Summary
Identifizierung von Genvarianten, die einen Beitrag zur komplexen menschlichen Krankheit ermöglicht neuartige Mechanismen zu identifizieren. Hier zeigen wir einen Multiplex-Genotypisierung Ansatz Kandidatengene oder Weg Genanalyse, die maximiert die Reichweite bei niedrigen Kosten und Kohorte-Studien zugänglich ist.
Abstract
Komplexe Krankheiten werden oft durch mehrere gemeinsame genetische Varianten untermauert, die Krankheitsanfälligkeit beitragen. Hier beschreiben wir eine kostengünstige Tag Einzel-Nukleotid Polymorphie (SNP) Ansatz mit einem gemultiplexten Genotypisierung Assay mit Massenspektrometrie, gen Weg Verbände in klinischer Kohorten zu untersuchen. Wir untersuchen Lebensmittel Allergie Kandidat Locus Interleukin13 (IL13) als Beispiel. Diese Methode maximiert effizient die Berichterstattung unter Ausnutzung der gemeinsamen Gestänge Ungleichgewicht (LD) innerhalb einer Region. Ausgewählten LD SNPs sind dann in einen Multiplex-Assay konzipiert ermöglichen bis zu 40 verschiedene SNPs gleichzeitig analysiert werden, Steigerung der Wirtschaftlichkeit. Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wird verwendet, um den Ziel-Loci, gefolgt von Einzel-Nukleotid-Erweiterung zu verstärken und die Amplifikate sind dann mit Matrix-unterstützte Laser Desorption/Ionisierung-Zeit der flight(MALDI-TOF) Massenspektrometrie gemessen. Die raw-Ausgabe wird mit dem Genotyp ruft Software, mit strengen Qualitätskontrolle Definitionen und Cut-Offs, analysiert und mit hoher Wahrscheinlichkeit Genotypen sind bestimmt und Ausgang für die Datenanalyse.
Introduction
In komplexen Krankheiten genetische Varianten tragen zur Krankheitsanfälligkeit und Quantifizierung dieser Varianten kann nützlich sein für Verständnis Pathogenese, hohes Risiko Patientengruppen und Behandlung Responder zu identifizieren. In der Tat ist das Versprechen der präzisionsmedizin Nutzung genomischer Informationen zur Identifizierung von Patientengruppen1abhängig. Leider innerhalb der komplexen Krankheit Biologie Raum, wo Krankheit Phänotypen durch erhebliche genetische Heterogenität, geringe Penetranz und variabler Expressivität untermauert werden, Kohorte Größe Anforderungen für genomweite Ansätze zu identifizieren, Roman Kandidaten sind oft übermäßig groß2. Alternativ beginnt ein gezielte Kandidat gen Ansatz mit einer a priori Hypothese über bestimmte Gene/Wege in Krankheit Ätiologie3. Pfad-Analyse-Tools werden häufig verwendet, um die Pathophysiologie der eine identifizierte Ziel Loci, erzeugen zahlreiche Kandidaten Wege erforscht werden zu untersuchen. Wir zeigen hier einen gemultiplexten Genotypisierung Ansatz ermöglicht die Untersuchung von Dutzende bis Hunderte von SNPs mit einem Assay, geeignet für menschlichen Kohorten Studien4. Dieser Ansatz ist relativ hohen Durchsatz, Hunderte bis Tausende von DNA-Proben für neuartige Entdeckung Studien genotypisiert sein und Untersuchung der spezifischen Bahnen erlaubt. Die hier beschriebenen Methoden eignen sich für identifizierende Risiko-Allele und ihre Verbände mit klinischen Merkmale auf eine relativ schnelle und kostengünstige Weise. Diese Plattform ist sehr vorteilhaft für Screening und diagnostische Zwecke5,6, und seit kurzem auch für mikrobielle Infektion7 und humanes Papillomavirus8gewesen.
Dieses Protokoll beginnt mit der Auswahl aus einer Reihe von Genen für Untersuchung, d. h.., den Zielregionen, in der Regel bestimmt durch Literatur suchen oder a priori Hypothesen für die Beteiligung an den Krankheitsprozess; oder vielleicht für die Replikation als den führenden Vereinigungen einer Entdeckung genomweite (GWA) Studie ausgewählt. Aus dem Gen-Set wird der Forscher des Tags SNPs einen raffinierten auswählen. Das heißt, ist die Verknüpfung Ungleichgewicht (LD) oder die Korrelation unter den Varianten in der Region zum Vertreter 'Tag SNP' für eine Gruppe von SNPs in hohen LD, bekannt als ein Haplotyp identifizieren. Die hohen LD der Region bedeutet, dass die SNPs oft zusammen vererbt werden, so dass Genotypisierung ein SNP ausreichen, um die Variation an allen SNPs in den Haplotyp vertreten ist. Alternativ, wenn auf eine endgültige Liste der SNPs aus vielen Regionen, z.B.Follow-up., Replikation für eine GWA-Studie, dieser Prozess möglicherweise unnötig. Für Multiplex Genotypisierung ist ein Test dann um diese Ziele auszulegen, so, dass die Verstärkung Zündkapseln sind unterschiedlicher Masse derjenigen die Verlängerung Zündkapseln und Produkte herstellen interpretierbaren Spektren Masse. Diese Parameter werden leicht durch ein Multiplex Genotypisierung-Assay-Design-Tool implementiert. Die Forward- und reverse Primer von diesem Design werden verwendet werden, Zielen auf die Markierungen des Interesses und verstärken die Sequenz, die SNP enthält. Die Erweiterung Primer Anhängen direkt proximal zu den SNPs und eine einzelne, Masse verändert, 'Terminator'-Basis, die komplementär zu der SNP ist hinzugefügt. Die Terminator Basis verhindert eine weitere Verlängerung der DNA. Die Masse-Modifikation des Sockels kann Fragmente abweichend von einer einzelnen Base von Massenspektrometrie detektiert werden. Die Platte enthält die Genotypisierung Chemie wird dann auf einen Chip für die Messung auf einer Plattform Massenspektrometrie angewendet. Nach der Anwendung entsprechende Qualitätskontrollen, die rohen Genotypisierung Anrufe vom System erkannt, können die Daten exportiert und verwendet zur statistischen Auswertung, um Verbindung mit Krankheit Phänotypen zu testen.
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Protocol
Das genetische Material hierin verwendeten ethisch stimmte für den Einsatz des Amtes für Kinder HREC (menschliche Research Ethics Committee) (CDF/07/492), die Abteilung der menschlichen Dienstleistungen HREC (10/07) und die königlichen Kinder Krankenhaus (RCH) HREC (27047).
1. Gestaltung des Multiplex-Tests
- Bereiten Sie eine SNP-Liste für Test-Design.
- Geben Sie die Zielregion der Tagger Funktion des Haploview (https://www.broadinstitute.org/haploview/downloads). Verwenden Sie die LD (Korrelation, R2) zwischen SNPs in der Zielregion erstellen eine Liste von SNPs, die vollständige Abdeckung der gewünschten Region mit der geringsten Anzahl von Varianten bietet. Eine Liste der SNPs erzeugen, so dass alle Allele erfasst werden über einen benutzerdefinierten Grenzwert korreliert sind (zB., R2 ≥0.8).
