Summary
Mikroskobik organizmaların genomik sıralama sırasında kontaminasyon büyük bir sorun olmaya devam etmektedir. İşte, bir tardigrade tek bir örnekten genom genomik DNA tüm genom amplifikasyon olmadan bulaşma riskini en aza indirmek için olduğu kadar az 50 pg ile sıralamak için bir yöntemi göstermektedir.
Abstract
Tardigrades su verildiğinde kuruma ve -ebilmek karşısında zaman denilen anhydrobiosis özgün durumlarına geri dönmek bir ametabolic durumuna girmek mikroskobik hayvanlardır. Genomik nasıl yapılacağını mikroskobik hayvan gibi tardigrades riskleri bakteriyel kontaminasyon bazen hatalı yorumlara, örneğin, yatay gen transferi bu hayvanlarda ölçüde ilgili yol açar. Burada, tardigrade, Hypsibius dujardini, tek bir örnekten genom sıralamak için bir ultralow giriş yöntemi sağlamak. Titiz çamaşır ve kirletici dışlama 50 verimli bir ayıklama birlikte istihdam tarafından ~ 200 pg genomik DNA'sı tek bir kişi, bir DNA sıralama aletle sıralı bir kütüphane inşa. Bu kütüphanelerin son derece tekrarlanabilir ve tarafsız ve sıralı okuma diğer H. dujardini genleri ile Bilişim Analizi kirlenme az miktarda gösterdi. Bu yöntem önceki yöntemleri kullanarak sıralı değil unculturable tardigrades için uygulanabilir.
Introduction
Tardigrades bir ametabolic devlet anhydrobiosis kuruma karşısında zaman denir girebilirsiniz mikroskobik hayvanlardır. Onlar su1,2absorpsiyonu ile yeniden elde etmek. Ametabolic durumda tardigrades aşırı sıcaklıklar3 ve baskıların4,5, ultraviyole ışık6, x ışını ve gama ışınları yüksek bir doz içeren çeşitli en uçtaki çevre, tolere yeteneğine 7 , 8ve kozmik uzay9. Genomik veri anhydrobiosis moleküler mekanizmaları çalışmanın vazgeçilmez bir temelidir.
Tardigrades genom sıralamak için önceki girişimleri bakteriyel kontaminasyon10,11,12,13,14belirtileri göstermiştir. Genomik sıralama böyle küçük organizmalar gelen çok sayıda hayvan gerektirir ve bakteriyel kontaminasyon için eğilimli; Bu nedenle, daha önce bir ultralow giriş yöntemi tardigrade, tek bir örnek başlayan contaminations15riskini en aza indirmek için bir sıralama iletişim kuralı'nı kurduk. Bu verileri kullanarak, biz daha fazla bir yüksek kaliteli içinden ve genom H. dujardini16,17yeniden montajı yaptık. Burada biz bu yöntem tek bir tardigrade kişinin (Şekil 1)dan genomik sıralama için ayrıntılı olarak tarif). Bu sıralama yöntemi doğrulama Bu kağıt odak ve zaten iyice bizim önceki rapor16' tartışıldı.
Bu yöntem iki bölümden oluşur: bir tek tardigrade mümkün olan en düşük kirlenme ve DNA'ın piktogram düzeyleri yüksek kaliteli çıkarılması ile yalıtım. Tardigrade hasret ve antibiyotik yanı sıra su ile iyice durulanır ve herhangi bir bakteriyel kirlenme kaldırılmasını sağlamak için 500 X büyütme ile mikroskop altında görülmektedir. Önceki tahminleri ve ölçümleri tardigrade tek bir kişinin yaklaşık 50-200 pg, donma-çözülme döngüsü veya el ile homojenizasyon kitin exoskeleton çatlama tarafından çıkarılan genomik DNA16, içerdiğini gösterir. Bu genomik DNA Kütüphane İnşaat için gönderilmiş ve DNA sıralama araç üzerinde sıralı. Bir ek Bilişim Analizi yüksek kaliteli sıralama yanı sıra önceki tardigrade sıralama projeleri ile karşılaştırıldığında kontaminasyon düzeyi düşük gösteriyor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. hazırlık
- % 2 özel jel 90 mm plastik kültür çanak ve bir % 1 penisilin/streptomisin DW ile kokteyl 10 mL çözücü olarak distile su (DW) kullanarak hazırlayın. Jel-ebilmek var olmak stok için 2-3 hafta içinde 18 ° C'de ayarla bir kuluçka
Not: herhangi bir depolama jel 10 ° C'den düşük sıcaklık jel ve tardigrades sıkışıp kültür çanak duvar arasında ufacık bir boşluk sonuçlanan özel jel küçüleceği için kaçının.
