Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Germination des téliospores chargée de l’enquête à l’aide de l’analyse Microrespiration et Microdissection

doi: 10.3791/57628 Published: May 13, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Champignons du charbon causent de nombreuses maladies agricoles dévastateurs. Ils sont dispersés sous forme de téleutospores dormants qui germent en réponse à des stimuli environnementaux. Nous décrivons deux méthodes pour étudier les changements moléculaires au cours de la germination : augmentation de la respiration pour détecter l’activation métabolique de mesure et l’évaluation changeant des événements moléculaires en isolant les téleutospores aux stades morphologiques distincts.

Abstract

Champignons du charbon sont les agents étiologiques de plusieurs maladies agricoles dévastateurs. Ils sont caractérisés par la production de téleutospores, qui sont des agents de dispersion à parois épaisses. Téliospores peuvent rester dormants pendant des décennies. La dormance est caractérisée par faibles taux métaboliques, suspendu la biosynthèse macromoléculaire et grandement réduit les niveaux de la respiration. À la réception des signaux environnementaux requis, téleutospores germent pour produire des cellules haploïdes, qui peuvent initier de nouveaux cycles d’infection. La germination des téliospores se caractérise par la reprise de biosynthèse macromoléculaire, une augmentation de la respiration et remaniements morphologiques. Afin de mesurer avec précision les changements dans la respiration cellulaire durant les premiers stades de la germination, nous avons développé un protocole simple utilisant un respiromètre Clark-type. Les derniers stades de la germination sont distinguent par des changements morphologiques spécifiques, mais la germination est asynchrone. Nous avons développé une technique de microdissection qui nous permet de recueillir des téliospores aux stades de germination distinctes.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Les champignons du charbon (Ustilaginales) se composent de plus de 1600 espèces qui infectent les herbes dont les récoltes de céréale importante de maïs, l’orge et le blé, causant des milliards de dollars en pertes de récoltes par an1. Ces champignons sont caractérisés par la production de téleutospores, ont pigmenté sombrement les parois cellulaires, qui sont les agents de dispersion. Téliospores servent à protéger le matériel génétique au cours du stress de la dispersion entre les plantes hôtes et peuvent persister dans un état dormant pour les années2. Par conséquent, téleutospores sont une composante essentielle de la propagation de la maladie.

Afin d’étudier la biologie téliospores, notre laboratoire utilise le champignon de charbon modèle Ustilago maydis (U. maydis), qui est l’agent causal de la maladie « charbon commun du maïs ». Mature U. maydis téliospores sont caractérisent par l’arrêt de croissance, le métabolisme cellulaire réduit et faible niveau de la respiration cellulaire3. Dans les conditions environnementales favorables (par exemple., la présence de sucres spécifiques), U. maydis téleutospores germent et toutes les basidiospores de la méiose, production qui peuvent initier de nouveaux cycles d’infection. La germination est caractérisée par une augmentation de la respiration, l’activité Retour à métabolique et la progression à travers les stades morphologiques observables de germination4.

La première étape de germination comprend une augmentation de la respiration et de la fonction métabolique, cependant, il n’y a pas d’indications morphologiques du changement. La taille originale du changement respiratoire dans U. maydis ont été effectuées depuis plus de 50 ans, mesurant la consommation d’oxygène manométriquement avec Warburg fiole appareil5. Nous avons développé une méthode simple d’étudier les changements précis dans la respiration durant la germination des téliospores en mesurant la consommation d’oxygène pendant un cours temps de germination à l’aide d’un microrespirometer de type Clark. Nous avons déjà utilisé cette méthode pour étudier les changements de rythme respiratoire entre le type sauvage mutants avec6de mitochondries défectueuses et U. maydis cellules haploïdes et ont adapté le protocole ici pour étudier les changements dans la respiration téliospores durant germination. Ceci fournit un moyen d’identifier avec précision le moment du changement de la respiration pour que nous puissions cibler téliospores le moment venu, après le début de la germination pour étudier les événements moléculaires précoces. La progression de la germination peut être suivie au microscope une fois le promycélium émerge de la téliospore, mais la nature asynchrone a inhibé l’isolement d’assez téleutospores à un stade donné pour enquête. Nous avons développé une technique de microdissection semblable à ceux utilisés pour la fécondation in vitro pour recueillir des téliospores physiquement à des stades morphologiques distincts de la germination.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. corn Cob Infection

  1. Zea mays (CV Golden Bantam) de croître jusqu'à ce que les épis sont formés et ont commencé à la soie (environ 60 jours).
  2. La culture haploïdes compatibles U. maydis souches à l’aide de protocoles standard comme précédemment décrit7.
  3. Infecter les épis de maïs à l’aide de protocoles standard comme décrit précédemment7.