- Identifikation von geeigneten Sequenzen für vorwärts, rückwärts und Verlängerung Zündkapseln
- Geben Sie die generierte Liste von SNPs in das Test-Design-Tool der Wahl.
Hinweis: Die folgenden Anweisungen gelten für das Test-Design-Tool verwendet, um die repräsentativen Ergebnisse, wie in der Tabelle der Materialienzu erzeugen. - Sobald das Test-Design-Tool gestartet wurde, wählen Sie Neue Genotypisierung Design. Geben Sie einen Namen für das Test-Design in das Feld Name Design .
- Geben Sie die SNP-Liste in Schritt 1.1.1 durch Klicken auf die Schaltfläche Bearbeiten Texteingabe mit den Anweisungen Rs oder FASTA auf der linken Seite der Taste erzeugt.
Hinweis: SNPs können als eine Textliste Bezugspunkt (Rs) SNP-IDs oder im FASTA-Format hochgeladen, oder das SNP-Gruppe-Dateiformat verwendet durch das Werkzeug. Um Dateien in diesen Formaten hochzuladen, wählen Sie die Schaltfläche " Datei hochladen ". Die Obergrenze von Varianten, die in einen einzigen Assay, bezeichnet 'gut,' gestaltet werden kann ist 40 SNPs. Es ist möglich, SNPs anzugeben, die eine Priorität für das Design sind vor Beginn der Ausführung; Diese werden zuerst gestaltet werden. Kontrolle SNPs können angegeben werden: beispielsweise ein Assay Geschlecht bei Probe Verwechslungen oder ein Steuerelement, um festzustellen, dass ausreichende Vorlage erkannt wurde hinzugefügt, wenn arbeiten mit geringer oder schlechte Qualität DNA. Allerdings ist darauf hinzuweisen, dass mit Kontrolle und Priorität SNPs die Anzahl der SNPs reduzieren kann, die in einem einzigen gut gestaltet werden kann. - Die Preset- Menü die Option hohe Multiplexing iPLEX voreingestellt . Wählen Sie aus dem Menü " Organismus " des Organismus, die DNA zu genotypisiert werden abgeleitet. Für die repräsentativen Ergebnisse hier vorgestellt war dieser Mensch.
Hinweis: Maus und bovine Organismen sind auch kompatibel mit dem Werkzeug. Man kann auch andere auswählen Wenn mit alternativen Organismus wie z.B. Werk oder Mikrobe arbeiten; die automatisierte Schritte für die Suche nach proximal SNPs und optimale Grundierung Bereiche werden jedoch nicht verfügbar, da das Fehlen eines Referenz-Genoms. - Wählen Sie im Menü Datenbank die neuesten Build des Genoms oder einen alternativen Build bei Bedarf, aus dem Menü " Chemie ". IPLEX auswählen und für die Multiplex-Ebene Feld eingeben multiplexing auf höchste Niveau: 40. Wählen Sie jetzt Anfangen zu laufen. "Schritt 1" des Werkzeugs wird begonnen.
Hinweis: In Schritt 1, das Tool ruft und formatiert die SNP-Sequenzen. Hier können Fehler enthalten Formatierung der FASTA-Datei, in der welchem Fall die FASTA-Datei sollten überprüft und bei Bedarf neu formatiert. Ein weiterer Fehler ist SNP Rs Zahlen, die zusammengeführt wurden mit einer anderen Rs-Nummer, in dem Fall der Rs-Reihe in einer SNP-Datenbank z. B. das NCBI DbSNP zu identifizieren, die neue SNP Rs Nummer gesucht werden soll. Sequenzen rund um die SNP sind alle bekannten proximalen SNPs gesucht, die besser gekleideteres Design stören könnten. Mögliche Standorte werden PCR Primer werden gegen das Genom zu unspezifischen Verstärkung durch mehrere Treffer im Genom verglichen. - Erwarten Sie Abschluss der "Schritt 2" von der Design-Tool in dem proximalen SNPs identifiziert werden.
Hinweis: Wenn einen Organismus, der durch diesen Schritt nicht unterstützt wird, kommentieren Sie die Sequenzen mit proximalen SNPs in IUPAC Anmerkung Wenn diese Informationen verfügbar sind. Bei diesem Schritt gibt es nur selten Fehler; jedoch können Fehler auftreten, wenn die falsche Referenz Organismus oder Genom ausgewählt wurde, oder wenn cDNA Sequenzen statt genomischer DNA eingegeben wurden. Schritt 2, unter Erweiterte Einstellungen zu optimieren ist es möglich, anhand einer Bevölkerung, wenn innerhalb einer bestimmten Population arbeiten SNPs herausfiltern. Seltene SNPs können auch herausgefiltert werden, mit Ausnahme derjenigen mit einer Frequenz unter 1 %. SNPs, die haben keinen validierten Status oder haben keine Bevölkerung Informationen können schließlich auch ausgeschlossen werden, falls gewünscht. - Erwarten Sie Fertigstellung der "Schritt 3" von der Design-Tool, das optimale Grundierung identifiziert Regionen. Geben Sie falls gewünscht, dass Grundierung Standorte identifiziert wurden oder mit einen anderen Organismus funktioniert ein, manuell Grundierung Standorte durch kommentieren die Eingabesequenz (SNP Gruppendateien) mit den bevorzugten Grundierung Regionen in Großbuchstaben und der Rest der Sequenz im unteren Fall, wählen Sie Zu wahren Fall aus Menü "Erweiterte Einstellungen" für diesen Schritt.
Hinweis: Fehler für die Schritte 2 und 3 umfassen: (1) A proximalen SNP blockieren das Design eines Primers mit der Lösung als Maske mit einem nicht-Template-Basis und bestellen ein Oligo eine universelle Basis wie Isonine oder zwei Zündkapseln, eine mit jedem der Allele die Proxim-design Al-SNP, oder Design eine Grundierung mit dem gemeinsamen Allel nur. (2) ein weiterer häufiger Fehler ist das Versäumnis, einen einzigartigen Ort für die Grundierung mit der Lösung die Amplifikate Länge ändern, um eine einzigartige Website identifizieren, identifizieren. In das Werkzeug für dieses Papier verwendet ist der Standardwert 80-120 bp. Dies kann geändert werden, von 60-400 bp in den erweiterten Einstellungen-Dialog unter der Amplifikate Länge Einstellungen in "3." Optimale Grundierung Bereiche identifizieren"und auch unter der Registerkarte" Amplikons ""4 ". Design-Assays." Stellen Sie sicher, dass beide geändert werden. Allerdings ist darauf hinzuweisen, dass die Erhöhung der Länge der der Amplifikate wenn mit DNA abgebaut wird nicht empfohlen. - Warten auf Abschluss des Assays designschritt ("Schritt 4" des Design-Tool), hier das Tool soll optimale Pass Trennung zwischen der Verlängerung Zündkapseln und der Allele der SNPs in der Multiplex-Designs. Nachdem dieser Schritt abgeschlossen ist, exportieren Sie die Oligo-Bestellung-Datei, die für einfache Bestellung durch eine Oligo Bestellung Anbieter der Wahl formatiert ist.