2. örnek hazırlama ve kirletici dışlama
- Bir tek tardigrade toplamak, hazırlanan agar tabağa yerleştirin ve yıkayın 2 x - 3 x herhangi bir kalan parçacıklar kaldırmak için DW ile.
- Tardigrade 18-22 ° C'de aşırı yemek bağırsak kaldırmak için 24 h için kuluçkaya.
- Aç tardigrade penisilin/streptomisin antibiyotik bakteriyel her türlü kirlilik ve dekontamine hayvan P10 pipet kullanarak bir temiz slayt camına yerleştirin 2-6 h için yerleştirin.
- 500 X büyütme, mikroskop altında tardigrade gözlemlemek ve kalan bakteri olduğunu doğrulayın.
Not: Bir stereomicroscope ile yüksek büyütme en iyi, ama bir optik mikroskobu alternatif olarak olmadan uygulama bir coverslip kullanılabilir. - En çok 5 µL sıvı içeren bir P10 pipet kullanarak bireysel toplamak, düşük-bağlama polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tüp içine yerleştirin ve mümkün olduğunca çok fazla sıvı olarak kaldırın.
Not: Mikrotüpler, PCR tüpleri ve pipet ipuçları tüm DNA kaybını en aza indirmek için düşük bağlama olmalıdır.
Not: en kısa zamanda bir homojenizasyon için hızlı kuruma yürütmek ya da ölüm hayvan genomik DNA önemli ölçüde zarar verebilir.
3. homojenizasyon ve DNA ekstraksiyon
- Hayvan genomik DNA'sının (gDNA) edinmek için aşağıdaki yöntemlerden biriyle lunaparkçı.
Not: Diğer setleri (sütun ve boncuk göre) bu son derece düşük giriş etkili değildir için Malzemeler tablo aşağıdaki DNA ekstraksiyon adımları konusunda gösterilen belirtilen kiti kullanmak için önemlidir. Genomik lizis arabellek kullanmadan % 0.5 beta-mercaptoethanol önce ile tedarik edilmektedir.- Donma-çözülme çevrimleri18hayvanla lunaparkçı.
- Hemen adım 2.5, ekleyin lizis arabelleği 100 µL PCR tüp tardigrade içeren.
- PCR tüp sıvı azot 10 dakika ve 10 dakika, yere taşıyın 37 ° c sıcak bir ısı blok 2 x bu adımı yineleyin.
Not: homojenizasyon yeterli değildir veya el ile kırma sonra gerçekleştirilen bu adımı tekrar edilebilir.
- El ile hayvan ezmek.
- Hemen altında bir stereomicroscope adımı 2.5, ardından hayvan PCR tüp duvara basarak bireysel pipet P10 ucu ile crush ve hemen 100 µL lizis arabelleği ekleyin.
Not: Bu yordam bir stereomicroscope altında tardigrade kolayca uzakta kayma olabilir ve verimsiz kırma gDNA ayıklamak için bir başarısızlık neden olur çünkü gözlemlemek için önemlidir. Böylece lizis arabellek organizma sızmak olabilir tardigrade kütikül kırık olduğundan emin olun.
- Hemen altında bir stereomicroscope adımı 2.5, ardından hayvan PCR tüp duvara basarak bireysel pipet P10 ucu ile crush ve hemen 100 µL lizis arabelleği ekleyin.
- Donma-çözülme çevrimleri18hayvanla lunaparkçı.
- Tüp lizis gerçekleşmesi için oda sıcaklığında 30 dk için kuluçkaya.
Not: En az 30 dk verimli bir lizis için gereklidir, ancak kuluçka daha uzun olabilir. - Tam birim (100 µL) bir temiz 1.5 mL düşük-bağlama microtube lizis karışımı aktarın.
