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Genetics

मल्टीप्लेक्स Genotyping और जनसंचार स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ नैदानिक पलटन अध्ययन में उंमीदवार जीन परीक्षण

Published: June 21, 2018 doi: 10.3791/57601
Automatic Translation
1,2, 2,3, 2,3,4, 2,3,5
1Molecular Genetics of Chronic Inflammation and Allergic Disease, Max-Delbrück Center for Molecular Medicine, 2Murdoch Childrens Research Institute, 3Department of Paediatrics, University of Melbourne, 4Centre for Social and Early Emotional Development, Faculty of Health, Deakin University, 5Department of Paediatrics, University of Western Australia

Summary

जटिल मानव रोग के लिए योगदान आनुवंशिक वेरिएंट की पहचान हमें उपंयास तंत्र की पहचान करने के लिए अनुमति देता है । यहां, हम उंमीदवार जीन या जीन मार्ग विश्लेषण के लिए एक मल्टीप्लेक्स genotyping दृष्टिकोण है कि कम कीमत पर कवरेज अधिकतम और पलटने के लिए उत्तरदाई है आधारित अध्ययन का प्रदर्शन ।

Abstract

जटिल रोगों अक्सर कई आम आनुवंशिक वेरिएंट है कि रोग संवेदनशीलता में योगदान द्वारा टिकी हैं । यहां, हम मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ एक मल्टीप्लेक्स genotyping परख का उपयोग कर एक लागत प्रभावी टैग एकल न्यूक्लियोटाइड बहुरूपता (SNP) दृष्टिकोण का वर्णन, नैदानिक साथियों में जीन मार्ग संघों की जांच करने के लिए । हम एक उदाहरण के रूप में खाद्य एलर्जी उंमीदवार लोकस Interleukin13 (IL13) की जांच । यह विधि एक क्षेत्र के भीतर साझा संपर्क संतुलन (LD) का लाभ लेने के द्वारा कवरेज को कुशलतापूर्वक अधिकतम कर लेती है । चयनित LD SNPs तो एक मल्टीप्लेक्सित परख में डिजाइन किए हैं, ४० अलग SNPs को सक्षम करने के लिए एक साथ विश्लेषण किया जाएगा, लागत प्रभावशीलता बढ़ाने । पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) लक्ष्य loci बढ़ाना, एकल न्यूक्लियोटाइड विस्तार के बाद किया जाता है, और amplicons तो मैट्रिक्स का उपयोग कर मापा जाता है-असिस्टेड लेजर desorption/ionization-उड़ान के समय (मालदी-तोफ) मास स्पेक्ट्रोमेट्री । कच्चे उत्पादन जीनोटाइप कॉलिंग सॉफ्टवेयर के साथ विश्लेषण किया है, कड़े गुणवत्ता नियंत्रण परिभाषा और कट-नापसंद का उपयोग कर, और उच्च संभाव्यता पादी निर्धारित कर रहे है और डेटा विश्लेषण के लिए उत्पादन ।

Introduction

मानव जटिल रोग में, आनुवंशिक वेरिएंट रोग संवेदनशीलता के लिए योगदान और इन वेरिएंट रोगजनन समझने के लिए उपयोगी हो सकता है, उच्च जोखिम रोगी समूहों की पहचान, और उपचार प्रतिक्रियाएँ. दरअसल, परिशुद्धता दवा का वादा रोगी उपसमूह1की पहचान करने के लिए जीनोमिक जानकारी का उपयोग करने पर निर्भर है । दुर्भाग्य से, जटिल रोग जीवविज्ञान अंतरिक्ष के भीतर, जहां रोग phenotypes पर्याप्त आनुवंशिक विविधता, कम penetrance, और चर expressivity द्वारा टिकी हैं, के जीनोम के लिए आकार आवश्यकताओं-व्यापक दृष्टिकोण उपंयास की पहचान करने के लिए प्रत्याशी अक्सर बड़े2नकारात्मक स्तर तक हैं । वैकल्पिक रूप से, एक लक्षित उंमीदवार जीन दृष्टिकोण विशिष्ट जीन के बारे में एक प्राथमिकताओं परिकल्पना के साथ शुरू होता है/ मार्ग विश्लेषण उपकरण सामांयतः एक पहचान लक्ष्य loci के pathophysiology की जांच करने के लिए उपयोग किया जाता है, कई उंमीदवार रास्ते पैदा करने के लिए पता लगाया जाएगा । हम यहां एक मल्टीप्लेक्स genotyping एक परख के साथ SNPs के सैकड़ों के लिए दसियों की जांच के लिए अनुमति दृष्टिकोण, मानव पलटन4अध्ययन के लिए उपयुक्त प्रदर्शन । इस दृष्टिकोण के माध्यम से अपेक्षाकृत उच्च रखा है, डीएनए नमूनों के हजारों के लिए सैकड़ों की अनुमति उपंयास खोज अध्ययन और विशिष्ट रास्ते की जांच के लिए genotyped हो । यहां उल्लिखित विधियों में एक अपेक्षाकृत तेजी से और सस्ती तरीके से नैदानिक लक्षण के साथ जोखिम alleles और उनके संघों की पहचान करने के लिए उपयोगी होते हैं । इस मंच को स्क्रीनिंग और नैदानिक प्रयोजनों के लिए किया गया है अत्यधिक लाभप्रद5,6, और अधिक हाल ही में, माइक्रोबियल संक्रमण के लिए7 और मानव papillomavirus8।

इस प्रोटोकॉल जांच के लिए जीन का एक सेट के चयन के साथ शुरू होता है, अर्थात्, लक्षित क्षेत्रों, आमतौर पर खोज साहित्य, या रोग की प्रक्रिया में शामिल होने के लिए एक प्राथमिकताओं परिकल्पना के माध्यम से निर्धारित; या शायद एक डिस्कवरी जीनोम चौड़ा एसोसिएशन (GWA) के अध्ययन के अग्रणी संघों के रूप में प्रतिकृति के लिए चुना है । जीन सेट से शोधकर्ता टैग SNPs की एक परिष्कृत सूची का चयन करेंगे । अर्थात, लिंकेज संतुलन (LD), या सहसंबंध, क्षेत्र में भिन्न प्रकार के बीच में एक प्रतिनिधि ' टैग SNP ' SNPs के एक समूह के लिए उच्च LD, एक haplotype के रूप में जाना जाता है की पहचान करने के लिए उपयोग किया जाता है । इस क्षेत्र के उच्च LD का मतलब है कि SNPs अक्सर एक साथ इस तरह विरासत में मिला है कि genotyping एक SNP सभी SNPs में haplotype में भिंनता का प्रतिनिधित्व करने के लिए पर्याप्त है । वैकल्पिक रूप से, यदि कई क्षेत्रों से SNPs की एक निश्चित सूची पर निंनलिखित, उदाहरणके लिए, एक GWA अध्ययन के लिए प्रतिकृति, इस प्रक्रिया को अनावश्यक हो सकता है । के लिए मल्टीप्लेक्स genotyping, एक परख तो इन लक्ष्यों के आसपास डिजाइन किया जाना चाहिए ऐसी है कि प्रवर्धन प्राइमर विस्तार प्राइमरों और उत्पादों के लिए व्याख्यात्मक मास स्पेक्ट्रा उत्पादन के उन लोगों के लिए जन भिंन के हैं । इन मापदंडों को आसानी से एक मल्टीप्लेक्स genotyping परख डिजाइन उपकरण द्वारा कार्यांवित कर रहे हैं । इस डिजाइन से आगे और रिवर्स प्राइमरों के लिए ब्याज के मार्कर लक्ष्य और SNP युक्त अनुक्रम बढ़ाना इस्तेमाल किया जाएगा । विस्तार प्राइमरों सीधे SNPs और एक एकल, जन संशोधित, ' टर्मिनेटर ' आधार है कि SNP के पूरक है संलग्न जोड़ दिया जाता है । टर्मिनेटर बेस डीएनए के आगे विस्तार को रोकता है । जन-आधार के संशोधन के एक एकल आधार से भिंन टुकड़ों में सक्षम बनाता है जन स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा पता लगाया जाएगा । genotyping रसायन युक्त थाली तो एक मास स्पेक्ट्रोमेट्री मंच पर माप के लिए एक चिप के लिए लागू किया जाता है । कच्चे genotyping कॉल प्रणाली द्वारा पता चला उचित गुणवत्ता नियंत्रण लागू करने के बाद, डेटा और निर्यात किया जा सकता है सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए इस्तेमाल के लिए रोग phenotypes के साथ सहयोग के लिए परीक्षण ।