Hinweis: Verstärkung Zündkapseln (nach vorne (F) und umgekehrt (R)) sind entworfen, um eine optimale Amplikons Größe von 80 bis 120 produzieren bp. Die Verstärkung Grundierung Masse muss unterscheiden sich von derjenigen der Erweiterung Primer und sein Produkt, widersprüchliche Ergebnisse im Massenspektrum und für PCR-Gesamtleistung zu vermeiden. Die Erweiterung Grundierung sollte 15 bis 30 Nukleotide lang (4.500-9.000 Da), so ausgelegt, dass die 3'-Ende direkt auf der Website von den Polymorphismus befestigt wird. All diese Einstellungen werden automatisch in das Werkzeug benutzt, um repräsentative Ergebnisse zu generieren eingestellt.
- Geben Sie die generierte Liste von SNPs in das Test-Design-Tool der Wahl.
- Exportieren Sie das Design aus der gewählten Werkzeug und Ordnung Primer von einem Oligomer-Provider: 25 Nmol aller die PCR-Primer (vorwärts und rückwärts) und 100 Nmol jeder Verlängerung Zündkapseln. Siehe Tabelle 1 für die Primer verwendet, um repräsentative Ergebnisse zu generieren.
(2) Genotypisierung (1-2 Tage)
- Bereiten Sie Verstärkung Zündkapseln.
- Wenn lyophilisierter Primer bestellt wurden, rekonstruieren Sie mit molekularen Grade Wasser. Verwenden Sie eine Konzentration von 100 μM/μL für forward und reverse Primer und 500 μM/μL für Erweiterung.
- Pool vorwärts & rückwärtige Zündkapseln für jedes gemultiplexten Assay in ein Lager Grundierung mischen, mit jeder Grundierung in einer Konzentration von 0,5 mM.
Hinweis: zum Beispiel, ein 400 μl Grundierung Pool für 400 Reaktionen:
2 μL jeder Grundierung in einer Konzentration von 100 μM/μL, ist erforderlich für die Lager Grundierung-Pool. Für einen 30-Plex-Assay mit 60 forward und reverse Primer, wäre insgesamt 120 μL Grundierung erforderlich (den konzentrierten Grundierung Pool). 280 μl Molekulare Grade Wasser würde dann zu einem Endvolumen von 400 μl Grundierung Mischen hinzugefügt werden.
- Amplifikation mit der Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
- Machen Sie einen master-Mix für die PCR mit 100 nM die Primer-Mix detailliert über 500 μM von dNTPs, 2 mM MgCl2und 0,5 U eines Enzyms DNA-Polymerase. 1 U ist erforderlich für mehr als 26-Plex-Assays. Siehe Tabelle 2.
- Geben Sie 4 μL dieser Mischung in jeder 384-Well-PCR-Platte, zusammen mit 1 μL genomischer DNA in einer Konzentration von 5 bis 10 ng/μl.
Hinweis: Qualitätskontrollen sollten auch enthalten sein, auf dem Teller, wie ein nicht-Template-Kontrolle und einer positiven Kontrolle, die vorher gut mit dem Assay (während eines Testlaufs) durchgeführt hat. Wenn mehrere Platten ausgeführt, mehrere DNA Proben aus den anderen Chicoréeblätter, zB., in dreifacher Ausfertigung, als technische Kontrollen zwischen den Platten Variabilität ausgeführt werden sollte. - Zentrifugieren Sie die Platte 200 X g für 1 min bei Raumtemperatur mit einer Platte um sicherzustellen, alle Flüssigkeit an der Unterseite der Platte Brunnen enthalten ist.
- Die PCR mit folgenden Thermocycler Bedingungen laufen: 4 min Inkubation bei 94 ° C zur Aktivierung der DNA-Polymerase; 45 Zyklen der folgenden (Denaturierung bei 94 ° C für 20 s, Glühen bei 56 ° C für 30 s und Erweiterung bei 72 ° C für 1 min) und dann eine letzte Verlängerung bei 72 ° C für 3 min. siehe PCR-Programm in Tabelle 3.
- Führen Sie Agarose-Gelelektrophorese um sicherzustellen, dass die DNA-Amplifikation erfolgreich ist. 1 µL des PCR-Produkt (mit 3 µL Puffer laden) auf einem 2 % (w/V) Agarose-Gel, gebildet durch das Mischen von Agarose-Pulver und 0,5 % Tris Borat EDTA (TBE) Puffer verwenden und führen für 45 min bei 100 V.
- Reinigungsstufe Shrimp alkalische Phosphatase (SAP)
Hinweis: Dieser Schritt dient zum Entfernen von unincorporated Nukleotide. Das SAP-Enzym spaltet Phosphatgruppen zu verhindern, dass überschüssige Zündkapsel und unincorporated dNTPs Einmischung in die kommende Erweiterung Reaktion.- Machen Sie einen Master mix mit 1,7 Einheiten/μL des Enzyms Shrimp alkalische Phosphatase (SAP), 10 X SAP-Puffer und make up, mit molekularen Grade Wasser. Siehe Tabelle 4.
- Fügen Sie 2 μL der frisch geschminkten SAP master Mix in jede Vertiefung der Platte, die bereits mit 5 μl aus der PCR-Reaktion. Zentrifugieren Sie kurz und zurück zum Thermocycler bei 37 ° C für 40 min. und dann bei 85 ° C für 5 min für Enzym-Inaktivierung. Siehe Tabelle 5.
- Primer-Extension-Reaktion
Hinweis: Die Konzentration der Erweiterung Primer in der Verlängerung Grundierung Mischung muss nach Größe (lineare Primer Anpassung – LPA) angepasst werden. Ist nämlich eine inverse Beziehung in Peak-Intensität (auf der Massenspektren) und Masse. Einstellung der Erweiterung Grundierung Konzentration korrigiert für diese Beziehung zum Gipfel des gleichen Intensitäten zu produzieren. Primer zur Erzeugung des Vertreters zur Verfügung gestellten Ergebnisse sind in den Tabellen 6 und 7angepasst. Die Bände zur Verfügung gestellt sind, 1,5 mL Erweiterung Grundierung Mix zu generieren.- Verdünnungsfaktoren für jede Grundierung mit einem Farbverlauf Algorithmus, verfügbar von Agena Biosciences ("lineare Primer Anpassung"), die für die Masse und die Konzentration der Grundierung und die Gesamtzahl der Primer in der gemultiplexten Reaktion (siehe passt zu berechnen Tabellen 6 und 7). Eintragen der UEP Mass für jede Grundierung UEP_MASS des Blattes lineare Anpassung der Primer.
Hinweis: Die Masse angepasste Konzentration für die Grundierung werden automatisch in die Zelle mit der Kopfzeilentext "Reaktion Zielkonzentration (µM)." berechnet Das Volumen der Grundierung Primer Pool hinzugefügt werden wird in der Zelle unter die Überschrift "Volumen Lager Primer Pool (µL) hinzugefügt werden." ausgegeben werden Das Volumen des Wassers, der Primer-Pool, um die berechneten Konzentrationen bilden hinzugefügt werden soll wird ausgegeben, die Zelle neben dem Text "Volumen der PCR Grade RNase frei H2O, Primer Pool (µL) hinzugefügt." - Nehmen Sie die Lautstärke jeder Grundierung wie angegeben in die lineare Anpassung der Primer-Datei und Make-up Grundierung Pool. Fügen Sie das Volumen des Wassers durch den Algorithmus zu verdünnen Sie den Primer Pool wie im Schritt 2.4.1 berechnet.