- Homojenizasyon için kullanılan ve şimdi boş düşük-bağlama PCR tüp 100 µL lizis arabelleği ekleyin ve karışımı pipetting sonra adım 3.3 kullanılan 1.5 mL düşük-bağlama microtube aktarmak. 2 x bu adımı yineleyin.
- Adım 3.4, olduğu gibi düşük-bağlama PCR tüp lizis arabelleği 300 µL ekleyin ve pipetting sonra karışım 1.5 mL düşük-bağlama microtube için hareket. 1.5 mL düşük-bağlama microtube 600 µL karışımı bu adımdan sonra içermelidir.
Not: Birden çok kez örnek yıkayarak PCR tüp duvara bağlı gDNA kaybını en aza indirmek için aşağıdaki adımları vardır. - 600 µL lizis karışımı toplam bir toplama tüpü spin sütun ekleyin ve 1 dk. için 10.000 x g, santrifüj kapasitesi.
- Aracılığıyla akış için sütun yeniden uygulamak ve 10.000 x g 1 dk. için de santrifüj kapasitesi.
Not: Bu emin olmak için kritik bir adımdır gDNA çoğu sütuna bağlı. - Yıkama arabelleği 500 µL spin sütununu ekleyin ve 10.000 x g 1 dk. Transfer de temiz 1.5 mL microtube spin kolona santrifüj kapasitesi.
- 10 mm Tris-HCl, pH 8,5, spin sütun, 5 min için beklemek için oda sıcaklığında 20 µL uygulamak ve 1 dk. için 10.000 x g, santrifüj kapasitesi.
Not: Kütüphane hazırlık enzimler ile müdahale için elüsyon arabellek EDTA, içermemelidir. - Akış üzerinden spin sütun ve kuluçka oda sıcaklığında 5 dk sonra yeniden uygulayın, 10.000 x g, 1 dk santrifüj kapasitesi.
Not: Bu sütuna bağlı gDNA maksimal elüsyon sağlamak için kritik bir adımdır.
4. Kütüphane inşaat sırası
-
DNA fragmantasyonu
- 1dk bir masa üstü microcentrifuge kullanarak için tüp santrifüj kapasitesi ve gDNA eluant 15 µL 15-µL microtube DNA fragmantasyonu için transfer.
Not: Malzemeler tablo gösterilen belirtilen microtube düşük bir giriş için en uygunudur. Düşük hacimli sonication ile parçalanma çok önemlidir ve bu DNA son derece düşük konsantrasyonu nedeniyle enzimatik parçalanma ile yerine olamaz. - 550 gDNA parçası bp.
Not: Biz kullanılan 550 bp ayarları aşağıdaki gibidir: tepe olay gücü = 30 W, görev faktörü = % 20, devir-de patlama = 50, tedavi süresi = 23 s. - Tam bir pipetting sonra parçalanmış DNA karışımı 10 µL temiz düşük bağlama PCR tüp aktarın.
Not: Deneme burada durdurulabilir. 4 ° C veya-20 ° c DNA korumak
- 1dk bir masa üstü microcentrifuge kullanarak için tüp santrifüj kapasitesi ve gDNA eluant 15 µL 15-µL microtube DNA fragmantasyonu için transfer.
-
Kütüphane inşaat sırası
Not: Belirtilen kiti Malzemeler tablo giriş DNA düşük miktar nedeniyle aşağıdaki yordamları kullanmak için kesinlikle önemlidir.- Şablon hazırlama arabelleğinin 2 µL ve 1 µL şablon hazırlama enzim ve onları iyice bir pipet ile karıştırın.
- Şablon hazırlama reaksiyon termal cycler aşağıdaki koşullar ile gerçekleştirmek: 25 dk, 55 ° C 20 dk, 4 ° C tutun ve 101-105 ° C'de ısıtılmış bir kapak için 22 ° C Reaksiyon tamamlandığında, sonraki adıma geçin.
- 1 µL Kütüphane sentez arabelleği ve Kütüphane sentez enzim 1 µL şablon hazırlama reaksiyon ürünü için ekleyin ve karışımı 40 dk 22 ° C'de (4 ° C'de beklemeye ile) kuluçkaya. Reaksiyon tamamlandığında, sonraki adıma geçin.
