. - في انتظار الانتهاء من "الخطوة 2" من تصميم الأداة التي ستحدد بطانات الدانية.
ملاحظة: إذا كان استخدام الكائن حي الذي غير معتمد من قبل هذه الخطوة، تعليم في التسلسل مع بطانات الدانية في الشرح البحتة إذا كانت هذه المعلومات متوفرة. ونادراً ما توجد أخطاء أثناء هذه الخطوة؛ ومع ذلك، قد تحدث أخطاء إذا تم تحديد الكائن إشارة خاطئة أو الجينوم، أو إذا تم إدخال تسلسل كدنا بدلاً من الحمض النووي. لتحسين الخطوة 2، تحت إعدادات متقدمة، من الممكن لتصفية بطانات استناداً إلى عدد سكان إذا كان يعمل ضمن عدد سكان محددة. ويمكن أيضا تخرج بطانات نادرة باستثناء تلك بتواتر أقل من 1%. وأخيراً، يمكن أيضا استبعاد بطانات التي لا تملك مركزا تم التحقق من صحتها أو لا تملك المعلومات السكانية إذا رغبت في ذلك. - في انتظار انتهاء مناطق "الخطوة الثالثة" من تصميم أداة تعرف التمهيدي الأمثل. إذا فضلت قد حددت مواقع التمهيدي، أو إذا كان العمل مع الكائنات مختلفة، يدوياً إدخال مواقع التمهيدي بالتأشير تسلسل الإدخال (ملفات المجموعة SNP) مع المناطق التمهيدي المفضل في أحرف كبيرة وبقية التسلسل في أقل الحالة، حدد الحفاظ على حالة من قائمة "إعدادات متقدمة" لهذه الخطوة.
ملاحظة: قد تتضمن أخطاء للخطوات 2 و 3: (1) SNP الدانية بعرقلة تصميم التمهيدي مع الحل الذي يجري لقناع مع قاعدة غير القالب وتأمر اليغو مع قاعدة عالمية مثل إيسونيني، أو تصميم كبسولة تفجير اثنين، واحد مع كل من الآليلات proxim ال SNP، أو تصميم واحد التمهيدي مع اليل المشتركة فقط. (2) وهناك خطأ شائع هو الفشل في تحديد موقع فريد من نوعه للتمهيدي مع الحل الذي يجري لتعديل طول amplicon بغية تحديد موقع فريد من نوعه. في الأداة المستخدمة لهذه الورقة، الافتراضي 80-120 بي بي. وهذا يمكن أن يكون تغيير من 60-400 شركة بريتيش بتروليوم في الحوار إعدادات متقدمة تحت إعدادات طول أمبليكون في "3. تحديد أمثل التمهيدي المناطق "وأيضا ضمن علامة التبويب أمبليكون " 4. تصميم الاختبارات ". ضمان سواء يتم تغييرها. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن زيادة طول أمبليكون عند استخدام المتدهورة الحمض النووي غير مستحسن. - في انتظار انتهاء الخطوة تصميم المقايسة ("الخطوة 4" من التصميم أداة)، وهنا الأداة تهدف إلى توفير ممر الأمثل الفصل بين كبسولة تفجير ملحق والاليلات من جميع بطانات في تصاميم متعدد. بعد الانتهاء من هذه الخطوة، تصدير ملف الترتيب اليغو، الذي تم تنسيقه لأنه أمر سهل عن طريق اليغو ترتيب المورد المفضل.
ملاحظة: تم تصميم كبسولة تفجير التضخيم (إلى الأمام (و) وعكس (R)) لإنتاج على حجم amplicon أمثل من 80 إلى 120 شركة بريتيش بتروليوم. التمهيدي التضخيم الجماهيري يجب أن تختلف التمهيدي التمديد ومنتجاته لتجنب نتائج متضاربة في الطيف الشامل وعلى الأداء العام لبكر. وينبغي تمديد التمهيدي 15 إلى 30 النيوكليوتيدات طويلة (دا 4,500-9,000)، مصممة بحيث سيتم إرفاق 3 ' نهاية المتاخمة مباشرة للموقع تعدد الأشكال. يتم تعيين كافة هذه الإعدادات تلقائياً في الأداة المستخدمة لتوليد نتائج تمثيلية.
- إدخال القائمة التي تم إنشاؤها من بطانات في أداة تصميم المقايسة للاختيار.
- تصدير التصميم من الإشعال أداة والنظام الذي تم اختياره من موفر أوليجومير: 25 نمول كل من الإشعال بكر (الأمامية والعكسية)، ونمول 100 لكل كبسولة تفجير ملحق. انظر الجدول 1 للإشعال المستخدمة لتوليد نتائج تمثيلية.
2-التنميط (1-2 أيام)
- إعداد التضخيم كبسولة تفجير.
- إذا كان أمر كبسولة تفجير المجففة بالتبريد، إعادة تشكيل مع المياه الصف الجزيئية. استخدام تركيز 100 ميكرومتر/ميكروليتر للإشعال إلى الأمام وعكس و 500 ميكرومتر/ميكروليتر للتمديد.
- تجمع الإشعال إلى الأمام وعكسي لكل تحليل متعدد في مزيج التمهيدي أسهم، التي تحتوي على كل التمهيدي في تركيز من 0.5 مم.
ملاحظة: على سبيل المثال، تجمع التمهيدي ميكروليتر 400 ل 400 من ردود الفعل:
2 ميكروليتر من كل التمهيدي، بتركيز 100 ميكرومتر/ميكروليتر، مطلوب لتجمع الأسهم التمهيدي. مقايسة 30-من نوع plex مع الإشعال إلى الأمام وعكس 60، سيكون ما مجموعة 120 ميكروليتر من التمهيدي المطلوب (تجمع التمهيدي مركزة). ثم تضاف الماء الجزيئية الصف ميكروليتر 280 جعل وحدة تخزين نهائي من 400 ميكروليتر من التمهيدي مزيج.
- التضخيم باستخدام سلسلة من ردود الفعل بوليميريز (PCR)
- جعل مزيج رئيسي للاسترداد التي تحتوي على 100 نانومتر من التمهيدي مزيج المفصلة أعلاه، 500 ميكرومتر من دنتبس، 2 مم مجكل2، و 0.5 يو إنزيم بوليميراز الدنا. 1 ش مطلوب لأكبر من فحوصات 26-من نوع plex. الرجوع إلى الجدول 2.