Hinweis: Wenn die gradient Algorithmus-Methode nicht verfügbar ist, ist eine andere Methode die Primer in niedrigen und hohen Masse aufteilen und verdoppeln die Konzentration der hohen Masse Primer im Vergleich zu der geringen Masse hinzufügen. Drei oder vier Gruppen möglicherweise erforderlich für einen High-Plex-Assay (d. h. mehr als 19 SNPs). Diese Methode wird jedoch nicht als optimale Tarife als gradient Algorithmus Methode erzielen. - Montieren Sie die Erweiterung-master-Mix. Für die niedrigen Plex-Assay (1-18 Plex) Hinzufügen von 0,2 μl Puffer, 0,1 μL Kündigung Mix, 0,94 μL des LPA angepasst-Grundierung-Mix und 0.0205 μL des Enzyms (vorbereitet auf Eis). Fügen Sie für die hohe Plex-Assay (19-36-Plex) doppelte Konzentration der Kündigung Mix und Enzym (Kündigung Mischung 0,2 μl und iPLEX Enzym 0,041 μL). Finden Sie in Tabelle 8.
- Die Platte fügen Sie 2 μL der Erweiterung-Reaktion-master-Mix aus der vorangegangenen Reaktion, jetzt bringt das Gesamtvolumen 9 μL pro Well hinzu. Zentrifugieren Sie kurz und in den Thermocycler: 94 ° C für eine 30 s erste Inkubation, 40 Zyklen von 1 x 94 ° C für 5 s mit 5 X (52 ° C für 5 s, gefolgt von 80 ° C für 5 s), und dann 72 ° C für 3 min. siehe Tabelle 9.
- Verdünnungsfaktoren für jede Grundierung mit einem Farbverlauf Algorithmus, verfügbar von Agena Biosciences ("lineare Primer Anpassung"), die für die Masse und die Konzentration der Grundierung und die Gesamtzahl der Primer in der gemultiplexten Reaktion (siehe passt zu berechnen Tabellen 6 und 7). Eintragen der UEP Mass für jede Grundierung UEP_MASS des Blattes lineare Anpassung der Primer.
- Harz-Reinigung.
Hinweis: Überschüssige Salze können nun aus der Reaktion mit dem Einsatz von Harz entfernt werden.- Die Brunnen der abgerufenen Platte, bringt das Volumen in der Platte bis zu 25 μL fügen Sie 16 μL deionisiertes Wasser hinzu.
- Wenden Sie Harz, in der Regel 6 mg Grübchen Harz Platte (separat erhältlich), gleichmäßig auf die ganze Platte an. Lassen Sie das Harz in den Harz Grübchen Platte für 20 min bei Raumtemperatur trocknen bevor Sie auf die Reaktion Platte anwenden. Nach Zugabe des Harzes, drehen die Platte für 5 min bei Raumtemperatur entweder von hand oder mit einem Fahrwerk-Mixer mit langsamer Geschwindigkeit (zB., 7,5 u/min).
Hinweis: Vor dem Laden der Genotypisierung Analyten auf die Genotypisierung Chip, müssen die Proben und das Assay-Layout in die Software-Schnittstelle eingegeben werden. Dies kann erreicht werden mit Hilfe der Design-Zusammenfassung-Datei aus der Assay-Design-Tool.
- Messung auf einer Plattform der Massenspektrometrie.
- Zentrifugieren Sie die Platte bei 3.200 x g für 5 min zur Anwendung des Harzes in den Massenspektren Chip zu vermeiden.
- Laden Sie die Platte Anordnung der Proben auf die System-Software-Schnittstelle vor dem Lauf.
Hinweis: Schritt 2.6.3 sollte nur von geschultem Personal durchgeführt werden. - Übernehmen Sie die Genotypisierung Analyten Mischung aus der Platte auf die Genotypisierung-Chip mit einer Dosieranlage. Als Nächstes laden Sie den Chip auf die MALDI-TOF-System, der Massenspektren aus der Analyt-Mischung zu erzeugen, die dann mit Hilfe der Plattform-Software-Schnittstelle interpretiert werden kann.
Hinweis: Das System generiert die Massenspektren von kurzen Pulsen von UV-Licht auf jedes "Pad", zu einem einzigen Brunnen der Genotypisierung Platte, von der Massenspektren Chip entsprechend richten. Dieser Impuls führt Desorption und Ionisation des Analyten. Diese ionisiert DNA Moleküle werden dann an die Spitze der Vakuum-Röhre durch eine Hochspannung elektrostatisches Feld, Trennung leichter Ionen, die schneller fahren und erreichen den Detektor zunächst von den schwereren Ionen angetrieben. "Time of Flight" diese Analyte werden vom System erfasst, aus denen die Masse jedes DNA-Fragment ermittelt werden und somit die Nukleotid-Basis bei der SNP abgeleitet werden kann.
(3) Genotypisierung Daten
Hinweis: Qualitätskontrolle und Interpretation der Daten stehen nicht im Mittelpunkt dieser Methodik Papier. Allerdings wird im folgenden kurz Interpretation der Massenspektren abdecken.
- Manuelle Inspektion und Qualitätskontrolle von Massenspektren.
Hinweis: Die rohe Massenspektren sind vom System generiert und analysiert mit der Software wie in der Tabelle der Materialienaufgeführt. Eine Gaußsche Mischung clustering-Methode wird an diesen Ausgang probabilistische Genotypisierung telefonieren angewendet.- Öffnen Sie die Analysesoftware. Wählen Sie Typer Analyzer. Wählen Sie aus dem Menü Datei Offenen Brunnen aus Datei und wählen Sie die XML-Datei mit im Schritt 2.6.3 gewonnenen spektrumdaten. Der Chip-Name für der Lauf sollte sichtbar, wählen Sie ihn und eine "Ampel" Glasscheibe 384-Well-Platte erscheint mit einer Liste von SNPs in der gewählten gut. Wählen Sie von hier aus Rufen Sie Cluster Grundstücke ein Streudiagramm von Datenpunkten für jede SNP anzeigen.
Hinweis: Es wird empfohlen, dass ein "kein Anruf" Ergebnis für niedrige Intensität SNPs angewendet werden. In der Software für die repräsentativen Ergebnisse verwendet empfiehlt sich ein clustering Größenordnung Cut-off von 5, die höher ist als Standard, für die strenge Qualitätskontrolle. Diese Einstellung kann im Bereich Post-Processing-Cluster in der Größenordnung Cutoff Feld unter Parameter eingestellt werden. Die Registerkarte " Extras " zu eine Clusteranalyse laufen wählen Sie Autocluster aus . - Durchzuführen Sie manuelle Inspektion der Genotyp Anrufe durch die Untersuchung der kartesischen Grundstücke im Bereich Post Processing. Im Bereich Test wählen Sie die SNP Interesse und klicken Sie auf die Registerkarte " Post-Processing-Cluster ", eine Cluster-Grundstück mit Genotyp clustering mit Probe-IDs und entsprechenden Genotypen für die SNP sichtbar sein wird.