- 30 µL Kütüphane amplifikasyon ana Mix (25 µL Kütüphane amplifikasyon arabelleği, 1 µL Kütüphane amplifikasyon enzim ve 4 µL nükleaz ücretsiz su) ve dizin oluşturma reaktif 5 µL ekleyin.
- Her şey iyice bir pipet ile karıştırın ve karışımı kısa bir süre ile masa üstü bir santrifüj santrifüj kapasitesi.
- Tablo 1' de sunulan koşulları ile bir PCR gerçekleştirin.
| Sıcaklık | Zaman | Döngüleri |
| 72 ˚C | 3 dakika | |
| 85 ˚C | 2 dakika | |
| 98 ˚C | 2 dakika | |
| 98 ˚C | 20 saniye | 4 döngüleri |
| 67 ˚C | 20 saniye | |
| 72 ˚C | 40 saniye | |
| 98 ˚C | 20 saniye | 16 döngüleri |
| 72 ˚C | 50 saniye | |
| 4 ˚C | Basılı tutun |
Tablo 1: PCR koşulları.
-
PCR ürünlerinin arıtma
Not: Bu adımı diğer arıtma yöntemleri ile yedek olabilir. Alternatif bir yöntem kullanılırsa, bir spektrofotometre kullanarak elde edilen DNA saflık için kontrol etmek emin olun. 260/280 ve 260 absorbans oranları/230 her ikisi de 1.8 olması gerekir.- Manyetik boncuklar 50 µL eklemek için çözüm 10 pipette x ve kısa bir süre ile bir masa üstü microcentrifuge santrifüj kapasitesi.
- Oda sıcaklığında 2 min için çözüm kuluçkaya.
- 5 min için manyetik bir stand üzerinde kuluçkaya veya çözüm tamamen şeklini alıncaya kadar Sil ve süpernatant kaldır.
- Düşük-bağlama PCR tüp bir mıknatıs stand taze hazırlanmış %80 etanol 200 µL eklemek, 30 s ve Kaldır süpernatant bekleyin. 2 x bu adımı yineleyin. Boncuk rahatsız etmeyin.
- Kısa bir süre düşük-bağlama PCR tüp ile masa üstü bir santrifüj santrifüj kapasitesi ve herhangi bir aşırı etanol manyetik stand kaldırın. Boncuk kuruması ama •kızılötesi kaçının.
- Boncuk 10 mm Tris-HCl, pH 8,5 15 µL ile resuspend, iyice manyetik boncuklar homojen dağılımı yapılır böylece çözüm pipette, oda sıcaklığında ve kısa aralıklarla sonra 2 dk için tüp kuluçkaya, manyetik bir stand 2 için kuluçkaya dk kadar çözüm açıktır.
Not: sıralama kimya ile müdahale için elüsyon arabellek EDTA, içermemelidir. - Süpernatant, yeni bir düşük-bağlama PCR Tube Pelet bozmadan aktarın.
Not: Deneme burada durdurulabilir. DNA'sı 4 ° C'de veya uzun süreli depolama için-20 ° C'de korumak.
5. kalite kontrol, miktar ve DNA dizisi
Not: Kalite kontrolü açılmadan önce DNA düşük miktar nedeniyle bu adım gerçekleştirilir değil.
-
DNA Kütüphane boyutu dağıtım doğrulama
Not: dijital boyut dağılımı raporlama ile diğer yüksek-duyarlı elektroforez sistemleri kullanılabilir.- Elektroforez arabellek reaktif dönün ve kartuş (Aralık 25-1000 bp) Oda sıcaklığında için jel.
- Elektroforez arabellek reaktif 3 µL 1 µL sıralama kitaplığı ile eklemek ve bunları bir girdap ile 1 dakika iyice karıştırın ve kısa bir süre onları ile masa üstü bir santrifüj santrifüj kapasitesi.
- Elektroforez kuralları ve ilişkili yazılım Kütüphane boyutu dağılımıyla doğrulayabilirsiniz. Ana parçası en yüksek geniş yaklaşık 300 1.000 arasında değişen bp.