- إضافة 4 ميكروليتر من هذا المزيج لكل بئر من لوحة بكر 384، حسنا، جنبا إلى جنب مع 1 ميكروليتر من الحمض النووي بتركيز 5-10 نانوغرام/ميكروليتر.
ملاحظة: ينبغي أن تكون شملت ضوابط الجودة أيضا على اللوحة، مثل عنصر تحكم غير قالب، وعنصر تحكم إيجابي الذي سبق أداؤه جيدا مع المقايسة (أثناء تشغيل اختبار). إذا كان تشغيل لوحات متعددة، الحمض النووي عدة عينات من plate(s) أخرى، على سبيل المثال-، يجب تشغيل في ثلاث نسخ، الضوابط التقنية للتقلب بين داخلي. - الطرد المركزي اللوحة في 200 غ س ل 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع غطاء لوحة لضمان جميع السائل الوارد في الجزء السفلي من لوحة الآبار.
- تشغيل ال [بكر] مع الشروط ثيرموسيكلير التالية: 4 دقيقة حضانة في 94 درجة مئوية لتنشيط بوليميراز الدنا؛ دورات 45 ما يلي (تمسخ في 94 درجة مئوية 20 s، الصلب في 56 درجة مئوية 30 ثانية، والتمديد في 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة) وثم ملحق نهائي في 72 درجة مئوية للحد الأدنى 3 الرجوع إلى البرنامج بكر في الجدول 3.
- أداء [اغروس] هلام التفريد لضمان نجاح تضخيم الحمض النووي. استخدم 1 ميليلتر من منتج PCR (مع 3 ميليلتر من تحميل المخزن المؤقت) على 2% (w/v) [اغروس] هلام، أدلى به خلط مسحوق [اغروس] و 0.5% يدتا بورات تريس (TBE) المخزن المؤقت، وتشغيلها لمدة 45 دقيقة في 100 V.
- الجمبري خطوة تنقية الفوسفاتيز القلوية (SAP)
ملاحظة: يتم استخدام هذه الخطوة لإزالة النيوكليوتيدات الفردية. إنزيم ساب كليفس مجموعات الفوسفات لمنع التدخل في رد فعل التمديد المقبل التمهيدي الزائدة ودنتبس الفردية.- جعل سيد مزيج التي تحتوي على وحدات/ميكروليتر 1.7 إنزيم الفوسفاتيز القلوية الجمبري (SAP)، x 10 SAP المخزن المؤقت وعلى وحدة التخزين بالماء الجزيئية الصف. أرجع إلى الجدول 4.
- إضافة 2 ميكروليتر من تقدم طازجة حتى ساب إتقان مزيج لكل بئر من اللوحة، الفعل الذي يتضمن 5 ميكروليتر من تفاعل PCR. الطرد المركزي بإيجاز والعودة إلى ثيرموسيكلير في 37 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة، ثم في 85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لأنزيم المنظمة. أرجع إلى الجدول 5.
- رد فعل التمديد التمهيدي
ملاحظة: يجب تعديل تركيز الإشعال التمديد في تمديد التمهيدي مزيج حسب الحجم (الخطي التمهيدي التكيف – [لبا]). وهذا يرجع إلى أن هناك علاقة عكسية في كثافة الذروة (على الأطياف الشامل) والمنتج الشامل. تعديل تركيز التمهيدي ملحق تصحيح لهذه العلاقة لإنتاج قمم كثافة متساوية. ضبط الإشعال المستخدمة في توليد الممثل وترد النتائج في الجداول 6 و 7. وحدات التخزين المقدمة لتوليد 1.5 مل من تمديد التمهيدي مزيج.- حساب عوامل إضعاف لكل التمهيدي باستخدام خوارزمية تدرج، ومتاحة من Agena العلوم البيولوجية ('الخطي التمهيدي التكيف')، الذي يضبط الإعلام وتركيز التمهيدي، والعدد الإجمالي للإشعال في رد فعل متعدد (انظر الجداول 6 و 7). إدخال كتلة آب لكل التمهيدي في الحقل UEP_MASS الورقة "الخطي التمهيدي التكيف".
ملاحظة: أن تركيز المعدل الشامل للتمهيدي سيتم تلقائياً حساب في الخلية مع نص رأس الصفحة "هدف رد فعل تركيز (ميكرومتر)." سيتم إخراج وحدة تخزين التمهيدي لتضاف إلى تجمع التمهيدي في الخلية تحت نص رأس الصفحة "حجم المخزون التمهيدي لتضاف إلى تجمع (ميليلتر)." حجم المياه التي تضاف إلى تجمع التمهيدي لجعل أعلى التركيزات المحسوبة هو الإخراج إلى الخلية بجانب النص "أضاف حجم بكر الصف رناسي مجاناً ح2س ليكون تجمع التمهيدي (ميليلتر)". - أن حجم كل التمهيدي كما هو محدد في الملف "الخطي التمهيدي التكيف" وبركة التمهيدي. إضافة حجم المياه التي تم حسابها بواسطة الخوارزمية لتمييع تجمع التمهيدي كما هو محدد في الخطوة 2.4.1.
ملاحظة: إذا لم يتوفر أسلوب الخوارزمية التدرج، أسلوب آخر هو تقسيم الإشعال إلى كتلة منخفضة وعالية وإضافة ضعف تركيز الإشعال جماعية عالية بالنسبة إلى مجموعة كتلة منخفضة. ثلاث أو أربع مجموعات قد يكون مطلوباً مقايسة عالية-من نوع plex (أي بطانات أكثر من 19). ومع ذلك، سوف لا تسفر عن هذا الأسلوب كأسعار المكالمات الأمثل كأسلوب الخوارزمية التدرج. - قم بتجميع مزيج الرئيسي التمديد. للمقايسة plex منخفضة (1-18 من نوع plex)، إضافة 0.2 ميكروليتر من المخزن المؤقت ميكروليتر 0.1 من مزيج الإنهاء، 0.94 ميكروليتر من [لبا] تعديل التمهيدي مزيج وميكروليتر 0.0205 إنزيم (أعد على الجليد). مقايسة عالية من نوع plex (19-36 من نوع plex)، أضف تركيز مزدوجة من مزيج الإنهاء وإنزيم (ميكروليتر ميكس 0.2 الإنهاء وقوانين الإنزيم 0.041 ميكروليتر). أرجع إلى الجدول 8.