- Prüfen Sie die Genotyp-Anruf-Cluster und bewerten Sie, wie gut jedes einzelne Gespräch mit den anderen Anrufe für die SNP Cluster. Die Software bietet einige Grenzlinien auf dem Grundstück für jede Genotyp zur Orientierung; Siehe Beispiel eines Genotyp Anrufe Cluster Plots aus einem IL13 SNP (Abbildung 1). Wenn der Anruf wird nicht eng mit anderen aufrufen cluster und sitzt deutlich außerhalb eines Clusters oder es hat sehr geringen Intensität, die Datapoint Rechtsklick und wählen Sie, Rufen Sie Änderung , um manuell zu No nennen.
- Um sicherzustellen, dass hohe Datenqualität Genotypisierung für nachgelagerte Analyse verwendet wird, schließen Sie SNPs und Einzelpersonen mit Call Tarife unterhalb einer Schwelle QC, z. B. 90 %. Einmal entsprechende Anpassungen wurden vorgenommen, um die Gesprächsdaten, exportieren Sie die Daten für statistische Anwendungen. In der Software verwendet, um die repräsentative Ergebnisse (aufgeführt in der Tabelle der Materialien) zu generieren ist dies durch die Platte Datenselektion aus dem Menü "Ansicht" und wählen Sie Speichern unter.
- Öffnen Sie die Analysesoftware. Wählen Sie Typer Analyzer. Wählen Sie aus dem Menü Datei Offenen Brunnen aus Datei und wählen Sie die XML-Datei mit im Schritt 2.6.3 gewonnenen spektrumdaten. Der Chip-Name für der Lauf sollte sichtbar, wählen Sie ihn und eine "Ampel" Glasscheibe 384-Well-Platte erscheint mit einer Liste von SNPs in der gewählten gut. Wählen Sie von hier aus Rufen Sie Cluster Grundstücke ein Streudiagramm von Datenpunkten für jede SNP anzeigen.
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Representative Results
Mit dem oben beschriebenen Protokoll kennzeichnen wir genotypisiert SNPs über das Th2 immun gen IL13 in einer Kohorte von Nahrungsmittel-Allergie Fälle und Kontrollen9. Wir angewendet logistische Regressionsanalyse, bereinigt um Abstammung und andere potentiellen Kovariablen zu testen, ob die genetische Varianten innerhalb der Region des Interesses Lebensmittel-Allergie-Risiko erhöht. Tabelle 10 9 zeigt, dass eine Variante rs1295686 Herausforderung erwiesen Nahrungsmittelallergie zugeordnet ist und wir bestätigt, dass diese Zuordnung in eine Replikation Kohorte mit dem gleichen Genotypisierung Ansatz gemultiplext. Eine Meta-Analyse der Ergebnisse aus den beiden Kohorten haben starke nachgewiesen Association of IL13 mit FA (Tabelle 11)9. Wir genetisch abgeleitet und bereinigt um Abstammung in die Analyse mit ein Abstammung informative SNP Marker-Panel aus veröffentlichten Panel10angepasst. Wir genotypisiert das Panel mit dem gleichen Multiplex assay Ansatz.
Die zugehörigen Variante, rs1295686, wurde zuvor identifiziert als ein Asthma-Risiko Loci11 und andere allergische immunologische Parameter12, was darauf hindeutet, dass es möglicherweise eine allgemeine Allergische Krankheit Risiko Loci zugeordnet. Die nächsten Schritte zur Durchführung weiterer Studien, wie z.B. differentielle Expressionsanalyse, Zuordnung von physikalischen Wechselwirkungen mit einer Chromatin-Capture-Methode, feine Zuordnung der Region wäre, und Haplotyp Analyse, Heften Sie die funktionelle Variante und charakterisieren die Biologie hinter die beobachteten Assoziation mit Nahrungsmittel-Allergie.
Abbildung 1: kartesischen Cluster Plot für die IL13 SNP-rs1295686. Gelbe Cluster repräsentieren homozygoten Genotyp Anrufe für das A-Allel, blau für das G-Allel und grün für heterozygote Anrufe. Die paar Genotyp Anrufe, die nicht cluster-mit der entweder homozygoten oder heterozygoten Massenspektren wurden vertont "kein Anruf."
Tabelle 1: Primer-Sequenzen verwendet, um repräsentative Ergebnisse für IL13generieren. Die Spalte "Name" enthält die SNP-ID, die gut Anzahl (wie bereits erwähnt, die "gut" beziehen sich auf die ID des Multiplex-Assays), und die Art der Grundierung (F für vorwärts, R für Reverse und UEP für die Erweiterung Grundierung). Die nächsten Spalten enthalten die Sequenz des Primers, die Größe der Grundierung und der Art der Reinigung. Es sei darauf hingewiesen, dass SPINK5 und eine Abstammung Informative Marker (AIM) Tafel wurden genotypisiert mit den gleichen Test, obwohl diese Ergebnisse nicht mit den vorgestellten repräsentativen Ergebnisse diskutiert werden. SNPs endet in _CEU und _CHB finden Sie unter Ziel SNPs die Nordeuropäer von Utah und die Han-Chinesen in Beijin, China Populationen aus dem 1000-Genome-Projekt bzw.. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.
| Master Mix | Niedrige Plex (≤26 SNPs) | Hohen Plex (> 26 SNP) | |||
| Reagenz | Konz in 5 µL. | × 1 | × 200 | × 1 | × 200 |
| (Entionisiertem) Wasser | 1.9 | 380 | 1.8 | 360 | |
| Puffer | 1 × (2 mM MgCl2) | 0,5 | 100 | 0,5 | 100 |
| MgCl2 | 2 mM | 0,4 | 80 | 0,4 | 80 |
| dNTPs | 500 ΜM | 0.1 | 20 | 0.1 | 20 |
| Grundierung mischen ** | 100 nM | 1 | 200 ** | 1 | 200 ** |
| Taq polymerase | 0,5 U / 1 U | 0.1 | 20 | 0,2 | 40 |
| Insgesamt | 4 ΜL | 800 ΜL | 4 ΜL | 800 ΜL | |
| ** bereits verdünnt mit entionisiertem H20 wie in 2.1.2 | |||||
Tabelle 2: Reagenzien und Konzentrationen erforderlich, damit den Verstärkung PCR-Primer mix. Die master-Mix-Bände sind für 200 Reaktionen gegeben, weil 400 (genug, um ein 384-Well-Platte) nicht in ein 1,5 µL Rohr passt und somit 2 x 200 in getrennten Rohren gemacht werden sollte. Mengen angegeben unter Low-Plex sollte verwendet werden, wenn der Multiplex-Test "gut" weniger als oder gleich 26 SNPs, wenn größer enthält als 26 SNPs gut verwendet hohe Plexus Bände werden.
| Thermocycler Bedingungen |
| 94 ° C für 4 min. |
| 45 Zyklen (94 ° C 20 s, 56 ° C 30 s, 72 ° C 1 min.) |
| 72 ° C für 3 min |
| 4 ° C halten |
Tabelle 3: Thermocycler Bedingungen für die PCR Verstärkung.
| Master Mix | × 1 | × 410 |
| (Entionisiertem) Wasser | 1,53 | 627.3 |
| 10 × Puffer | 0,17 | 69,7 |
| SAP-Enzym (1,7 U/µL) | 0,3 | 123 |
| Insgesamt | 2 ΜL | 820 ΜL |
Tabelle 4: Reagenzien und Konzentrationen für den master-Mix für die SAP-Reaktion. Master-Mix Bände sind für 410 Reaktionen zur Deckung einer 384-Well-Platte mit einer Marge für Pipettier Fehler gegeben.