-
DNA miktar
Not: Diğer floresans tabanlı Yöntemler veya kantitatif PCR da kullanılabilir, ancak sıralama kitaplıkları miktarının için doğru değil gibi spectrophotometry kaçınılmalıdır.- 796 µL çözüm arabelleği ve floresan reaktif 4 µL ekleyip iyice karıştırın. 190 µL çalışma çözüm için iki tahlil tüp ve bir tahlil tüp için 197 µL dağıtmak.
- Standartlar 10 µL DNA bilinen konsantrasyonları 190 µL çalışma çözüm içeren her tahlil Tube ile ve 3 µL 197 µL çalışma çözüm içeren tahlil tüp hazır kitaplığına ekleyin.
- Girdap kısaca tüpler ve onları bir masa üstü santrifüj santrifüj kapasitesi. Bir yer 3-µL ayarları kullanılarak DNA ölçmek.
-
DNA Kitaplığı dizisi
Not: Sıralama platformu belirtilen kitaplık inşaat kiti ile uyumlu olması gerekir.- Üreticinin protokolüne dayalı sıralama kitaplığı hazırlayın.
- Reaktif kaset ve akış hücre sıralama araç ayarlamak ve üreticinin iletişim kuralı takip bilgi çalıştırın sıralama girin.
- Nasıl yapılacağını çalıştırın.
Not: Biz iki sıralama çalışması yaptık: dört örnekleri bir vadede multiplexed yanı sıra bir örnek/çalıştır.
6. sayısal analiz
- Base-çağrı ve gerekirse, okuma demultiplex.
- FastQC19sıra verilerle kalitesini doğrulamak.
Not: elde edilen verileri daha ayrıntılı doğrulamak için bizim önceki rapor16bakın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kirletici dışlama:
Bu iletişim kuralı tardigrade ve sterilizasyon kirlenme en aza indirmek için antibiyotik tedavisi ile kapsamlı bir çamaşır içerir. Aynı zamanda bu süreçlerin bütünlüğü sağlamak için görsel bir denetimi işlemi gerektirir. (Adım 2.4 Protokolü) doğrulama sırasında yapılan bir mikroskop görüntüsü Şekil 2' de gösterilmiştir. 500 X büyütme oranında gözlenen, bakteri hücreleri tek tek tardigrade hareket küçük parçacıklar olarak görülebilir.
Doğrulama DNA Kütüphane kalite:
İnşa DNA-Seq Kütüphane toplam miktarı yaklaşık 109.5 ng (7,3 ng/µL x 15 µL)16' dır. Parçalanma uzunluğu dağıtım doğrulamak için bir elektroforez desen benzer olmalıdır Şekil 3. Parçalanma boyutu 550 için ayarladığınız gibi bp bir DNA kesme sistemi ile Kütüphane 550-600 bp, sıralama bağdaştırıcıları dahil olmalıdır. Sıra Kütüphane çoğunluğu 200-1000 bp arasında yer alıyor ve çoğaltır (N1 - N4) arasında tutarlıdır görülebilmektedir.
Dizi veri analizi:
DNA'sı nasıl yapılacağını yaklaşık 20 - 25-M için eşleştirilmiş okuma başına oluşturulan. Kalite doğrulama FastQC (Şekil 4) kullanılarak yapılmıştır. Sıralı okuma boyunca kalite tipik bir 300-bp eşleştirilmiş çalıştırmak dağılımıdır.
