Summary
Kontaminering under genomisk sekvensering av mikroskopiska organismer är fortfarande ett stort problem. Här visar vi en metod att sekvensera genomet hos en trögkrypare från ett enda exemplar med så lite som 50 pg av genomisk DNA utan hela genomet förstärkning för att minimera risken för kontaminering.
Abstract
Tardigrades är mikroskopiska djur som anger en ametabolic stat kallas anhydrobiosis inför uttorkning och kan återgå till sitt ursprungliga skick när vatten tillhandahålls. Genomisk sekvensering av mikroskopiska djur såsom tardigrades risker bakteriell kontamination som ibland leder till felaktiga tolkningar, till exempel angående omfattningen av horisontell genöverföring i dessa djur. Här ger vi en ultralåga inmatningsmetod för att sekvensera genomet hos trögkrypare, Echiniscus paret, från ett enda exemplar. Genom att anställa noggrann tvätt och föroreningars utslagning tillsammans med en effektiv utvinning av 50 ~ 200 pg genomiskt DNA från en enda individ, vi konstruerat ett bibliotek sekvenseras med ett instrument för DNA-sekvensering. Dessa bibliotek var mycket reproducerbara och opartisk, och en informatik analys av sekvenserade läser med andra H. paret genomen visade en minimal mängd av förorening. Denna metod kan tillämpas på unculturable tardigrades som inte kunde sekvenseras med föregående metoder.
Introduction
Tardigrades är mikroskopiska djur som kan ange en ametabolic stat kallas anhydrobiosis inför uttorkning. De återställa genom absorption av vatten1,2. I den ametabolic staten klarar tardigrades av att tolerera olika extrema miljöer, bland annat extrema temperaturer3 och tryck4,5, en hög dos av ultraviolett ljus6, röntgenstrålar och gammastrålar 7 , 8och kosmiska rymden9. Genomisk data utgör en oumbärlig grund för studier av molekylära mekanismer för anhydrobiosis.
Tidigare försök att sekvensera genomet hos tardigrades har visat tecken på bakteriell kontamination10,11,12,13,14. Genomisk sekvensering från sådana små organismer kräver ett stort antal djur och är benägna att bakteriell kontamination; Därför har vi tidigare konstaterat ett sekvensering protokoll med en ultralåga inmatningsmetod start från en enstaka exemplar av trögkrypare, för att minimera risken för föroreningar15. Med hjälp av dessa data, har vi ytterligare genomfört en högkvalitativ återställande och ihopsättning av genomet hos H. paret16,17. Här beskriver vi i detalj denna metod för genomisk sekvensering från en enda tardigrade individ ()figur 1). Validering av denna sekvensering metod är utöver fokus i denna uppsats och har redan diskuterats ingående i vårt föregående rapport16.
Denna metod består av två delar: isolering av en enda trögkrypare med den lägsta möjligt föroreningar och hög kvalitet extraktion av piktogram nivåer av DNA. Trögkrypare är utsvulten och sköljas grundligt med vatten, samt antibiotika och observerade under ett Mikroskop med 500 X förstoring för avlägsnande av någon bakteriell kontamination. Tidigare bedömningar och mätningar visar att en enda individ av trögkrypare innehåller ungefärligt 50-200 pg genomisk DNA16, som utvinns av sprickbildning Chitinen exoskelett genom frysning-tining cykler eller genom manuell homogenisering. Detta genomiskt DNA lämnas till biblioteket konstruktion och sekvenserade i ett instrument för DNA-sekvensering. En ytterligare informatik analys visar hög kvalitet sekvensering, samt låga halter av föroreningar jämfört med tidigare tardigrade sekvensering projekt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. beredning
- Förbered 2% agarosgel med destillerat vatten (DW) som lösningsmedel i en 90-mm plast kultur maträtt, och 10 mL av en 1% penicillin/streptomycin cocktail med DW. Gelen kan förvaras i 2-3 veckor i en inkubator inställd på 18 ° C.
Obs: Undvik all lagring av gelen under 10 ° C, för den låga temperaturen kommer att krympa i agarosgel, vilket resulterar i en mycket liten klyfta mellan gel och kultur maträtt väggen där tardigrades kan fastna.
2. prov förberedelse och föroreningars utslagning
- Samla en enda trögkrypare, placera den på den förberedda agarplattan och tvätta det 2 x - 3 x med DW ta bort eventuella kvarvarande partiklar.