2. téliospores récolte

  1. Équipement d’autoclave (entonnoir Büchner, flacons de Büchner, mélangeurs, bouteilles de 250 mL Centrifugeuse, spatules plates et eau) en utilisant une norme sec cycle au moins 30 min de stérilisation à 121 ° C (cycle liquide standard pour l’eau).
  2. Enlever les épis infectés provenant de plantes (environ 28 à 35 jours après l’infection) à l’aide d’un rasoir et mettre les épis sur un plateau couvert de protecteur de banc.
  3. Retirer les tumeurs épis avec une lame de rasoir et de recueillir dans un bécher.
  4. Remplissez une tasse 250 mL de mélangeur laboratoire présentant des tumeurs jusqu'à environ 1/3 plein et ajoutez autoclavés dH2O jusqu'à ce que la Coupe du mélangeur est environ 3/4 plein. Perturber les tumeurs petites pressions sur le mélangeur à faible, jusqu'à ce que homogénéisé.
  5. Branchez la pompe à vide sur un piège à eau, puis dans une fiole de Büchner de 1 L.
  6. Insérez le grand entonnoir Büchner dans la fiole et Tapissez le fond de l’entonnoir Büchner avec quatre couches d’étamine.
  7. Tourner sur la pompe à vide.
  8. Verser une partie des tumeurs homogénéisés par le biais de l’étamine et gratter avec une spatule.
  9. Versez quelques dH2O dans l’étamine afin de rincer les téliospores à travers.
  10. Répétez jusqu'à ce que la dH2O traversant l’étamine est clair.
  11. Essorez l’étamine contenant le matériel de tumeur homogénéisé dans le filtre pour assurer un recouvrement maximal téliospores.
  12. Quand le flacon de Büchner 1 L devient proche de plein, vider dans un erlenmeyer de grand et mettez-le de côté.
  13. Introduire un nouveau morceau de gaze dans le filtre et répétez les étapes (2,7 – 2.12) jusqu'à ce que toutes les tumeurs ont été perturbés et filtrées.
  14. Versez les téliospores filtrées dans autoclavés 250 mL Centrifugeuse bouteilles et centrifuger à 1 000 x g pendant 5 min et éliminer le surnageant.
  15. Répétez l’étape 2.14 jusqu'à ce que tous les téliospores filtrées sont granulées par centrifugation.
  16. Suspendre les granules dans un peu d’eau et transfert pour tubes de centrifugeuse 50 mL.
  17. Centrifuger les tubes à 1 000 x g pendant 5 min et éliminer le surnageant.
  18. Suspendre le culot dans environ 50 mL de dH2O, centrifuger les tubes à 1 000 x g pendant 5 min et éliminer le surnageant. Racler doucement la couche grise avec une spatule et déposez-le. Répétez jusqu'à ce qu’il n’est plus une couche grise sur le dessus.
  19. Sécher les échantillons durant la nuit dans un dessiccateur à vide.
  20. Stocker des téliospores séchées à 4 ° C jusqu'à l’utilisation.
  21. Si vous le souhaitez, traiter les téliospores avec sulfate de cuivre8 avant d’induire à germer. Si non traitée, puis exécutez approfondie analyse microscopique des téliospores pour confirmer l’échantillon représente des téliospores pures et est dépourvue de bactéries ou d’autres contaminations.
    1. Peser environ 50 mg de téleutospores dans un tube de microtubes de 1,5 mL.
    2. Ajouter environ 1,0 mL de 0,75 % CuSO4 dans le tube de microtubes de 1,5 mL contenant les téliospores. Pipetter haut et bas pour suspendre les téliospores dans la solution de CuSO4 suivie d’agiter l’échantillon pendant 3 h.
    3. Centrifuger l’échantillon à 2 500 g pendant 5 min et retirer le surnageant. Resuspendre le culot de téliospores avec de l’eau stérile, répétez la centrifugation et éliminer le surnageant.
    4. Répétez l’étape 2.21.3 deux fois plus.