- إضافة 2 ميكروليتر من رد فعل التمديد مزيج الرئيسي اللوحة من رد فعل سابق، الآن يصل الحجم الإجمالي إلى 9 ميكروليتر كل بئر. الطرد المركزي بإيجاز وفي ثيرموسيكلير: 94 درجة مئوية 30 s أولى حضانة، دورات 40 1 x 94 درجة مئوية 5 s مع 5 x (52 درجة مئوية 5 s، تليها 80 درجة مئوية 5 s)، وثم 72 درجة مئوية للحد الأدنى 3 الرجوع إلى الجدول 9.
- حساب عوامل إضعاف لكل التمهيدي باستخدام خوارزمية تدرج، ومتاحة من Agena العلوم البيولوجية ('الخطي التمهيدي التكيف')، الذي يضبط الإعلام وتركيز التمهيدي، والعدد الإجمالي للإشعال في رد فعل متعدد (انظر الجداول 6 و 7). إدخال كتلة آب لكل التمهيدي في الحقل UEP_MASS الورقة "الخطي التمهيدي التكيف".
- تنقية الراتنج.
ملاحظة: الأملاح الزائدة يمكن الآن إزالة من رد الفعل مع الاستخدام راتنج.- إضافة 16 ميكروليتر من المياه إلى الآبار التي بليت المستردة، يصل الحجم في لوحة ما يصل إلى 25 ميكروليتر.
- تطبيق الراتنج، عادة 6 مغ لوحة الراتنج الدمل (تم شراؤها بشكل منفصل)، بالتساوي إلى لوحة كاملة. ترك الراتنج الجافة في لوحة الراتنج الدمل لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة قبل تطبيق لوحة رد فعل. بعد إضافة الراتنج، تدوير اللوحة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة أما باليد أو خلاط تعليق بسرعة بطيئة (على سبيل المثال-، 7.5 لفة في الدقيقة).
ملاحظة: قبل تحميل أكثر التنميط على رقاقة التنميط، العينات وتخطيط المقايسة يجب أن يكون الإدخال في واجهة البرنامج. يمكن أن يتحقق هذا باستخدام ملف "ملخص التصميم" من تصميم أداة التحليل.
- القياس على منصة الكتلي.
- الطرد المركزي اللوحة في 3,200 س ز لمدة 5 دقائق لتجنب تطبيق الراتنج على رقاقة الأطياف الشامل.
- تحميل تخطيط لوحة عينات لواجهة البرنامج للنظام قبل التشغيل.
ملاحظة: إلا ينبغي أن يكون تنفيذ الخطوة 2.6.3 موظفون مدربون. - تطبيق الخليط الوراثي أكثر من اللوحة على رقاقة التنميط بالاستغناء عن نظام. وبعد ذلك، تحميل رقاقة على النظام استخدام TOF لتوليد الأطياف الشامل من الخليط أكثر، التي يمكن أن تفسر ثم مع معونة واجهة البرنامج للمنبر.
ملاحظة: يقوم النظام بإنشاء الأطياف الجماعي بتوجيه نبضات قصيرة من ضوء الأشعة فوق البنفسجية في كل 'منصة' المقابلة لبئر واحدة لوحة التنميط، رقاقة أطياف الجماعية. يؤدي هذا النبض الامتزاز والتاين أكثر. هذه المتأين الحمض النووي الجزيئات ثم دفعت إلى الجزء العلوي من فراغ أنبوب من حقل عالية جهد الكهربائي، فصل الأيونات الأخف، السفر أسرع وتصل إلى الجهاز أولاً، من أيونات أثقل. وتسجل "وقت الرحلة" من هذه التحاليل بالنظام، ومن خلاله يمكن تحديد الكتلة من كل جزء من الحمض النووي وبالتالي يمكن الاستدلال على قاعدة النوكليوتيدات حاضرا الحزب الوطني اﻻسكتلندي.
3-التنميط البيانات
ملاحظة: مراقبة الجودة وتفسير البيانات لا تركز هذه الورقة منهجية. ومع ذلك، ما يلي بإيجاز سيغطي تفسير الأطياف الشامل.
- دليل التفتيش ومراقبة الجودة لأطياف الجماعية.
ملاحظة: الأطياف الشامل الخام إنشاؤها بواسطة النظام وتحليلها مع البرنامج كما هو موضح في الجدول للمواد. خليط ضبابي تجميع الأسلوب يطبق على إخراج هذا لإجراء مكالمات التنميط الاحتمالية.- فتح برنامج التحليل. حدد محلل من نوع. من القائمة ملف ، حدد الآبار المفتوحة من ملف ، وحدد ملف xml مع مجموعة البيانات التي تم إنشاؤها في الخطوة 2.6.3. اسم رقاقة للتشغيل يجب أن تكون مرئية، حدد ذلك وسوف يتم عرض جزء "الضوئية" من لوحة 384-جيدا مع قائمة ببطانات في المحدد جيدا. من هنا، حدد الكلمة قطع المجموعة لعرض سكاتيربلوت نقاط البيانات لكل الحزب الوطني اﻻسكتلندي.
ملاحظة: من المستحسن أن تطبق 'لا الاتصال' نتيجة لانخفاض كثافة بطانات. في البرمجيات المستخدمة للحصول على النتائج التمثيلية، يقترح وقف حجم تجميع من 5، وأعلى من الافتراضي، لمراقبة الجودة الصارمة. يمكن ضبط هذا الإعداد في الحقل "حجم قطع" تحت معلمات في جزء وظيفة تجهيز مجموعات . حدد أوتوكلوستير من علامة التبويب أدوات لتشغيل تحليل كتلة. - إجراء التفتيش اليدوي للمكالمات الوراثي بفحص "قطع ديكارت" في "جزء معالجة وظيفة". في جزء مقايسة، حدد SNP من الفائدة، وانقر فوق علامة التبويب مجموعات مرحلة ما بعد المعالجة ، مؤامرة كتلة مع النمط الوراثي التكتل سيكون مرئياً مع معرفات عينة والأنماط الجينية المقابلة للحزب الوطني اﻻسكتلندي.
- دراسة مجموعات الدعوة الوراثي وتقدير جيدا كيف مجموعات كل الدعوة الفردية مع دعوات أخرى للحزب الوطني اﻻسكتلندي. البرنامج يوفر بعض خطوط الحدود على الأرض لكل النمط الوراثي للتوجيه؛ انظر على سبيل المثال من مؤامرة الكتلة مكالمات الوراثي من IL13 SNP (الشكل 1). إذا كانت الدعوة لا الكتلة محكم مع مكالمات أخرى ويجلس وضوح خارج كتلة، أو إذا كان لديه كثافة منخفضة جداً، انقر بالزر الأيمن داتابوينت وحدد تغيير الكلمة تعيين يدوياً إلى لا استدعاء.