| Thermocycler Bedingungen |
| 37 ° C für 40 min. |
| 85 ° C für 5 min |
| 4 ° C halten |
Tabelle 5: Thermocycler Voraussetzungen für die SAP-Reaktion.
| # | Erweiterung-Primer | Original Lager Konzentration (µM) | Misc. | UEP_ MASSE | Zielkonzentration Reaktion (µM) | EXT-Primer-Pool-Konzentration (µM) | Volume Lager Primer, Pool (µL) hinzugefügt werden |
| 1 | rs36110_CHB | 500 | 4359.8 | 0.560 | 5,36 | 16.09. | |
| 2 | rs10488619_CHB | 500 | 4546 | 0.602 | 5.76 | 17,29 | |
| 3 | rs1986420_CEU | 500 | 4761.1 | 0.648 | 6.21 | 18,62 | |
| 4 | rs2934193_CEU | 500 | 4964.3 | 0.690 | 6.61 | 19,82 | |
| 5 | rs4968382_CEU | 500 | 5047.3 | 0,707 | 6,77 | 20.30 Uhr | |
| 6 | rs1227647_CEU | 500 | 5136.4 | 0.724 | 6,93 | 20.80 | |
| 7 | rs1402851_CEU | 500 | 5338.5 | 0.763 | 7.30 Uhr | 21,91 | |
| 8 | rs4705054 | 500 | 5476.6 | 0.788 | 7.55 | 22.64 | |
| 9 | rs6928827 | 500 | 5678.7 | 0.824 | 7.89 | 23.68 | |
| 10 | rs9325072 | 500 | 5762.8 | 0,839 | 8.03 | 24.10. | |
| 11 | rs4841401_CHB | 500 | 5853.9 | 0,855 | 8.18 | 24,55 | |
| 12 | rs11098964_CHB | 500 | 6052.9 | 0.888 | 8.50 | 25.51 | |
| 13 | rs2416504_CHB | 500 | 6174 | 0.908 | 8,69 | 26.08 | |
| 14 | rs1860933 | 500 | 6264.1 | 0.923 | 8,83 | 26.50 | |
| 15 | rs2193595_CHB | 500 | 6391.2 | 0,943 | 9.03 | 27.08 | |
| 16 | rs1519260_CHB | 500 | 6469.2 | 0.955 | 9.14 | 27.43 | |
| 17 | rs11184898_CHB | 500 | 6588.3 | 0.973 | 9.32 | 27,95 | |
| 18 | rs679832_CEU | 500 | 6757.4 | 0.998 | 9,56 | 28.68 | |
| 19 | rs326626_CEU | 500 | 6765.4 | 1.000 | 9,57 | 28.71 | |
| 20 | rs1612904 | 500 | 6873.5 | 1.015 | 9,72 | 29,17 | |
| 21 | rs862942 | 500 | 6960.5 | 1,028 | 9,84 | 29,53 | |
| 22 | rs2486448_CHB | 500 | 7169.7 | 1.058 | 10.13 | 30,38 | |
| 23 | rs4824001_CEU | 500 | 7341.8 | 1.081 | 10.35 Uhr | 31,06 | |
| 24 | rs6552216_CEU | 500 | 7465.9 | 1,098 | 10,51 | 31.54 | |
| 25 | rs1488299_CHB | 500 | 7620 | 1,119 | 10.71 | 32,13 | |
| 26 | rs1347201_CHB | 500 | 7626 | 1,119 | 10.72 | 32,15 | |
| 27 | rs315280_CHB | 500 | 7747 | 1.135 | 10,87 | 32,60 | |
| 28 | rs11203006_CHB | 500 | 7834.1 | 1.146 | 10,97 | 32.92 | |
| 29 | rs4240793_CHB | 500 | 8036.3 | 1.172 | 11.22 | 33.66 | |
| 30 | rs9325071 | 500 | 8219.4 | 1.194 | 11,43 | 34.30 | |
| 31 | rs12678324_CEU | 500 | 8394.5 | 1,215 | 11,64 | 34,91 | |
| 32 | rs4653130_CEU | 500 | 8455.5 | 1.223 | 11.71 | 35.12 | |
| 33 | rs9275596 | 500 | 8537.6 | 1.232 | 11.80 | 35.39 | |
| 34 | rs12595448_CHB | 500 | 8603.6 | 1,240 | 11.87 | 35,62 | |
| Volumen der PCR Grade Rnase frei H2O, hinzugefügt Primer Pool (µL) | 561.78 | ||||||
Tabelle 6: gut 1 eingestellten Primer verwendet, um repräsentative Ergebnisse zu generieren. Eine Tabelle mit Verlängerung Zündkapseln angepasst durch Größe, einschließlich die Zielkonzentration, die Lautstärke in der Grundierung Pool und Endkonzentration für jede Grundierung Primer-Pool für gut 1 verwendet. Das Volumen des Wassers erforderlich machen, der letzte Band wird am unteren Rand der Tabelle bereitgestellt. Das Gesamtvolumen der Grundierung Pool war 1,5 mL.
| # | Erweiterung-Primer | Original Lager Konzentration (µM) | Misc. | UEP_ MASSE | Zielkonzentration Reaktion (µM) | EXT-Primer-Pool-Konzentration (µM) | Volume Lager Primer, Pool (µL) hinzugefügt werden |
| 1 | rs10515597 | 500 | 4482.9 | 0.588 | 5.63 | 16.89 | |
| 2 | rs2759281_CEU | 500 | 4921.2 | 0.681 | 6.52 | 19,57 | |
| 3 | rs17641748 | 500 | 5080.3 | 0.713 | 6,83 | 20,48 | |
| 4 | rs1698042_CEU | 500 | 5201.4 | 0.737 | 7.05 | 21.16 | |
| 5 | rs5753625_CHB | 500 | 5411.6 | 0.776 | 7.43 | 22: 30 Uhr | |
| 6 | rs3912537_CEU | 500 | 5811.8 | 0.848 | 8.12 | 24,35 | |
| 7 | rs6141319_CEU | 500 | 5883.8 | 0.860 | 8.23 | 24.70 | |
| 8 | rs1002587_CEU | 500 | 6026.9 | 0,884 | 8.46 | 25,39 | |
| 9 | rs1295686 | 500 | 6172 | 0.908 | 8,69 | 26.07 | |
| 10 | rs16877243_CEU | 500 | 6386.2 | 0.942 | 9.02 | 27.05. | |
| 11 | rs1103811 | 500 | 6595.3 | 0.974 | 9.33 | 27.98 | |
| 12 | rs6510332_CEU | 500 | 6790.4 | 1.003 | 9,61 | 28.82 | |
| 13 | rs6595142_CHB | 500 | 6874.5 | 1.016 | 9,72 | 29,17 | |
| 14 | rs4484738_CEU | 500 | 6966.5 | 1.029 | 9,85 | 29.55 | |
| 15 | rs1432975 | 500 | 7028.6 | 1.038 | 9,94 | 29.81 | |
| 16 | rs10879311_CEU | 500 | 7317.8 | 1.078 | 10.32 | 30.97 | |
| 17 | rs864481 | 500 | 7416.9 | 1.092 | 10.45 Uhr | 31.35 | |
| 18 | rs1295687 | 500 | 7447.8 | 1,096 | 10,49 | 31,47 | |
| 19 | rs12644851_CHB | 500 | 7634 | 1.120 | 10,73 | 32,18 | |
| 20 | rs4265409_CHB | 500 | 7926.2 | 1.158 | 11.09 | 33.26 | |
| 21 | rs2927385_CHB | 500 | 7997.2 | 1.167 | 11.17 | 33.52 | |
| 22 | rs1538956_CHB | 500 | 8286.4 | 1.202 | 11,51 | 34,54 | |
| Volumen der PCR Grade Rnase frei H2O, hinzugefügt Primer Pool (µL) | 899.42 | ||||||
Tabelle 7: gut 2 bereinigte Primer verwendet, um repräsentative Ergebnisse zu generieren. Eine Tabelle mit Verlängerung Zündkapseln angepasst durch Größe, einschließlich die Zielkonzentration, die Lautstärke in der Grundierung Pool und Endkonzentration für jede Grundierung Primer-Pool für gut 2 verwendet. Das Volumen des Wassers erforderlich machen, der letzte Band wird am unteren Rand der Tabelle bereitgestellt. Das Gesamtvolumen der Grundierung Pool war 1,5 mL.