3. téliospores viabilité et Test de Germination

  1. Peser environ 10 mg d’u. maydis téleutospores dans un tube de microtubes de 1,5 mL pour évaluer leur viabilité et le moment de la germination.
  2. Dans une armoire de biosécurité, préparer les bouillon de dextrose de pomme de terre (APB, 24 g/L) additionné de sulfate de streptomycine (160 µg/mL).
  3. Suspendre les téliospores 500 µL de PDB. Pipetez doucement pour mélanger et briser tous les agrégats de téleutospores.
  4. Transférer la suspension téliospores à une autoclave 250 mL fiole Erlenmeyer contenant 10 mL de l’APB.
  5. Incuber le ballon à 28 ° C, secouant à 90 t/mn pendant 12 à 16 h.
  6. Dans une armoire de biosécurité, enlever un échantillon de 20 µL des téleutospores amenées à germer et à préparer une lame de microscope.
  7. À l’aide d’un microscope, évaluer visuellement les stades de la germination qui sont présents et la présence de contamination bactérienne.
    1. Compter le nombre de téleutospores à étapes I à V à l’aide d’un hémocytomètre et déterminer le pourcentage qui ont germé.
    2. Serait-ce que l’étape I téliospores sont présents, continuer à incuber le ballon pour un total de 24 h avant d’évaluer la germination des téliospores. Continuer d’incubation pour un maximum de 48 h avant que l’échantillon non viables.
    3. Si la contamination bactérienne est présente, Supplément de l’APB avec du sulfate de kanamycine (50 µg/mL) ainsi que le sulfate de streptomycine (160 µg/mL) et répétez les étapes 3.1 à 3.7. Si la contamination bactérienne persiste, traiter des téliospores avec du sulfate de cuivre et répétez les étapes 3.1 à 3.7.

4. l’induction de la Germination pour la surveillance de la Respiration

  1. Peser la quantité égale (e.g., 50 mg) de téleutospores pour chaque expérience de la respiration.
  2. Dans une armoire de biosécurité, ajouter téliospores devant une Assemblée de respiration autoclavés.
  3. Remplir la chambre avec l’APB (24 g/L) additionné de sulfate de streptomycine (160 µg/mL) et du sulfate de kanamycine (50 µg/mL).
  4. Pipetter en haut et en bas pour créer une suspension téliospores.
  5. Placer le couvercle de la chambre dans la chambre pour créer joint étanche à l’air.

5. l’obtention de mesures de vitesses (OCR) de consommation d’oxygène

  1. Placez la chambre dans le panier de la chambre à l’intérieur d’un bain d’eau (chauffé à 28 ° C).
  2. Placez la sonde de2 O à l’intérieur de l’ouverture de la chambre.
  3. Surveiller les points de données qui apparaissent en temps réel sur le programme de « Taux de SensorTrace » et laisser la sonde stabiliser (~ 3 min après que la sonde est placée dans la chambre).
  4. Cliquez sur « Mesure » pour mesurer les concentrations de2 O en continu pendant 6 h avec mesures enregistrées à intervalles de 2 s.
  5. Arrêter la mesure et répétez les étapes 4.1 – 5,4 pour chaque échantillon à analyser.
  6. Exporter les données vers Microsoft Excel en cliquant sur « fichier | Export | Enregistrer sous .xls ».

6. analyse de données

  1. Calculer les OCR
    1. Dans le fichier Excel exporté sous l’onglet « Within_Rates », enregistrer le « taux » pour chaque mesure de chambre (nmol/h).
    2. Pour chaque échantillon expérimental, soustraire le « taux » de la chambre vide depuis le « taux » de la chambre de l’échantillon expérimental afin d’obtenir une valeur corrigée de l’OCR et prendre la valeur absolue de ce nombre.
    3. Calculer le total OCR par mg de téliospores en divisant la valeur corrigée de OCR absolue par le cellulaire masse utilisé.
    4. Moyenne répliquer les valeurs « OCR par mg de téliospores » pour chaque souche.
  2. Analyser les données à l’aide de la méthode statistique appropriée (p. ex.., de student t-test, analyse de variance) à l’aide de Microsoft Excel d’un autre logiciel de statistique.
  3. Graphique des données brutes, de calculer le pourcentage d’oxygène restant pour chaque point de temps vous souhaitez graphique. Diviser la première lecture par elle-même et multiplier par 100 (100 % d’oxygène restant), puis divisez chaque lecture ultérieure par la première lecture et multiplier par 100 pour obtenir le pourcentage d’oxygène restant dans la chambre.

7. l’induction de la Germination des téliospores pour isoler les téleutospores à différents stades de la Germination

  1. Préparer le PDB (24 g/L) additionné de sulfate de streptomycine (160 µg/mL) dans une armoire de sécurité biologique.
  2. Placer environ 10 mg d’u. maydis téleutospores dans un tube de microtubes de 1,5 mL.
  3. Suspendre les téliospores 500 µL de PDB. Pipetez doucement pour bien mélanger jusqu'à ce qu’il n’y a aucun amas de téleutospores dans le milieu.
  4. Transférer la suspension téliospores dans un erlenmeyer autoclavés 250 mL contenant APB complétée avec sulfate de streptomycine.
  5. Incuber le flacon du jour au lendemain à 28 ° C, secouant à 90 tr/min.