- Inkubera i trögkrypare på 18-22 ° C under 24 h ta bort eventuella överskott mat från tarmarna.
- Placera den utsvultna trögkrypare i penicillin/streptomycin antibiotika för 2-6 h ta bort någon bakteriell kontaminering och placera dekontaminerad djuret på en ren bild glas med P10 pipett.
- Observera trögkrypare i Mikroskop vid 500 gångers förstoring och bekräfta att det inte finns några kvarvarande bakterier.
Obs: Den höga förstoringen med ett stereomikroskop är optimalt, men ett ljusmikroskop kan användas alternativt utan tillämpa ett täckglas. - Samla den individ som använder en P10-pipett med högst 5 µL vätska, placera den i ett låg-bindande polymeras-kedjereaktion (PCR) rör och ta bort så mycket överflödig vätska som möjligt.
Obs: De mikrorör, PCR-rören och pipettspetsar bör alla vara låg bindning till minimera förlusten av DNA.
Obs: Genomföra en homogenisering så snart som möjligt, för snabb uttorkning eller djuret kan avsevärt skada genomisk DNA.
3. homogenisering och DNA-extraktion
- Homogenisera djuret för att få dess genomiskt DNA (gDNA) med en av följande metoder.
Obs: Det är viktigt att använda den angivna kit som visas i Tabellen för material i följande DNA extraktion, för andra Kit (antingen kolumn och pärla baserat) inte är effektiva på detta extremt låg input. Den genomiska lyseringsbuffert har levererats med 0,5% beta-merkaptoetanol före användning.- Homogenisera djuret med frysning-och-tining cykler18.
- Omedelbart efter steg 2.5, tillsätt 100 µL lyseringsbuffert till PCR-röret som innehåller trögkrypare.
- Placera PCR-röret i flytande kväve för 10 min och 10 min, flytta den till ett värme block värmas till 37 ° C. Upprepa detta steg 2 x.
Obs: Detta steg kan upprepas när homogenisering inte är tillräcklig eller kan utföras efter manuell krossning.
- Manuellt krossa djuret.
- Direkt efter steg 2.5, under ett stereomikroskop, krossa individen med P10 spetsen på pipetten genom att trycka på djuret mot väggens PCR-röret och omedelbart Tillsätt 100 μl lyseringsbuffert.
Obs: Det är viktigt att följa proceduren under ett stereomikroskop, eftersom trögkrypare kanna lätt glida bort, och ineffektiva krossning kommer att resultera i ett misslyckande att extrahera gDNA. Kontrollera att tardigrade nagelbanden är bruten så att lysisbuffert kan infiltrera organismen.
- Direkt efter steg 2.5, under ett stereomikroskop, krossa individen med P10 spetsen på pipetten genom att trycka på djuret mot väggens PCR-röret och omedelbart Tillsätt 100 μl lyseringsbuffert.
- Homogenisera djuret med frysning-och-tining cykler18.
- Inkubera röret i 30 min i rumstemperatur för Lys att inträffa.
Obs: Det krävs minst 30 min för en effektiv Lys, men inkubationstiden kan vara längre. - Överföra den hela volymen (100 µL) av Lys blandningen till en ren 1,5 mL låg-bindande mikrorör.
- Tillsätt 100 μl lyseringsbuffert till låg-bindande PCR-röret som användes för homogenisering och är nu tom, och efter pipettering blandningen, överföra den till den 1,5 mL låg-bindande mikrorör använde i steg 3.3. Upprepa detta steg 2 x.
- Som i steg 3,4, tillsätt 300 μl lyseringsbuffert till låg-bindande PCR-röret, och, efter pipettering, flytta blandningen till det 1,5 mL låg-bindande mikroröret. Det 1,5 mL låg-bindande mikroröret bör innehålla 600 µL av blandningen efter detta steg.
Obs: Dessa steg är att minimera förlusten av gDNA bunden till PCR-röret väggen, genom att tvätta provet flera gånger. - Lägg till sammanlagt 600 µL av Lys blandning till spin kolumn placeras i en samling rör och centrifugera det 10 000 x g för 1 min.
- Återapplicera flödet genom att kolumnen och centrifugera det 10 000 x g för 1 min.