Resim 1: iş akışı bu protokol. Bu rakam bu iletişim kuralı bir özetini gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Bir bakteri-özgür tardigrade temsili fotoğrafı. Bu şekilde kirlenmiş (sol) tardigrade ve temizlenmiş (sağda) tardigrade (Hypsibius dujardini), görüntüleri ile birlikte daha fazla büyütülmüş görüntü (alt) gösterilir. Çubuk şeklinde hücrelerin etrafında tardigrade kirleticiler vardır ve bir ok ile gösterilir. Ölçek çubuğu 100 µm. gösterir Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Parça uzunluğu dağıtım inşa DNA kitaplığının doğrulanmasını. Bu panel sıralama Kütüphane boyutu dağılımı gösterir. Mor ve yeşil çizgiler, 1.500 ve 25 bp, alt ve üst işaretleri, sırasıyla gösterir. L merdiven, S = = örnek/Çalıştır, 1 N1 - N4 = çoğaltır/Çalıştır 4. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : DNA-Seq kalite doğrulama örnekle FastQC. DNA-Seq veri sırası performans doğrulamak için FastQC sunuldu. Temel sıra kalite başına temsil edici bir sonuç DRR055040 için (DDBJ sıra okuma arşiv DRA00445516) gösterilir. (A) Bu panel gösterir ileri okuma (R1). (B) Bu panel geriye doğru okuma (R2) gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bakteriyel kontaminasyon Mikroskobik organizmaların genomik sıralama için bir tehdit oluşturuyor. Önceki çalışmalarda tardigrade genom sıralama üzerinde geniş Bilişim yöntemleri12,20kullanarak kirlenme filtre iken, genom contaminations riskini en aza indirmek için tek bir kişi üzerinden sıralı. Bireysel bir tardigrade yaklaşık 50-200 pg genomik DNA16 içerir ve kitin exoskeleton kalın bir tabaka kaplı, kirleticiler ve yüksek kaliteli DNA ekstraksiyon dışlanması bu protokolündeki kritik noktaları vardır. Varolan tardigrades kültürler aseptik değildir ve bu yüzey, hem de onların bağırsak yiyecek kalıntıları kirletici çok vahşi taşımak toplanır. Önceki genom sıralama projeleri tardigrades 10.000-100.000 bireylerin topluca olarak sonuçları tarafından bakteriyel kirletici madde etkisinde çok olasıdır anlamına gelir bir örnek12,14, sıralı. Bunlar raporda, Boothby vd. H. dujardini bireyler kendi negatif fototaksis davranış14kullanarak toplanan ve grubun herhangi bir anti-bakteriyel yöntemleri istihdam değil.
Kirletici maddeler varsa görsel olarak incelemek için tardigrade antibiyotik (penisilin/streptomisin) içinde inkübe ve bireysel 500 X mikroskopla inceledi. Tek bir kişinin yalıtma ve dikkatli bir şekilde herhangi bir kirletici için teftiş, mümkün contaminations riskini en aza indirilmiştir. Kirlenme seviyesinin düşük sıralama verilerden iyi16olarak teyit edildi. DNA ekstraksiyon gelince, biz el ile homojenizasyon, hem de termal homojenizasyon18istihdam. Sıvı azot ve 37 ° C tardigrade bireysel göndererek, çatlaklar kitin exoskeleton indüklenen ve lizis arabellek vücut nüfuz ve hücreleri parçalayıcı başardı. DNA verim beklenenden daha düşük kaldığında, termal ve el ile homojenizasyon verimi en üst düzeye çıkarmak için yürütülen.
Bu makalede yöntemi bazı sınırlamaları vardır. İlk olarak, homojenizasyon donma-çözülme döngüsü tarafından nematodlar üzerinde bir çalışma uygulandı; Böylece, yöntem yalnızca ecdysozoa karşı etkili olabilir. İkinci olarak, DNA dizisi Kütüphane aşamasında DNA parçalarının amplifikasyon nedeniyle PCR hata olasılığını göz ardı edilemez. Böylece, sıralı veri yüksek doğruluk okuma gerektiren analiz için tavsiye edilmez (yani, SNP Analizi). İletişim kuralında belirttiğimiz gibi Ayrıca, Malzemeler tablo gösterilen belirtilen SNA-Seq kit kullanımı kesinlikle, giriş DNA düşük miktar nedeniyle önemlidir. Bu DNA Kütüphane inşaat kiti Illumina adaptör dizileri amplifikasyon önce ligates; Bu nedenle, bu kütüphane PacBio veya Nanopore teknolojisini kullanarak uzun okunur sıralama için uygulanamaz. Son olarak, kalite kontrolü inşa DNA Kütüphane bu protokol sırasında yalnızca bir kez, sıralama kitaplığı inşaat sonra oluşur. Bu DNA düşük giriş nedeniyle beri çoğu DNA miktar ve Elektroforez yöntemleri 50-200 pg DNA'ın algılayamaz. Bu nedenle, yalnızca PCR güçlendirme sonra kalite kontrolleri, Elektroforez (Şekil 1) ve quantifications, floresans tabanlı gibi yaptık.