8. préparation de la boîte de Pétri et micromanipulateur

  1. Préparer un plat de Pétri (57 cm2) par pipetage rangées de gouttelettes microcapillaire PROCEDE de preparation et prélèvement d’échantillons.
    1. Pipetter 5 gouttes de2O dH µL (x 4) dans la partie supérieure de la boîte de Pétri.
    2. Distribuer 2 µL (x3) de solution de stabilisation RNA sur la boîte de Pétri à utiliser pour la collecte d’échantillons.
    3. Pipetter 5 gouttes µL (x 30) de germination des téleutospores sur la boîte de Pétri.
  2. Ajouter 15 mL d’huile minérale à la boîte de Pétri. S’assurer que toutes les gouttelettes sont recouvertes d’huile avant de procéder.
  3. Préparer un microcapillaire avec un diamètre intérieur de 15 µm, bride de 1 mm, 55 mm de longueur et un angle de pointe de 20° en le plaçant dans le support microcapillaire et submergeant dans l’huile minérale où l’action capillaire permettra à l’huile minérale entrer le microcapillaire. Relâcher la pression dans le microcapillaire avant de le porter à la goutte d’eau. Aspirez pour préparer le microcapillaire avec de l’eau.

9. isolement de spécifiques au stade germination des téleutospores

  1. En utilisant les contrôles de la micromanipulateur, placez le microcapillaire disposé sur un des gouttelettes de la germination. Pénétrer la goutte, d’abaisser la microcapillaire et apporter l’embouchure de la microcapillaire jusqu'à un téliospores en germination au stade de la germination d’intérêt.
  2. Aspirer doucement pour capturer les téliospores en germination. Arrêter d’aspirer une fois la téliospore entré la microcapillaire. Répétez jusqu'à ce qu’il y a environ cinq téliospores dans le microcapillaire.
  3. Relevez le microcapillaire avec le micromanipulateur et l’amener à la goutte de collection de solution de stabilisation RNA. Pénétrer la gouttelette et injecter les téliospores dans la goutte.
  4. Répétez les étapes 8.1 à 8.3 jusqu'à environ 1 000 téliospores ont été capturés.

10. récupération des gouttelettes de Collection

  1. Pipetter vers le haut de la goutte de la collection et la transférer sur le couvercle d’un tube de microtubes de 2,0 mL exempte de RNase/DNase. Retirez soigneusement l’huile minérale avec une pipette sans déranger la gouttelette de collection.
  2. Utilisez les téliospores pour applications en aval telles que l’isolement du RNA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Utilisant la méthode de base microrespirometer Clark-type de mesurer les changements dans la respiration au cours de la germination et la dormance téliospores, nous a confirmé que les dormants téliospores présentent un faible niveau de la respiration (~ 1 075 µmol/h/mg), comparée à germer téliospores (~ 2 614 µmol/h/mg ; Figure 1 a). Il s’agit d’un changement de ~2.4-fold taux moyen de la respiration entre téliospores dormants et téliospores qui ont été induites à germer. En outre, nous avons identifié que téliospores qui ont été induites à germer ont un retard de ~ 45 min dans la consommation d’oxygène (Figure 1 b). Ceci est indiqué par le retard de ~ 30 min dans l’absorption d’oxygène (Figure 1 b) en plus du délai de ~ 15 min entre l’induction de la germination et début de la mesure d’oxygène. Ceci identifie un point de temps pour commencer à évaluer les changements moléculaires dans les téliospores en germination qui ne changent pas visiblement.

Les modifications ultérieures pendant la germination peuvent être observées au microscope. On a déterminé les cinq étapes de la germination. Stade I de germination représente téliospores qui ont été induites à germer, mais restent impossibles à distinguer des téliospores dormants. Téliospores de phase II ont de nouveaux promycélium avec une longueur qui est inférieur ou égal au diamètre de la téliospore. Téliospores de phase III ont promycélium qui sont plus grandes que le diamètre de téliospores. Stade IV de la germination est le bourgeonnement initial des basidiospores du promycélium et stade V sont résultantes haploïdes basidiospores qui divisent par bourgeonnement (Figure 2). En utilisant la technique de microdissection que nous avons élaborée, nous avons isolé avec succès téliospores en germination de 500 à 1 000 pour les applications en aval telles que les ARN pour la RT-PCR ou RNA-Seq (tableau 1). La figure 3 montre l’ensemble général vers le haut de la Petri dish pour microdissection et les étapes de la microdissection à l’aide d’un micromanipulateur.