| Master Mix | Niedrige Plex (1-18) | Hohen Plex (19-36) | ||
| Reagenz | × 1 | × 410 | × 1 | × 410 |
| (Entionisiertem) Wasser | 0.7395 | 303.195 | 0.619 | 253.79 |
| Puffer | 0,2 | 82 | 0,2 | 82 |
| Kündigung-mix | 0.1 | 41 | 0,2 | 82 |
| Grundierung mischen (LPA angepasst) | 0,94 | 385.4 | 0,94 | 385.4 |
| iPLEX Enzym * | 0.0205 | 8,405 | 0,041 | 16.81 |
| Insgesamt | 2 ΜL | 820 ΜL | 2 ΜL | 820 ΜL |
Tabelle 8: Reagenzien und Konzentrationen für die Erweiterung Reaktion master Mix. In diesem Fall sollte die Volumina für Low-Plex Reaktionen verwendet werden, sind 18 Jahre oder weniger SNPs in den Brunnen. Verwenden Sie für 19 oder mehr SNPs hohe Plex Reaktionen Bände. Dies ist anders als die SNP-Anforderungen der niedrig-Plex und hoch-Plex von Verstärkung PCR master-Mix detailliert in Tabelle 2.
| Thermocycler Bedingungen |
| 94 ° C für 30 s |
| 40 Zyklen (94 ° C 5 s, (5 Zyklen von 52 ° C 5 s, 80 ° C 5-s)) |
| 72 ° C für 3 min |
| 4 ° C halten |
Tabelle 9: Thermocycler Bedingungen für die Erweiterung Reaktion
| Lebensmittel allergisch Fällen Vs nicht-allergische Lebensmittelkontrolle | |||||
| SNP | A1 | P | ODER | L95 | U95 |
| rs1295686 | A | 0,003 | 1.75 | 1.2 | 2.53 |
| rs2243297 | A | 0.13 | 2.1 | 0,8 | 5.51 |
| rs1295687 | G | 0,19 | 1,63 | 0.78 | 3.41 |
| rs2243211 | A | 0,22 | 1,45 | 0,8 | 2,64 |
| rs1295683 | T | 0,25 | 1.32 | 0,82 | 2.13 |
| rs2243248 | G | 0.51 | 1.21 | 0.69 | 2.11 |
| rs2243300 | T | 0.51 | 1.19 | 0,7 | 2.02 |
| rs1800925 | T | 0,6 | 1.11 | 0,75 | 1,63 |
| rs3091307 | G | 0,62 | 1.1 | 0,75 | 1.6 |
Tabelle 10: Variante rs1295686 von der IL13 Locus ist mit Herausforderung erwiesen Nahrungsmittelallergie verbunden. Logistische Regressionsanalyse, bereinigt um Abstammung, Geschlecht und Vorhandensein von Neurodermitis, offenbart dieser Variante rs1295686 ist verbunden mit Herausforderung bewiesen Nahrungsmittel-Allergie in der Entdeckung-Kohorte (n = 367 Fälle und 156 Allergiefreie Kontrollen). Die SNP-Spalte listet die Marker untersucht, die A1-Spalte listet die kleinere Allel, als das Referenz-Allel für den Verein-Test verwendet. Die P-Spalte listet die P-Werte aus der Regressionsanalyse, die OR-Spalte listet die entsprechenden Odds Ratio und L95 und U95 sind die unteren und oberen Grenzen des 95 %-Konfidenzintervalls aus der Analyse. Daten von Ashely Et Al., 20179reproduziert.
| A. Replikation Analyse: Lebensmittel allergische Fälle Vs nicht-allergische Lebensmittelkontrolle | B. Meta-Analyse – Entdeckung und Replikation | ||||||||||
| SNP | A1 | ODER | L95 | U95 | P | P | FALLT | ODER | OR(R) | Q | Ich |
| rs1295686 | A | 1.37 | 1.03 | 1,82 | 0,03 | 0,0005 | 0,0006 | 1.5 | 1.5 | 0,31 | 3.32 |
| rs1295687 | C | 1.1 | 0,68 | 1,78 | 0,7 | 0,3 | 0,3 | 1.24 | 1.24 | 0,38 | 0 |
Tabelle 11: Replikation in einer unabhängigen Bevölkerung bestätigt Assoziation zwischen IL13 Variante rs1295686 und Herausforderung erwiesen Nahrungsmittelallergie. Logistische Regression für Hauptkomponenten Abstammung, Geschlecht und Neurodermitis in einer unabhängigen Bevölkerung korrigiert (n = 203 Lebensmittel allergische Fälle und 330 Allergiefreie Kontrollen) bestätigt die Zuordnung zwischen Variante rs1295686 und Nahrungsmittel-Allergie. Meta-Analyse wurde dann durchgeführt, das höchste Niveau der Beweis für eine Verbindung zwischen der SNP und das Ergebnis, mit wenig Beweis der Heterogenität in Kraft zwischen den beiden Populationen an dieser SNP Größen. Hier die Spalten sind gemäß Tabelle 10, mit zusätzlichen P(R) und OR(R) Werte für die zufälligen Effekten Meta-Analyse Modell Vs die fixierte Effekte-Modell (P und oder). Q und ich sind der P-Wert für die Cochrane-Test und der Index beziehungsweise, beide sind Maßnahmen der Heterogenität in den Effekt-Größen zwischen den Studien. Daten von Ashely Et Al., 20179reproduziert.
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Discussion
Hier zeigen wir die Methode der gemultiplexten Genotypisierung mittels Massenspektrometrie. Die repräsentativen Ergebnisse wurden mittels PCR gepaart mit MALDI-TOF-Massenspektrometrie4 mit Assay Chemie entnehmen Sie bitte der Tabelle der Materialien13generiert. Mit dieser Plattform haben wir insgesamt 11.295 Genotypen auf 1.255 Einzelpersonen für 9 SNPs innerhalb von 40 Stunden im Labor erzeugt.
Wir verdeutlichen den Nutzen der Technik bei der Beantwortung genetische Hypothesen durch Erzeugung und Analyse von SNP Daten für das Kandidaten-gen IL13 in einer Entdeckung klinische Kohorte Wildreben für Nahrungsmittel-Allergie und mit unabhängigen Replikation. Die Plattform ist relativ robust, DNA-Qualität zu senken und erfordert minimale Ausgangsmaterial, die Eingabe von nur 10 ng. Wichtige Schritte im Protokoll Folgendes beinhalten: sorgfältige Problembehandlung für das Test-Design-Prozess zu gewährleisten maximale SNP-Aufnahme in die Multiplex-Assays, erfolgreiche Verstärkung der Zielregionen während der Amplifikation PCR, erfolgreiche Single Nukleotid-Erweiterung während der Verlängerung Reaktion und Laden der Assay und Probe-Platte-Layout in der Analyse-Software, damit die Software genau die Massenspektren Daten zuordnen.
Wie bereits erwähnt ist das Test-Design-Tool kompatibel mit der Verwendung von Maus und bovine Polymorphismen, zusätzlich zu Menschen. Für andere Organismen wie Mikroben oder Pflanze kann "andere" im Menü "Organismus" ausgewählt werden. Die automatisierte Schritte zum proximalen SNPs erkennen und optimale Grundierung Bereiche werden jedoch nicht zur Verfügung.
Während des Entwurfsprozesses proximalen SNP eine optimale Grundierung Gebiets, blockiert eine kann entweder entfernen die SNP vom Design und wählen Sie eine andere in hohen LD (z.B., R2 = 1), oder wählen Sie zwei Zündkapseln, eins mit dem Referenz-design Allel des SNP und eins mit der alternative Allel, entwerfen eine Grundierung mit dem gemeinsamen Allel oder Maskierung der SNP eine universelle Basis (z.B.Inosin). Besteht ein Problem mit der Identifizierung eines einzigartigen Ort für die Grundierung, kann man die Amplifikate Länge um eine einzigartige Stätte finden Einstellungen. Die Standardeinstellung ist 80-120 bp, aber dies kann von 60-400 bp geändert werden. Allerdings ist anzumerken, dass wenn mit degradierten DNA (z. B.aus FFPE Gewebe) arbeiten, es nicht ideal ist, um die Amplifikate Länge zu erhöhen.
Fehler während der Assay-Design-Schritt des Werkzeugs können hohe Haarnadel oder Grundierung Dimer potenzielle enthalten. Beide Einstellungen können gelockert werden, versuchen einen Platz die Entwürfe. Es wird jedoch empfohlen, dass Schwellen nicht unter 0,8 gelockert werden; beginnen Sie mit 0,9 zu sehen, ob diese Einstellung ausreichend ist, um die SNPs zu retten und auf 0,8 nur bei Bedarf zu reduzieren. In den erweiterten Einstellungen ist es möglich, ändern Sie die Anzahl der Design-Iterationen (bis 10) unter der Registerkarte " Multiplex " "4." Design-Assays"sowie die besten Iteration Auswahlkriterien zu Höchsten durchschnittlichen Multiplex oder Wenigsten ablehnt durch Low-Plex. Erhöhung der Anzahl der Design-Iterationen kann vorteilhaft sein, weil das Tool dauert die erste SNP in der Reihenfolge sie wurden zur Verfügung gestellt und einen Test zu entwerfen. Dann prüft er ob die nächsten SNP kompatibel zum gleichen Multiplex-Test ist. Damit die Reihenfolge der SNPs Angelegenheit. Mehrere Iterationen die Option aktiviert wird die Software zufällige Reihenfolge der SNPs und versuchen anderen Iterationen. Dies kann die Zahl der SNPs in der Lage, in jeder Multiplex gestaltet werden oder kann der SNP Ausschuss verringern. Allerdings wird es auch Zeit Kosten, kommen, wie das Design-Werkzeug in diesem Schritt viel länger dauern wird.
Gemultiplexten Genotypisierung ist eine schnelle und kostengünstige Ansatz zur Untersuchung der Loci von Interesse. Die Methode ist optimiert und erlaubt den Betrieb von rund 760 Proben von bis zu 40-Plex SNPs in 10 Stunden, schönem Zehntausende von Genotypen in weniger als einem Tag14generiert werden. Der Massenspektren können leicht von der Plattform bereitgestellten Tools analysiert werden.
Einige Einschränkungen auf der Plattform gehören einen geschätzten Schaden von ca. 5-10 % der SNPs, die Test-Design-Prozess fehl. Dies kann manchmal durch Auswahl eines alternativen Tag oder Proxy SNP korrigiert werden. Die Broad Institute SNP Annotation und Proxy Suche (SNAP) Datenbank ist ein solches Tool, das erleichtert die Identifizierung des Proxy SNPs15. Eine weitere Einschränkung des Systems ist, dass es eine gezielte Plattform und also nicht für umfangreiche neuartige Entdeckung erlaubt, wie mit genomweite Ansätze erreicht. Darüber, wie der Ansatz Tag-SNP Proxys verwendet, um die Berichterstattung über Gene zu maximieren, Fine-Mapping-Studien anschließend erforderlich sein, um die präzise kausale Variante zu ermitteln.
Gemultiplexten Genotypisierung ist immer noch eine nützliche Plattform für das Verhör der Krankheit verbundenen SNPs in GWA Studie Ansätze oder Hypothese getrieben Kandidat und Weg gen Exploration identifiziert. Zukünftige Anwendungen für die Plattform dürften neue Verwendungen für Diagnose und Screening in Bereichen wie Krebs und klinische Virologie. Insgesamt ist gemultiplexten Genotypisierung mit Massenspektrometrie eine schnelle, kostengünstige und zuverlässige Medium-Durchsatz-Methode zur Genotypisierung Kandidat Loci.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Die Autoren haben keine Bestätigungen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Genomic DNA | - | - | 1 μL at a concentration of 5-10 ng/μL |
| Primers: forward and reverse amplification and extension | IDT | - | see manuscript section 1.2.1 on design of primers |
| Deionized water | E.g. Milli-Q water | - | deionized with 18.2 MΩ.cm resistivity |
| Genotyping reagent kit. iPLEX Gold Chemistry reagent set | Agena Bioscience | #10148-2 | includes all reagents for reactions in 2.2.1, 2.3.1 and 2.4.2 , chip and resin |
| PCR plates (384-well) | Abgene | #ABGAB-1384 | For the MassARRAY system plates by Abgene are compatible |
| Micropipettes | single and 8-channel | ||
| Centrifuge | compatible with 384-well plates | ||
| Thermocycler | compatible with PCR programs as detailed in 2.2.4, 2.3.2 and 2.4.3 | ||
| Dimple resin plate | Agena Bioscience | 6mg, 384-well | |
| Plate rotator | |||
| MassARRAY Analyzer 4 System | Agena Biosciences | MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption/ionization – time of flight) Mass Spectrometer. | |
| RS1000 Nanodispenser | Agena Biosciences | ||
| Assay Design Suite | Agena Biosciences | Tool used to design the multiplex genotyping assays | |
| Hot Start Taq | DNA polymerase enzyme | ||
| Resin | Agena Biosciences | Supplied with iPLEX kit |
References
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