Obs: Detta steg är avgörande för att säkerställa att de flesta av gDNA binds till kolumnen. - Tillsätt 500 µL tvättlösning till kolumnen spin och centrifugera det 10 000 x g för 1 min. Transfer spin kolumnen till en ren 1,5 mL mikrorör.
- Tillsätt 20 µL av 10 mM Tris-HCl, pH 8.5, till kolumnen spin, vänta 5 min i rumstemperatur, och centrifugera det 10 000 x g för 1 min.
Obs: Eluering bufferten måste inte innehåller EDTA, för det stör de bibliotek förberedelse enzymerna. - Applicera nytt flödet genom kolumnen spin, och efter 5 min inkubering vid rumstemperatur, Centrifugera det i 1 min vid 10 000 x g.
Obs: Detta steg är avgörande för att säkerställa den maximal elueringen av den gDNA bunden till kolumnen.
4. biblioteket konstruktion sekvens
-
DNA-fragmentering
- Överföra 15 µL av den gDNA eluant till en 15-µL mikrorör för DNA-fragmentering och centrifugera röret för 1 min med en bordsskiva mikrocentrifug.
Obs: Den angivna mikrorör visas i Tabell av material är optimal för en låg input. Splittringen med låg volym ultraljudsbehandling är avgörande, och detta kan inte ersättas med enzymatisk fragmentering på grund av den extremt låga koncentrationen av DNA. - Fragment av gDNA till 550 bp.
Obs: 550 bp inställningarna vi använt är följande: incident toppeffekt = 30 W, plikt faktor = 20%, cykler per burst = 50, behandlingstid = 23 s. - Efter en grundlig pipettering, överföra 10 µL av fragmenterade DNA blandningen till en ren låg-bindande PCR-röret.
Obs: Experimentet kan stoppas här. Bevara DNA vid 4 ° C eller -20 ° C.
- Överföra 15 µL av den gDNA eluant till en 15-µL mikrorör för DNA-fragmentering och centrifugera röret för 1 min med en bordsskiva mikrocentrifug.
-
Bibliotek konstruktion sekvens
Obs: Det är absolut nödvändigt att använda den angivna kit i Tabellen av material i följande procedurer, på grund av den låga mängden input DNA.- Tillsätt 2 µL av mallen förberedelse bufferten och 1 µL av enzymet mall förberedelse och blanda dem med en pipett.
- Utföra den mall utarbetande reaktionen på en termocykel med följande villkor: 22 ° C i 25 min, 55 ° C i 20 min, 4 ° C håll och ett uppvärmt lock vid 101-105 ° C. När reaktionen är klar, gå vidare till nästa steg.
- Tillsätt 1 µL bibliotek syntes bufferten och 1 µL av enzymet bibliotek syntes mall utarbetande reaktion produkt och inkubera blandningen vid 22 ° C i 40 min (med 4 ° C stadga). När reaktionen är klar, gå vidare till nästa steg.
- Lägg till 30 µL bibliotek förstärkning huvudmixen (25 µL av bibliotek förstärkning bufferten, 1 µL av enzymet bibliotek förstärkning och 4 µL nuclease-fritt vatten) och 5 µL av indexering reagens.
- Blanda allt med en pipett och centrifugera blandningen kort med en bordsskiva centrifug.
- Utföra en PCR med de villkor som anges i tabell 1.
| Temperatur | Tid | Cykler |
| 72 ° C | 3 minuter | |
| 85 ° C | 2 minuter | |
| 98 ˚C | 2 minuter | |
| 98 ˚C | 20 sekunder | 4 cykler |
| 67 ° C | 20 sekunder | |
| 72 ° C | 40 sekunder | |
| 98 ˚C | 20 sekunder | 16 cykler |
| 72 ° C | 50 sekunder | |
| 4 ° C | Håll |
Tabell 1: PCR villkor.
-
Rening av PCR-produkter
Obs: Detta steg kan ersättas med andra reningsmetoder. Om en alternativ metod används, se till att kontrollera för den resulterande DNA renhet med en spektrofotometer. Absorbansen nyckeltal av 260/280 och 260/230 måste båda vara ovan 1,8.- Tillsätt 50 µL av magnetiska pärlor, Pipettera lösningen 10 x, och centrifugera det kort med en bordsskiva mikrocentrifug.
- Inkubera lösningen i 2 min i rumstemperatur.
- Inkubera det på en magnetisk stå för 5 min eller tills lösningen blir helt klart, och avlägsna supernatanten.