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Protocol

यहां उपयोग की जाने वाली आनुवंशिक सामग्री को कार्यालय द्वारा बच्चों के लिए HREC (मानव अनुसंधान आचार समिति) (CDF/07/492), मानव सेवा विभाग HREC (10/07) और रॉयल चिल्ड्रन अस्पताल (RCH) HREC (२७०४७) के उपयोग के लिए नैतिक रूप से अनुमोदित किया गया था ।

1. मल्टीप्लेक्स की डिजाइनिंग परख

  1. परख डिजाइन के लिए एक SNP सूची तैयार करें ।
    1. इनपुट Haploview (https://www.broadinstitute.org/haploview/downloads) के tagger समारोह में लक्ष्य क्षेत्र । SNPs की एक सूची बनाने के लिए लक्ष्य क्षेत्र में फैले SNPs के बीच LD (सहसंबंध, आर2) का उपयोग करें, जो वांछित क्षेत्र की आवश्यक वेरिएंट की संख्या के साथ पूर्ण कवरेज प्रदान करता है । किसी यूज़र-डिफ़ाइंड थ्रेशोल्ड (उदा., r2 ≥ ०.८) से संबंधित सभी alleles को कैप्चर करने के लिए SNPs की एक सूची जनरेट करें ।
  2. फॉरवर्ड, रिवर्स, और एक्सटेंशन प्राइमरों के लिए उपयुक्त दृश्यों की पहचान
    1. चुनाव की परख डिजाइन उपकरण में SNPs की सूची उत्पंन दर्ज करें ।
      नोट: निंनलिखित निर्देश परख डिजाइन के लिए प्रतिनिधि परिणाम उत्पंन करते थे उपकरण के लिए लागू होते हैं, के रूप में सामग्री की तालिकामें निर्दिष्ट ।
    2. एक बार परख डिजाइन उपकरण शुरू किया गया है, नई Genotyping डिजाइनका चयन करें । डिज़ाइन नाम फ़ील्ड में परख डिज़ाइन के लिए कोई नाम दर्ज करें ।
    3. SNP सूची प्रदान करें बटन पर क्लिक करके 1.1.1 कदम के लिए निर्देश रुपये या बटन के बाईं ओर फसता के साथ संपादित पाठ इनपुट लेबल ।
      नोट: SNPs संदर्भ (rs) SNP IDs की एक पाठ सूची के रूप में दर्ज किया जा सकता या फसता स्वरूप, या उपकरण द्वारा उपयोग किया गया SNP समूह फ़ाइल स्वरूप में अपलोड किया गया । इन स्वरूपों में फ़ाइलें अपलोड करने के लिए, फ़ाइल अपलोड बटन का चयन करें । वेरिएंट की ऊपरी सीमा है कि एक एकल परख में डिजाइन किया जा सकता है, ' अच्छी तरह से, ' ४० SNPs है । यह SNPs कि चलाने शुरू करने से पहले डिजाइन के लिए एक प्राथमिकता है निर्दिष्ट करने के लिए संभव है; इन्हें पहले डिजाइन किया जाएगा । नियंत्रण SNPs निर्दिष्ट किया जा सकता है: उदाहरण के लिए, एक परख नमूना मिश्रण अप या एक नियंत्रण के मामले में लिंग का पता लगाने के लिए निर्धारित है कि पर्याप्त टेंपलेट अगर कम या गरीब गुणवत्ता डीएनए के साथ काम कर जोड़ा गया था । हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि नियंत्रण और प्राथमिकता SNPs का उपयोग SNPs कि एक अच्छी तरह से डिजाइन किया जा सकता है की संख्या को कम कर सकते हैं ।
    4. प्रीसेट मेनू से, उच्च division iPLEX प्रीसेट विकल्प का चयन करें । जीव मेनू से, उस जीव का चयन करें जिसमें से डीएनए genotyped किया जाना है । प्रतिनिधि के लिए यहां प्रस्तुत परिणाम, यह मानव था ।
      नोट: माउस और गोजातीय जीवों को भी उपकरण के साथ संगत कर रहे हैं । एक भी अंय का चयन कर सकते है अगर एक वैकल्पिक जीव जैसे संयंत्र या सूक्ष्म जीव के साथ काम कर; हालांकि, समीपस्थ SNPs और इष्टतम प्राइमरी क्षेत्रों को खोजने के लिए स्वचालित कदम एक संदर्भ जीनोम के अभाव के कारण उपलब्ध नहीं होगा ।
    5. डेटाबेस मेनू पर, जीनोम के नवीनतम बिल्ड का चयन करें, या एक वैकल्पिक निर्माण यदि आवश्यक हो, रसायन विज्ञान मेनू से. iPLEX का चयन करें और मल्टीप्लेक्स स्तर फ़ील्ड के लिए, मल्टीप्लेक्स का उच्चतम स्तर दर्ज करें: ४०. अब, चुनें शुरू भागो। "उपकरण के चरण 1" शुरू होगा ।
      नोट: चरण 1 के दौरान, उपकरण पुनर्प्राप्त करता और SNP अनुक्रम स्वरूपित करता है । यहाँ, त्रुटियों में फसता फ़ाइल का स्वरूपण शामिल हो सकता है, जिस स्थिति में फसता फ़ाइल को आवश्यकतानुसार जाँचा और पुन: स्वरूपित किया जाना चाहिए. एक अन्य त्रुटि SNP रुपये संख्या है, जो एक और रुपये नंबर के साथ विलय कर दिया गया है, जिस स्थिति में रुपये संख्या एक SNP डेटाबेस में खोजा जाना चाहिए जैसे NCBI के dbSNP नए SNP रुपये संख्या की पहचान करने के लिए. SNP के आसपास अनुक्रम किसी भी ज्ञात समीपस्थ SNPs कि प्राइमर डिजाइन के साथ हस्तक्षेप कर सकता है के लिए खोज कर रहे हैं । संभावित पीसीआर प्राइमर साइटों जीनोम के खिलाफ तुलना गैर विशिष्ट जीनोम में कई हिट के कारण प्रवर्धन से बचने के लिए कर रहे हैं ।
    6. जो समीपस्थ SNPs पहचान की जाएगी डिजाइन उपकरण के "चरण 2" के पूरा होने का इंतजार है ।
      नोट: यदि एक जीव है कि इस कदम से समर्थित नहीं है का उपयोग कर, आईयूपीएसी एनोटेशन में समीपस्थ SNPs के साथ अनुक्रम व्याख्या अगर यह जानकारी उपलब्ध है । इस चरण के दौरान बहुत कम त्रुटियां हैं; हालांकि, गलत संदर्भ जीव या जीनोम का चयन किया गया था, या यदि सीडीएनए अनुक्रम जीनोमिक डीएनए के बजाय दर्ज किए गए थे, तो त्रुटियाँ हो सकती हैं । चरण 2 को ऑप्टिमाइज़ करने के लिए, उन्नत सेटिंग के अंतर्गत, किसी विशिष्ट जनसंख्या में कार्य करते हुए जनसंख्या के आधार पर SNPs को फ़िल्टर करना संभव है. दुर्लभ SNPs भी 1% से नीचे एक आवृत्ति के साथ उन लोगों को छोड़कर द्वारा फ़िल्टर किया जा सकता है । अंत में, SNPs कि एक मांय स्थिति नहीं है या जनसंख्या जानकारी नहीं है भी अगर वांछित बाहर रखा जा सकता है ।
    7. डिजाइन उपकरण है कि इष्टतम प्राइमर क्षेत्रों की पहचान के "चरण 3" के पूरा होने का इंतजार है । यदि पसंदीदा प्राइमर स्थानों की पहचान की गई है, या यदि एक अलग जीव के साथ काम कर रहे, मैंयुअल रूप से इनपुट अनुक्रम व्याख्या (SNP समूह फ़ाइलें) अपरकेस में पसंदीदा प्राइमर क्षेत्रों और अनुक्रम के आराम के साथ कम मामले, इस चरण के लिए उंनत सेटिंग्स मेनू से रक्षित करें चुनें ।
      नोट: चरण 2 और 3 के लिए त्रुटियों में शामिल हो सकते हैं: (1) एक समीपस्थ SNP एक गैर के साथ मुखौटा करने के लिए किया जा रहा समाधान के साथ एक किताब के डिजाइन अवरुद्ध, आधार टेम्पलेट और Isonine की तरह एक सार्वभौमिक आधार के साथ एक oligo आदेश, या, डिजाइन दो प्राइमरों, proxim के alleles में से प्रत्येक के साथ एक अल SNP, या, डिजाइन आम एलील के साथ ही एक किताब । (2) एक अंय आम त्रुटि के लिए amplicon लंबाई को संशोधित करने के लिए एक अद्वितीय साइट की पहचान करने के लिए किया जा रहा समाधान के साथ प्राइमर के लिए एक अद्वितीय साइट की पहचान विफलता है । इस पेपर के लिए प्रयुक्त उपकरण में, डिफ़ॉल्ट है ८०-१२० bp । यह "3 में Amplicon लंबाई सेटिंग्स के अंतर्गत उन्नत सेटिंग्स संवाद में ६०-४०० बीपी से बदला जा सकता है । की पहचान इष्टतम प्राइमर क्षेत्रों "और भी Amplicon टैब के तहत" 4 । डिजाइन परख । सुनिश्चित करें कि दोनों बदल रहे हैं । हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि amplicon की लंबाई बढ़ाने जब अपमानित डीएनए का उपयोग अनुशंसित नहीं है ।
    8. परख डिजाइन कदम के पूरा होने का इंतजार ("चरण 4" डिजाइन उपकरण के), यहां उपकरण के लिए विस्तार प्राइमरों और मल्टीप्लेक्स डिजाइन में सभी SNPs के alleles के बीच इष्टतम पास जुदाई प्रदान करना है । इस चरण के पूरा होने के बाद, Oligo आदेश फ़ाइल, जो पसंद के एक Oligo आदेश विक्रेता के माध्यम से आसान आदेश देने के लिए स्वरूपित है निर्यात करें ।
      नोट: प्रवर्धन प्राइमर (फॉरवर्ड (एफ) और रिवर्स (आर)) के लिए ८० १२० बीपी के लिए एक इष्टतम amplicon आकार का उत्पादन करने के लिए डिज़ाइन कर रहे हैं । प्रवर्धन प्राइमर मास बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रम में परस्पर विरोधी परिणामों से बचने के लिए और समग्र पीसीआर प्रदर्शन के लिए एक्सटेंशन प्राइमर और उसके उत्पाद से अलग होना चाहिए । एक्सटेंशन प्राइमर 15 से 30 न्यूक्लियोटाइड लंबी (४,५००-९,००० डीए), ताकि 3 ' अंत बहुरूपता की साइट के लिए सीधे आसंन संलग्न होगा डिजाइन किया जाना चाहिए । इन सेटिंग्स के सभी स्वचालित रूप से प्रतिनिधि परिणाम उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया उपकरण में सेट कर रहे हैं.
  3. एक oligomer प्रदाता से चुना उपकरण और आदेश प्राइमरों से डिजाइन निर्यात: पीसीआर प्राइमरों में से प्रत्येक के 25 nmol (आगे और रिवर्स), और १०० एक्सटेंशन प्राइमरों में से प्रत्येक के nmol । के लिए प्रतिनिधि परिणाम उत्पंन करने के लिए इस्तेमाल प्राइमरों के लिए 1 तालिका देखें ।