- لضمان استخدام البيانات التنميط عالية الجودة لتحليل المصب، استبعاد بطانات والأفراد مع أسعار المكالمات عتبة مراقبة الجودة، مثل 90%. عندما أدخلت تعديلات ملائمة لبيانات المكالمة، تصدير البيانات للتطبيقات الإحصائية. ويتحقق ذلك في البرامج المستخدمة لتوليد نتائج الممثل (المدرجة في الجدول للمواد) مع التحديد لوحة البيانات من القائمة طريقة العرض، واختيار حفظ باسم.
- فتح برنامج التحليل. حدد محلل من نوع. من القائمة ملف ، حدد الآبار المفتوحة من ملف ، وحدد ملف xml مع مجموعة البيانات التي تم إنشاؤها في الخطوة 2.6.3. اسم رقاقة للتشغيل يجب أن تكون مرئية، حدد ذلك وسوف يتم عرض جزء "الضوئية" من لوحة 384-جيدا مع قائمة ببطانات في المحدد جيدا. من هنا، حدد الكلمة قطع المجموعة لعرض سكاتيربلوت نقاط البيانات لكل الحزب الوطني اﻻسكتلندي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
مع البروتوكول، المذكورة أعلاه، ونحن جينوتيبيد الوسم بطانات عبر Th2 المناعي الجين IL13 في مجموعة من المواد الغذائية الحساسية حالات وضوابط9. قمنا بتطبيق تحليل الانحدار اللوجستي، بعد تعديلها للنسب وغيرها من المتغيرات المشاركة المحتملة، لاختبار ما إذا كانت المتغيرات الجينية داخل منطقة الفائدة زاد خطر الحساسية الغذائية. الجدول 10 9 يظهر أن rs1295686 متغير واحد يرتبط بالحساسية الغذائية ثبت التحدي وأكدنا متعدد هذه الرابطة في مجموعة النسخ متماثل باستخدام نفس نهج التنميط. تحليل تلوي للنتائج من الأفواج اثنان أدلة قوية من رابطة IL13 مع اتحاد كرة القدم (الجدول 11)9. نحن وراثيا الاستدلال وتعديلها للنسب في التحليل استخدام النسب مفيدة SNP علامة فريق، مقتبس من لوحة منشورة10. الاعتداء علينا جينوتيبيد متعدد الفريق استخدام نفس النهج.
تم سابقا عرف المكاني خطر الربو11 البديل المرتبطة بها، rs1295686، والمرتبطة بحساسية المعلمات المناعية الأخرى12، مما يوحي بأنه قد يكون المكاني مخاطر عامة لأمراض حساسية. ستكون الخطوات المقبلة لإجراء المزيد من الدراسات، مثل تحليل التعبير التفاضلية، رسم الخرائط التفاعلات المادية مع أسلوب التقاط الكروماتين، ورسم خرائط للمنطقة بشكل جيد، وتحليل هابلوتيبي، دبوس نقطة البديل الفنية وتميز البيولوجيا خلف الرابطة لوحظ مع الحساسية للأغذية.
رقم 1: مؤامرة الكتلة ديكارت rs1295686 IL13 SNP. كتل صفراء تمثل استدعاءات وراثي متماثل اليل A والأزرق اليل ز، والأخضر للمكالمات متخالف. تم تعيين القليلة الوراثي المكالمات الكتلة لا مع الأطياف الشامل متماثل أو متخالف أما إلى "لا دعوة".
الجدول 1: التمهيدي تسلسل يستخدم لتوليد نتائج تمثيلية ل IL13. اسم العمود يحتوي على معرف SNP، عدد جيدا (وكما ذكر سابقا، عدد "جيدا" يشير إلى معرف المقايسة متعدد)، ونوع التمهيدي (و للأمام والبحث والتطوير لعكس وآب لتمديد التمهيدي). الأعمدة التالية تحتوي على تسلسل التمهيدي، وحجم التمهيدي ونوع التنقية. تجدر الإشارة إلى أن جينوتيبيد باستخدام التحليل نفسه على الرغم من أن لا تناقش هذه النتائج مع نتائج قدم الممثل SPINK5 وفريق علامات الزاخر بمعلومات والنسب (هدف). بطانات المنتهي في _CEU و _CHB الرجوع إلى هدف بطانات "الأوروبيين شمال" من ولاية يوتا والهان في الصين Beijin السكان من 1000 مشروع الجينوم على التوالي. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
| ميكس ماجستير | منخفضة من نوع Plex (بطانات دي تو سيكس) | نوع Plex عالية (> 26 SNP) | |||
| كاشف | الأسفلت في 5 ميليلتر | × 1 | × 200 | × 1 | × 200 |
| المياه (منزوع) | 1.9 | 380 | 1.8 | 360 | |
| المخزن المؤقت | × 1 (MgCl 2 مم2) | 0.5 | 100 | 0.5 | 100 |
| مجكل2 | 2 مم | 0.4 | 80 | 0.4 | 80 |
| دنتبس | 500 ميكرومتر | 0.1 | 20 | 0.1 | 20 |
| ميكس التمهيدي * * | 100 نانومتر | 1 | 200 * * | 1 | 200 * * |
| [تق] [بولمرس] | 0.5 يو/1 يو | 0.1 | 20 | 0.2 | 40 |
| المجموع | 4 ميليلتر | 800 ميليلتر | 4 ميليلتر | 800 ميليلتر | |
| * * الفعل المخفف بواسطة ح20 كما هو مفصل في 2.1.2 | |||||
الجدول 2: الكواشف والتركيزات المطلوبة لجعل "بكر التضخيم" التمهيدي مزيج. وحدات التخزين الرئيسية ميكس ترد ردود فعل 200 لأنه لا يتناسب 400 (ما يكفي لتغطية صفيحة 384-جيدا) في أنبوب ميليلتر 1.5 وهكذا ينبغي 2 × 200 في أنابيب منفصلة. ينبغي أن تستخدم وحدات التخزين المحددة بموجب Plex منخفضة إذا كان التحليل متعدد "حسنا" يحتوي على أقل من أو يساوي بطانات 26، إذا كان أكبر من بطانات 26 هي في استخدام جيدا من نوع Plex عالية وحدات التخزين.
| شروط ثيرموسيكلير |
| 94 درجة مئوية لمدة دقيقة 4 |
| دورات 45 (ق 94 ° ج 20، ق 56 درجة مئوية 30، 72 ° ج 1 دقيقة) |
| 72 درجة مئوية لمدة 3 دقائق |
| عقد 4 درجة مئوية |
الجدول 3: شروط ثيرموسيكلير "بكر التضخيم".
| ميكس ماجستير | × 1 | × 410 |
| المياه (منزوع) | 1.53 | 627.3 |
| المخزن المؤقت 10 × | 0.17 | 69.7 |
| ساب إنزيم (1.7 يو/ميليلتر) | 0.3 | 123 |
| المجموع | 2 ميليلتر | 820 ميليلتر |
الجدول 4: الكواشف وتركيزات لمزيج الرئيسي لرد فعل SAP. وحدات التخزين الرئيسية ميكس ترد ردود فعل 410 لتغطية صفيحة 384-جيدا مع هامش للخطأ بيبيتينج.
| شروط ثيرموسيكلير |
| 37 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة |
| 85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق |
| عقد 4 درجة مئوية |
الجدول 5: ثيرموسيكلير الشروط اللازمة لرد فعل SAP.
| # | كبسولة تفجير ملحق | تركيز المخزون الأصلي (ميكرومتر) | متفرقات. | كتلة UEP_ | الهدف رد فعل تركيز (ميكرومتر) | تحويله التمهيدي تجمع تركيز (ميكرومتر) | حجم "المخزون التمهيدي" لتضاف إلى بركة (ميليلتر) |
| 1 | rs36110_CHB | 500 | 4359.8 | 0.560 | 5.36 | 16.09 | |
| 2 | rs10488619_CHB | 500 | 4546 | 0.602 | 5.76 | 17.29 | |
| 3 | rs1986420_CEU | 500 | 4761.1 | 0.648 | 6.21 | 18.62 | |
| 4 | rs2934193_CEU | 500 | 4964.3 | 0.690 | 6.61 | 19.82 | |
| 5 | rs4968382_CEU | 500 | 5047.3 | 0.707 | 6.77 | 20.30 | |
| 6 | rs1227647_CEU | 500 | 5136.4 | 0.724 | 6.93 | 20.80 | |
| 7 | rs1402851_CEU | 500 | 5338.5 | 0.763 | 7.30 | 21.91 | |
| 8 | rs4705054 | 500 | 5476.6 | 0.788 | 7.55 | 22.64 | |
| 9 | rs6928827 | 500 | 5678.7 | 0.824 | 7.89 | 23.68 | |
| 10 | rs9325072 | 500 | 5762.8 | 0.839 | 8.03 | 24-10 تناط | |
| 11 | rs4841401_CHB | 500 | 5853.9 | 0.855 | 8.18 | 24.55 | |
| 12 | rs11098964_CHB | 500 | 6052.9 | 0.888 | 8.50 | 25.51 | |
| 13 | rs2416504_CHB | 500 | 6174 | 0.908 | 8.69 | 26.08 | |
| 14 | rs1860933 | 500 | 6264.1 | 0.923 | 8.83 | 26.50 | |
| 15 | rs2193595_CHB | 500 | 6391.2 | 0.943 | 9.03 | 27.08 | |
| 16 | rs1519260_CHB | 500 | 6469.2 | 0.955 | 9.14 | 27.43 | |
| 17 | rs11184898_CHB | 500 | 6588.3 | 0.973 | 9.32 | 27.95 | |
| 18 | rs679832_CEU | 500 | 6757.4 | 0.998 | 9.56 | 28.68 | |
| 19 | rs326626_CEU | 500 | 6765.4 | 1.000 | 9.57 | 28.71 | |
| 20 | rs1612904 | 500 | 6873.5 | 1.015 | 9.72 | 29.17 | |
| 21 | rs862942 | 500 | 6960.5 | 1.028 | 9.84 | 29.53 | |
| 22 | rs2486448_CHB | 500 | 7169.7 | 1.058 | 10.13 | 30.38 | |
| 23 | rs4824001_CEU | 500 | 7341.8 | 1.081 | 10.35 | 31.06 | |
| 24 | rs6552216_CEU | 500 | 7465.9 | 1.098 | 10.51 | 31.54 | |
| 25 | rs1488299_CHB | 500 | 7620 | 1.119 | 10.71 | 32.13 | |
| 26 | rs1347201_CHB | 500 | 7626 | 1.119 | 10.72 | 32.15 | |
| 27 | rs315280_CHB | 500 | 7747 | 1,135 | 10.87 | 32.60 | |
| 28 | rs11203006_CHB | 500 | 7834.1 | 1.146 | 10.97 | 32.92 | |
| 29 | rs4240793_CHB | 500 | 8036.3 | 1.172 | 11.22 | 33.66 | |
| 30 | rs9325071 | 500 | 8219.4 | 1.194 | 11.43 | 34.30 | |
| 31 | rs12678324_CEU | 500 | 8394.5 | 1.215 | 11.64 | 34.91 | |
| 32 | rs4653130_CEU | 500 | 8455.5 | 1.223 | 11.71 | 35.12 | |
| 33 | rs9275596 | 500 | 8537.6 | 1.232 | 11.80 | 35.39 | |
| 34 | rs12595448_CHB | 500 | 8603.6 | 1.240 | 11.87 | 35.62 | |
| إضافة وحدة تخزين "بكر الصف رناسي" مجاناً ح2س أن تجمع التمهيدي (ميليلتر) | 561.78 | ||||||
الجدول 6: حسنا 1 كبسولة تفجير المعدلة المستخدمة لتوليد نتائج الممثل. جدول ملحق كبسولة تفجير تعديلها حسب الحجم، بما في ذلك تركيز الهدف، وحدة التخزين المستخدمة في تجمع التمهيدي، والتركيز النهائي لكل التمهيدي في تجمع التمهيدي ل 1 جيدا. حجم الماء اللازم لجعل وحدة التخزين النهائي يتم توفيرها في الجزء السفلي من الجدول. وكان الحجم الإجمالي للمجمع التمهيدي 1.5 مل.
| # | كبسولة تفجير ملحق | تركيز المخزون الأصلي (ميكرومتر) | متفرقات. | كتلة UEP_ | الهدف رد فعل تركيز (ميكرومتر) | تحويله التمهيدي تجمع تركيز (ميكرومتر) | حجم "المخزون التمهيدي" لتضاف إلى بركة (ميليلتر) |
| 1 | rs10515597 | 500 | 4482.9 | 0.588 | 5.63 | 16.89 | |
| 2 | rs2759281_CEU | 500 | 4921.2 | 0.681 | 6.52 | 19.57 | |
| 3 | rs17641748 | 500 | 5080.3 | 0.713 | 6.83 | 20.48 | |
| 4 | rs1698042_CEU | 500 | 5201.4 | 0.737 | 7.05 | 21.16 | |
| 5 | rs5753625_CHB | 500 | 5411.6 | 0.776 | 7.43 | 22.30 | |
| 6 | rs3912537_CEU | 500 | 5811.8 | 0.848 | 8.12 | 24.35 | |
| 7 | rs6141319_CEU | 500 | 5883.8 | 0.860 | 8.23 | 24.70 | |
| 8 | rs1002587_CEU | 500 | 6026.9 | 0.884 | 8.46 | 25.39 | |
| 9 | rs1295686 | 500 | 6172 | 0.908 | 8.69 | 26.07 | |
| 10 | rs16877243_CEU | 500 | 6386.2 | 0.942 | 9.02 | 27.05 | |
| 11 | rs1103811 | 500 | 6595.3 | 0.974 | 9.33 | 27.98 | |
| 12 | rs6510332_CEU | 500 | 6790.4 | 1.003 | 9.61 | 28.82 | |
| 13 | rs6595142_CHB | 500 | 6874.5 | 1.016 | 9.72 | 29.17 | |
| 14 | rs4484738_CEU | 500 | 6966.5 | 1.029 | 9، 85 | 29.55 | |
| 15 | rs1432975 | 500 | 7028.6 | 1، 038 | 9.94 | 29.81 | |
| 16 | rs10879311_CEU | 500 | 7317.8 | 1.078 | 10.32 | 30.97 | |
| 17 | rs864481 | 500 | 7416.9 | 1.092 | 10.45 | 31.35 | |
| 18 | rs1295687 | 500 | 7447.8 | 1.096 | 10.49 | 31.47 | |
| 19 | rs12644851_CHB | 500 | 7634 | 1.120 | 10.73 | 32.18 | |
| 20 | rs4265409_CHB | 500 | 7926.2 | 1.158 | 11.09 | 33.26 | |
| 21 | rs2927385_CHB | 500 | 7997.2 | 1.167 | 11.17 | 33.52 | |
| 22 | rs1538956_CHB | 500 | 8286.4 | 1.202 | 11.51 | 34.54 | |
| إضافة وحدة تخزين "بكر الصف رناسي" مجاناً ح2س أن تجمع التمهيدي (ميليلتر) | 899.42 | ||||||
الجدول 7: حسنا 2 كبسولة تفجير المعدلة المستخدمة لتوليد نتائج الممثل. جدول ملحق كبسولة تفجير تعديلها حسب الحجم، بما في ذلك تركيز الهدف، وحدة التخزين المستخدمة في تجمع التمهيدي، والتركيز النهائي لكل التمهيدي في تجمع التمهيدي 2 جيدا. حجم الماء اللازم لجعل وحدة التخزين النهائي يتم توفيرها في الجزء السفلي من الجدول. وكان الحجم الإجمالي للمجمع التمهيدي 1.5 مل.
| ميكس ماجستير | منخفضة من نوع Plex (1-18) | عالية من نوع Plex (19-36) | ||
| كاشف | × 1 | × 410 | × 1 | × 410 |
| المياه (منزوع) | 0.7395 | 303.195 | 0.619 | 253.79 |
| المخزن المؤقت | 0.2 | 82 | 0.2 | 82 |
| ميكس الإنهاء | 0.1 | 41 | 0.2 | 82 |
| ميكس التمهيدي (تعديل بدل الوالد الوحيد) | 0.94 | 385.4 | 0.94 | 385.4 |
| قوانين إنزيم * | 0.0205 | 8.405 | 0.041 | 16.81 |
| المجموع | 2 ميليلتر | 820 ميليلتر | 2 ميليلتر | 820 ميليلتر |
الجدول 8: الكواشف وتركيزات لرد فعل التمديد سيد ميكس- وفي هذه الحالة ينبغي استخدام وحدات التخزين منخفضة-من نوع Plex ردود الفعل إذا كان هناك بطانات 18 أو أقل في البئر. لبطانات 19 أو أكثر استخدام وحدات التخزين ردود فعل عالية من نوع Plex. وهذا يختلف عن متطلبات SNP plex منخفضة وعالية-من نوع plex التضخيم PCR مزيج الرئيسي بالتفصيل في الجدول 2.
| شروط ثيرموسيكلير |
| 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية |
| دورات 40 (ق 94 ° ج 5، (5 دورات من 52 درجة مئوية 5 ق، ق 80 درجة مئوية 5)) |
| 72 درجة مئوية لمدة 3 دقائق |
| عقد 4 درجة مئوية |
الجدول 9: ثيرموسيكلير الظروف لرد فعل التمديد
| حالات حساسية الغذاء مقابل غير الغذائية ضوابط حساسية | |||||
| الحزب الوطني اﻻسكتلندي | A1 | ف | أو | L95 | U95 |
| rs1295686 | A | 0.003 | 1.75 | 1.2 | 2.53 |
| rs2243297 | A | 0.13 | 2.1 | 0.8 | 5.51 |
| rs1295687 | ز | 0.19 | 1.63 | 0.78 | 3.41 |
| rs2243211 | A | 0.22 | 1.45 | 0.8 | 2.64 |
| rs1295683 | T | 0.25 | 1.32 | 0.82 | 2.13 |
| rs2243248 | ز | 0.51 | 1.21 | 0.69 | 2.11 |
| rs2243300 | T | 0.51 | 1.19 | 0.7 | 2.02 |
| rs1800925 | T | 0.6 | 1.11 | 0.75 | 1.63 |
| rs3091307 | ز | 0.62 | 1.1 | 0.75 | 1.6 |
الجدول 10: Rs1295686 البديل IL13 موضع يرتبط بالحساسية الغذائية ثبت التحدي. وكشف تحليل الانحدار اللوجستي، بعد تعديلها للنسب والجنس ووجود الاكزيما التاتبيه، يرتبط هذا الخيار rs1295686 مع التحدي ثبت الحساسية الغذائية في الفوج الاكتشاف (n = 367 الحالات والضوابط غير حساسية 156). يسرد العمود SNP علامات يجري بحثها، ويسرد العمود A1 اليل البسيطة، اليل مرجع لاختبار الرابطة. يسرد العمود ف فالقيم من تحليل الانحدار ويسرد العمود أو نسب الأرجحية المقابلة و L95 و U95 هي الحدود الدنيا والعليا لفاصل الثقة 95% من التحليل. البيانات الواردة من مدير et al., 20179.
| ألف تحليل النسخ المتماثل: حالات حساسية الغذاء مقابل غير الغذائية ضوابط حساسية | ب التحليل التلوي – اكتشاف والنسخ المتماثل | ||||||||||
| الحزب الوطني اﻻسكتلندي | A1 | أو | L95 | U95 | ف | ف | P(R) | أو | OR(R) | Q | أنا |
| rs1295686 | A | 1.37 | 1.03 | 1.82 | 0.03 | 0.0005 | 0.0006 | 1.5 | 1.5 | 0.31 | 3.32 |
| rs1295687 | ج | 1.1 | 0.68 | 1.78 | 0.7 | 0.3 | 0.3 | 1.24 | 1.24 | 0.38 | 0 |
الجدول 11: النسخ المتماثل في حالة سكان مستقلة تؤكد الرابطة بين IL13 rs1295686 البديل والحساسية للأغذية ثبت التحدي. الانحدار اللوجستي، تصحيح للنسب المكونات الرئيسية والجنس والاكزيما التاتبيه، في حالة سكان مستقلة (n = 203 حالات حساسية الغذاء وعناصر تحكم غير حساسية 330) أكدت الرابطة بين rs1295686 البديل والحساسية للأغذية. أجرى بعد ذلك، توفير أعلى مستوى من الأدلة على اقتران بين الحزب الوطني اﻻسكتلندي ونتائج التحليل التلوي، مع أدلة تذكر على وجود عدم تجانس أحجام سارية المفعول بين اثنين من السكان في هذا الحزب الوطني اﻻسكتلندي. هنا الأعمدة حسب الجدول 10، مع P(R) إضافية والقيم OR(R) للتحليل التلوي آثار عشوائية النموذجية مقابل نموذج الآثار الثابتة (ف أو). Q، وهي قيمة P للاختبار كوكرين ومؤشر التوالي، وكلاهما تدابير لعدم تجانس في أحجام تأثير بين الدراسات. البيانات الواردة من مدير et al., 20179.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا، علينا أن نظهر أسلوب التنميط متعدد باستخدام الطيف الكتلي. نتائج تمثيلية تم إنشاؤها باستخدام PCR يقترن استخدام-TOF الكتلي4 مع الكيمياء الإنزيم المدرجة في الجدول للمواد13. مع هذا النظام الأساسي، ونحن إنشاء مجموعة من الأنماط الجينية 11,295 على الأفراد 1,255 لبطانات 9 ضمن ح 40 في المعمل.
نحن توضيح فائدة هذا الأسلوب في الرد على الفرضيات الوراثية بتوليد وتحليل البيانات SNP للجينات المرشحة IL13 في فوج سريرية اكتشاف فينوتيبيد للحساسية الغذائية ومع النسخ المتماثل مستقلة. المنصة قوية نسبيا إلى انخفاض نوعية الحمض النووي وتتطلب مواد انطلاق الحد الأدنى، مدخلاً 10 فقط الحرس الوطني. خطوات حاسمة في البروتوكول ما يلي: استكشاف الأخطاء وإصلاحها دقيق لعملية التصميم الفحص لضمان إدراج SNP القصوى في فحوصات متعدد، التضخيم الناجحة للمناطق المستهدفة خلال التضخيم بكر، واحد ناجح ملحق النوكليوتيدات أثناء رد فعل التمديد، وتحميل تخطيط لوحة الفحص والعينة في تحليل البرمجيات من أجل البرامج لتعيين دقة البيانات الأطياف الشامل.
كما ذكر آنفا، أداة تصميم المقايسة متوافق مع استخدام الماوس والأبقار مجمع الأشكال المتعددة، بالإضافة إلى ذلك للإنسان. للكائنات الحية الأخرى مثل الميكروبات أو النباتات، يمكن تحديد "الآخر" في قائمة "الكائن". ومع ذلك، لن تتوفر الآلي خطوات إيجاد بطانات الدانية وتحديد مجالات التمهيدي الأمثل.
أثناء عملية التصميم، إذا كان يتم حظر SNP الدانية تحديد منطقة التمهيدي الأمثل، واحد يمكن أما إزالة SNP من التصميم وحدد آخر في LD عالية (مثلاً، ص2 = 1)، أو اختيار تصميم كبسولة تفجير اثنين، واحدة مع الإشارة اليل SNP وواحدة مع اليل بديلة، أو تصميم واحد التمهيدي مع اليل المشتركة، أو إخفاء SNP مع قاعدة عالمية (مثلاً، إينوسيني). إذا كان هناك مشكلة في تحديد موقع فريد من نوعه للتمهيدي، واحد يمكن تغيير إعدادات طول amplicon للعثور على موقع فريد من نوعه. الإعداد الافتراضي 80-120 بي بي ولكن يمكن تعديل هذه من 60-400 شركة بريتيش بتروليوم. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أنه إذا كان يعمل مع الحمض النووي المتدهورة (مثلاً، من الأنسجة FFPE)، أنها ليست مثالية لزيادة طول amplicon.
وقد تشمل أخطاء أثناء الخطوة المقايسة تصميم أداة دبوس عالية أو التمهيدي ديمر المحتملة. يمكن أن تخفف كلا الإعدادات في محاولة استيعاب التصاميم. ومع ذلك، من المستحسن أن العتبات لا استرخاء أدناه 0.8؛ بدء تشغيل مع 0.9 معرفة ما إذا كان هذا الإعداد كافية لإنقاذ بطانات والحد إلى 0.8 فقط إذا لزم الأمر. في إعدادات متقدمة، فمن الممكن لتغيير عدد مرات التكرار التصميم (حتى 10) ضمن علامة التبويب متعدد "4. تصميم الاختبارات "، فضلا عن معايير الاختيار التكرار أفضل أما أعلى متوسط متعدد أو يرفض أقل من نوع Plex منخفضة. يمكن زيادة عدد التكرارات التصميم يكون من المفيد لأن الأداة سوف تتخذ SNP الأولى في الترتيب أنها قدمت وستقوم بتصميم مقايسة. ثم أنها الاختبارات إذا SNP القادم متوافق للمقايسة متعدد نفس. وهكذا، ترتيب هذه المسألة بطانات. مع تحديد خيار تكرارات متعددة، سيتم ترتيب بطانات بطريقة عشوائية البرنامج وحاول تكرار مرة أخرى. هذا قد يزيد عدد بطانات قادرة على أن تصمم في كل متعدد أو قد ينخفض عدد ترفض SNP. ومع ذلك، أنها ستأتي أيضا بتكلفة وقت، كأداة التصميم سوف يستغرق وقتاً أطول بكثير في هذه الخطوة.
التنميط متعدد نهج سريعة وبأسعار معقولة للتحقيق في المكاني للفائدة. الأسلوب هو تبسيط ويسمح تشغيل عينات 760 تقريبا ليصل إلى 40-من نوع plex بطانات في 10 ساعات، السماح لعشرات الآلاف من الأنماط الجينية إلى يتم إنشاؤها في أقل من يوم واحد14. يمكن تحليل الأطياف الشامل بسهولة مع الأدوات التي توفرها المنصة.
وتشمل بعض القيود إلى المنصة خسائر تقدر من 5-10% بطانات ستفشل عملية تصميم المقايسة. يمكن تصحيح هذا في بعض الأحيان باختيار العلامة البديلة أو الوكيل SNP. قاعدة بيانات البحث الوكيل (الإضافية) وشرح SNP واسع للمعهد هو إحدى هذه الأدوات التي تيسر تحديد الوكيل بطانات15. تقييد آخر للنظام هو أنه هو منصة مستهدفة ولذلك لا تسمح باكتشاف رواية مستفيضة، كما حققت مع النهج الشاملة للجينوم. وعلاوة على ذلك، كما يستخدم النهج وكلاء SNP العلامة لتحقيق أقصى قدر من التغطية عبر الجينات، قد لاحقاً تحتاج الدراسات الجميلة لرسم الخرائط لتحديد البديل سببية دقيقة.
التنميط متعدد لا تزال منبرا مفيداً لاستجواب بطانات الأمراض المرتبطة المحددة في نهج الدراسة GWA أو فرضية مدفوعة استكشاف الجينات المرشحة والمسار. التطبيقات المستقبلية للمنصة من المحتمل أن تكون استخدامات جديدة للتشخيص والفحص في ميادين مثل السرطان وعلم الفيروسات اﻻكلينيكي. عموما التنميط متعدد مع الطيف الكتلي طريقة سريعة وفعالة من حيث التكلفة وموثوق بها الإنتاجية المتوسطة للتنميط المكاني المرشح.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
المؤلفين قد لا شكر وتقدير.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Genomic DNA | - | - | 1 μL at a concentration of 5-10 ng/μL |
| Primers: forward and reverse amplification and extension | IDT | - | see manuscript section 1.2.1 on design of primers |
| Deionized water | E.g. Milli-Q water | - | deionized with 18.2 MΩ.cm resistivity |
| Genotyping reagent kit. iPLEX Gold Chemistry reagent set | Agena Bioscience | #10148-2 | includes all reagents for reactions in 2.2.1, 2.3.1 and 2.4.2 , chip and resin |
| PCR plates (384-well) | Abgene | #ABGAB-1384 | For the MassARRAY system plates by Abgene are compatible |
| Micropipettes | single and 8-channel | ||
| Centrifuge | compatible with 384-well plates | ||
| Thermocycler | compatible with PCR programs as detailed in 2.2.4, 2.3.2 and 2.4.3 | ||
| Dimple resin plate | Agena Bioscience | 6mg, 384-well | |
| Plate rotator | |||
| MassARRAY Analyzer 4 System | Agena Biosciences | MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption/ionization – time of flight) Mass Spectrometer. | |
| RS1000 Nanodispenser | Agena Biosciences | ||
| Assay Design Suite | Agena Biosciences | Tool used to design the multiplex genotyping assays | |
| Hot Start Taq | DNA polymerase enzyme | ||
| Resin | Agena Biosciences | Supplied with iPLEX kit |
References
- Aronson, S. J., Rehm, H. L. Building the foundation for genomics in precision medicine. Nature. 526 (7573), 336-342 (2015).
- Ball, R. D. Designing a GWAS: power, sample size, and data structure. Genome-Wide Association Studies and Genomic Prediction. , 37-98 (2013).
- Kwon, J. M., Goate, A. M. The candidate gene approach. Alcohol research and health. 24 (3), 164-168 (2000).
- Oeth, P., Mistro, G. D., Marnellos, G., Shi, T., van den Boom, D. Qualitative and quantitative genotyping using single base primer extension coupled with matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MassARRAY). Single Nucleotide Polymorphisms: Methods and Protocols. , 307-343 (2009).
- Pusch, W., Kostrzewa, M. Application of MALDI-TOF mass spectrometry in screening and diagnostic research. Current pharmaceutical design. 11 (20), 2577-2591 (2005).
- Su, K. Y., et al. Pretreatment epidermal growth factor receptor (EGFR) T790M mutation predicts shorter EGFR tyrosine kinase inhibitor response duration in patients with non-small-cell lung cancer. Journal of clinical oncology. 30 (4), 433-440 (2012).
- Singhal, N., Kumar, M., Kanaujia, P. K., Virdi, J. S. MALDI-TOF mass spectrometry: an emerging technology for microbial identification and diagnosis. Frontiers in microbiology. 6, 791 (2015).
- Cricca, M., et al. High-throughput genotyping of high-risk Human Papillomavirus by MALDI-TOF Mass Spectrometry-based method. New Microbiologica. 38 (2), 211-223 (2015).
- Ashley, S., et al. Genetic Variation at the Th2 Immune Gene IL13 is Associated with IgE-mediated Paediatric Food Allergy. Clinical & Experimental Allergy. 47 (8), 1032-1037 (2017).
- Bousman, C. A., et al. Effects of NRG1 and DAOA genetic variation on transition to psychosis in individuals at ultra-high risk for psychosis. Translational psychiatry. 3 (4), e251 (2013).
- Moffatt, M. F., et al. A large-scale, consortium-based genomewide association study of asthma. New England Journal of Medicine. 363 (13), 1211-1221 (2010).
- Granada, M., et al. A genome-wide association study of plasma total IgE concentrations in the Framingham Heart Study. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 129 (3), 840-845 (2012).
- Oeth, P., et al. iPLEX assay: Increased plexing efficiency and flexibility for MassARRAY system through single base primer extension with mass-modified terminators. Sequenom application note. 27, (2005).
- Ellis, J. A., Ong, B. The MassARRAY System for Targeted SNP Genotyping. Genotyping: Methods and Protocols. , 77-94 (2017).
- Johnson, A. D., et al. SNAP: A web-based tool for identification and annotation of proxy SNPs using HapMap. Bioinformatics. 24 (24), 2938-2939 (2008).