Figure 1
Figure 1 : évolution temporelle de la consommation d’oxygène au cours de la germination des téliospores. Téliospores dormants ont été amenées à germer, et des niveaux d’oxygène ont été enregistrées continuellement pendant 6 h, à l’aide d’un microrespirometer de type Clark. Téliospores dormants non induits ont été utilisés comme un contrôle, et toutes les mesures ont été normalisées à un échantillon témoin. (A) données représentées comme moyen OCR. (B) les données brutes complotèrent pour obtenir des courbes de la respiration, qui permet la détection de changements dans l’OCR au cours du temps. Téliospores qui ont été induites à germer consommant l’oxygène en moyenne 2,4 fois plus vite que non induites téliospores dormants (p < 0,01 ; De Student t-test). COCHON : après induction de la germination. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : étapes de la germination des téliospores. Stades I à V de la germination des téliospores sont illustrées (AE). Echelle = 20 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Microdissection d’isoler les stades morphologiques distincts de germination des téleutospores. Le général mis en place un Petri dish pour microdissection et les mesures d’isolement des téliospores au stade III de germination sont illustrées. (A) Illustration d’une boîte de Pétri mis en place avec des rangées de gouttelettes contenant de l’eau stérile, solution de RNA de stabilisation, ou la germination des téleutospores. Après l’induction de la germination, téliospores ont été isolées à des étapes spécifiques de la germination à l’aide de microdissection. (B) une germination gouttelettes contenant induit à germer téliospores aux stades I à III. (C) un prêt microcapillaire a grandi à un téliospores stade III pour la collecte par aspiration. (D) téliospores le stade III dans un verre microcapillaire est retiré de la gouttelette de germination et s’installe à une gouttelette de la collection. (E) le microcapillaire a été insérée dans la solution de stabilisation collection gouttelettes contenant RNA et la téliospore de phase III a été injectée dans la goutte. (F) une collection de téleutospores stade III dans la solution de stabilisation RNA. Echelle = 20 µm (A-D, F) et 50 µm (E). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Stade de la germination Nombre de germination des téleutospores isolé
Stade I 1 000
Stade II 500
Stade III 650

Tableau 1 : nombre de téliospores en germination avec succès isolé pour chaque étape de germination dans une expérience d’une isolation standard. Le tableau montre le nombre moyen de téleutospores qui ont été isolés à l’aide de microdissection pour les stades I à III avant le prélèvement pour les applications en aval.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Pathogènes basidiomycète biotrophe causent milliards de dollars en pertes de récoltes par an. La grande majorité de ces agents pathogènes produire des téliospores qui font partie intégrante de la dispersion fongique et reproduction sexuée. Acquérir les connaissances du développement et la germination des téleutospores est essentielle à la compréhension de la propagation des maladies dévastatrices provoquées par ces champignons. Afin d’identifier les changements moléculaires aux points de contrôle clés nous avons mis au point une méthode permettant de déterminer la chronologie des changements physiologiques et un autre pour isoler les téleutospores à différents stades de la germination. Seto et al. (non publiées) notés cinq étapes de la germination des téliospores par microscopie optique (Figure 2). Afin d’étudier l’activation physiologique au cours de l’étape I et pour évaluer les taux de respiration pendant la germination, nous avons utilisé un microrespirometer type Clark de mesurer avec précision les changements dans la consommation d’oxygène. Nos données indiquent que notre méthode est précise et très reproductible. Nos résultats confirment que germer U. maydis téliospores présentent une augmentation drastique dans la respiration cellulaire par rapport aux non induites téliospores dormants. Pour la première fois, nous avons identifié qu’u. maydis téliospores qui ont été induites à germer présentent un retard de ~ 45 min dans la consommation d’oxygène. Ceci suggère qu’u. maydis téliospores peuvent exiger quelque temps à traiter des signaux de la germination (par ex.., la présence de sucres) avant de répondre, que l’absorption d’oxygène n’est pas parmi les réponses très immédiates aux signaux de germination ou que notre essai n’était pas assez sensible pour détecter des modifications minimes dans l’absorption d’oxygène initial.