Biyoinformatik analizleri bu verilerin tam bir tartışma Bu makalenin kapsamı dışında olduğunu; Ancak, kısa bir süre çeşitli analizler biz yaptık belirttiler. Kalite kontrolü FastQC19 ile sıralama veri Bankası başına nitelikleri, sıra çoğaltılması, doğrulanmış vb sıralı veri genom derlemesi için teslim edilebilir hesaplar. Biz MaSuRCA v3.1.321 ile 132 Mb genom oluşturduk ve BWA22 ve QualiMap23 diğer H. dujardini genom derlemeler16ile bu DNA sıralama kütüphanesi ile hesaplanan eşleme istatistikleri karşılaştırıldığında var. Ayrıca, biz de bu DNA sıralama veri bizim çalışma17' kirletici maddeleri hariç tutma için kullanılan ve sıralı okuma genom eşit olarak dağıtılır gözlemledim.
Tardigrades24ile olduğu gibi çoğu projeler olmayan model organizmalar üzerinde yeterli örnek malzeme kültür başlatın. Kültür teknikleri teknik gelişmeler tardigrade kültür, yüksek miktarlarda etkin ama geçerli kültür yöntemleri değildir henüz aseptik ve en tardigrades laboratuarlarda hala unculturable, genom yapmak neredeyse imkansız oldu veya transcriptome sıralama. Bu tek bir kişinin DNA sıralama yönteminden daha az inceledik deniz türleri de dahil olmak üzere nadir tardigrade tür analiz olanak sağlar. Bir daha geniş phyletic alanı karşılaştırmalı genomik yaparak, tardigrades anhydrobiosis mekanizmaları daha fazla anlayış elde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Yazarlar Nozomi Abe, Yuki Takai ve Nahoko Ishii genomik sıralama ve teknik destek için teşekkür ederiz. Bu eser Grant-in-Aid tarafından Japonya Derneği Bilim promosyon (JSP'ler) araştırma görevlisi, genç bilim adamları (No.22681029) için KAKENHI Grant-in-Aid ve KAKENHI Grant-in-Aid için bilimsel araştırma (B), No. 17 H JSP'ler, 03620 tarafından desteklenmiştir bir Sumitomo Vakfı (No.140340) ve araştırma fonları Yamagata Kagawa hükümet ve Tsuruoka City, Japonya tarafından kısmen temel bilim araştırma projeleri için Grant. Tardigrades beslemek için kullanılan chlorella vulgaris Chlorella Sanayi LTD. nezaket sağlandı
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SZ61 microscope | OLYMPUS | ||
| BactoAgar | Difco Laboratories | 214010 | |
| Penicillin Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco by life technologies | 15140-148 | |
| VHX-5000 System | Keyence | ||
| 0.2mL Silicone coating tube | Bio Medical Science | BC-bmb20200 | |
| Quick-DNA Microprep Kit | ZYMO Research | D3021 | Use of this kit is absolutey critical; see step 3.1 |
| 1.5 mL microtube | greiner bio-one | 616-201 | See 4.1.1 |
| HIgh speed refrigerated micro centrifuge | TOMY | MX-307 | |
| Covaris M220 | Covaris Inc. | 4482277 | |
| ThruPLEX DNA-Seq kit | Rubicon Genomics | CAT. NO. R400406 | Use of this kit is absolutey critical; see step 4.2 |
| Thermal Cycler | Bioer Technology | TC-96GHbC | |
| AMPure XP reagent | BECKMAN COULTER Life Science | A63881 | |
| Ethanol | Wako | 054-027335 | |
| EB buffer | QIAGEN | 19086 | |
| 2200 TapeStation | Agilent | G2965AA | |
| D1000 Reagents | Agilent | 5067-5583 | |
| D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5582 | |
| Qubit dsDNA BR Buffer/Reagent | ThermoFisher Scientific | Q32850 | |
| Cubee Mini-Centrifuge | RecenttecGenereach | R5-AQBD01aqbd | |
| MiSeq 600 cycle v3 | Illumina Inc. | MS-102-3003 | |
| MiSeq Sequencer | Illumina Inc. | SY-410-1003 |
References
- Crowe, J. H., Hoekstra, F. A., Crowe, L. M. Anhydrobiosis. Annual Review of Physiology. 54 (1), 579-599 (1992).
- Mobjerg, N., et al. Survival in extreme environments - on the current knowledge of adaptations in tardigrades. Acta Physiologica. 202 (3), 409-420 (2011).
- Becquerel, P. La suspension de la vieau dessous de 1/20 K absolu par demagnetization adiabatique de L'alun de fer dans le vide les plus eléve. Comptes Rendus de l'Académie des Sciences. 231, 261-264 (1950).
- Ono, F., et al. Effect of ultra-high pressure on small animals, tardigrades and Artemia. Cogent Physics. 3 (1), 1167575 (2016).
- Horikawa, D. D., et al. Tolerance of anhydrobiotic eggs of the Tardigrade Ramazzottius varieornatus to extreme environments. Astrobiology. 12 (4), 283-289 (2012).
- Horikawa, D. D., et al. Analysis of DNA repair and protection in the Tardigrade Ramazzottius varieornatus and Hypsibius dujardini after exposure to UVC radiation. PLoS One. 8 (6), e64793 (2013).
- Horikawa, D. D., et al. Radiation tolerance in the tardigrade Milnesium tardigradum. International Journal of Radiation Biology. 82 (12), 843-848 (2006).
- May, R. M., Maria, M., Gumard, J. Action différentielle des rayons x et ultraviolets sur le tardigrade Macrobiotus areolatus, a L'état actif et desséché. Bulletin Biologique de la France et de la Belgique. 98, 349-367 (1964).
- Jonsson, K. I., Harms-Ringdahl, M., Torudd, J. Radiation tolerance in the eutardigrade Richtersius coronifer. International Journal of Radiation Biology. 81 (9), 649-656 (2005).
- Bemm, F., Weiss, C. L., Schultz, J., Forster, F. Genome of a tardigrade: Horizontal gene transfer or bacterial contamination? Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (22), E3054-E3056 (2016).
- Delmont, T. O., Eren, A. M. Identifying contamination with advanced visualization and analysis practices: metagenomic approaches for eukaryotic genome assemblies. PeerJ. 4, e1839 (2016).
- Koutsovoulos, G., et al. No evidence for extensive horizontal gene transfer in the genome of the tardigrade Hypsibius dujardini. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (18), 5053-5058 (2016).
- Boothby, T. C., Goldstein, B., et al. Reply to Bemm et al. and Arakawa: Identifying foreign genes in independent Hypsibius dujardini genome assemblies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (22), E3058-E3061 (2016).
- Boothby, T. C., et al. Evidence for extensive horizontal gene transfer from the draft genome of a tardigrade. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (52), 15976-15981 (2015).
- Arakawa, K. No evidence for extensive horizontal gene transfer from the draft genome of a tardigrade. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (22), E3057 (2016).
- Arakawa, K., Yoshida, Y., Tomita, M. Genome sequencing of a single tardigrade Hypsibius dujardini individual. Scientific Data. 3, 160063 (2016).
- Yoshida, Y., et al. Comparative genomics of the tardigrades Hypsibius dujardini and Ramazzottius varieornatus. PLoS Biology. 15 (7), e2002266 (2017).
- He, F. Total RNA Extraction from C. elegans. Bio-protocol. Bio101, e47 (2011).
- Andrews, S. FastQC a quality-control tool for high-throughput sequence data. , http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2015).
- Hashimoto, T., et al. Extremotolerant tardigrade genome and improved radiotolerance of human cultured cells by tardigrade-unique protein. Nature Communications. 7, 12808 (2016).
- Zimin, A. V., et al. The MaSuRCA genome assembler. Bioinformatics. 29 (21), 2669-2677 (2013).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).
- Okonechnikov, K., Conesa, A., Garcia-Alcalde, F. Qualimap 2: advanced multi-sample quality control for high-throughput sequencing data. Bioinformatics. 32 (2), 292-294 (2016).
- Horikawa, D. D., et al. Establishment of a rearing system of the extremotolerant tardigrade Ramazzottius varieornatus: a new model animal for astrobiology. Astrobiology. 8 (3), 549-556 (2008).