2. Genotyping (1-2 दिन)

  1. प्रवर्धन प्राइमरों तैयार करते हैं ।
    1. यदि lyophilized प्राइमरों के आदेश दिए गए, आणविक ग्रेड पानी के साथ पुनर्गठन । आगे और रिवर्स प्राइमरों के लिए १०० माइक्रोन/μL की एकाग्रता का उपयोग करें और विस्तार के लिए ५०० माइक्रोन/μL ।
    2. पूल आगे और रिवर्स एक शेयर प्राइमरी मिश्रण में प्रत्येक मल्टीप्लेक्स परख के लिए प्राइमरों, ०.५ mM की एकाग्रता में प्रत्येक पुस्तक युक्त ।
      नोट: उदाहरण के लिए, ४०० प्रतिक्रियाओं के लिए एक ४०० μL प्राइमर पूल:
      Equation
      प्रत्येक किताब के 2 μL, १०० माइक्रोन/μL की एकाग्रता में, स्टॉक प्राइमर पूल के लिए आवश्यक है । ६० आगे और रिवर्स प्राइमरों के साथ एक 30-plex परख के लिए, प्राइमर के १२० μL की कुल (केंद्रित प्राइमरी पूल) की आवश्यकता होगी । २८० μL आणविक ग्रेड पानी तो प्राइमर मिश्रण के ४०० μL के एक अंतिम मात्रा बनाने के लिए जोड़ा जाएगा ।
  2. पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) का उपयोग कर वर्धन
    1. इसके बाद के संस्करण विस्तृत, dNTPs के ५०० माइक्रोन, 2 MgCl2मिमी, और एक डीएनए पोलीमरेज़ एंजाइम के ०.५ यू के १०० समुद्री मील की दूर मिश्रण युक्त पीसीआर के लिए एक मास्टर मिश्रण बनाओ । 1 यू से अधिक के लिए आवश्यक है 26-plex परख । तालिका 2का संदर्भ लें ।
    2. इस मिश्रण के 4 μL जोड़ें ३८४ की एक अच्छी तरह से पीसीआर प्लेट के लिए, साथ में जीनोमिक डीएनए के 1 μL की एकाग्रता पर 5-10 एनजी/μL ।
      नोट: गुणवत्ता नियंत्रण भी प्लेट पर शामिल किया जाना चाहिए, जैसे कि एक गैर-टेम्पलेट नियंत्रण, और एक सकारात्मक नियंत्रण पहले अच्छी तरह से परख के साथ प्रदर्शन किया है (एक परीक्षण रन के दौरान). कई प्लेटों चल रहा है, अन्य प्लेट (ओं) से कई डीएनए नमूने, जैसे, तपसिल में, इंटर प्लेट परिवर्तनशीलता के लिए तकनीकी नियंत्रण के रूप में चलाया जाना चाहिए.
    3. सभी तरल प्लेट कुओं के नीचे निहित है सुनिश्चित करने के लिए जगह में एक थाली कवर के साथ कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए २०० x g पर थाली केंद्रापसारक ।
    4. निंनलिखित thermocycler शर्तों के साथ पीसीआर भागो: ९४ ° c पर 4 मिन मशीन डीएनए पोलीमरेज़ को सक्रिय करने के लिए; निम्नलिखित में से ४५ चक्र (20 एस के लिए ९४ डिग्री सेल्सियस पर विकार, 30 एस के लिए ५६ डिग्री सेल्सियस पर एनीलिंग, और 1 मिनट के लिए ७२ ° c पर विस्तार) और फिर 3 मिनट के लिए ७२ ° c पर एक अंतिम विस्तार । तालिका 3में पीसीआर प्रोग्राम देखें ।
    5. प्रदर्शन agarose जेल ट्रो डीएनए प्रवर्धन सुनिश्चित करने के लिए सफल है । एक 2% (डब्ल्यू/वी) agarose जेल, मिश्रण agarose पाउडर और ०.५% Tris बोराटे EDTA (TBE) बफर, और १०० वी पर ४५ मिनट के लिए चलाने पर (के साथ 3 µ एल लोडिंग बफर के) 1 µ l का उपयोग करें ।
  3. चिंराट क्षारीय फॉस्फेट (एसएपी) शुद्धि कदम
    नोट: यह चरण unन्यूक्लियोटाइडed निकालने के लिए उपयोग किया जाता है । एसएपी एंजाइम फॉस्फेट समूहों के लिए आगामी विस्तार प्रतिक्रिया में दखल देने से अतिरिक्त प्राइमर और undNTPs को रोकने के लिए सट ।
    1. चिंराट alkaline फॉस्फेट (एसएपी) एंजाइम, 10x एसएपी बफर की १.७ इकाइयों/μL युक्त एक मास्टर मिश्रण बनाने के लिए और आणविक ग्रेड पानी के साथ मात्रा करने के लिए बनाते हैं । तालिका 4का संदर्भ लें ।
    2. पहले से ही पीसीआर रिएक्शन से 5 μL युक्त, प्लेट के प्रत्येक कुआं के लिए ताजा बनाया एसएपी मास्टर मिश्रण के 2 μL जोड़ें । केंद्रापसारक संक्षेप में और ४० मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर thermocycler के लिए वापस और फिर ८५ डिग्री सेल्सियस पर एंजाइम निष्क्रियता के लिए 5 मिनट के लिए । तालिका 5का संदर्भ लें ।
  4. प्राइमरी एक्सटेंशन रिएक्शन
    नोट: एक्सटेंशन प्राइमरी मिश्रण में एक्सटेंशन प्राइमरों की एकाग्रता आकार द्वारा समायोजित किया जाना चाहिए (रैखिक प्राइमरी समायोजन-LPA). ऐसा इसलिए है क्योंकि पीक तीव्रता में व्युत्क्रम संबंध (मास स्पेक्ट्रा पर) और उत्पाद द्रव्यमान होता है । विस्तार प्राइमर एकाग्रता के समायोजन के लिए समान तीव्रता की चोटियों का उत्पादन करने के लिए इस रिश्ते के लिए सही है । समायोजित प्राइमरों के प्रतिनिधि परिणाम उत्पंन करने के लिए इस्तेमाल किया 6 और 7 सारणीमें प्रदान की जाती हैं । प्रदान की मात्रा के लिए एक्सटेंशन प्राइमरी मिश्रण के १.५ मिलीलीटर उत्पंन कर रहे हैं ।
    1. एक ढाल एल्गोरिथ्म, Agena से उपलब्ध का उपयोग कर एक प्राइमरी के लिए कमजोर पड़ने कारकों की गणना (' रैखिक प्राइमरी ' समायोजन), जो प्राइमर के बड़े पैमाने पर और एकाग्रता के लिए समायोजित कर देता है, और मल्टीप्लेक्स की प्रतिक्रिया में प्राइमरों की कुल संख्या (देखें 6 & 7 तालिकाएं) । रैखिक प्राइमर समायोजन शीट के UEP_MASS क्षेत्र में प्रत्येक प्राइमर के लिए UEP मास दर्ज करें ।
      नोट: प्राइमर के लिए जन समायोजित एकाग्रता स्वचालित रूप से हैडर पाठ "लक्ष्य प्रतिक्रिया एकाग्रता (µ एम) के साथ सेल में गणना की जाएगी." प्राइमर की मात्रा प्राइमरी पूल में जोड़ा जा करने के लिए शीर्षक पाठ के तहत सेल में उत्पादन किया जाएगा "मात्रा स्टॉक प्राइमर पूल में जोड़ा जा करने के लिए (µ एल)." पानी की मात्रा को प्राइमरी पूल में जोड़ा जा करने के लिए गणना की सांद्रता अप करने के लिए सेल के अगले पाठ के लिए आउटपुट है "पीसीआर ग्रेड RNase नि: शुल्क एच2ओ की मात्रा प्राइमरी पूल (µ एल) जोड़ा जा करने के लिए."
    2. रैखिक प्राइमर समायोजन फ़ाइल में निर्दिष्ट के रूप में प्रत्येक पुस्तक की मात्रा ले लो और एक प्राइमरी पूल बनाते हैं । चरण 2.4.1 में निर्धारित के रूप में प्राइमरी पूल पतला करने के लिए एल्गोरिथ्म द्वारा गणना की पानी की मात्रा जोड़ें ।
      नोट: यदि ग्रेडिएंट एल्गोरिथ्म पद्धति अनुपलब्ध है, तो किसी अन्य विधि में प्राइमरों को कम मास और उच्च मास में विभाजित करना और कम मास ग्रुप के सापेक्ष उच्च मास प्राइमरों की एकाग्रता को जोड़ना है. तीन या चार समूहों के लिए एक उच्च plex परख की आवश्यकता हो सकती है (है कि, अधिक से अधिक 19 SNPs) । हालांकि, इस विधि के रूप में इष्टतम कॉल दर ग्रेडिएंट एल्गोरिथ्म विधि के रूप में yield नहीं होगा ।
    3. एक्सटेंशन मास्टर मिक्स इकट्ठा । कम plex परख (1-18 plex) के लिए, बफर के ०.२ μL जोड़ने, समाप्ति मिश्रण के ०.१ μL, μL समायोजित प्राइमर मिश्रण के ०.९४ LPA, और एंजाइम के ०.०२०५ μL (बर्फ पर तैयार) । उच्च plex परख (19-36 plex) के लिए, समाप्ति मिश्रण और एंजाइम (समाप्ति मिश्रण ०.२ μL और iPLEX एंजाइम ०.०४१ μL) के दोहरे एकाग्रता जोड़ें । तालिका 8का संदर्भ लें ।
    4. पिछली प्रतिक्रिया से प्लेट में एक्सटेंशन रिएक्शन मास्टर मिक्स के 2 μL जोड़ें, अब अच्छी तरह से 9 μL के लिए कुल मात्रा ला । thermocycler में संक्षेप में और जगह केंद्रापसारक: ९४ ° c एक 30 एस प्रारंभिक मशीन के लिए, 5 एस के लिए 1 x ९४ ° c के ४० चक्र 5 के लिए x (५२ ° c 5 एस के लिए, ८० डिग्री सेल्सियस के बाद 5 एस के लिए), और उसके बाद के लिए ७२ ° c 3 min. के लिए तालिका 9देखें ।
  5. राल शुद्धि ।
    नोट: अतिरिक्त लवण अब राल के उपयोग के साथ प्रतिक्रिया से हटाया जा सकता है ।
    1. पुनर्प्राप्त की गई प्लेट के कुओं में पानी के 16 μL, 25 μL तक प्लेट में मात्रा लाने के लिए जोड़ें ।
    2. राल लागू करें, आम तौर पर 6 डिंपल राल प्लेट की मिलीग्राम (अलग से खरीदा), समान रूप से पूरी थाली के लिए. प्रतिक्रिया प्लेट के लिए आवेदन करने से पहले कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए राल डिंपल प्लेट में सूखा छोड़ दें । राल के अलावा के बाद, या तो हाथ से या एक धीमी गति (जैसे, ७.५ rpm) पर एक निलंबन मिक्सर के साथ कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए थाली घुमाएँ ।
      नोट: genotyping चिप पर genotyping analyte लोड करने से पहले, नमूनों और परख लेआउट सॉफ्टवेयर इंटरफ़ेस में इनपुट होना चाहिए । यह परख डिजाइन उपकरण से डिजाइन सारांश फ़ाइल का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है ।
  6. एक मास स्पेक्ट्रोमेट्री मंच पर माप।
    1. 5 मिनट के लिए ३,२०० x जी में प्लेट केंद्रापसारक मास स्पेक्ट्रा चिप के लिए राल के आवेदन से बचने के लिए ।
    2. रन करने से पहले सिस्टम के सॉफ्टवेयर इंटरफेस के लिए नमूनों की प्लेट लेआउट अपलोड करें ।
      नोट: चरण 2.6.3 केवल प्रशिक्षित कर्मियों द्वारा किया जाना चाहिए ।
    3. genotyping analyte मिश्रण प्लेट से genotyping चिप के लिए एक वितरण प्रणाली के साथ लागू होते हैं । अगले, मालदी पर चिप लोड-तोफ प्रणाली analyte मिश्रण है, जो तब है मंच सॉफ्टवेयर अंतरफलक की सहायता से व्याख्या की जा सकती से बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रा उत्पंन करने के लिए ।
      नोट: प्रणाली ' प्रत्येक पैड पर यूवी प्रकाश की छोटी दालों निर्देशन, ' genotyping प्लेट की एक अच्छी तरह से, मास स्पेक्ट्रा चिप के लिए इसी के द्वारा बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रा उत्पंन करता है । इस पल्स desorption और analyte के ionization में परिणाम है । ये, डीएनए अणुओं तो एक उच्च वोल्टेज इलेक्ट्रोस्टैटिक क्षेत्र से वैक्यूम ट्यूब के शीर्ष करने के लिए चालित कर रहे हैं, बाहर हल्का आयनों, जो तेजी से यात्रा और डिटेक्टर पहले तक पहुंचने, भारी आयनों से अलग । इन analytes के "उड़ान के समय" प्रणाली द्वारा दर्ज की गई हैं, जहां से प्रत्येक डीएनए टुकड़ा के द्रव्यमान निर्धारित किया जा सकता है और इस प्रकार SNP पर मौजूद न्यूक्लियोटाइड आधार आस्थगित किया जा सकता है ।

3. Genotyping डेटा

नोट: गुणवत्ता नियंत्रण और डेटा व्याख्या इस पद्धति कागज का ध्यान केंद्रित नहीं कर रहे हैं । हालांकि, निंनलिखित संक्षेप में बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रा की व्याख्या को कवर किया जाएगा ।

  1. मैनुअल निरीक्षण और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रा की गुणवत्ता नियंत्रण ।
    नोट: कच्चे जन स्पेक्ट्रा प्रणाली द्वारा उत्पंन कर रहे है और सॉफ्टवेयर के साथ विश्लेषण के रूप में सामग्री की तालिकामें सूचीबद्ध । एक गाऊसी मिश्रण clustering विधि इस आउटपुट के लिए संभाव्य genotyping कॉल करने के लिए लागू किया जाता है ।
    1. विश्लेषण सॉफ़्टवेयर खोलें । टाइपकर्ता विश्लेषकका चयन करें । फ़ाइल मेनू से, फ़ाइल से खुला कुओं का चयन करें और चरण 2.6.3 में उत्पन्न स्पेक्ट्रम डेटा के साथ xml फ़ाइल का चयन करें. चलाने के लिए चिप नाम, यह चयन करें और एक "यातायात प्रकाश" ३८४ के फलक-अच्छी तरह से थाली में चयनित अच्छी तरह से SNPs की एक सूची के साथ प्रदर्शित किया जाएगा । यहां से, प्रत्येक SNP के लिए डेटा बिंदुओं का scatterplot देखने के लिए कॉल क्लस्टर प्लॉट्स का चयन करें ।
      नोट: यह सिफारिश की है कि एक ' नहीं ' कॉल परिणाम कम तीव्रता SNPs के लिए लागू किया जाएगा । प्रतिनिधि परिणामों के लिए इस्तेमाल किया सॉफ्टवेयर में, एक क्लस्टरिंग परिमाण कट-ऑफ 5 है, जो डिफ़ॉल्ट से अधिक है, कड़े गुणवत्ता नियंत्रण के लिए सुझाव दिया है । यह सेटिंग पोस्ट प्रोसेसिंग क्लस्टर फलक में पैरामीटर के अंतर्गत परिमाण Cutoff फ़ील्ड में समायोजित किया जा सकता है । क्लस्टर विश्लेषण को चलाने के लिए उपकरण टैब से क्लस्टर का चयन करें ।
    2. पोस्ट प्रोसेसिंग फलक में काटीज़ियनवादी भूखंडों का परीक्षण कर जीनोटाइप कॉल के मैनुअल निरीक्षण करें । परख फलक में, SNP का चयन करें और पोस्ट-संसाधन क्लस्टर टैब पर क्लिक करें, क्लस्टर जीनोटाइप के साथ प्लॉट नमूना IDs और SNP के लिए इसी पादी के साथ दृश्यमान हो जाएगा ।
    3. जीनोटाइप कॉल समूहों की जाँच करें और कितनी अच्छी तरह SNP के लिए अन्य कॉल्स के साथ प्रत्येक व्यक्ति कॉल क्लस्टर का आकलन. सॉफ्टवेयर मार्गदर्शन के लिए प्रत्येक जीनोटाइप के लिए भूखंड पर कुछ सीमा रेखाएं प्रदान करता है; एक IL13 SNP (चित्रा 1) से एक जीनोटाइप कॉल क्लस्टर प्लॉट का उदाहरण देखें । यदि कॉल अंय कॉल के साथ कसकर क्लस्टर नहीं है और स्पष्ट रूप से एक क्लस्टर के बाहर बैठता है, या यदि यह बहुत कम तीव्रता है, सही datapoint पर क्लिक करें और बदलें कॉल का चयन करने के लिए मैंयुअल रूप से इसे कोई फोनपर सेट ।
    4. उच्च गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए genotyping डेटा अनुप्रवाह विश्लेषण के लिए उपयोग किया जाता है, SNPs और व्यक्तियों को एक QC सीमा के नीचे कॉल दरों के साथ शामिल न करें, उदा. ९०% । एक बार उपयुक्त समायोजन कॉल डेटा के लिए किया गया है, सांख्यिकीय अनुप्रयोगों के लिए डेटा निर्यात करें । इस सॉफ्टवेयर में प्रतिनिधि परिणाम उत्पंन करने के लिए इस्तेमाल किया ( सामग्री की तालिकामें सूचीबद्ध) इस प्लेट डेटा चयन के साथ दृश्य मेनू से हासिल की है और के रूप में सहेजेंका चयन ।

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Representative Results

प्रोटोकॉल के साथ ऊपर वर्णित है, हम genotyped टैग Th2 प्रतिरक्षा जीन IL13 भर में खाद्य एलर्जी मामलों के एक पलटन में SNPs और9नियंत्रण । हम रसद प्रतिगमन विश्लेषण लागू, पैतृक और अन्य संभावित covariates के लिए समायोजित, परीक्षण करने के लिए कि ब्याज के क्षेत्र के भीतर आनुवंशिक वेरिएंट खाद्य एलर्जी जोखिम में वृद्धि हुई. तालिका 10 9 से पता चलता है कि एक संस्करण rs1295686 चुनौती साबित खाद्य एलर्जी के साथ जुड़ा हुआ है और हम एक प्रतिकृति एक ही मल्टीप्लेक्स genotyping दृष्टिकोण का उपयोग कर पलटन में इस संघ की पुष्टि की । एक मेटा दो साथियों से परिणामों का विश्लेषण एफए के साथ IL13 के संघ के मजबूत सबूत (तालिका 11)9प्रदान की है । हम आनुवंशिक रूप से आस्थगित और विश्लेषण में पैतृक के लिए समायोजित एक पैतृक जानकारीपूर्ण SNP मार्कर पैनल का उपयोग कर, एक प्रकाशित10पैनल से अनुकूलित । हम उसी मल्टीप्लेक्स परख दृष्टिकोण का उपयोग कर पैनल genotyped ।

संबंधित संस्करण, rs1295686, पहले एक अस्थमा के जोखिम के रूप में पहचान की गई है loci11 और अन्य एलर्जी प्रतिरक्षा मानकों के साथ जुड़े12, यह एक सामान्य एलर्जी रोग जोखिम loci हो सकता है सुझाव. अगले कदम के लिए इस तरह के अंतर अभिव्यक्ति विश्लेषण के रूप में आगे की पढ़ाई, आचरण होगा, एक क्रोमेटिन कब्जा विधि के साथ भौतिक बातचीत मानचित्रण, क्षेत्र की ठीक मानचित्रण, और haplotype विश्लेषण, पिन बिंदु कार्यात्मक संस्करण और विशेषताएं खाद्य एलर्जी के साथ मनाया एसोसिएशन के पीछे जीव विज्ञान ।

Figure 1
चित्र 1: IL13 SNP rs1295686 के लिए काटीज़ियनवादी क्लस्टर प्लॉट । पीला क्लस्टर एक एलील, जी एलील के लिए नीले, और heterozygous कॉल के लिए हरे रंग के लिए homozygous जीनोटाइप कॉल का प्रतिनिधित्व करते हैं । कुछ जीनोटाइप कॉल जो या तो homozygous या heterozygous मास स्पेक्ट्रा के साथ क्लस्टर नहीं किया था करने के लिए सेट किया गया था "कोई कॉल."

तालिका 1: IL13के लिए प्रतिनिधि परिणाम उत्पन्न करने के लिए प्राइमर अनुक्रम का इस्तेमाल किया. नाम कॉलम SNP आईडी, अच्छी तरह से संख्या में शामिल है (जैसा कि पहले उल्लेख किया है, "अच्छी तरह से" संख्या मल्टीप्लेक्स की परख की आईडी को संदर्भित करता है), और प्राइमर के प्रकार (आगे के लिए एफ, रिवर्स के लिए आर, और UEP विस्तार प्राइमर के लिए) । अगले कॉलम प्राइमर के अनुक्रम, प्राइमर के आकार और शुद्धि प्रकार के होते हैं । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि SPINK5 और एक पैतृक जानकारीपूर्ण मार्करों (AIM) पैनल genotyped एक ही परख का उपयोग कर रहे थे, हालांकि प्रस्तुत प्रतिनिधि परिणामों के साथ इन परिणामों पर चर्चा नहीं कर रहे हैं । SNPs _CEU और _CHB में समाप्त करने के लिए यूटा और Beijin में हान चीनी से उत्तरी गोरों के लिए SNPs उद्देश्य को देखें, १००० जीनोम परियोजना से चीन की आबादी क्रमशः । कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए ।

मास्टर मिक्स कम Plex (≤ 26 SNPs) उच्च Plex (> 26 SNP)
अभिकर्मक 5 µ l × 1 × २०० × 1 × २००
पाणी (ताक) १.९ ३८० १.८ ३६०
बफ़र 1 × (2 मिमी MgCl2) ०.५ १०० ०.५ १००
MgCl२ 2 मिमी ०.४ ८० ०.४ ८०
dNTPs ५०० माइक्रोन ०.१ 20 ०.१ 20
प्राइमरी मिक्स * * १०० एनएम 1 २०० * * 1 २०० * *
Taq पोलीमरेज़ ०.५ यू/1 यू ०.१ 20 ०.२ ४०
कुल 4 µ l ८०० µ l 4 µ l ८०० µ l
* * पहले से ही पतला 2.1.2 में विस्तृत के रूप में ज20

तालिका 2: रिएजेंट और एकाग्रता प्रवर्धन पीसीआर प्राइमर मिश्रण बनाने के लिए आवश्यक है । क्योंकि ४०० (एक ३८४ अच्छी प्लेट को कवर करने के लिए पर्याप्त) एक १.५ µ एल ट्यूब में फिट नहीं होगा और इस तरह 2 एक्स २०० अलग ट्यूबों में किया जाना चाहिए, क्योंकि मास्टर मिक्स संस्करणों २०० प्रतिक्रियाओं के लिए दिया जाता है । कम Plex के अंतर्गत निर्दिष्ट खंड का उपयोग किया जाना चाहिए यदि मल्टीप्लेक्स्ड परख "well" में 26 SNPs से कम या बराबर हैं, तो 26 SNPs से अधिक उच्च Plex वॉल्यूंस का उपयोग करें ।

Thermocycler अटी
4 मिनट के लिए ९४ ° c
४५ चक्र (९४ ° c 20 s, ५६ ° c 30 s, ७२ ° c 1 min)
3 मिनट के लिए ७२ ° c
4 ° c पकड़

तालिका 3: प्रवर्धन पीसीआर के लिए Thermocycler शर्तें ।

मास्टर मिक्स × 1 × ४१०
पाणी (ताक) १.५३ ६२७.३
10 × बफर ०.१७ ६९.७
SAP एंजाइम (१.७ यू/µ एल) ०.३ १२३
कुल 2 µ l ८२० µ l

तालिका 4: रिएजेंट और SAP प्रतिक्रिया के लिए मास्टर मिश्रण के लिए सांद्रता । मास्टर मिक्स वॉल्यूम pipetting त्रुटि के लिए एक मार्जिन के साथ एक ३८४-well प्लेट को कवर करने के लिए ४१० प्रतिक्रियाओं के लिए दिया जाता है ।

Thermocycler अटी
४० मिनट के लिए ३७ ° c
5 मिनट के लिए ८५ ° c
4 ° c पकड़

तालिका 5: SAP प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक Thermocycler शर्तें ।

# एक्सटेंशन प्राइमर मूल स्टॉक एकाग्रता (µ m) विविध. UEP_ मास लक्ष्य प्रतिक्रिया एकाग्रता (µ m) EXT प्राइमर पूल एकाग्रता (µ एम) मात्रा स्टॉक प्राइमर पूल करने के लिए जोड़ा जा करने के लिए (µ एल)
1 rs36110_CHB ५०० ४३५९.८ ०.५६० ५.३६ १६.०९
2 rs10488619_CHB ५०० ४५४६ ०.६०२ ५.७६ १७.२९
3 rs1986420_CEU ५०० ४७६१.१ ०.६४८ ६.२१ १८.६२
4 rs2934193_CEU ५०० ४९६४.३ ०.६९० ६.६१ १९.८२
5 rs4968382_CEU ५०० ५०४७.३ ०.७०७ ६.७७ २०.३०
6 rs1227647_CEU ५०० ५१३६.४ ०.७२४ ६.९३ २०.८०
7 rs1402851_CEU ५०० ५३३८.५ ०.७६३ ७.३० २१.९१
8 rs4705054 ५०० ५४७६.६ ०.७८८ ७.५५ २२.६४
9 rs6928827 ५०० ५६७८.७ ०.८२४ ७.८९ २३.६८
10 rs9325072 ५०० ५७६२.८ ०.८३९ ८.०३ २४.१०
11 rs4841401_CHB ५०० ५८५३.९ ०.८५५ ८.१८ २४.५५
12 rs11098964_CHB ५०० ६०५२.९ ०.८८८ ८.५० २५.५१
13 rs2416504_CHB ५०० ६१७४ ०.९०८ ८.६९ २६.०८
14 rs1860933 ५०० ६२६४.१ ०.९२३ ८.८३ २६.५०
15 rs2193595_CHB ५०० ६३९१.२ ०.९४३ ९.०३ २७.०८
16 rs1519260_CHB ५०० ६४६९.२ ०.९५५ ९.१४ २७.४३
17 rs11184898_CHB ५०० ६५८८.३ ०.९७३ ९.३२ २७.९५
18 rs679832_CEU ५०० ६७५७.४ ०.९९८ ९.५६ २८.६८
19 rs326626_CEU ५०० ६७६५.४ १.००० ९.५७ २८.७१
20 rs1612904 ५०० ६८७३.५ १.०१५ ९.७२ २९.१७
21 rs862942 ५०० ६९६०.५ १.०२८ ९.८४ २९.५३
22 rs2486448_CHB ५०० ७१६९.७ १.०५८ १०.१३ ३०.३८
23 rs4824001_CEU ५०० ७३४१.८ १.०८१ १०.३५ ३१.०६
24 rs6552216_CEU ५०० ७४६५.९ १.०९८ १०.५१ ३१.५४
25 rs1488299_CHB ५०० ७६२० १.११९ १०.७१ ३२.१३
26 rs1347201_CHB ५०० ७६२६ १.११९ १०.७२ ३२.१५
27 rs315280_CHB ५०० ७७४७ १.१३५ १०.८७ ३२.६०
28 rs11203006_CHB ५०० ७८३४.१ १.१४६ १०.९७ ३२.९२
29 rs4240793_CHB ५०० ८०३६.३ १.१७२ ११.२२ ३३.६६
30 rs9325071 ५०० ८२१९.४ १.१९४ ११.४३ ३४.३०
31 rs12678324_CEU ५०० ८३९४.५ १.२१५ ११.६४ ३४.९१
३२ rs4653130_CEU ५०० ८४५५.५ १.२२३ ११.७१ ३५.१२
३३ rs9275596 ५०० ८५३७.६ १.२३२ ११.८० ३५.३९
३४ rs12595448_CHB ५०० ८६०३.६ १.२४० ११.८७ ३५.६२
पीसीआर ग्रेड Rnase की मात्रा नि: शुल्क एच2ओ जोड़ा जा करने के लिए प्राइमर पूल (µ एल) ५६१.७८

तालिका 6: अच्छी तरह से 1 समायोजित प्राइमरों के प्रतिनिधि परिणाम उत्पंन करते थे । एक्सटेंशन प्राइमरों के आकार द्वारा समायोजित, लक्ष्य एकाग्रता सहित, मात्रा प्राइमर पूल में इस्तेमाल किया, और प्राइमरी पूल में एक किताब के लिए अंतिम एकाग्रता अच्छी तरह से 1 के लिए । अंतिम मात्रा तक बनाने के लिए आवश्यक पानी की मात्रा टेबल के नीचे दी गई है । प्राइमरी पूल का कुल वॉल्यूम १.५ एमएल था ।

# एक्सटेंशन प्राइमर मूल स्टॉक एकाग्रता (µ m) विविध. UEP_ मास लक्ष्य प्रतिक्रिया एकाग्रता (µ m) EXT प्राइमर पूल एकाग्रता (µ एम) मात्रा स्टॉक प्राइमर पूल करने के लिए जोड़ा जा करने के लिए (µ एल)
1 rs10515597 ५०० ४४८२.९ ०.५८८ ५.६३ १६.८९
2 rs2759281_CEU ५०० ४९२१.२ ०.६८१ ६.५२ १९.५७
3 rs17641748 ५०० ५०८०.३ ०.७१३ ६.८३ २०.४८
4 rs1698042_CEU ५०० ५२०१.४ ०.७३७ ७.०५ २१.१६
5 rs5753625_CHB ५०० ५४११.६ ०.७७६ ७.४३ २२.३०
6 rs3912537_CEU ५०० ५८११.८ ०.८४८ ८.१२ २४.३५
7 rs6141319_CEU ५०० ५८८३.८ ०.८६० ८.२३ २४.७०
8 rs1002587_CEU ५०० ६०२६.९ ०.८८४ ८.४६ २५.३९
9 rs1295686 ५०० ६१७२ ०.९०८ ८.६९ २६.०७
10 rs16877243_CEU ५०० ६३८६.२ ०.९४२ ९.०२ २७.०५
11 rs1103811 ५०० ६५९५.३ ०.९७४ ९.३३ २७.९८
12 rs6510332_CEU ५०० ६७९०.४ १.००३ ९.६१ २८.८२
13 rs6595142_CHB ५०० ६८७४.५ १.०१६ ९.७२ २९.१७
14 rs4484738_CEU ५०० ६९६६.५ १.०२९ ९.८५ २९.५५
15 rs1432975 ५०० ७०२८.६ १.०३८ ९.९४ २९.८१
16 rs10879311_CEU ५०० ७३१७.८ १.०७८ १०.३२ ३०.९७
17 rs864481 ५०० ७४१६.९ १.०९२ १०.४५ ३१.३५
18 rs1295687 ५०० ७४४७.८ १.०९६ १०.४९ ३१.४७
19 rs12644851_CHB ५०० ७६३४ १.१२० १०.७३ ३२.१८
20 rs4265409_CHB ५०० ७९२६.२ १.१५८ ११.०९ ३३.२६
21 rs2927385_CHB ५०० ७९९७.२ १.१६७ ११.१७ ३३.५२
22 rs1538956_CHB ५०० ८२८६.४ १.२०२ ११.५१ ३४.५४
पीसीआर ग्रेड Rnase की मात्रा नि: शुल्क एच2ओ जोड़ा जा करने के लिए प्राइमर पूल (µ एल) ८९९.४२

तालिका 7: अच्छी तरह से 2 समायोजित प्राइमर प्रतिनिधि परिणाम उत्पंन करने के लिए इस्तेमाल किया । एक्सटेंशन प्राइमरों के आकार द्वारा समायोजित, लक्ष्य एकाग्रता सहित, मात्रा प्राइमर पूल में इस्तेमाल किया, और प्राइमरी पूल में एक किताब के लिए अंतिम एकाग्रता अच्छी तरह से 2 के लिए । अंतिम मात्रा तक बनाने के लिए आवश्यक पानी की मात्रा टेबल के नीचे दी गई है । प्राइमरी पूल का कुल वॉल्यूम १.५ एमएल था ।

मास्टर मिक्स कम Plex (1-18) उच्च Plex (19-36)
अभिकर्मक × 1 × ४१० × 1 × ४१०
पाणी (ताक) ०.७३९५ ३०३.१९५ ०.६१९ २५३.७९
बफ़र ०.२ ८२ ०.२ ८२
समापन मिश्रण ०.१ ४१ ०.२ ८२
प्राइमरी मिक्स (LPA समायोजित) ०.९४ ३८५.४ ०.९४ ३८५.४
iPLEX एंजाइम * ०.०२०५ ८.४०५ ०.०४१ १६.८१
कुल 2 µ l ८२० µ l 2 µ l ८२० µ l

तालिका 8: रिएजेंट और एक्सटेंशन प्रतिक्रिया मास्टर मिश्रण के लिए सांद्रता. इस मामले में कम Plex प्रतिक्रियाओं के लिए मात्रा में इस्तेमाल किया जाना चाहिए अगर वहां 18 या कम SNPs में अच्छी तरह से कर रहे हैं । के लिए 19 या अधिक SNPs उच्च Plex प्रतिक्रियाओं का उपयोग करें वॉल्यूम । यह कम plex और उच्च plex के प्रवर्धन पीसीआर मास्टर मिश्रण तालिका 2में विस्तृत की SNP आवश्यकताओं के लिए अलग है ।

Thermocycler अटी
९४ ° c 30 s के लिए
४० के चक्र (९४ ° c 5 s, (5 चक्रों का ५२ ° c 5 s, ८० ° c 5 s))
3 मिनट के लिए ७२ ° c
4 ° c पकड़

तालिका 9: एक्सटेंशन प्रतिक्रिया के लिए Thermocycler शर्तें

खाद्य एलर्जी मामले बनाम गैर खाद्य एलर्जी नियंत्रण
Snp A1 पी या L95 U95
rs1295686 ए ०.००३ १.७५ १.२ २.५३
rs2243297 ए ०.१३ २.१ ०.८ ५.५१
rs1295687 जी ०.१९ १.६३ ०.७८ ३.४१
rs2243211 ए ०.२२ १.४५ ०.८ २.६४
rs1295683 टी ०.२५ १.३२ ०.८२ २.१३
rs2243248 जी ०.५१ १.२१ ०.६९ २.११
rs2243300 टी ०.५१ १.१९ ०.७ २.०२
rs1800925 टी ०.६ १.११ ०.७५ १.६३
rs3091307 जी ०.६२ १.१ ०.७५ १.६

तालिका 10: वैरिएंट rs1295686 का IL13 लोकस चुनौती साबित खाद्य एलर्जी के साथ जुड़ा हुआ है । उपस्कर प्रतिगमन विश्लेषण, पैतृक, सेक्स और atopic एक्जिमा की उपस्थिति के लिए समायोजित, पता चला कि संस्करण rs1295686 खोज पलटन में चुनौती साबित खाद्य एलर्जी के साथ जुड़ा हुआ है (n = ३६७ मामलों और १५६ गैर एलर्जी नियंत्रण) । SNP स्तंभ की जांच की जा रही मार्करों सूचीबद्ध करता है, A1 स्तंभ संबद्धता परीक्षण के लिए संदर्भ एलील के रूप में उपयोग किया गया नाबालिग एलील, सूचीबद्ध करता है । p स्तंभ प्रतीपगमन विश्लेषण से p-मानों को सूचीबद्ध करता है, या स्तंभ संगत बाधाओं के अनुपात को सूचीबद्ध करता है और L95 और U95 विश्लेषण से ९५% विश्वास अंतराल की निचली और ऊपरी सीमाएं हैं । डेटा ऐश एट अल से reproduced, २०१७9।

A. प्रतिकृति विश्लेषण: खाद्य एलर्जी मामले बनाम गैर-खाद्य एलर्जी नियंत्रण B. मेटा-विश्लेषण-डिस्कवरी और प्रतिकृति
Snp A1 या L95 U95 पी पी P (R) या या (R) Q मैं
rs1295686 ए १.३७ १.०३ १.८२ ०.०३ ०.०००५ ०.०००६ १.५ १.५ ०.३१ ३.३२
rs1295687 सी १.१ ०.६८ १.७८ ०.७ ०.३ ०.३ १.२४ १.२४ ०.३८ 0

तालिका 11: एक स्वतंत्र जनसंख्या में प्रतिकृति के बीच संबद्धता की पुष्टि IL13 वैरिएंट rs1295686 और चैलेंज-सिद्ध खाद्य एलर्जी । उपस्कर प्रतिगमन, पैतृक प्रमुख घटकों के लिए सही, सेक्स और atopic एक्जिमा, एक स्वतंत्र जनसंख्या में (n = 203 खाद्य एलर्जी मामलों और ३३० गैर एलर्जी नियंत्रण) संस्करण rs1295686 और खाद्य एलर्जी के बीच सहयोग की पुष्टि की । मेटा विश्लेषण तो आयोजित किया गया था, SNP और परिणाम के बीच एक संघ के लिए सबूत के उच्चतम स्तर प्रदान करने, इस SNP में दो आबादी के बीच प्रभाव आकार में विविधता के छोटे सबूत के साथ । यहां कॉलम 10 तालिकाके अनुसार, अतिरिक्त पी के साथ कर रहे है (r) और या (r) यादृच्छिक प्रभाव मेटा विश्लेषण मॉडल के लिए मूल्यों बनाम तय प्रभाव मॉडल (पी और या) । Q और मैं डिशवॉशर परीक्षण और मैं सूचकांक क्रमशः के लिए पी मूल्य रहे हैं, दोनों अध्ययन के बीच प्रभाव आकारों में विविधता के उपाय कर रहे हैं । डेटा ऐश एट अल से reproduced, २०१७9।

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Discussion

यहां हम बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग करके मल्टीप्लेक्स genotyping की विधि का प्रदर्शन करते हैं । प्रतिनिधि परिणाम मालदी के साथ युग्मित पीसीआर का उपयोग कर उत्पंन किया गया-तोफ सामग्री की तालिका13में सूचीबद्ध रसायन विज्ञान के साथ जन स्पेक्ट्रोमेट्री4 । इस मंच के साथ, हम प्रयोगशाला में ४० एच के भीतर 9 SNPs के लिए १,२५५ व्यक्तियों पर ११,२९५ पादी की कुल उत्पंन ।

हम में उंमीदवार जीन IL13 के लिए SNP डेटा पैदा करने और विश्लेषण द्वारा आनुवंशिक परिकल्पनाओं का जवाब देने में तकनीक की उपयोगिता का वर्णन एक डिस्कवरी नैदानिक phenotyped खाद्य एलर्जी के लिए और स्वतंत्र प्रतिकृति के साथ । मंच अपेक्षाकृत कम डीएनए गुणवत्ता के लिए मजबूत है और ंयूनतम शुरू सामग्री, केवल 10 एनजी के एक इनपुट की आवश्यकता है । प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण चरणों में निंनलिखित शामिल हैं: परख डिजाइन प्रक्रिया के निवारण सावधान करने के लिए मल्टीप्लेक्स की परख में अधिक से अधिक SNP शामिल किए जाने को सुनिश्चित करने, प्रवर्धन पीसीआर के दौरान लक्ष्य क्षेत्रों के सफल प्रवर्धन, सफल एकल विस्तार प्रतिक्रिया के दौरान न्यूक्लियोटाइड विस्तार, और विश्लेषण सॉफ्टवेयर में आदेश में सॉफ्टवेयर के लिए परख और नमूना प्लेट लेआउट की लोडिंग के लिए सही मास स्पेक्ट्रा डेटा आवंटित ।

जैसा कि पहले उल्लेख किया है, परख डिजाइन उपकरण माउस और गोजातीय बहुरूपताओं के उपयोग के साथ संगत है, मानव के अलावा । अन्य जीवों जैसे सूक्ष्म जीव या पौधे के लिए "अन्य" को "जीव" मेन्यू में चुना जा सकता है । हालांकि, समीपस्थ SNPs ढूंढने और इष्टतम प्राइमरी क्षेत्रों की पहचान करने के लिए स्वचालित कदम उपलब्ध नहीं होंगे ।

डिजाइन की प्रक्रिया के दौरान, यदि एक समीपस्थ SNP एक इष्टतम प्राइमरी क्षेत्र की पहचान को अवरुद्ध है, एक या तो डिजाइन से SNP को हटा सकते है और उच्च LD में एक अंय का चयन करें (जैसे, आर2 = 1), या दो प्राइमरों, संदर्भ के साथ एक डिजाइन का चयन SNP के एलील और वैकल्पिक एलील के साथ एक, या आम एलील के साथ एक किताब डिजाइनिंग, या एक सार्वभौमिक आधार के साथ SNP मास्किंग (जैसे, Inosine) । यदि प्राइमर के लिए एक अद्वितीय साइट की पहचान के साथ एक मुद्दा है, एक amplicon लंबाई सेटिंग्स बदल सकते है एक अद्वितीय साइट को खोजने के लिए । डिफ़ॉल्ट सेटिंग है ८०-१२० bp लेकिन यह ६०-४०० bp से संशोधित किया जा सकता है । हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि अगर अपमानित डीएनए के साथ काम करना (जैसे, FFPE ऊतक से), यह amplicon लंबाई बढ़ाने के लिए आदर्श नहीं है ।

उपकरण की परख डिजाइन कदम के दौरान त्रुटियों उच्च hairpin या प्राइमर डिमर क्षमता शामिल हो सकता है । दोनों सेटिंग्स एक समायोजित डिजाइन की कोशिश करने के लिए आराम किया जा सकता है । हालांकि, यह अनुशंसा की जाती है कि थ्रेसहोल्ड ०.८ नीचे आराम नहीं कर रहे हैं; ०.९ के साथ शुरू करने के लिए यदि यह सेटिंग SNPs बचाव के लिए पर्याप्त है और केवल यदि आवश्यक हो तो ०.८ को कम देखने के लिए । उन्नत सेटिंग्स में, "4 के मल्टीप्लेक्स टैब के अंतर्गत डिज़ाइन पुनरावृत्तियों की संख्या (10 तक) परिवर्तित करना संभव है. डिजाइन परख ", साथ ही सबसे अधिक औसत मल्टीप्लेक्स या कम Plex द्वारा कटेंगे खारिजकरने के लिए सर्वश्रेष्ठ पुनरावृत्ति चयन मानदंड । डिजाइन पुनरावृत्तियों की संख्या में वृद्धि लाभप्रद हो सकता है क्योंकि उपकरण के क्रम में वे प्रदान की गई और एक परख डिजाइन करेंगे में पहली SNP ले जाएगा । तो यह परीक्षण अगर अगले SNP एक ही मल्टीप्लेक्स परख के लिए संगत है । इस प्रकार, SNPs मामले का क्रम । कई पुनरावृत्तियों विकल्प चयनित के साथ, सॉफ्टवेयर SNPs के आदेश यादृच्छिक और अन्य पुनरावृत्तियों का प्रयास करेंगे. इससे प्रत्येक मल्टीप्लेक्स में डिजाइन किए जा सकने वाले SNPs की संख्या बढ़ सकती है या SNP की संख्या में कमी आ सकती है. हालांकि, यह भी एक समय लागत पर आ जाएगा, के रूप में डिजाइन उपकरण इस कदम पर अधिक समय लगेगा ।

मल्टीप्लेक्स genotyping ब्याज की loci की जांच के लिए एक त्वरित और किफायती दृष्टिकोण है । विधि सुव्यवस्थित है और ४० तक के लगभग ७६० नमूने के चलने की अनुमति देता है-plex SNPs 10 घंटे में, पादी के हजारों की अनुमति दसियों से कम एक दिन14में उत्पंन हो । मास स्पेक्ट्रा आसानी से मंच द्वारा प्रदान की गई उपकरणों के साथ विश्लेषण किया जा सकता है ।

मंच के लिए कुछ प्रतिबंधों SNPs की 5-10% की अनुमानित हानि है कि परख डिजाइन प्रक्रिया विफल हो जाएगा शामिल हैं । यह कभी एक वैकल्पिक टैग या प्रॉक्सी SNP के चयन के द्वारा ठीक किया जा सकता है । व्यापक संस्थान के SNP एनोटेशन और प्रॉक्सी खोज (स्नैप) डाटाबेस एक ऐसे उपकरण है कि प्रॉक्सी SNPs15की पहचान की सुविधा है । प्रणाली की एक और सीमा यह है कि यह एक लक्षित मंच है और इसलिए व्यापक उपंयास खोज के लिए अनुमति नहीं है, के रूप में जीनोम चौड़ा दृष्टिकोण के साथ प्राप्त की । इसके अलावा, के रूप में दृष्टिकोण टैग का उपयोग करता है-SNP परदे के ऊपर जीन में कवरेज को अधिकतम करने के लिए, ठीक मानचित्रण अध्ययन बाद में सटीक कारण संस्करण निर्धारित करने की आवश्यकता हो सकती है ।

division genotyping अभी भी बीमारी से जुड़े SNPs GWA अध्ययन दृष्टिकोण या परिकल्पना संचालित उंमीदवार और मार्ग जीन अंवेषण में पहचान की पूछताछ के लिए एक उपयोगी मंच है । मंच के लिए भविष्य अनुप्रयोगों के निदान और कैंसर और नैदानिक वायरोलॉजी जैसे क्षेत्रों में स्क्रीनिंग के लिए उपंयास का उपयोग करता है होने की संभावना है । समग्र division genotyping with मास स्पेक्ट्रोमेट्री genotyping उंमीदवार loci के लिए एक त्वरित, लागत प्रभावी और विश्वसनीय माध्यम-प्रवाह विधि है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखकों को कोई पावती नहीं है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Genomic DNA  - - 1 μL at a concentration of 5-10 ng/μL
Primers: forward and reverse amplification and extension IDT - see manuscript section 1.2.1 on design of primers
Deionized water  E.g. Milli-Q water  - deionized with 18.2 MΩ.cm resistivity
Genotyping reagent kit. iPLEX Gold Chemistry reagent set  Agena Bioscience #10148-2 includes all reagents for reactions in 2.2.1, 2.3.1 and 2.4.2 , chip and resin
PCR plates (384-well) Abgene #ABGAB-1384 For the MassARRAY system plates by Abgene are compatible
Micropipettes single and 8-channel
Centrifuge  compatible with 384-well plates
Thermocycler compatible with PCR programs as detailed in 2.2.4, 2.3.2 and 2.4.3
Dimple resin plate  Agena Bioscience 6mg, 384-well
Plate rotator 
MassARRAY Analyzer 4 System Agena Biosciences MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption/ionization – time of flight) Mass Spectrometer.
RS1000 Nanodispenser Agena Biosciences
Assay Design Suite Agena Biosciences Tool used to design the multiplex genotyping assays
Hot Start Taq DNA polymerase enzyme 
Resin  Agena Biosciences Supplied with iPLEX kit

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References

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जेनेटिक्स इश्यू १३६ Genotyping मल्टीप्लेक्स परख मास स्पेक्ट्रोमेट्री मालदी-तोफ परीक्षार्थी जीन क्लिनिकल पलटन
मल्टीप्लेक्स Genotyping और जनसंचार स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ नैदानिक पलटन अध्ययन में उंमीदवार जीन परीक्षण
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Ashley, S. E., Meyer, B. A., Ellis, J. A., Martino, D. J. Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (136), e57601, doi:10.3791/57601 (2018).

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