Précédente, études portant sur les taux de respiration des téliospores charbon3 s’est appuyée sur un appareil de fiole de Warburg pour mesurer l’oxygène niveaux manométriquement5. En bref, cette méthode permet de mesurer la consommation d’oxygène et la production de CO2 en détectant les changements de pression dans un flacon fermé par le biais de l’observation directe des changements de niveau liquides dans le bras de manomètre. Les expériences peuvent être difficiles à mettre en place, et les mesures peuvent être imprécis. L’appareil doit être assisté pendant toute la période de mesure et des calculs sont nécessaires pour estimer l’OCR. Notre protocole fait usage des progrès technologiques, l’élimination de l’obligation pour l’utilisateur de rester par l’appareil pendant la durée de l’expérience, prendre des mesures par œil et utiliser des formules mathématiques. D’autres ont utilisé les premiers respiromètres Clark-type à mesure OCR de Neurospora crassa9 et Botryodpilodia theobromae10 spores, toutefois, ces instruments anciens permis mesures en continu pour un maximum de 20 min. Cette limitation n'aurait pas permis l’identification du retard ~ 45 min dans la consommation d’oxygène, que nous avons observé avec le respiromètre de modèle plus récent. Notre protocole a fait l’interprétation des données plus simple, car la lecture est la concentration d’oxygène restant dans la chambre, qui peut être représenté graphiquement directement sans aucune manipulation de calculs ou de données. En outre, il est possible de prendre des mesures en continu (toutes les 2 s) pour un montant indéterminé de fois jusqu'à ce que l’oxygène disponible est complètement épuisée. Cela permet l’identification de petits changements dans la respiration sur une longue période de temps. Par conséquent, nous avons amélioré les techniques antérieures et mis au point une méthode simple, précise et reproductible pour mesurer la consommation d’oxygène de spores fongiques. À notre connaissance, c’est la première étude à un respiromètre Clark-type modern permet d’étudier la respiration de la dormance et la germination des téleutospores des champignons du charbon.

Malgré la facilité et la simplicité du présent protocole, l’optimisation est nécessaire et il y a des réalités biologiques qui ont limité l’analyse. Tout d’abord, les échantillons doivent être identifiés pour atteindre OCRs raisonnables. Trop d’échantillon peut conduire à prématuré s’écraser des niveaux d’oxygène, et échantillon trop petit peut se traduire par l’incapacité d’observer les changements significatifs dans la consommation d’oxygène. Deuxièmement, il est impératif de laisser le temps de la sonde stabiliser (~ 3 min) pour fournir des données exactes initiales. Enfin, il est important de compléter les milieu de germination avec agents antibactériens (e.g., sulfate de streptomycine) afin d’assurer une contamination bactérienne ne modifie pas les lectures de l’OCR. Les limitations biologiques, que nous avons été confrontés ont un taux de germination faible au cours de l’évolution temporelle de la mesure, (~ 1 %), tel que déterminé par l’observation des changements morphologiques. Détermination de la viabilité des spores permettrait cette détermination de taux pour être converti en un taux par nombre de spores et isoler des téliospores avec des taux plus élevés de germination conduirait à OCRs supérieurs. La germination asynchrone des U. maydis téliospores11 est une réalité qui doit être pris en compte et peut-être avoir contribué à l’incapacité de détecter la consommation d’oxygène plus haut dans la germination.

Afin d’améliorer l’exactitude et la précision de la mesure des changements dans la respiration téliospores, future adaptation de cette méthode pourrait inclure OCR de mesure sur une seule cellule-base. Techniques de micromanipulation pourraient servir à isoler une téliospores unique, qui peut ensuite être induit à germer et son taux de respiration peuvent être surveillé. Cela pourrait améliorer la résolution, fournissant des informations concernant l’OCR pendant le quart de dormance-germination par téliospores, plutôt que par mg de téleutospores. En outre, cela résoudrait la question confondant de germination asynchrone.

Pour les étapes ultérieures de la germination, nous développé une méthode de micromanipulation pour isoler des téliospores aux stades communs de la germination. Cela a permis la création de populations relativement synchrone téliospores pour analyse. Diverses méthodes pour isoler des micro-organismes simples ont été décrites et ont été améliorées sur plus de12ans. Ces méthodes incluent la dilution des suspensions de spores pour obtenir des micro-organismes simples, semi mécaniques Méthodes avec l’utilisation de microcapillaries pour obtenir des spores qui sont transférés au moyen de méthodes de culture et mécaniques qui utilisent des micromanipulateurs . Les méthodes précédentes qui nous permet d’obtenir des téliospores au même stade de la germination incluent élutriation centrifuge contre-courant et filtrage en germination des téleutospores à travers une membrane en nylon avec une taille de pores spécifique. En utilisant ces méthodes nous a permis d’enrichir pour la germination des téleutospores, cependant, nos échantillons contenaient encore des téliospores à divers stades de la germination,13. La technologie actuelle pour la micromanipulation des micro-organismes simples s’est améliorée avec l’introduction de plus de grossissement et d’instruments pour un contrôle précis des aiguilles capillaires, aspiration et transfert de micro-organismes. Techniques de micromanipulation précédentes ont mis l’accent sur l’isolation de cellules individuelles pour cultiver ou devant servir à cellule unique PCR demandes14. L’utilisation de micromanipulateurs pour isoler des spores fongiques individuelles n’est pas préalablement établie. Une méthode précédente pour isoler des spores fongiques individuelles comportait l’utilisation de la pince fine ou aiguilles pour ramasser les petits morceaux de milieu solide contenant la germination des spores15. Micromanipulation avec l’utilisation de micromanipulateurs est largement utilisée dans les études de levure où les grappes d’ascospores peuvent être séparée sporulation suivante en culture sur milieu gélosé pour analyse génétique méiotique16. Nous avons développé une méthode qui combine la technique de micromanipulation des cellules bactériennes14 et méthodes de la fécondation in vitro pour isoler les téliospores en germination. Nous avons montré que des centaines de communes téliospores stade de germination peuvent être obtenus avec cette technique. Ces échantillons peuvent être utilisés pour des études d’expression en aval à l’aide de techniques telles que la RT-qPCR ou RNA-Seq. obtenir une population de téliospores dont la germination est synchronisée permet l’analyse des changements spécifiques dans l’expression des gènes qui se produit au cours de au début, milieu et plus tard des stades de la germination des téliospores.