- Tillsätt 200 µL av nylagade 80% etanol till låg-bindande PCR-röret på en magnet monter, vänta 30 s, och ta bort supernatanten. Upprepa detta steg 2 x. Stör inte pärlorna.
- Kort Centrifugera låg-bindande PCR-röret med en bordsskiva centrifug och ta bort eventuella överskott etanol på magnetiska stativet. Lufttorka pärlor men undvika overdrying.
- Återsuspendera pärlorna med 15 µL 10 mm Tris-HCl, pH 8.5, grundligt Pipettera lösningen så att de magnetiska pärlorna fördelas homogent, Inkubera röret i 2 min i rumstemperatur, och efter en kort centrifugering, inkubera det på en magnetisk stå för 2 min tills lösningen är klar.
Obs: Eluering bufferten bör inte innehåller EDTA, för det stör efter sekvensering kemi. - Överför supernatanten, utan att störa pelleten, till en ny låg-bindande PCR-röret.
Obs: Experimentet kan stoppas här. Bevara DNA vid 4 ° C eller vid-20 ° C för långvarig lagring.
5. kvalitetskontroll, kvantifiering och DNA-sekvens
Obs: En kvalitetskontroll utförs inte innan detta steg på grund av den låga mängden DNA.
-
Validering av fördelningen av DNA bibliotek storlek
Obs: Andra hög-känsliga electrophoresis system med en digital rapportering av storleksfördelningen kan användas.- Returnera elektrofores buffert reagens och gel patron (25-1000 bp i intervallet) till rumstemperatur.
- Tillsätt 3 µL av elektrofores buffert reagens med 1 µL sekvensering biblioteket och blanda dem ordentligt för 1 min med en virvel, och kort Centrifugera dem med en bordsskiva centrifug.
- Genomföra elektrofores och validera bibliotek storleksfördelning med tillhörande programvara. Den huvudsakliga fragment toppen bör i stort sett alltifrån ca 300 till 1000 bp.
-
DNA kvantifiering
Obs: Andra fluorescens-baserade metoder eller kvantitativ PCR kan också användas, men spektrofotometri bör undvikas, eftersom det inte är tillräckligt noggranna för att kvantifiera sekvensering bibliotek.- Lägg till 796 µL lösning buffert och 4 µL av fluorescerande reagens och blanda dem väl. Dosera 190 µL arbetslösning till två assay rör och 197 µL till en assay röret.
- Lägg till 10 µL av standarder med kända koncentrationer av DNA till varje assay röret som innehåller 190 µL av arbetslösning och 3 µL av beredda biblioteket till assay röret som innehåller 197 µL av arbetslösning.
- Vortex rören kort och centrifugera dem på en bordsskiva centrifug. Kvantifiera DNA med en fluorometer med 3-µL inställningar.
-
DNA-sekvensen för bibliotek
Obs: Sekvensering plattformen måste vara kompatibel med angivet bibliotek byggsats.- Förbereda den sekvensering bibliotek baserat på tillverkarens protokollet.
- Ställ in reagens kassett och flöde cellen i sekvensering instrument och ange den sekvensering kör information efter tillverkarens protokollet.
- Köra sekvensering.
Obs: Vi har utfört två sekvensering körs: ett prov/kör, samt fyra prover multiplexed i en kör.
6. beräkningsinriktad analys
- Base-samtal och, om så krävs, multiplex läser.
- Validera kvaliteten på sekvensdata med FastQC19.
Obs: För en mer djupgående validering av de erhållna uppgifterna, se vår tidigare rapport16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Främmande ämne uteslutande:
Detta protokoll innebär en grundlig tvätt av trögkrypare och en sterilisering med antibiotika behandling för att minimera kontaminering. Det innebär också en visuell kontroll process för att säkerställa fullständighet av dessa processer. En Mikroskopbilden under valideringen (steg 2,4 i protokollet) visas i figur 2. När observeras vid 500 X förstoring, kan bakterieceller ses som små partiklar som rör sig runt de enskilda trögkrypare.
Validering av DNA bibliotek kvalitet:
Den totala mängden Byggyta DNA-Seq biblioteket är ungefärligt 109,5 ng (7,3 ng/µL x 15 µL)16. För att validera längd fördelningen av fragmentering, bör en elektrofores mönster likna figur 3. Som vi satt storleken för fragmentering till 550 bp med en DNA klippning system, biblioteket bör vara 550-600 bp, inklusive sekvensering adaptrar. Det kan påpekas att majoriteten av sekvens biblioteket finns mellan 200-1000 bp och är konsekvent mellan replikat (N1 - N4).
Sequence Data Analysis:
De DNA-sekvenseringen genereras ungefär 20 - till 25-M ihopkopplade läsningar per körning. Validering av kvalitet utfördes med FastQC (figur 4). Fördelningen av kvaliteten längs sekvenserade Läs är typiskt för en 300-bp Parade körning.
Figur 1: arbetsflöde för detta protokoll. Denna figur visar en sammanfattning av detta protokoll. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Representativ bild av en bakteriefri trögkrypare. Denna figur visar bilder av en förorenad (vänster) trögkrypare och rengjorda (höger) trögkrypare (Echiniscus paret), tillsammans med ytterligare förstorade bilder (nederst). Stavformade celler runt trögkrypare föroreningar och indikeras med en pil. Skalstapeln anger 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3 : Validering av fragment längd fördelningen av konstruerade DNA biblioteket. Denna panel visar fördelningen av sekvensering bibliotek storlek. De lila och gröna linjerna anger de övre och nedre markörerna vid 1500 och 25 bp, respektive. L = stege, S = 1 prov/kör, N1 - N4 = 4 replikat/köra. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Exempel på validering av DNA-Seq kvalitet med FastQC. DNA-Seq uppgifter lämnades in till FastQC att validera sekvens prestanda. Representativa resultat för DRR055040 per bas sekvens kvalitet visas (DDBJ sekvens Läs Arkiv DRA00445516). (A) denna panel visar den framtida läser (R1). (B) denna panel visar den omvända läser (R2). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bakteriell kontaminering utgör ett hot mot genomisk sekvensering av mikroskopiska organismer. Medan tidigare studier på tardigrade Genomsekvensering har filtrerats bort kontaminering med omfattande informatik metoder12,20, sekvenserat vi genomet från en enda individ att minimera risken för föroreningar. Eftersom en enskild trögkrypare innehåller ungefärligt 50-200 pg genomisk DNA16 och är inkapslad i ett tjockt lager av chitinen exoskelett, uteslutandet av föroreningar och hög kvalitet DNA-extraktion är de kritiska punkterna i detta protokoll. Befintliga tardigrades kulturer är inte aseptisk, och de samlas in från den vilda bär en hel del föroreningar på ytan, liksom resterna av mat i deras tarmar. Tidigare genomet sekvensering projekt av tardigrades har sekvenserade 10 000-100 000 individer kollektivt som en prov12,14, vilket innebär att resultaten är mycket sannolikt att påverkas av bakteriella föroreningar. I sin rapport, Boothby o.a. samlas H. paret individer med hjälp av deras negativa phototaxis beteende14, och gruppen anställa inte någon anti-bakteriell metoder.
För att visuellt undersöka om det finns föroreningar, vi inkuberas i trögkrypare i antibiotika (penicillin/streptomycin) och undersökte enskilde i 500 X Mikroskop. Genom att isolera en enskild individ och noga inspekterar den för eventuella föroreningar, minimerat vi risken för eventuella föroreningar. Låga halter av föroreningar bekräftades från sekvensering data som väl16. När det gäller DNA-extraktion anställd vi manuell homogenisering, samt termisk homogenisering18. Genom att skicka tardigrade individen att flytande kväve och 37 ° C, sprickor förmåddes i Chitinen exoskelett, och lyseringsbuffert kunde tränga igenom kroppen och lysera celler. När DNA avkastningen blir lägre än väntat, kan både termisk och manuell homogenisering utföras för att maximera avkastningen.
Den metod som anges i denna artikel har flera begränsningar. Först, homogenisering av frysning-och-tining cykler tillämpades från en studie på nematoder; metoden kan således endast vara effektivt mot ecdysozoa. För det andra, på grund av förstärkning av DNA-fragment under fasen DNA sekvens bibliotek, risken för PCR-fel kan inte ignoreras. Således sekvensdata rekommenderas inte för analys som kräver hög noggrannhet läsningar (dvs SNP-analys). Dessutom som vi har sagt i protokollet, är användningen av angivna SNA-Seq satsen visas i Tabell av material helt avgörande, på grund av den låga mängden input DNA. Detta DNA bibliotek byggsats ligates Illumina adapter sekvenser innan förstärkning; Därför kan inte detta bibliotek tillämpas för lång-Läs sekvensering med PacBio eller Nanopore teknik. Slutligen uppstår en kvalitetskontroll av konstruerade DNA biblioteket Under detta protokoll endast en gång, efter sekvensering bibliotek byggandet. Detta är på grund av låg tillförsel av DNA eftersom de flesta DNA kvantifiering och elektrofores metoder inte kan upptäcka 50-200 pg av DNA. Därför har vi genomfört kvalitetskontroller, såsom elektrofores (figur 1) och fluorescens-baserade kvantifieringar, endast efter den PCR-amplifieringen.
En fullständig diskussion av bioinformatik analyser av denna data är utanför ramen för denna artikel. dock har vi kort sagt flera analyser som vi har utfört. En kvalitetskontroll av sekvensering data med FastQC19 beräknar de per-base kvaliteterna, sekvens dubbelarbete, etc. Sequence data som har validerats kan lämnas till församlingens genomet. Vi har samlat en 132 Mb arvsmassa med MaSuRCA v3.1.321 och har jämfört mappning statistiken beräknas med BWA22 och QualiMap23 för detta DNA sekvensering bibliotek med andra H. paret genomet församlingar16. Dessutom vi också har använt detta DNA sekvensering data för uteslutandet av föroreningar i vår studie17och har konstaterat att den sequenced läser fördelas jämnt i hela genomet.
De flesta projekt på icke-modellorganismer starta från odla tillräckligt provmaterial, som var fallet med tardigrades24. Tekniska framsteg inom kultur tekniker har aktiverat höga mängder av tardigrade kultur, men nuvarande kultur metoder ännu inte är aseptisk och eftersom de flesta tardigrades är fortfarande unculturable i labs, det har varit nästan omöjligt att genomföra genomet eller transkriptom sekvensering. Denna metod för sekvensering av DNA från en enskild individ gör det möjligt att analysera sällsynta tardigrade arter, inklusive marina arter som har studerats mindre. Genom att genomföra jämförande genomik vid ett större phyletic område, kan en vidare förståelse av anhydrobiosis mekanismer i tardigrades uppnås.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna tackar Nozomi Abe, Yuki Takai och Nahoko Ishii för deras tekniska support i genomisk sekvensering. Detta arbete stöddes av bidrag för Japan Society för främjande av vetenskap (JSPS) Research Fellow, KAKENHI bidrag för unga forskare (No.22681029) och KAKENHI bidrag för vetenskaplig forskning (B), nr 17 H 03620 från JSPS, genom en Bidrag för grundläggande forskningsprojekt från Sumitomo Foundation (No.140340) och delvis av forskningsmedel från Yamagata prefekturernas regeringen och Tsuruoka City, Japan. Chlorella vulgaris används till foder på tardigrades var förutsatt artighet Chlorella Industry Co. LTD.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SZ61 microscope | OLYMPUS | ||
| BactoAgar | Difco Laboratories | 214010 | |
| Penicillin Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco by life technologies | 15140-148 | |
| VHX-5000 System | Keyence | ||
| 0.2mL Silicone coating tube | Bio Medical Science | BC-bmb20200 | |
| Quick-DNA Microprep Kit | ZYMO Research | D3021 | Use of this kit is absolutey critical; see step 3.1 |
| 1.5 mL microtube | greiner bio-one | 616-201 | See 4.1.1 |
| HIgh speed refrigerated micro centrifuge | TOMY | MX-307 | |
| Covaris M220 | Covaris Inc. | 4482277 | |
| ThruPLEX DNA-Seq kit | Rubicon Genomics | CAT. NO. R400406 | Use of this kit is absolutey critical; see step 4.2 |
| Thermal Cycler | Bioer Technology | TC-96GHbC | |
| AMPure XP reagent | BECKMAN COULTER Life Science | A63881 | |
| Ethanol | Wako | 054-027335 | |
| EB buffer | QIAGEN | 19086 | |
| 2200 TapeStation | Agilent | G2965AA | |
| D1000 Reagents | Agilent | 5067-5583 | |
| D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5582 | |
| Qubit dsDNA BR Buffer/Reagent | ThermoFisher Scientific | Q32850 | |
| Cubee Mini-Centrifuge | RecenttecGenereach | R5-AQBD01aqbd | |
| MiSeq 600 cycle v3 | Illumina Inc. | MS-102-3003 | |
| MiSeq Sequencer | Illumina Inc. | SY-410-1003 |
References
- Crowe, J. H., Hoekstra, F. A., Crowe, L. M. Anhydrobiosis. Annual Review of Physiology. 54 (1), 579-599 (1992).
- Mobjerg, N., et al. Survival in extreme environments - on the current knowledge of adaptations in tardigrades. Acta Physiologica. 202 (3), 409-420 (2011).
- Becquerel, P. La suspension de la vieau dessous de 1/20 K absolu par demagnetization adiabatique de L'alun de fer dans le vide les plus eléve. Comptes Rendus de l'Académie des Sciences. 231, 261-264 (1950).
- Ono, F., et al. Effect of ultra-high pressure on small animals, tardigrades and Artemia. Cogent Physics. 3 (1), 1167575 (2016).
- Horikawa, D. D., et al. Tolerance of anhydrobiotic eggs of the Tardigrade Ramazzottius varieornatus to extreme environments. Astrobiology. 12 (4), 283-289 (2012).
- Horikawa, D. D., et al. Analysis of DNA repair and protection in the Tardigrade Ramazzottius varieornatus and Hypsibius dujardini after exposure to UVC radiation. PLoS One. 8 (6), e64793 (2013).
- Horikawa, D. D., et al. Radiation tolerance in the tardigrade Milnesium tardigradum. International Journal of Radiation Biology. 82 (12), 843-848 (2006).
- May, R. M., Maria, M., Gumard, J. Action différentielle des rayons x et ultraviolets sur le tardigrade Macrobiotus areolatus, a L'état actif et desséché. Bulletin Biologique de la France et de la Belgique. 98, 349-367 (1964).
- Jonsson, K. I., Harms-Ringdahl, M., Torudd, J. Radiation tolerance in the eutardigrade Richtersius coronifer. International Journal of Radiation Biology. 81 (9), 649-656 (2005).
- Bemm, F., Weiss, C. L., Schultz, J., Forster, F. Genome of a tardigrade: Horizontal gene transfer or bacterial contamination? Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (22), E3054-E3056 (2016).
- Delmont, T. O., Eren, A. M. Identifying contamination with advanced visualization and analysis practices: metagenomic approaches for eukaryotic genome assemblies. PeerJ. 4, e1839 (2016).
- Koutsovoulos, G., et al. No evidence for extensive horizontal gene transfer in the genome of the tardigrade Hypsibius dujardini. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (18), 5053-5058 (2016).
- Boothby, T. C., Goldstein, B., et al. Reply to Bemm et al. and Arakawa: Identifying foreign genes in independent Hypsibius dujardini genome assemblies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (22), E3058-E3061 (2016).
- Boothby, T. C., et al. Evidence for extensive horizontal gene transfer from the draft genome of a tardigrade. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (52), 15976-15981 (2015).
- Arakawa, K. No evidence for extensive horizontal gene transfer from the draft genome of a tardigrade. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (22), E3057 (2016).
- Arakawa, K., Yoshida, Y., Tomita, M. Genome sequencing of a single tardigrade Hypsibius dujardini individual. Scientific Data. 3, 160063 (2016).
- Yoshida, Y., et al. Comparative genomics of the tardigrades Hypsibius dujardini and Ramazzottius varieornatus. PLoS Biology. 15 (7), e2002266 (2017).
- He, F. Total RNA Extraction from C. elegans. Bio-protocol. Bio101, e47 (2011).
- Andrews, S. FastQC a quality-control tool for high-throughput sequence data. , http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2015).
- Hashimoto, T., et al. Extremotolerant tardigrade genome and improved radiotolerance of human cultured cells by tardigrade-unique protein. Nature Communications. 7, 12808 (2016).
- Zimin, A. V., et al. The MaSuRCA genome assembler. Bioinformatics. 29 (21), 2669-2677 (2013).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).
- Okonechnikov, K., Conesa, A., Garcia-Alcalde, F. Qualimap 2: advanced multi-sample quality control for high-throughput sequencing data. Bioinformatics. 32 (2), 292-294 (2016).
- Horikawa, D. D., et al. Establishment of a rearing system of the extremotolerant tardigrade Ramazzottius varieornatus: a new model animal for astrobiology. Astrobiology. 8 (3), 549-556 (2008).
