Summary
Identification des variantes génétiques qui contribuent à la maladie humaine complexe permet de repérer les nouveaux mécanismes. Ici, nous démontrons une approche de génotypage multiplex de gènes candidats ou analyse de voie de gène qui maximise la protection à faible coût et peut faire l’objet d’études de cohorte.
Abstract
Maladies complexes reposent souvent sur plusieurs variants génétiques communs qui contribuent à la susceptibilité à la maladie. Nous décrivons ici une approche de polymorphisme (SNP) de nucléotide simple tag rentable en utilisant un test de génotypage multiplexée avec la spectrométrie de masse, à étudier les associations de voie de gène dans les cohortes de la cliniques. A titre d’exemple, nous étudions le locus de candidat d’allergie alimentaire Interleukin13 (IL13). Cette méthode optimise efficacement la couverture en profitant de déséquilibre de liaison partagée (LD) au sein d’une région. SNP sélectionnés de LD puis visent dans un essai multiplexé, permettant jusqu'à 40 différents SNP à analyser en même temps, augmenter la rentabilité. Réaction en chaîne par polymérase (PCR) est utilisée pour amplifier les loci de cible, suivis de nucléotide simple extension, et les amplicons sont alors mesurés à l’aide de laser assistée par matrice désorption/ionisation-temps flight(MALDI-TOF) de spectrométrie de masse. La sortie brute est analysée avec le génotype composant logiciel, en utilisant le contrôle de la qualité rigoureuses définitions et seuils, et les génotypes de forte probabilité sont déterminés et d’analyse des données de sortie.
Introduction
Dans la maladie humaine complexe, variants génétiques contribuent à la susceptibilité à la maladie et quantifier ces variantes peut-être être utile pour la pathogénie de compréhension, identifier les groupes patients à risque élevé et les intervenants de traitement. En effet, la promesse de la médecine de précision est dépendante de l’utilisation de l’information génomique pour identifier des sous-groupes de patients1. Malheureusement, en l’espace de biologie des maladies complexes, où les phénotypes de la maladie sont sous-tendus par une hétérogénéité génétique importante, faible pénétrance et expressivité variable, cohorte taille les besoins pour les approches de Génome-large d’identifier roman les candidats sont souvent excessivement large2. Par ailleurs, une approche de gène candidat ciblé commence par une hypothèse a priori sur les gènes spécifiques et des sentiers dans l' étiologie de la maladie3. Outils d’analyse de parcours sont utilisées pour étudier la physiopathologie d’un locus de cibles identifiés, générant de nombreuses voies de candidat d’être explorées. Nous montrons ici une approche de génotypage multiplex permettant l’étude des dizaines ou des centaines de SNP avec un dosage, adaptés aux études de cohorte humaine4. Cette approche est relativement élevée à travers-mis, permettant à des centaines de milliers d’échantillons d’ADN d’être génotypés pour les études de la découverte et l’étude des voies spécifiques. Les méthodes décrites ici sont utiles pour identifier des allèles de risque et de leurs associations à caractères cliniques de façon relativement rapide et peu coûteuse. Cette plate-forme a été très avantageuse pour le dépistage et de diagnostic des fins5,6et plus récemment, pour les infections microbiennes7 et papillomavirus humain8.
Ce protocole commence par la sélection d’un ensemble de gènes pour enquête, i.e., les régions cibles, généralement déterminées par le biais de recherches documentaires ou des hypothèses a priori pour implication dans le processus de la maladie ; ou peut-être sélectionné pour la réplication, comme les principales associations d’une étude Génome-large association (GWA) de découverte. De l’ensemble de gènes, le chercheur choisira une liste raffinée du SNP. Autrement dit, le déséquilibre de liaison (LD), ou la corrélation, parmi les variantes dans la région sert à identifier un représentant « tag SNP » pour un groupe de SNP dans haute LD, connu comme un haplotype. Le LD haut de la région signifie que les SNP sont souvent hérités ensemble tel que génotypage un SNP est suffisant pour représenter la variation à tous les SNP dans l’haplotype. Alternativement, si suite à une liste définitive de SNP dans de nombreuses régions, par exemple., la réplication pour une étude GWA, ce processus peut être inutile. Pour le génotypage multiplexé, un test doit être conçu autour de ces cibles telles que les amorces d’amplification sont des différant en masse à ceux des amorces extension et spectres de masse de produits pour produire interprétable. Ces paramètres sont facilement mises en œuvre par un outil de conception de test de génotypage multiplexé. Les amorces et inverses de l’illustration servira à cibler les marqueurs d’intérêt et d’amplifier la séquence contenant le SNP. Les amorces extension attachent directement proximal des SNP et une base unique, masse modifié, « terminator » qui complète le SNP est ajoutée. La base de terminator empêche plus extension de l’ADN. La masse-modification de la base permet aux fragments qui diffère par une base unique pour être détectée par spectrométrie de masse. La plaque contenant la chimie de génotypage est ensuite appliquée à une puce pour la mesure sur une plate-forme de spectrométrie de masse. Après l’application des contrôles de qualité appropriés aux appels génotypage cru détectés par le système, les données peuvent être exportées et utilisées pour l’analyse statistique pour tester la liaison avec les phénotypes de la maladie.
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Protocol
Le matériel génétique utilisé dans les présentes était éthiquement approuvé par le Bureau pour enfants HREC (Human Research Ethics Committee) (CDF/07/492), le département de HREC de Services humains (10/07) et Hospital (RCH l’enfance Royal) HREC (27047).
1. la conception du test multiplexé
- Préparer une liste SNP pour la conception de l’essai.
- La région cible l’entrée dans la fonction de tagger des Haploview (https://www.broadinstitute.org/haploview/downloads). Utilisez le LD (corrélation, r2) entre le SNP s’étendant sur la région cible pour générer une liste de SNP, qui fournit une couverture complète de la région souhaitée avec le plus petit nombre de variantes nécessaires. Générer une liste de SNP tels que tous les allèles à saisir sont corrélés au-dessus d’un seuil défini par l’utilisateur (p. ex.., r2 0,8).
- Identification des séquences appropriées pour marche avant, marche arrière et extension des amorces
- Entrez la liste générée de SNP dans l’outil de conception de test de choix.
Remarque : Les instructions suivantes s’appliquent à l’outil de conception de test utilisé pour générer les résultats représentatifs, comme spécifié dans la Table des matières. - Une fois que l’outil de conception de test a été lancé, sélectionnez le Nouveau Design de génotypage. Entrez un nom pour la conception de test dans le champ Nom de la conception .
- Fournir la liste SNP générée à l’étape 1.1.1 en cliquant sur le bouton Modifier la saisie de texte avec les instructions rs ou FASTA à gauche du bouton.
Remarque : SNP peut être dans une liste de texte de référence (SR) SNP IDs ou téléchargées au format FASTA, ou le format de fichier de groupe de SNP utilisée par l’outil. Pour télécharger des fichiers dans ces formats, cliquez sur le bouton de Téléchargement de fichiers . La limite supérieure de variantes qui peuvent être conçus dans un seul essai, appelé « bien », est 40 SNP. Il est possible de spécifier les SNP qui constituent une priorité pour la conception avant de commencer la course ; ce seront tout d’abord conçus. SNP de contrôle peut être spécifiées : par exemple, un test pour détecter des sexes dans le cas d’échantillon mix ups ou un contrôle pour déterminer ce modèle suffisant a été ajouté si vous travaillez avec faible ou de mauvaise qualité de l’ADN. Toutefois, il convient de noter qu’à l’aide de SNP contrôle et priorité peut réduire le nombre de SNP qui peuvent être conçus dans un seul bien. - Dans le menu prédéfini , sélectionnez l’option de multiplexage haute iPLEX Preset . Dans le menu de l’organisme , sélectionnez l’organisme dont dérive l’ADN d’être génotypés. Pour les résultats représentatifs présentés ici, c’était l’homme.
Remarque : La souris et organismes bovines sont également compatibles avec l’outil. On peut choisir aussi autres si vous travaillez avec un autre organisme comme plante ou microbe ; Toutefois, les étapes automatisées pour trouver SNP proximale et zones amorce optimale ne sera pas disponibles en raison de l’absence d’un génome de référence. - Dans le menu base de données , sélectionnez la dernière version du génome, ou une version alternative si nécessaire, dans le menu de la chimie . Choisissez iPLEX introduction par effraction pour le champ Niveau de Multiplex , le plus haut niveau du multiplexage : 40. Maintenant, sélectionnez Commencer à courir. « Étape 1 » de l’outil commencera.
Remarque : Au cours de l’étape 1, l’outil récupère et met en forme les séquences SNP. Ici, les erreurs peuvent inclure mise en forme du fichier FASTA auquel cas le fichier FASTA devrait être vérifié et reformaté en tant que de besoin. Une autre erreur est SNP rs numéros qui ont été fusionnés avec un autre numéro de rs, dans lequel cas le nombre de rs doivent être recherchés dans une base de données SNP comme dbSNP de la NCBI pour identifier le nouveau numéro de rs SNP. Séquences autour du SNP sont recherchées pour n’importe quel SNP proximale connue pouvant interférer avec la conception d’amorce. Des sites potentiels d’amorces PCR sont comparés avec le génome pour éviter l’amplification non spécifique en raison de multiples coups dans le génome. - Attendent l’achèvement de « Step 2 » de l’outil de conception dans lequel proximale SNP est identifiés.
Remarque : Si vous utilisez un organisme qui n’est pas pris en charge par cette étape, annoter les séquences avec SNP proximale dans l’annotation de l’UICPA si cette information est disponible. Il y a rarement des erreurs au cours de cette étape ; Cependant, des erreurs peuvent survenir si l’organisme de référence erronée ou du génome a été sélectionné ou si les séquences d’ADNc ont été entrées plutôt que de l’ADN génomique. Pour optimiser l’étape 2, sous Paramètres avancés, il est possible de filtrer les SNP basée sur une population si vous travaillez au sein d’une population spécifique. SNP rare peut également être filtré en excluant ceux qui ont une fréquence inférieure à 1 %. Enfin, SNP qui n’ont pas un statut validé ou n’ont pas d’information de la population peut également être exclus si vous le souhaitez. - Attendent l’achèvement des régions « Étape 3 » de l’outil de conception qui identifie l’apprêt optimal. Si vous préférez l’apprêt emplacements ont été identifiés, ou si vous travaillez avec un organisme différent, entrer manuellement les emplacements de l’apprêt en annotant la séquence d’entrée (les fichiers de groupe SNP) avec les régions des amorces privilégiées en majuscules et le reste de la séquence en bas cas, certains Cas de préserver dans le menu paramètres avancés pour cette étape.
Note : Les erreurs pour les étapes 2 et 3 peuvent inclure : (1) A proximal SNP la conception d’une amorce de blocage avec la solution étant de masquer avec une base sans modèle et commander un oligo avec une base universelle comme Isonine ou, pour concevoir deux amorces, une avec chacun des allèles de la proxim SNP al, ou, une amorce de conception avec l’allèle commun seulement. (2) une autre erreur commune est l’incapacité d’identifier un site unique pour l’amorce avec la solution étant de modifier la longueur de l’amplicon afin d’identifier un site unique. Dans l’outil utilisé pour cet article, la valeur par défaut est 80-120 bp. Ceci peut être modifié de bp 60-400 dans le dialogue des paramètres avancés sous les paramètres de longueur de l’Amplicon dans « 3. Identifier les zones optimales de Primer » et également sous l’onglet Amplicon « 4. Concevoir des essais ». S’assurer que les deux sont modifiés. Toutefois, il est à noter qu’augmenter la longueur de l’amplicon lorsqu’à l’aide de dégradé l’ADN n’est pas recommandé. - Attendre l’achèvement de l’étape de conception de test (outil « Etape 4 » de la conception), ici l’outil vise à assurer l’espacement optimal passe entre les amorces d’extension et les allèles de tous les SNP dans les conceptions multiplexées. Une fois cette étape terminée, exporter le fichier de commande Oligo, qui est formaté pour la commande facile via un oligo commande fournisseur de choix.
Remarque : Les amorces d’Amplification (vers l’avant (F) et marche arrière (R)) sont conçus pour produire un amplicon optimale de taille de 80 à 120 bp. L’apprêt d’amplification masse doit être différent de celui de l’amorce de l’extension et son produit pour éviter des résultats contradictoires dans le spectre de masse et de la performance globale de PCR. L’amorce de l’extension devrait être de 15 à 30 nucléotides de long (4 500-9 000 Da), conçus de sorte que l’extrémité 3' s’attache directement adjacent au site du polymorphisme. Tous ces paramètres sont définis automatiquement dans l’outil utilisé pour générer les résultats représentatifs.
- Entrez la liste générée de SNP dans l’outil de conception de test de choix.
- Exporter la conception d’amorces outil et ordre choisis auprès d’un fournisseur de l’oligomère : 25 nmol de chacune des amorces PCR (avant et arrière) et 100 nmol de chacune des amorces extension. Voir le tableau 1 pour les amorces utilisées pour produire les résultats représentatifs.
2. le génotypage (1 à 2 jours)
- Préparer des amorces d’amplification.
- Advenant que des amorces lyophilisées, reconstituer avec de l’eau moléculaire de catégorie. Utiliser une concentration de 100 μM/μL d’amorces et inverses et 500 μM/μL d’extension.
- Piscine avant et marche arrière amorces pour chaque dosage multiplexé dans un mélange de stock apprêt, contenant chaque amorce à une concentration de 0,5 mM.
Remarque : par exemple, une piscine de primer 400 ml pour 400 réactions :
2 μL de chaque amorce, à une concentration de 100 μM/μL, est nécessaire pour le pool stock amorce. Pour un dosage de 30-plex avec 60 amorces avant et arrière, un total de 120 μL d’apprêt serait nécessaire (la piscine de l’apprêt concentré). Eau de moléculaire-grade 280 μL s’ajouterait alors à faire un volume final de 400 ml d’apprêt mélanger.
- Amplification en utilisant la réaction en chaîne de la polymérase (PCR)
- Faire un mélange maître pour la PCR contenant 100 nM du mix amorce détaillés plus haut 500 μM des dNTPs, 2 mM de MgCl2et 0,5 U de l’enzyme ADN polymérase. 1 U est requis pendant plus de 26-plex dosages. Reportez-vous au tableau 2.
- Ajouter 4 μL de ce mélange dans chaque puits de la plaque PCR 384 puits, ainsi que 1 μL de l’ADN génomique à une concentration de 5 à 10 ng/μl.
Remarque : les contrôles de qualité devrait également figurer sur la plaque, comme le contrôle sans modèle et un contrôle positif qui a joué auparavant avec le dosage (au cours d’une série de tests). Si l’exécution de plusieurs plaques, ADN plusieurs échantillons provenant de l’autre plaque (s), par exemple., en trois exemplaires, doit être exécuté en tant que contrôles techniques pour la variabilité inter inter-plaques. - Centrifuger la plaque à 200 x g pendant 1 min à température ambiante avec une plaque de couverture en place pour assurer le maximum de liquide figure au bas du puits de la plaque.
- Exécutez le PCR dans les conditions suivantes de thermocycleur : incubation de 4 min à 94 ° C, pour activer l’ADN polymérase ; 45 cycles de ce qui suit (dénaturation à 94 ° C pendant 20 s, recuit à 56 ° C pendant 30 s et l’extension à 72 ° C pendant 1 min) et ensuite une extension finale à 72 ° C pendant 3 min. se référer au programme de la PCR dans le tableau 3.
- Effectuer sur gel d’agarose pour que l’amplification de l’ADN soit réussie. Utilisez 1 µL du produit PCR (avec 3 µL de tampon de charge) sur un gel d’agarose 2 % (p/v), en mélangeant la poudre d’agarose et tampon Tris Borate EDTA (TBE) de 0,5 %, puis exécutez pendant 45 min à 100 V.
- Étape de Purification de la Phosphatase alcaline (SAP) crevettes
Remarque : Cette étape sert à enlever les nucléotides non constituées en société. L’enzyme SAP Clive groupes phosphate pour empêcher les excès d’apprêt et dNTPs non constituées en société d’interférer dans la réaction de l’extension à venir.- Faire un master mix contenant 1,7 unités/μL d’enzyme Phosphatase alcaline crevettes (SAP), tampon SAP x 10 et compléter au volume avec de l’eau moléculaire de qualité. Reportez-vous au tableau 4.
- Ajouter 2 μL de la fraîchement confectionnés par SAP master mix à chaque puits de la plaque, contenant déjà 5 μL de la réaction PCR. Centrifuger brièvement et retourner au thermocycleur à 37 ° C pendant 40 min, puis à 85 ° C pendant 5 min pour l’inactivation de l’enzyme. Voir au tableau 5.
- Réaction de Extension d’amorce
Remarque : La concentration des amorces dans le mélange de primer extension extension doit être ajustée selon la taille (ajustement linéaire de Primer-APL). C’est parce qu’il y a une relation inverse à l’intensité maximale (sur les spectres de masse) et produit masse. Ajustement de la concentration de primer extension corrige cette relation produire des pics d’intensité égale. Ajusté des amorces utilisées pour générer des résultats sont fournis par le représentant dans les tableaux 6 et 7. Les volumes fournis sont de générer 1,5 mL du mélange primer extension.- Calculer les facteurs de dilution pour chaque amorce en utilisant un algorithme dégradé, disponible à partir de Agena Biosciences (« ajustement linéaire en Primer »), qui règle pour la masse et la concentration de l’amorce et le nombre total d’amorces dans la réaction multiplexée (voir Les tableaux 6 et 7). Entrez la masse UEP pour chaque amorce dans la UEP_MASS de la feuille de l’ajustement linéaire de Primer.
Remarque : La concentration en masse ajustée pour l’apprêt est automatiquement calculée dans la cellule avec le texte de l’en-tête « Réaction Concentration cible (µM). » Le volume d’amorce à ajouter à la piscine de l’amorce sera sorti dans la cellule sous le texte de l’en-tête « Volume Stock amorce d’être ajouté à la piscine (µL). » Le volume d’eau à ajouter à la piscine de l’apprêt pour compenser les concentrations calculées est sorti de la cellule en regard du texte « Volume de PCR Grade RNase libre H2O d’être ajouté Primer Pool (µL). » - Prendre le volume de chaque amorce comme spécifié dans le fichier d’ajustement linéaire de Primer et forment un bassin d’apprêt. Ajouter le volume d’eau calculé par l’algorithme pour diluer la piscine apprêt tel que déterminé à l’étape 2.4.1.
Remarque : Si la méthode algorithme dégradé n’est pas disponible, une autre méthode consiste à diviser les amorces de faible masse et de masse élevée et ajouter le double de la concentration des amorces massives élevées par rapport à la faible groupe de masse. Trois ou quatre groupes peuvent être requis pour un dosage de haute-plex (autrement dit, plus de 19 SNP). Toutefois, cette méthode ne se produira pas comme taux d’appel optimal comme la méthode de gradient algorithm. - Assembler le mélange maître de poste. Pour le dosage faible plex (plex 1-18), ajouter 0,2 μL de tampon, 0,1 μL de mélange de résiliation, 0,94 μL du mélange amorces APL ajusté et 0.0205 μL d’enzyme (préparée sur glace). Pour le dosage élevé de plex (plex 19-36), ajouter double concentration du mélange de résiliation et enzyme (résiliation mix 0,2 μL et iPLEX enzyme 0,041 μL). Se référer au tableau 8.
- Ajouter 2 μl du mélange maître extension réaction à la plaque de la réaction précédente, maintenant ce qui porte le total à 9 μL par puits. Centrifuger brièvement et placer dans le thermocycleur : 94 ° C pendant une incubation initiale de 30 s, 40 cycles de 1 x 94 ° C pendant 5 s avec 5 x (52 ° C pendant 5 s, suivie de 80 ° C pendant 5 s) et puis de 72 ° C pendant 3 min. se reporter au tableau 9.
- Calculer les facteurs de dilution pour chaque amorce en utilisant un algorithme dégradé, disponible à partir de Agena Biosciences (« ajustement linéaire en Primer »), qui règle pour la masse et la concentration de l’amorce et le nombre total d’amorces dans la réaction multiplexée (voir Les tableaux 6 et 7). Entrez la masse UEP pour chaque amorce dans la UEP_MASS de la feuille de l’ajustement linéaire de Primer.
- Purification de la résine.
Remarque : Sels d’excès peuvent donc être supprimées de la réaction avec l’utilisation de résine.- Ajouter 16 μL d’eau déionisée dans les puits de la plaque Récupérée, ce qui porte le volume de la plaque jusqu'à 25 μL.
- Appliquer la résine, habituellement de 6 mg de plaque de résine réactionnelle (achetée séparément), ajuster à la plaque entière. Laissez la résine à sécher la plaque réactionnelle de la résine pendant 20 min à température ambiante avant de l’appliquer à la plaque de réaction. Après addition de la résine, faire pivoter la plaque pendant 5 min à température ambiante à la main ou avec un mélangeur de suspension à une vitesse lente (e.g., 7,5 t/min).
Remarque : Avant le chargement de l’analyte de génotypage sur la puce de génotypage, les échantillons et la mise en page de test doivent être entrées dans l’interface du logiciel. Ceci peut être réalisé en utilisant le fichier de résumé de la conception de l’outil de conception de test.
- Mesure sur une plate-forme de spectrométrie de masse.
- Centrifuger la plaque à 3 200 g pendant 5 min éviter l’application de résine à la puce de spectres de masse.
- Télécharger le schéma des échantillons à l’interface du logiciel du système avant l’exécution.
Note : Étape 2.6.3 doit être effectuée uniquement par personnel qualifié. - Appliquer le mélange d’analyte de génotypage de la plaque à la puce de génotypage avec un système de distribution. Ensuite, chargez la puce sur le système de MALDI-TOF pour générer les spectres de masse du mélange d’analyte, qui peuvent ensuite être interprétées à l’aide de l’interface du logiciel de la plate-forme.
Remarque : Le système génère les spectres de masse par réalisation de courtes impulsions de lumière UV à chaque « pad », correspondant à un seul puits de la plaque de génotypage, de la puce de spectres de masse. Cette impulsion se traduit par désorption et l’ionisation de l’analyte. Ces ionisé ADN molécules sont ensuite propulsés à la tête du tube par un champ électrostatique de haute tension, séparer les ions plus légers, qui se déplacent plus rapidement et d’atteint le détecteur tout d’abord, des ions plus lourdes. Le « temps de vol » de ces analytes sont enregistré par le système, d'où la masse de chaque fragment d’ADN peut être déterminée, et donc la base nucléotide présente au SNP peut être déduite.
3. données de génotypage
Remarque : contrôle de la qualité et l’interprétation des données ne sont pas l’objet de ce document de méthodologie. Toutefois, le texte suivant brièvement couvrira interprétation des spectres de masse.
- Inspection manuelle et contrôle de la qualité des spectres de masse.
Remarque : Les spectres de masse brutes sont générés par le système et analysées avec le logiciel figurant dans la Table des matières. Un mélange gaussien méthode de clustering est appliqué à cette sortie pour faire des appels de génotypage probabiliste.- Ouvrez le logiciel d’analyse. Sélectionnez Typer Analyzer. Dans le menu fichier , sélectionnez Des puits ouverts de fichier et sélectionnez le fichier xml avec les données du spectre générées à l’étape 2.6.3. Le nom de puce pour la course doit être visible, sélectionnez-le et un volet « feu » de la plaque 384 puits s’affiche avec une liste des SNP dans le bien. De là, sélectionnez Appeler Cluster parcelles pour afficher un diagramme de dispersion des points de données pour chaque SNP.
Remarque : Il est recommandé qu’un résultat « sans appel » être demandé au SNP de faible intensité. Dans le logiciel utilisé pour les résultats représentatifs, un seuil de grandeur clustering de 5, qui est supérieur à la valeur par défaut, est suggéré pour le contrôle de qualité rigoureux. Ce paramètre peut être réglé sur le champ de Magnitude Cutoff sous paramètres dans le volet de Post Processing Clusters . Sélectionnez Autocluster dans l’onglet Outils pour exécuter une analyse typologique. - Effectuer une inspection manuelle du génotype appels en examinant les parcelles cartésienne dans le volet de traitement de message. Dans le volet de l’analyse, sélectionnez le SNP d’intérêt et cliquez sur l’onglet Groupes de post-Processing , une parcelle de cluster avec le génotype de cluster sera visible avec ID d’échantillon et génotypes correspondantes pour le SNP.
- Examiner les grappes d’appel génotype et évaluer la façon dont chaque appel individuel grappes avec les autres appels pour le SNP. Le logiciel fournit des lignes de démarcation sur le terrain pour chaque génotype d’orientation ; Voir l’exemple d’un complot de cluster appels génotype de l' IL13 SNP (Figure 1). Si l’appel non cluster étroitement avec les autres appels et se trouve clairement à l’extérieur d’un cluster, ou si elle a de très faible intensité, cliquez avec le bouton droit sur le point de données et sélectionnez Appeler changement manuellement mettre à N° à appeler.
- Pour s’assurer que les données de génotypage de haute qualité sont utilisées pour l’analyse en aval, exclure les SNP et des individus avec des taux d’appel inférieur à un seuil QC, par exemple 90 %. Une fois que les ajustements appropriés ont été apportées aux données appel, exportez les données pour les applications de la statistique. Dans le logiciel utilisé pour générer les résultats représentatifs (énumérés dans la Table des matières), ceci est réalisé avec la sélection de Données de la plaque depuis le menu Affichage et en sélectionnant Enregistrer sous.
- Ouvrez le logiciel d’analyse. Sélectionnez Typer Analyzer. Dans le menu fichier , sélectionnez Des puits ouverts de fichier et sélectionnez le fichier xml avec les données du spectre générées à l’étape 2.6.3. Le nom de puce pour la course doit être visible, sélectionnez-le et un volet « feu » de la plaque 384 puits s’affiche avec une liste des SNP dans le bien. De là, sélectionnez Appeler Cluster parcelles pour afficher un diagramme de dispersion des points de données pour chaque SNP.
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Representative Results
Avec le protocole décrit ci-dessus, nous génotypées tag SNPs dans le gène immunitaire Th2 IL13 dans une cohorte de nourriture allergie cas et témoins9. Nous avons appliqué l’analyse de régression logistique, ajustée pour l’ascendance et autres covariables potentiels, afin de vérifier si les variantes génétiques dans la région d’intérêt augmente les risques d’allergies alimentaires. Tableau 10 9 montre qu’une variante rs1295686 est associée avec l’allergie alimentaire défi a fait ses preuves et nous avons confirmé multiplexé de cette association dans une cohorte de réplication en utilisant la même approche de génotypage. Une méta-analyse des résultats des deux cohortes a fourni des preuves solides de liaison de l’IL13 avec FA (tableau 11)9. Nous génétiquement déduite et ajusté pour ancêtres dans l’analyse en utilisant un ascendance informative SNP panneau de repère, adapté d’un groupe d’experts publiés10. Nous génotypées multiplexé le panneau à l’aide de la même approche de dosage.
La variante associée, rs1295686, a été précédemment identifiée comme un asthme risque locus11 et associée aux autres paramètres immunologiques allergique12, ce qui suggère que peut-être un locus de risque de maladies allergiques générales. Les prochaines étapes serait de mener d’autres études, telles que l’analyse de l’expression différentielle, cartographie des interactions physiques avec une méthode de capture de la chromatine, fine de cartographie de la région, et haplotype analyse, à la broche point la variante fonctionnelle et caractériser la biologie derrière l’association observée avec les allergies alimentaires.
Figure 1 : terrain de cluster cartésienne à l’IL13 SNP rs1295686. Grappes jaunes représentent les appels de génotype homozygote pour l’allèle A, bleu pour l’allèle de G et vert pour les appels hétérozygotes. Les quelques appels de génotype qui ne pas cluster avec soit homozygotes ou hétérozygotes spectres de masse ont été mis pour « sans appel ».
Tableau 1 : Séquences d’amorces utilisées pour générer les résultats représentatifs pour IL13. La colonne nom contient l’ID du SNP, le nombre de puits (tel que mentionné précédemment, le nombre de « bien » désigne l’ID du dosage multiplex) et le type d’apprêt (F pour la marche avant, R pour reverse et UEP pour l’amorce de l’extension). Les prochaines colonnes contiennent la séquence de l’amorce, la taille de l’amorce et le type de purification. Il est à noter que SPINK5 et un panneau marqueurs informatifs ascendance (AIM) ont été génotypés à l’aide de la même épreuve, bien que ces résultats ne sont pas discutés avec les résultats présentés représentatifs. SNP se terminant par _CEU et _CHB renvoient aux SNP objectif pour les européens du Nord de l’Utah et les chinois de Han dans les populations de Beijin, Chine du projet 1000 génomes, respectivement. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.
| Mix Master | Plex faible (≤26 SNP) | Plex élevé (> 26 SNP) | |||
| Réactif | Conc. dans 5 µL | × 1 | × 200 | × 1 | × 200 |
| Eau (déminéralisée) | 1,9 | 380 | 1.8 | 360 | |
| Mémoire tampon | 1 x (2 mM MgCl2) | 0,5 | 100 | 0,5 | 100 |
| MgCl2 | 2 mM | 0,4 | 80 | 0,4 | 80 |
| dNTPs | 500 ΜM | 0,1 | 20 | 0,1 | 20 |
| Apprêt mix ** | 100 nM | 1 | 200 ** | 1 | 200 ** |
| Taq polymérase | 0,5 U DE / 1 U | 0,1 | 20 | 0,2 | 40 |
| Total | 4 ΜL | 800 ΜL | 4 ΜL | 800 ΜL | |
| ** déjà dilué avec désionisée H20 comme indiqué au point 2.1.2 | |||||
Tableau 2 : réactifs et concentrations requises pour rendre l’amorce PCR Amplification mélanger. Les volumes de mélange maître sont donnés pour 200 réactions parce que 400 (assez pour couvrir une plaque 384 puits) ne rentrera pas dans un tube de 1,5 µL et donc 2 x 200 devraient être faits dans des tubes distincts. Volumes spécifiés sous faible Plex doivent être utilisés si le dosage multiplexé « bien » inférieur ou égal à 26 SNP, contient si supérieure à 26 SNP est dans le bien utiliser le Plex haut volumes.
| Conditions de thermocycleur |
| 94 ° C pendant 4 min |
| 45 cycles de (94 ° C, 20 s, 56 ° C 30 s, 72 ° C 1 min) |
| 72 ° C pendant 3 min |
| Cale de 4 ° C |
Tableau 3 : Les conditions de thermocycleur pour l’Amplification PCR.
| Mix Master | × 1 | × 410 |
| Eau (déminéralisée) | 1.53 | 627,3 |
| tampon de 10 × | 0,17 | 69,7 |
| Enzyme SAP (1,7 U/µL) | 0,3 | 123 |
| Total | 2 ΜL | 820 ΜL |
Tableau 4 : réactifs et concentrations des master mix pour la réaction de SAP. Mix Master volumes sont donnés pour 410 réactions couvrir une plaque 384 puits avec une marge d’erreur de pipettage.
| Conditions de thermocycleur |
| 37 ° C pendant 40 min |
| 85 ° C pendant 5 min |
| Cale de 4 ° C |
Tableau 5 : Thermocycleur conditions requises pour la réaction de SAP.
| # | Extension des amorces | Concentration de stock initiale (µM) | Misc. | UEP_ MASSE | Concentration cible de réaction (µM) | Concentration de piscine EXT Primer (µM) | Apprêt de Stock de volume à ajouter à la piscine (µL) |
| 1 | rs36110_CHB | 500 | 4359.8 | 0.560 | 5.36 | 16.09 | |
| 2 | rs10488619_CHB | 500 | 4546 | 0,602 | 5.76 | 17.29 | |
| 3 | rs1986420_CEU | 500 | 4761.1 | 0,648 | 6.21 | 18,62 | |
| 4 | rs2934193_CEU | 500 | 4964.3 | 0,690 | 6.61 | 19,82 | |
| 5 | rs4968382_CEU | 500 | 5047.3 | 0,707 | 6.77 | 20 h 30 | |
| 6 | rs1227647_CEU | 500 | 5136.4 | 0,724 | 6.93 | 20,80 | |
| 7 | rs1402851_CEU | 500 | 5338.5 | 0,763 | 7 h 30 | 21,91 | |
| 8 | rs4705054 | 500 | 5476.6 | 0,788 | 7.55 | 22.64 | |
| 9 | rs6928827 | 500 | 5678.7 | 0,824 | 7.89 | 23.68 | |
| 10 | rs9325072 | 500 | 5762.8 | 0,839 | 8.03 | 24.10 | |
| 11 | rs4841401_CHB | 500 | 5853.9 | 0,855 | 8.18 | 24,55 | |
| 12 | rs11098964_CHB | 500 | 6052.9 | 0.888 | 8.50 | 25.51 | |
| 13 | rs2416504_CHB | 500 | 6174 | 0,908 | 8.69 | 26.08 | |
| 14 | rs1860933 | 500 | 6264.1 | 0,923 | 8.83 | 26.50 | |
| 15 | rs2193595_CHB | 500 | 6391.2 | 0,943 | 9.03 | 27.08 | |
| 16 | rs1519260_CHB | 500 | 6469.2 | 0,955 | 9.14 | 27.43 | |
| 17 | rs11184898_CHB | 500 | 6588.3 | 0,973 | 9.32 | 27,95 | |
| 18 | rs679832_CEU | 500 | 6757.4 | 0,998 | 9.56 | 28,68 | |
| 19 | rs326626_CEU | 500 | 6765.4 | 1.000 | 9,57 | 28.71 | |
| 20 | rs1612904 | 500 | 6873.5 | 1.015 | 9.72 | 29.17 | |
| 21 | rs862942 | 500 | 6960.5 | 1,028 | 9.84 | 29,53 | |
| 22 | rs2486448_CHB | 500 | 7169.7 | 1.058 | 10.13 | 30,38 | |
| 23 | rs4824001_CEU | 500 | 7341.8 | 1.081 | 10 h 35 | 31.06 | |
| 24 | rs6552216_CEU | 500 | 7465.9 | 1.098 | 10.51 | 31.54 | |
| 25 | rs1488299_CHB | 500 | 7620 | 1.119 | 10,71 | 32.13 | |
| 26 | rs1347201_CHB | 500 | 7626 | 1.119 | 10.72 | 32.15 | |
| 27 | rs315280_CHB | 500 | 7747 | 1.135 | 10,87 | 32.60 | |
| 28 | rs11203006_CHB | 500 | 7834.1 | 1,146 | 10.97 | 32,92 | |
| 29 | rs4240793_CHB | 500 | 8036.3 | 1.172 | 11.22 | 33,66 | |
| 30 | rs9325071 | 500 | 8219.4 | 1,194 | 11.43 | 34.30 | |
| 31 | rs12678324_CEU | 500 | 8394.5 | 1.215 | 11.64 | 34,91 | |
| 32 | rs4653130_CEU | 500 | 8455.5 | 1,223 | 11.71 | 35.12 | |
| 33 | rs9275596 | 500 | 8537.6 | 1,232 | 11.80 | 35,39 | |
| 34 | rs12595448_CHB | 500 | 8603.6 | 1.240 | 11.87 | 35,62 | |
| Volume de PCR Grade Rnase libre H2O être ajouté Primer Pool (µL) | 561.78 | ||||||
Tableau 6 : Eh bien 1 amorces ajusté utilisé pour générer les résultats représentatifs. Un tableau des amorces d’extension ajusté selon la taille, y compris la concentration de la cible, le volume utilisé dans la piscine de l’apprêt et la concentration finale pour chaque amorce dans la piscine de l’apprêt pour puit 1. Le volume d’eau nécessaire pour compenser le volume final est fourni au bas de la table. Le volume total de la piscine d’apprêt était de 1,5 mL.
| # | Extension des amorces | Concentration de stock initiale (µM) | Misc. | UEP_ MASSE | Concentration cible de réaction (µM) | Concentration de piscine EXT Primer (µM) | Apprêt de Stock de volume à ajouter à la piscine (µL) |
| 1 | rs10515597 | 500 | 4482.9 | 0,588 | 5.63 | 16.89 | |
| 2 | rs2759281_CEU | 500 | 4921.2 | 0,681 | 6.52 | 19.57 | |
| 3 | rs17641748 | 500 | 5080.3 | 0.713 | 6.83 | 20,48 | |
| 4 | rs1698042_CEU | 500 | 5201.4 | 0,737 | 7.05 | 21.16 | |
| 5 | rs5753625_CHB | 500 | 5411.6 | 0.776 | 7.43 | 22 h 30 | |
| 6 | rs3912537_CEU | 500 | 5811.8 | 0,848 | 8.12 | 24.35 | |
| 7 | rs6141319_CEU | 500 | 5883.8 | 0,860 | 8.23 | 24.70 | |
| 8 | rs1002587_CEU | 500 | 6026.9 | 0,884 | 8.46 | 25,39 | |
| 9 | rs1295686 | 500 | 6172 | 0,908 | 8.69 | 26.07 | |
| 10 | rs16877243_CEU | 500 | 6386.2 | 0,942 | 9.02 | 27.05 | |
| 11 | rs1103811 | 500 | 6595.3 | 0,974 | 9.33 | 27.98 | |
| 12 | rs6510332_CEU | 500 | 6790.4 | 1,003 | 9,61 | 28.82 | |
| 13 | rs6595142_CHB | 500 | 6874.5 | 1,016 | 9.72 | 29.17 | |
| 14 | rs4484738_CEU | 500 | 6966.5 | 1.029 | 9.85 | 29,55 | |
| 15 | rs1432975 | 500 | 7028.6 | 1.038 | 9.94 | 29,81 | |
| 16 | rs10879311_CEU | 500 | 7317.8 | 1.078 | 10.32 | 30,97 | |
| 17 | rs864481 | 500 | 7416.9 | 1,092 | 10 h 45 | 31,35 | |
| 18 | rs1295687 | 500 | 7447.8 | 1,096 | 10.49 | 31,47 | |
| 19 | rs12644851_CHB | 500 | 7634 | 1.120 | 10,73 | 32,18 | |
| 20 | rs4265409_CHB | 500 | 7926.2 | 1,158 | 11.09 | 33,26 | |
| 21 | rs2927385_CHB | 500 | 7997.2 | 1,167 | 11.17 | 33,52 | |
| 22 | rs1538956_CHB | 500 | 8286.4 | 1.202 | 11.51 | 34.54 | |
| Volume de PCR Grade Rnase libre H2O être ajouté Primer Pool (µL) | 899.42 | ||||||
Tableau 7 : bien 2 amorces ajustés utilisées pour produire des résultats représentatifs. Un tableau des amorces d’extension ajusté selon la taille, y compris la concentration de la cible, le volume utilisé dans la piscine de l’apprêt et la concentration finale pour chaque amorce dans la piscine de l’apprêt pour puits 2. Le volume d’eau nécessaire pour compenser le volume final est fourni au bas de la table. Le volume total de la piscine d’apprêt était de 1,5 mL.
| Mix Master | Plex faible (1-18) | Haute Plex (19-36) | ||
| Réactif | × 1 | × 410 | × 1 | × 410 |
| Eau (déminéralisée) | 0.7395 | 303.195 | 0.619 | 253.79 |
| Mémoire tampon | 0,2 | 82 | 0,2 | 82 |
| Mélange de résiliation | 0,1 | 41 | 0,2 | 82 |
| Mélange d’apprêt (LPA ajusté) | 0,94 | 385,4 | 0,94 | 385,4 |
| iPLEX enzyme * | 0,0205 | 8,405 | 0,041 | 16.81 |
| Total | 2 ΜL | 820 ΜL | 2 ΜL | 820 ΜL |
Tableau 8 : concentrations pour la réaction d’extension et réactifs master mix. Dans ce cas les volumes pour Low-Plex réactions devraient servir s’il y a 18 ans ou moins de SNP dans le puits. Pour les SNP 19 ou plus utiliser les volumes de réactions de Plex élevé. Ceci est différent avec les exigences de SNP de plex-basse et haute-plex d’amplification PCR master mix détaillé dans le tableau 2.
| Conditions de thermocycleur |
| 94 ° C pendant 30 s |
| 40 cycles de (94 ° C 5 s, (5 cycles de 52 ° C 5 s, 80 ° C 5 s)) |
| 72 ° C pendant 3 min |
| Cale de 4 ° C |
Tableau 9 : Thermocycleur conditions de la réaction de l’extension
| Allergiques alimentaires cas contrôles allergique de vs non alimentaires | |||||
| SNP | A1 | P | OU | L95 | U95 |
| rs1295686 | A | 0,003 | 1,75 | 1.2 | 2.53 |
| rs2243297 | A | 0,13 | 2.1 | 0,8 | 5.51 |
| rs1295687 | G | 0,19 | 1.63 | 0,78 | 3.41 |
| rs2243211 | A | 0,22 | 1.45 | 0,8 | 2.64 |
| rs1295683 | T | 0.25 | 1.32 | 0,82 | 2.13 |
| rs2243248 | G | 0,51 | 1.21 | 0,69 | 2.11 |
| rs2243300 | T | 0,51 | 1.19 | 0,7 | 2.02 |
| rs1800925 | T | 0,6 | 1.11 | 0,75 | 1.63 |
| rs3091307 | G | 0,62 | 1.1 | 0,75 | 1.6 |
Tableau 10 : Variante rs1295686 de la IL13 locus est associée aux allergies alimentaires défi a fait ses preuves. Analyse de régression logistique, ajustée pour l’ascendance, le sexe et la présence d’eczéma atopique, a révélé cette variante rs1295686 est associé à faute prouvée des allergies alimentaires dans la cohorte de découverte (n = 367 cas et 156 témoins non allergique). La colonne SNP répertorie les marqueurs en cours d’examen, la colonne A1 répertorie l’allèle mineur, utilisé comme l’allèle de référence pour l’essai de l’association. La colonne P répertorie les P-valeurs de l’analyse de régression, la colonne d’OR répertorie les rapports de cotes correspondantes et L95 et U95 sont les limites inférieures et supérieures de l’intervalle de confiance de 95 % de l’analyse. Les données reproduites de Ashely et coll., 20179.
| A. analyse de la réplication : aliments allergiques cas contrôles allergique de vs non alimentaires | B. méta-analyse – découverte et réplication | ||||||||||
| SNP | A1 | OU | L95 | U95 | P | P | P (R) | OU | OR(R) | Q | J’ai |
| rs1295686 | A | 1.37 | 1.03 | 1.82 | 0,03 | 0,0005 | 0,0006 | 1.5 | 1.5 | 0,31 | 3.32 |
| rs1295687 | C | 1.1 | 0,68 | 1,78 | 0,7 | 0,3 | 0,3 | 1.24 | 1.24 | 0,38 | 0 |
Tableau 11 : Réplication dans une population indépendante confirme le lien entre IL13 rs1295686 variante et allergie alimentaire défi a fait ses preuves. La régression logistique, corrigée pour les composantes principales d’ascendance, de sexe et de l’eczéma atopique, dans une population indépendante (n = 203 cas allergiques alimentaires et 330 contrôles non allergique) a confirmé l’association entre la variante rs1295686 et allergie alimentaire. Méta-analyse a été réalisée ensuite, offrant le plus haut niveau de preuve d’un lien entre le SNP et les résultats, avec peu de preuves de l’hétérogénéité des tailles en vigueur entre les deux populations à cette SNP. Ici les colonnes sont selon le tableau 10, avec p (r) supplémentaires et des valeurs OR(R) pour la méta-analyse des effets aléatoires modèles vs modèle à effets fixes (P et ou). Q et moi sommes la P-value pour le test de Cochrane et de l’indice j’ai respectivement, les deux sont des mesures de l’hétérogénéité dans les tailles d’effet entre les études. Les données reproduites de Ashely et coll., 20179.
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Discussion
Ici, nous démontrons la méthode de génotypage multiplexé, spectrométrie de masse. Les résultats représentatifs ont été générés à l’aide de la PCR jumelé avec MALDI-TOF spectrométrie de masse4 avec chimie dosage figurant dans le Tableau des matériaux13. Avec cette plate-forme, nous avons généré un total de 11 295 génotypes 1 255 personnes pour 9 SNP au sein de 40 h en laboratoire.
Nous illustrons l’utilité de la technique en réponse à des hypothèses génétiques en générant et en analyse des données SNP pour le gène candidat IL13 dans une cohorte de cliniques de découverte phénotypée pour les allergies alimentaires et à la réplication indépendante. La plate-forme est relativement robuste pour abaisser la qualité de l’ADN et requiert un minimum matériel de départ, un apport de seulement 10 ng. Des étapes cruciales dans le protocole sont les suivants : Dépannage prudent du processus de conception de test pour assurer l’inclusion de SNP maximale dans les essais multiplexés, amplification réussie des régions ciblées au cours de l’amplification PCR, succès extension de nucléotides lors de la réaction de l’extension et chargement du schéma test et l’échantillon dans le logiciel d’analyse afin que le logiciel d’attribuer avec précision les données de spectres de masse.
Tel que mentionné précédemment, l’outil de conception de test est en outre compatible avec l’utilisation de la souris et le polymorphisme des bovins, à l’homme. Pour autres organismes tels que le microbe ou plante, « autres » peuvent être sélectionnée dans le menu « Organisme ». Toutefois, les étapes automatisées pour trouver SNP proximale et identifier les domaines de l’apprêt optimal ne seront pas disponibles.
Au cours du processus de conception, si un SNP proximal bloque l’identification d’une zone d’amorce optimale, on peut soit retirer le SNP de la conception et sélectionnez un autre en haut LD (p. ex., r2 = 1), ou choisir de concevoir deux amorces, l’un avec la référence allèle de la SNP et un avec l’autre allèle, concevoir une amorce avec l’allèle commun ou masquant le SNP avec une base universelle (p. ex., Inosine). S’il y a un problème avec l’identification d’un site unique pour le primaire, on peut changer les réglages de longueur d’amplicon pour trouver un site unique. Le paramètre par défaut est 80-120 bp, mais cela peut être modifié de bp 60-400. Toutefois, il est à noter que si vous travaillez avec de l’ADN dégradé (par exemple, de tissu FFPE), il n’est pas idéal pour augmenter la longueur de l’amplicon.
Erreurs lors de l’étape de conception de test de l’outil peuvent inclure haute en épingle à cheveux ou potentiels de dimère d’amorce. Ces deux paramètres peuvent être assouplies pour tenter un accommodement les dessins. Toutefois, il est recommandé que les seuils ne sont pas détendus inférieure à 0,8 ; Commencez par 0,9 pour voir si ce paramètre est suffisant pour sauver les SNP et les ramènent à 0,8 seulement si nécessaire. Dans les paramètres avancés, il est possible de modifier le nombre d’itérations de conception (jusqu'à 10) sous l’onglet Multiplex « 4. Essais de conception », ainsi que les meilleurs critères de sélection itération à Plus haute moyenne Multiplex ou Rejette le moins de basse Plex. Augmenter le nombre d’itérations de conception peut être avantageux car l’outil prendra le SNP premier dans l’ordre qu’ils ont été fournis et concevront un dosage. Il vérifie ensuite si le SNP suivant est compatible pour l’essai même multiplex. Ainsi, l’ordre de la matière du SNP. Avec l’option d’itérations multiples sélectionnée, le logiciel randomiser l’ordre des SNP et essayer des autres itérations. Cela peut augmenter le nombre de SNP en mesure d’être conçu dans chaque multiplex ou peut diminuer le nombre de rebuts SNP. Cependant, il viendra aussi à un coût en temps, comme l’outil de conception aura beaucoup plus de temps à cette étape.
Génotypage multiplexé est une approche rapide et abordable pour l’enquête sur les lieux d’intérêt. La méthode est simple et permet le fonctionnement d’environ 760 échantillons de jusqu'à 40-plex SNP en 10 heures, permettant à des dizaines de milliers de génotypes à générer en moins d’un jour14. Les spectres de masse peuvent être analysés facilement avec les outils fournis par la plate-forme.
Certaines restrictions à la plate-forme incluent une perte estimée de 5 à 10 % de SNP risquent d’échouer le processus de conception de test. Parfois, cela peut être corrigé par la sélection d’une autre balise ou proxy SNP. La base de données SNP Annotation de l’Institut Broad et recherche de Proxy (SNAP) est un tel outil qui facilite l’identification du proxy SNP15. Une autre limite du système est qu’il est une plateforme ciblée et donc ne permet pas de grande découverte, comme atteints d’approches à l’échelle du génome. En outre, comme l’approche utilise des proxies tag-SNP pour maximiser la couverture dans l’ensemble de gènes, études de cartographie fine peuvent être par la suite nécessaire afin de déterminer la variante causale précise.
Génotypage multiplexé est toujours une plate-forme utile pour l’interrogatoire de maladie associée SNP identifiés dans les approches d’étude GWA ou hypothèse conduit exploration de gène de candidat et de la voie. Futures applications pour la plate-forme risquent d’être de nouvelles utilisations pour le diagnostic et de dépistage dans des domaines comme le cancer et virologie clinique. Dans l’ensemble, génotypage multiplexée avec la spectrométrie de masse est une méthode de moyen débit rapide, rentable et fiable pour les locus candidat génotypage.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs n’ont aucun remerciements.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Genomic DNA | - | - | 1 μL at a concentration of 5-10 ng/μL |
| Primers: forward and reverse amplification and extension | IDT | - | see manuscript section 1.2.1 on design of primers |
| Deionized water | E.g. Milli-Q water | - | deionized with 18.2 MΩ.cm resistivity |
| Genotyping reagent kit. iPLEX Gold Chemistry reagent set | Agena Bioscience | #10148-2 | includes all reagents for reactions in 2.2.1, 2.3.1 and 2.4.2 , chip and resin |
| PCR plates (384-well) | Abgene | #ABGAB-1384 | For the MassARRAY system plates by Abgene are compatible |
| Micropipettes | single and 8-channel | ||
| Centrifuge | compatible with 384-well plates | ||
| Thermocycler | compatible with PCR programs as detailed in 2.2.4, 2.3.2 and 2.4.3 | ||
| Dimple resin plate | Agena Bioscience | 6mg, 384-well | |
| Plate rotator | |||
| MassARRAY Analyzer 4 System | Agena Biosciences | MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption/ionization – time of flight) Mass Spectrometer. | |
| RS1000 Nanodispenser | Agena Biosciences | ||
| Assay Design Suite | Agena Biosciences | Tool used to design the multiplex genotyping assays | |
| Hot Start Taq | DNA polymerase enzyme | ||
| Resin | Agena Biosciences | Supplied with iPLEX kit |
References
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