Microdissection de phase spécifique en germination des téleutospores peut exiger d’expérience dans l’ensemble vers le haut et reconnaissant les différentes étapes de la germination, cependant, cette expérience peut être obtenue rapidement par la pratique. Il y a plusieurs étapes doivent être suivies pour microdissection réussie suivie d’ARN. Tout d’abord, le milieu de germination doit être complétée avec des antibiotiques (e.g., sulfate de streptomycine) pour supprimer la croissance de contamination bactérienne lorsque la germination est lancée, ainsi qu’au cours de la collection de germination des téleutospores. Deuxièmement, il est important d’utiliser une solution de stabilisation pour stabiliser et protéger les RNA pour l’isolation. La solution de stabilisation RNA empêche également les téleutospores recueillies de progresser vers l’étape suivante de la germination, alors qu’elles ramassaient des téliospores supplémentaires. Troisièmement, il est important d’enlever l’huile minérale, une fois que la gouttelette de collection a été récupérée pour assurer l’extraction réussie de l’ARN. Enfin, nous avons remarqué un certain manque de qualité de RNA si téliospores isolés sont stockés dans une solution de stabilisation RNA pendant une période prolongée de temps ; par conséquent, il est recommandé que l’ARN est isolé à la suite de collection des téliospores spécifique de stade germination. Une limitation de la méthode qui est la scène j’ai téliospores recueillies pourraient contenir des dormants, morts et induites à germer téliospores comme ces trois étapes sont morphologiquement indiscernables. En outre, lors de la collecte des téliospores de stade III, un mélange de téleutospores dans la méiose j’ai ou méiose II puisse être obtenue. Une façon d’aider à distinguer téliospores vraiment sommeil et morts pourrait consister à déterminer la viabilité de l’échantillon. Une méthode pour évaluer la viabilité des spores fongiques à l’aide d’analyses de viabilité de cellules de vivre/morts peut-être être en mesure d’évaluer le pourcentage de téleutospores viables, d'où un taux de germination plus informatif pourrait être déterminée17. En outre, noyau coloration au DAPI, par exemple, pourrait être utilisé pour visualiser les événements de la méiose qui sont produisent au cours de la phase III et le passage au stade IV afin de caractériser davantage téliospores morphologiquement au stade III. Cela aiderait à la collection des téliospores au seul stade de germination lors de l’utilisation de notre méthode de microdissection.

En conclusion, nous avons développé une méthode simple, précise et reproductible de mesurer les changements dans la respiration cellulaire qui se produisent pendant le quart de dormance-germination des téleutospores Ustilago maydis . Par ailleurs, nous avons développé une méthode pour rassembler des étapes spécifiques de germination des téleutospores qui pourraient être utilisés pour des applications en aval, tels que RNA-Seq. Nos méthodes peuvent être adaptées pour tenir compte des diverses espèces et types de cellules. Nous prévoyons que les améliorations apportées à nos techniques facilitera la détection de changements respiratoires sur une seule spore niveau ainsi que définir les événements qui sont produisent dans les derniers stades de la germination.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs ont pas concurrentes d’intérêts financiers ou autres conflits d’intérêts de divulguer.

Acknowledgments

Nous tenons à remercier le Dr Paul Frost pour utilisation de son microrespirometer et Nicole Wagner et Alex Bell pour l’assistance technique. Ce travail a été financé par une subvention du CRSNG à B.J.S.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Streptomycin Sulfate BioShop STP101
Kanamycin Sulfate BioShop KAN201
Potato Dextrose Broth BD Difco 254920
1 L Waring Laboratory blender Waring 7011S
Cheesecloth VWR 470150-438
Nalgene Polypropylene Desiccator with Stopcock ThermoFisher Scientific 5310-0250
Unisense MicroRespiration system
MicroRespiration Sensor (O2) Unisense OX10
MicroOptode Meter Amplifier Unisense N/A
MR-Ch Small Unisense MR-Ch
SensorTrace Rate Software Unisense N/A
MicroRespiration Rack Unisense MR2-Rack
MicroRespiration Stirrer Unisense MR2-Co
Microdissection system
Axio Vert.A1 Inverted Light Microscope Zeiss
Coarse Manipulator Narishige MMN-1
Three-axis Hanging Joystick Oil Hydraulic Micromanipulator Narishige MMO-202ND
Pneumatic Microinjector Narishige IM-11-2
TransferTip (ES) Eppendorf 5175107004

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Saville, B. J., Donaldson, M. E., Doyle, C. E. Meiosis - Molecular Mechanisms and Cytogenetic Diversity. Swan, A. InTech. 411-460 (2012).
  2. Christensen, J. J. Monograph Number 2. The American Phytopathological Society. Worcester, MA. (1963).
  3. Caltrider, P. D., Gottlieb, D. Respiratory activity and enzymes for glucose catabolism in fungal spores. Phytopathology. 53, 1021-1030 (1963).
  4. Allen, P. J. Metabolic aspects of spore germination in fungi. Ann. Rev. Phytopathol. 3, 313-342 (1965).
  5. Warburg, O. Metabolism of tumours. Biochemische Zeitschrift. 142, 317-333 (1923).
  6. Ostrowski, L. A., Saville, B. J. Natural antisense transcripts are linked to the modulation of mitochondrial function and teliospore dormancy in Ustilago maydis. Mol Microbiol. 103, (5), 745-763 (2017).
  7. Morrison, E. N., Donaldson, M. E., Saville, B. J. Identification and analysis of genes expressed in the Ustilago maydis dikaryon: uncovering a novel class of pathogenesis genes. Canadian Journal of Plant Pathology-Revue Canadienne De Phytopathologie. 34, (3), 417-435 (2012).
  8. Doyle, C. E., Cheung, H. Y. K., Spence, K. L., Saville, B. J. Unh1, an Ustilago maydis Ndt80-like protein, controls completion of tumor maturation, teliospore development, and meiosis. Fungal Genetics and Biology. 94, 54-68 (2016).
  9. Stade, S., Brambl, R. Mitochondrial biogenesis during fungal spore germination: respiration and cytochrome c oxidase in Neurospora crassa. J Bacteriol. 147, (3), 757-767 (1981).
  10. Brambl, R. Characteristics of developing mitochondrial genetic and respiratory functions in germinating fungal spores. Biochim Biophys Acta. 396, (2), 175-186 (1975).
  11. Sacadura, N. T., Saville, B. J. Gene expression and EST analyses of Ustilago maydis germinating teliospores. Fungal Genet Biol. 40, (1), 47-64 (2003).
  12. Hilderbrand, E. M. Techniques for the isolation of single microorganisms. Botanical Review. 4, (12), 38 (1938).
  13. Seto, A. M. Analysis of gene transcripts during Ustilago maydis teliospore dormancy and germination. Trent University. M.Sc. thesis (2013).
  14. Fröhlich, J., König, H. Soil Biology - Intestinal Microorganisms of Termites and Other Invertebrates. König, H., Varma, A. Springer. 425-437 (2006).
  15. Choi, Y., Hyde, K., Ho, W. Single spore isolation of fungi. Fungal Diversity. 3, 11 (1999).
  16. Sherman, F. Getting started with yeast. Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology, Pt B. 350, 3-41 (2002).
  17. Chen, Y., Seguin-Swartz, G. A rapid method for assessing the viability of fungal spores. Canadian Journal of Plant Pathology-Revue Canadienne De Phytopathologie. 24, (2), 230-232 (2002).
Germination des téliospores chargée de l’enquête à l’aide de l’analyse Microrespiration et Microdissection
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ostrowski, L. A., Seto, A. M., Saville, B. Investigating Teliospore Germination Using Microrespiration Analysis and Microdissection. J. Vis. Exp. (135), e57628, doi:10.3791/57628 (2018).More

Ostrowski, L. A., Seto, A. M., Saville, B. Investigating Teliospore Germination Using Microrespiration Analysis and Microdissection. J. Vis. Exp. (135), e57628, doi:10.3791/57628 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter