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Biology

वयस्क माउस के श्लेष्मा और लेमिना Propria से प्रवेश Glial कोशिकाओं का अलगाव

Published: August 15, 2018 doi: 10.3791/57629
Automatic Translation
1,4, 1, 1, 1, 1, 3, 1,2, 1,2,5
1Department of Internal Medicine-Gastroenterology, University of Michigan, 2Department of Molecular and Integrative Physiology, University of Michigan, 3Department of Molecular, Cellular and Developmental Biology, University of Michigan, 4Department of Gastrointestinal Surgery, The First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, 5Division of Gastroenterology, University of Arizona College of Medicine

Summary

यहां, हम आंतों से glial कोशिकाओं के अलगाव का वर्णन-श्लेष्मा EDTA chelate divalent cations और फिर गैर में मशीन-एंजाइमी सेल वसूली समाधान के लिए अनुक्रमिक-म्यूकोसा का उपयोग कर । कार्यात्मक विश्लेषण के लिए सबम्यूकोसल glial कोशिकाओं की एक अत्यधिक समृद्ध संस्कृति में पाली-डी-lysine और laminin परिणाम पर परिणामी सेल निलंबन चढ़ाना ।

Abstract

दर्जी तंत्रिका तंत्र (िनों) न्यूरॉन्स और प्रवेश glial कोशिकाओं (EGCs) है कि चिकनी मांसपेशियों की दीवार के भीतर रहते हैं, उपश्लेषक और लेमिना propria. EGCs विभिंन पौष्टिकता कारकों की रिहाई के माध्यम से आंत homeostasis में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते है और उपकला बाधा की अखंडता के लिए योगदान करते हैं । प्राथमिक दर्जी glial संस्कृतियों का सबसे अध्ययन एंजाइमी पृथक्करण के बाद myenteric जाल से पृथक कोशिकाओं का उपयोग करें । यहाँ, अलग करने के लिए एक गैर-एंजाइमी विधि और आंत्र उपम्यूकोसा और लेमिना propria से EGCs संस्कृति का वर्णन किया गया है । अनुदैर्ध्य मांसपेशी परत के मैनुअल हटाने के बाद, EGCs व्यावसायिक रूप से उपलब्ध गैर HEPES सेल वसूली समाधान में मशीन द्वारा पीछा लेमिना propria और अनुक्रमिक EDTA बफर एंजाइमी की गर्मी का उपयोग कर म्यूकोसा से मुक्त थे । EDTA गर्मी लेमिना propria से उपकला म्यूकोसा के सबसे पट्टी करने के लिए पर्याप्त थे, सबम्यूकोसल EGCs को मुक्त करने के लिए सेल वसूली समाधान की अनुमति । किसी भी अवशिष्ट लेमिना propria और चिकनी मांसपेशी myenteric glia के साथ छोड़ दिया गया था । EGCs आसानी से glial fibrillary अम्लीय प्रोटीन (GFAP) व्यक्त करने की क्षमता से पहचाना गया । केवल सेल निलंबन के बारे में ५०% निहित GFAP + कोशिकाओं ऊतक की गर्मी को पूरा करने के बाद और पाली-डी-lysine/laminin सब्सट्रेट पर चढ़ाना करने से पहले. हालांकि, संवर्धन के 3 दिनों के बाद glial सेल में कोशिकाओं-व्युत्पंन neurotrophic फैक्टर (GDNF)-संस्कृति मीडिया युक्त, सेल सब्सट्रेट लेपित प्लेटों के लिए पालन की आबादी में शामिल > 95% प्रवेश glia । हम रोजा-tdTomato रिपोर्टर लाइन के लिए एक hGFAP-Cre माउस प्रजनन द्वारा एक संकर माउस लाइन बनाया GFAP + अंतर्जात सेल प्रतिदीप्ति का उपयोग कर कोशिकाओं का प्रतिशत ट्रैक । इस प्रकार, गैर-myenteric एंट्रेंस glia को गैर-एंजाइमी तरीकों से अलग किया जा सकता है और कम से 5 दिनों के लिए कल्चरल कर सकते हैं ।

Introduction

प्रवेश glial कोशिकाओं (EGCs) के समारोह में रुचि तेजी से आंत अखंडता और homeostasis1,2में उनकी मांयता प्राप्त भूमिकाओं के कारण बढ़ गया है । इसके अलावा, EGCs सैनिक पथ3,4की लंबाई के साथ अपने स्थान के अनुसार बदलती हैं । EGCs glial कोशिका व्युत्पंन neurotrophic फैक्टर (GDNF) सहित विभिन्न पौष्टिकता कारकों रिहाई, आंत गतिशीलता1,5 में योगदान और माइक्रोबियल शोधकार्य6,7का जवाब । अध्ययनों से संकेत दिया है कि EGC जनसंख्या विषम है और है कि उनके समारोह कि वे सबम्यूकोसल रहे है या myenteric जाल1,7के भीतर रहते है पर निर्भर करता है । उदाहरण के लिए, उपम्यूकोसा के भीतर EGCs तंग जंक्शनों में योगदान8। अंतर GFAP अभिव्यक्ति और EGCs में फास्फारिलीकरण पार्किंसंस रोग से जोड़ा गया है, इस विकार के आंत phenotype के लिए उनके संभव कड़ी सुझाव9। हाल ही में, यह देखा गया कि समीपस्थ आंत्र उपश्लेष्मा से EGCs की पृथक संस्कृतियों में परमाणु प्रोटीन menin की हानि हार्मोन गैस्ट्रीन10की अभिव्यक्ति के लिए प्रेरित करने के लिए पर्याप्त था । नतीजतन, यह प्रस्ताव किया गया था कि EGCs ग्रहणी gastrinomas, neuroendocrine ट्यूमर का एक प्रकार का मूल हो सकता है10। सामूहिक रूप से, इन उदाहरणों व्यवहार और neuropathic विकारों और11कैंसर में अलग EGCs के समारोह के अध्ययन की प्रासंगिकता को रेखांकित ।

क्षेत्र में चुनौती बनी रहती है कि कैसे अलग और अध्ययन या तो या दोनों EGC इन विट्रो मेंआबादी । वंश ट्रेस प्रयोगों का प्रदर्शन किया है कि EGCs में उपम्यूकोसा और लेमिना propria में जनक कोशिकाओं से उत्पन्न myenteric जाल7. यद्यपि वहां कई प्रकाशित अलगाव प्रोटोकॉल myenteric EGCs12,13,14,15,16,17की संस्कृतियों उत्पंन करने के लिए उपलब्ध हैं, 18,19, कोई भी विशेष रूप से सबम्यूकोसल/लेमिना propria EGC जनसंख्या का अलगाव लक्ष्य । EGC अलगाव के लिए मौजूदा प्रोटोकॉल विशेष रूप से यांत्रिक जुदाई या चिकनी एंजाइमी पृथक्करण के साथ संयुक्त मांसपेशी के microdissection का एक संयोजन का उपयोग करें, अंततः श्लैष्मिक कोशिका परत खारिज ।

इस पांडुलिपि के लक्ष्य को गैर enzymatically अलग प्राथमिक EGCs लेमिना propria इन विट्रो में अध्ययन के लिए कदम प्रदर्शित करने के लिए है । के बाद से वहां कोई मार्करों है कि विशेष रूप से myenteric EGCs के उपम्यूकोसा में भेद कर रहे हैं, चिकनी मांसपेशी से उपकला म्यूकोसा के स्थानिक जुदाई सबम्यूकोसल EGCs को अलग करने के लिए शोषण किया गया था । इसके अलावा, गैर-एंजाइमी पृथक्करण के साथ EDTA केलेशनथेरेपी के संयोजन के द्वारा, EGCs चिकनी मांसपेशी के विपरीत श्लेष्मा से अलग किया गया था, जो संबद्ध अंतर-myenteric EGCs के साथ छोड़ दिया गया था । इसके अलावा उपम्यूकोसा और लेमिना propria EGCs की जुदाई glial सेल के अनुकूल सब्सट्रेट, जैसे, पाली-डी-lysine और laminin पर कोशिकाओं संवर्धन द्वारा हुई ।

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Protocol

सभी पशु प्रयोगों का उपयोग और जानवरों की देखभाल पर मिशिगन विश्वविद्यालय के समिति द्वारा अनुमोदित किया गया ।

1. बाँझ की तैयारी पाली-डी-lysine (PDL) और Laminin समाधान

  1. सेल अलगाव से कम से एक दिन पहले, पॉली-डी-lysine (PDL) और laminin लेपित प्लेटें तैयार करें ।
    नोट: दोनों 6 अच्छी तरह से और 12 अच्छी तरह से प्लेटें प्रयोगात्मक लक्ष्यों के आधार पर तैयार किया गया । आमतौर पर, 12-अच्छी तरह से प्लेटें पश्चिमी दाग का उपयोग मात्रात्मक विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया; जबकि, 6-well प्लेट्स immunohistochemistry के लिए autoclaved (बाँझ) coverslips पकड़ करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । 24-well प्लेट्स के लिए इस्तेमाल किया गया था कल्चर EGCs Ca2 + फ्लक्स इमेजिंग के लिए ।
  2. ultrapure ऊतक संस्कृति ग्रेड के साथ शेयर समाधान पतला, DNase मुक्त और RNase-HEPA-फ़िल्टर हवा के साथ एक ऊतक संस्कृति हूड में मुफ्त पानी ।
  3. बंध्याकरण ग् coverslips
    1. बाँझ संदंश के साथ coverslip पकड़ो और 15 मिनट के लिए १००% इथेनॉल के एक चोंच में coverslips विसर्जित कर दिया । इथेनॉल ऊतक संस्कृति हूड में लुप्त हो जाना और फिर 6-अच्छी तरह से प्लेटों में जगह की अनुमति दें ।
    2. वैकल्पिक रूप से, एक प्लास्टिक कंटेनर में 2 मिमी मोटी सोख्ता कागज पर व्यक्तिगत रूप से कई coverslips प्लेस और फिर आटोक्लेव ।

2. कोटिंग प्लेट्स

नोट: एक बाँझ ऊतक संस्कृति लामिना प्रवाह हूड के तहत इन चरणों का प्रदर्शन.

  1. गल 1 मिलीग्राम/एमएल PDL स्टॉक और पतला बाँझ के साथ 1:10, टिशू कल्चर ग्रेड पानी ताकि अंतिम एकाग्रता १०० µ g/एमएल है । 6 अच्छी तरह से प्लेटें, 1 मिलीलीटर एक अच्छी तरह से 24-अच्छी तरह से प्लेटों में एक के लिए एक 12 अच्छी थाली और ०.५ मिलीलीटर के एक अच्छी तरह से कवर करने के लिए 2 मिलीलीटर प्रति का प्रयोग करें । शेष पतला PDL 12 मिलीलीटर aliquots में-20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
  2. PDL के लिए कुओं कोट करने के लिए अनुमति देने के बाद से कम 1 ज, एक बाँझ पिपेट के साथ PDL निकालें. प्लेटें पूरी तरह से एक ऊतक संस्कृति लामिना प्रवाह हूड के तहत सूखी हवा के लिए अनुमति दें ।
    नोट: एक बाँझ पिपेट के साथ PDL समाधान निकालने के बाद, यह एक ०.२२ µm फिल्टर के माध्यम से गुजर रहा है और 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण के बाद 1 सप्ताह के भीतर दो बार अधिक इस्तेमाल किया जा सकता है.
  3. जेल गठन से बचने के लिए बर्फ पर laminin स्टॉक गल ।
    नोट: undilute laminin ठोस जब 8 डिग्री सेल्सियस से ऊपर गरम हो जाता है ।
  4. laminin स्टॉक पतला (०.५ मिलीग्राम/एमएल) 1:50 बाँझ Dulbecco के फास्फेट के साथ बफर खारा (DPBS) के लिए एक अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए 10 µ g/ml. -20 डिग्री सेल्सियस पर 12 मिलीलीटर aliquots में पतला laminin स्टोर ।
  5. सूखे PDL युक्त कुओं को पतला laminin जोड़ें. 12-अच्छी तरह से प्लेटों के नीचे कवर करने के लिए 6-well सतह और ०.५ मिलीलीटर कवर करने के लिए 1 मिलीलीटर का उपयोग करें । coverslips के लिए, सतह कवरेज प्राप्त करने के लिए coverslips के लिए पतला laminin के ४०० µ l जोड़ें ।
  6. 2 ज के लिए ३७ ° c में लेपित प्लेटें, अगर थाली एक ही दिन (त्वरित कोटिंग) प्रयोग किया जाता है । यदि नहीं, प्लास्टिक लपेटो के साथ प्लेटें सील, और 4 डिग्री सेल्सियस (धीमी कोटिंग) पर रात भर की दुकान ।
    नोट: सील सुखाने और संदूषण से बचने के लिए महत्वपूर्ण है ।
  7. सतह खरोंच से बचने के लिए एक पिपेट के साथ सावधानी से laminin समाधान निकालें । धीरे से कुओं को तीन बार बाँझ DPBS से धो लें ।
  8. एक अच्छी तरह से पूरा glial विकास मीडिया जोड़ें और ३७ ° c पर प्लेटों को बनाए रखने जब तक EGC निलंबन जोड़ने के लिए तैयार है ।
    नोट: पाली-डी lysine और laminin लेपित प्लेटें 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 दिनों के लिए संग्रहित किया जा सकता है । कोट कई दिन आगे प्लेटें और फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर, बाँझ DPBS तीन बार के साथ प्लेटें धो लें । प्रत्येक अच्छी तरह से अंतिम धोने के बाद बाँझ DPBS के 2 मिलीलीटर जोड़ें । 4 डिग्री सेल्सियस पर parafilm और स्टोर के साथ प्लेट सील । यह सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है कि laminin बाहर सूखी नहीं है ।

3. अलगाव समाधान की तैयारी

  1. EDTA/HEPES/DPBS पृथक्करण समाधान तैयार करें । समाधान के ५०० मिलीलीटर के लिए, बाँझ DPBS का उपयोग करें (कैल्शियम और मैग्नीशियम के बिना) 10 मिमी HEPES और 5 मिमी EDTA के एक अंतिम समाधान करने के लिए. DPBS के ४९० मिलीलीटर, 1 मीटर HEPES बफर और ०.५ मीटर EDTA स्टॉक समाधान के 5 मिलीलीटर की 5 मिलीलीटर जोड़ें । उपयोग करने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
  2. तालिका 1में सूचीबद्ध एजेंट का उपयोग कर glial कक्ष resuspension मीडिया तैयार करें ।
  3. तालिका 2में सूचीबद्ध एजेंट का उपयोग करके glial विकास मीडिया तैयार करें ।
    नोट: GDNF युक्त Glial ग्रोथ मीडिया 4 डिग्री सेल्सियस पर एक सप्ताह के लिए संग्रहित किया जा सकता है ।

4. आंतों खंड का निष्कासन

नोट: चूहों isoflurane ड्रॉप विधि और एक महत्वपूर्ण अंग को हटाने के द्वारा euthanization करने से पहले भोजन और पानी के लिए स्वतंत्र पहुँच की अनुमति दी गई. C57BL/6 चूहों से अधिक उम्र के 8 सप्ताह का उपयोग किया गया. दोनों लिंगों की तैयारी में अंतर नजर बिना इस्तेमाल किया गया ।

  1. isoflurane और जगह लापरवाह की ओवरडोज के साथ माउस को एक विदारक ट्रे में Euthanize । पैरों को पिन और ७०% इथेनॉल के साथ पेट निष्फल । संदंश के साथ त्वचा को स्टेंट करें और फिर पेट को कैंची से खोलें ।
  2. जिगर लिफ्ट और बाहर पेट की पहचान/जठरनिर्गम । फिर समीपस्थ आंत के 7 सेमी निकालें । आंत को फाड़ने के लिए नहीं सावधान रहें ।
  3. संदंश के साथ जठरनिर्गम को पकड़ते हुए snipping दूर अन्त्रपेशी ।
    1. अनुयाई अग्ंयाशय दूर परिमार्जन करने के लिए कैंची के पीछे के साथ कुंद विच्छेदन का प्रयोग करें ।
    2. आइस-कोल्ड DPBS को बिना सीए2 + या2 मिलीग्राम + (figure 1a) में रखें ।
      ध्यान दें: आंत या बृहदांत्र के अंय क्षेत्रों में भी एक ही तकनीक का उपयोग कर हटाया जा सकता है ।
  4. एक 5 या 10 मिलीलीटर एक कुंद अंत 20 जी सुई से जुड़ी सिरिंज आइस कोल्ड DPBS (चित्रा 1b) के साथ मल सामग्री फ्लश का प्रयोग करें ।
  5. 3 सेमी क्षेत्रों में आंत फूट डालो अनुदैर्ध्य शुरू में स्मिथ एट अल द्वारा वर्णित तकनीक का उपयोग कर मांसपेशियों को दूर करने के लिए । 12 और के रूप में Sundaresan एट अल में संशोधित किया । 10.
    नोट: HEPES/EDTA/DPBS आइसोलेशन समाधान के प्रति 30 मिलीलीटर से दो चूहों के लिए आंतों क्षेत्रों का उपयोग किया जाता है ।
  6. बंद के बारे में 4 सेमी के लिए कपास टिप से लकड़ी के छड़ी अलग तोड़ । लकड़ी के स्टिक को DPBS (figure 1C) में भिगो दें ।
  7. गीला छड़ी (चित्रा 2a-सी) पर आसानी से आंत्र क्षेत्रों में से एक पर्ची ।
  8. निकालें अनुयाई अन्त्रपेशी अभी भी सुई नाक संदंश (चित्रा 2d) का उपयोग कर संलग्न ।
  9. एक साफ उस्तरा ब्लेड या स्केलपेल आंत जहां अन्त्रपेशी (चित्रा 2E) संलग्न किया गया था साथ दो अनुदैर्ध्य निक बनाने के लिए उपयोग करें ।
    1. DPBS के साथ कपास टिप गीला । अनुदैर्ध्य मांसपेशी/myenteric जाल (LMMP) को ढीला करने के लिए मांसपेशी के साथ गीला कपास टिप longitudinally रगड़ना । तो कपास टिप क्षैतिज कदम दूर LMMP हटाने के दौरान आंत्र खंड की लंबाई के साथ परिपत्र मांसपेशी से LMMP चिढ़ाने के लिए ।
    2. बीच और चौथे उंगली (चित्रा 2F) के साथ खंड स्थिर जबकि अंगूठे और तर्जनी के बीच छड़ी की नोक पकड़ो । जब पूरा, LMMP आसानी से आंतों खंड छील जाएगा ।
  10. छोड़ LMMP आंत्र ट्यूब से छीन लिया और कपास झाड़ू से जुड़ी जब तक myenteric जाल से कटाई EGCs वांछित है ।
  11. एक उस्तरा ब्लेड का उपयोग करने के लिए लकड़ी की छड़ी से हटाने के लिए आंत्र खंड longitudinally खोलने लूटना ।
  12. DPBS में बर्फ पर छीन लिया आंत्र ऊतक (मुख्य रूप से म्यूकोसा और उपश्लेषक प्लस परिपत्र मांसपेशी) की दुकान । दोहराएं चरण 4.4 – 4.11 जब तक सभी आंत्र खंड तैयार कर रहे हैं ।

5. उपकला म्यूकोसा को हटाने

  1. ठीक कैंची के साथ ~ ०.५ cm के छोटे टुकड़ों में आंतों में कटौती ।
  2. एक बाँझ ५० मिलीलीटर शंकु केंद्रापसारक ट्यूब बर्फ ठंड EDTA/HEPES/DPBS समाधान के 30 मिलीलीटर युक्त में ऊतक प्लेस ।
  3. रॉक ऊतक युक्त समाधान पर 10 मिनट के लिए 4 ° c पर ~ ६० प्रति मिनट झुकाव ।
  4. पूर्व गीला एक 5 मिलीलीटर प्लास्टिक पिपेट pipetting द्वारा EDTA/HEPES/DPBS बफर ऊपर और नीचे एक बार, और फिर ऊतक और बफर निलंबन पिपेट करने के लिए पूर्व गीला पिपेट का उपयोग करें ऊपर और नीचे (trituration) 20 बार उपकला म्यूकोसा बेदखल करने के लिए ।
  5. एक १०० µm नायलॉन सेल छलनी के माध्यम से मिश्रण डालने के द्वारा EDTA गर्मी से ऊतक ले लीजिए । पंकिल श्लेष्मा-भरा प्रवाह-के माध्यम से (चित्रा 3) त्यागें ।
  6. एक नया ५० मिलीलीटर शंकु केंद्रापसारक ट्यूब बर्फ ठंड EDTA/HEPES/DPBS के सुई-नाक संदंश का उपयोग कर के 30 मिलीलीटर युक्त में ऊतक छलनी में रखा प्लेस ।
  7. EDTA/HEPES/DPBS के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ऊतक का घोड़ा द्वारा एक दूसरी बार एक दूसरे समय को दोहराएं ~ ६० प्रति मिनट झुकाव को अतिरिक्त उपकला म्यूकोसा बंद पट्टी ।
  8. पूर्व गीला एक 5 मिलीलीटर बफर के साथ पिपेट और फिर पिपेट ऊतक निलंबन ऊपर और नीचे 20 बार श्लेष्म कोशिकाओं को बेदखल करने के लिए ।
    नोट: ऊतक उपकला के अधिक के रूप में पिपेट के अंदर करने के लिए छड़ी करने के लिए करते हैं हटा दिया जाएगा.
  9. एक १०० µm नायलॉन सेल छलनी के माध्यम से मिश्रण डालने के द्वारा दूसरी गर्मी के बाद ऊतक ले लीजिए और के माध्यम से प्रवाह त्याग । दूसरी प्रवाह के माध्यम से पहले से कम पंकिल होना चाहिए (चित्रा 3) ।
  10. दोहराएं 10 मिनट EDTA की मशीन जब तक समाधान लगभग स्पष्ट है (के बारे में 3 से 4 की मशीन ऊतक की मात्रा और trituration की प्रभावशीलता पर निर्भर करता है) (चित्रा 3) ।

6. लेमिना Propria और उपश्लेषक से एंट्रेंस Glial कोशिकाओं का संग्रह

  1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 25-30 मिनट के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सेल रिकवरी समाधान और रॉक के 5 मिलीलीटर युक्त एक 15 मिलीलीटर शंकु केंद्रापसारक ट्यूब करने के लिए नायलॉन छलनी से ऊतक स्थानांतरण ।
  2. Triturate धीरे 10x लेमिना propria से अलग कर देना glial कोशिकाओं में प्रवेश करने के लिए ।
    1. एक ४० µm फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर और एक साफ ५० एमएल ट्यूब में छानने का जिम्मा इकट्ठा ।
    2. DPBS के 1 मिलीलीटर के साथ नायलॉन फिल्टर पर ऊतक कुल्ला ।
    3. ऊतक त्यागें और एक साफ 15 मिलीलीटर शंकु केंद्रापसारक ट्यूब करने के लिए छानने का ~ 5 – 6 मिलीलीटर स्थानांतरण ।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए एक झूलते बाल्टी में २,००० x g पर निस्पंदन स्पिन ।
  3. पुनः निलंबन glial सेल-गोली से कम 1 resuspension बफर की मिलीलीटर में धीरे से गोली ऊपर और एक ५०० µ l पिपेट टिप के साथ नीचे pipetting । बुलबुले शुरू करने से बचें ।
    नोट: कुओं और प्लेटों की संख्या के लिए आवश्यकतानुसार निलंबन की मात्रा समायोजित करें । उदाहरण के लिए, एक 6-अच्छी प्लेट के लिए १.२ मिलीलीटर; दो 6 के लिए २.४ मिलीलीटर-अच्छी तरह से प्लेटें; १ १२-अच्छी तरह से थाली के लिए २.४ मिलीलीटर ।
  4. पिपेट २०० µ 6 के प्रत्येक कुआं में सेल निलंबन के एल अच्छी तरह से या १०० µ एल एक 12 के लिए अच्छी तरह से PDL-laminin लेपित प्लेटें glial विकास मीडिया युक्त ।
  5. प्लेटों के लिए कोशिकाओं को जोड़ने और ३७ ° c मशीन में रखने के लिए कोशिकाओं की अधिकतम संख्या का पालन करने की अनुमति देने के बाद पकवान परेशान मत करो ।
    ध्यान दें: कोशिकाओं की एक स्वस्थ तैयारी 6-8 घंटे के भीतर देते हैं, लेकिन धीरे से मीडिया को बदलने से पहले गैर अनुयाई कोशिकाओं के साथ साथ मीडिया pipetting से कम 24 घंटे के लिए प्रतीक्षा करेंगे ।
  6. प्रयोगों के लिए कोशिकाओं का उपयोग 3-4 दिनों के बाद वे संस्कृति में रखा जाता है (चित्रा 4). विशिष्ट प्रोटीन मार्करों के लिए ब्याज की एंटीबॉडी का उपयोग कर immunofluorescent विश्लेषण प्रदर्शन (तालिका 3). उदाहरण के लिए, GFAP, S100b और p75NTR या Sox10 का उपयोग यहां किया गया था । ई-cadherin या अल्फा चिकनी मांसपेशी actin एंटीबॉडी अन्य कोशिका प्रकार से संदूषण की डिग्री का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया.

7. Immunofluorescent धुंधलाना

  1. मीडिया संस्कृतियों से महाप्राण और दो बार पंजाबियों के साथ कुल्ला ।
  2. 4% paraformaldehyde के साथ कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए संस्कृतियों को ठीक करें ।
  3. निर्धारण को हटा दें और फिर पंजाबियों के साथ 3 बार कुल्ला करें ।
  4. कमरे के तापमान पर ०.२% ट्राइटन X-१०० युक्त पंजाबियों के साथ कोशिकाओं Permeabilize ।
  5. कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए विरोधी चिकन IgY, विरोधी खरगोश या विरोधी माउस आईजीजी के शामिल समाधान के साथ permeabilized कोशिकाओं मशीन ।
  6. प्राथमिक एंटीबॉडी रात भर के साथ कोशिकाओं को गर्मी, जैसे, GFAP (1:1000) ।
    1. पंजाबियों के साथ 3 बार कोशिकाओं कुल्ला । यदि colocalization ७.७ चरण के लिए आगे बढ़ना है ।
  7. कमरे के तापमान पर कम से कम 2 ज के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी के अगले सेट की मशीन, लेकिन अधिमानतः 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात । खरगोश विरोधी S100 या माउस विरोधी p75NTR के एक 1:500 कमजोर पड़ने के एक 1:1000 कमजोर पड़ने का प्रयोग करें ।
    नोट: सभी एंटीबॉडी पंजाब में पतला कर रहे हैं ।
  8. प्राथमिक एंटीबॉडी हटाने के लिए पंजाबियों के साथ 3 बार कोशिकाओं कुल्ला । तो कमरे के तापमान (तालिका 3) में 2 घंटे के लिए उपयुक्त फ्लोरोसेंट-टैग माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ कुल्ला कोशिकाओं की मशीन ।
  9. माध्यमिक एंटीबॉडी को दूर करने के लिए पंजाबियों के साथ 3 बार कुल्ला ।
  10. DAPI के साथ बढ़ते मीडिया के 1-2 बूंदें और एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के नीचे की कोशिकाओं को देखने का उपयोग कर स्लाइड पर coverslips माउंट ।

8. फ्लो Cytometry

  1. DPBS के साथ एक बार कोशिकाओं को धोने और फिर ०.२५% trypsin-EDTA प्रति निर्माता के प्रोटोकॉल जोड़ने के द्वारा प्रवाह cytometry के लिए अनुयाई glial कोशिकाओं को निकालें । 3 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर trypsin-EDTA समाधान में कोशिकाओं की मशीन । पूरा glial सेल वृद्धि मीडिया में कोशिकाओं को इकट्ठा करके पाचन समाप्त ।
  2. 5 मिनट के लिए ४०० x g पर केंद्रापसारक द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा, और फिर फिर से पंजाब में कोशिकाओं को निलंबित ।
  3. 10 मिनट के लिए 4% paraformaldehyde के साथ कोशिकाओं को ठीक करें और फिर चरण ७.४ में वर्णित के रूप में पंजाब में ०.२% ट्राइटन X-१०० के साथ permeabilize ।
  4. 20 मिनट के लिए 1% BSA और ऊतक विशिष्ट immunoglobulin युक्त पंजाबियों के साथ कोशिकाओं ब्लॉक, जैसे, गधा विरोधी चिकन IgY (आईजीजी) (एच + एल) (1:1000) या गधा विरोधी बकरी आईजीजी (एच + एल) (1:1000) ।
  5. प्राथमिक एंटीबॉडी GFAP (1:2000), ई-cadherin (1:400), α-चिकनी मांसपेशी actin (1:500), या 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात रात 9.5 (1:500) के साथ गर्मी कोशिकाओं ।
  6. पंजाबियों के साथ एंटीबॉडी को दूर धोएं ।
    1. मशीन के साथ प्रतिजन-एंटीबॉडी परिसर में फ्लोरोसेंट-टैग माध्यमिक एंटीबॉडी 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मशीन ।
    2. isotype नियंत्रण के रूप में कार्य करने के लिए द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ मशीन की गई कक्षों की एक पृथक aliquot का उपयोग करें । कोशिकाओं की दोनों आबादी धोया और cytometry प्रवाह से पहले पंजाब में resuspend कर रहे हैं ।
    3. लाइव कोशिकाओं पर गेटिंग द्वारा एक प्रवाह cytometer पर कोशिकाओं की दो आबादी का विश्लेषण.

9. hGFAP-Cre: tdTomato चूहों से माउस के ऊतकों की तैयारी

नोट: लोक्स-STOP-लोक्स-tdTomato सीडीएनए रोजा लोकस22,23 (जैक्सन लैब्स, #007914) से व्यक्त किया जाता है और अंतर्जात प्रतिदीप्ति उत्पन्न करता है जब एक Cre recombinase (hGFAP-Cre) व्यक्त माउस को पैदा. में सीटू विश्लेषण जमे हुए ऊतक वर्गों पैदा करके किया जाता है ।

  1. 1 घंटे के लिए 4% paraformaldehyde में आंत्र ऊतक फिक्स और फिर पंजाब में 1 मीटर सुक्रोज में रात भर निर्जलित ।
  2. व्यावसायिक रूप से खरीदा इष्टतम काटने ऊतक (OCT) यौगिक 10% polyvinyl शराब और ४.२% पॉलीथीन ग्लाइकोल के शामिल में ऊतक एंबेड, और फिर तरल नाइट्रोजन में फ्रीज स्नैप ।
  3. तैयार 5 µm cryosections और फिर DAPI के साथ एक antifade बढ़ते मीडिया का उपयोग कर माउंट ।
  4. प्रवाह cytometry के लिए, hGFAP-Cre: tdTomato + चूहों से EGCs तैयार करें जैसा कि चरण 4.1 – 6.5 में वर्णित है ।
  5. Trypsinize थाली से कोशिकाओं के रूप में 3 दिनों के बाद संस्कृतियों में ८.१ चरण में और फिर 4% paraformaldehyde में 10 मिनट के लिए फिक्स ।
  6. एक प्रवाह cytometer पर hGFAP-Cre: tdTomato + चूहों से पृथक कोशिकाओं के साथ समानांतर में Cre नकारात्मक चूहों से अलग कोशिकाओं का विश्लेषण.
    नोट: मृत कोशिकाओं और मलबे से बचने के लिए गेट्स का निर्माण किया गया था ।

10. Ca2 + फ्लक्स इमेजिंग

  1. मशीन EGCs 3 µ एम Fluo के साथ एक 24 अच्छी प्लेट पर चढ़ाया-4-३७ ° c पर 30 मिनट के लिए हूं ।
  2. छवि Ca2 + व्यावसायिक रूप से एक कताई डिस्क फोकल माइक्रोस्कोप और ४८० एनएम (F480) के एक उत्तेजना तरंग दैर्ध्य CCK या गैस्ट्रीन पेप्टाइड जोड़ने के बाद का उपयोग कर Tyrode समाधान में सिग्नल खरीदा है । छवि विश्लेषण Sundaresan एट अल में बताया गया था । 10 .

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Representative Results

प्रस्तुतीकरण असफल माना जाता था अगर GFAP + कोशिकाओं का पालन नहीं किया और 24 घंटे के भीतर फैल (4a आंकड़ा) । glial कोशिकाओं की संख्या 24 के बाद जब तक निर्धारित नहीं किया जा सकता है जब कोशिकाओं का पालन और फ्लैट समुच्चय (चित्रा 4B) में फैलने के सबूत दिखाया । समूहों के किनारे पर कोशिकाओं को लंबी प्रक्रियाओं का विस्तार करने के लिए खड़ा है और क्लासिक glial मार्करों, उदाहरण के लिए, GFAP, S100b और p75NTR (चित्रा 4c, 4d)10,16व्यक्त किया । 2एन डी दिन तक, glial कोशिकाओं को कसकर गैर अनुयाई आबादी को पंजाबियों के साथ दूर कुल्ला करने की अनुमति सतह का पालन किया । सेल मलबे के साथ-साथ अधिकांश फ्लोटिंग कोशिकाएं उपकला और लेमिना propria कोशिकाएं थीं । इन फ्लोटिंग सेल के झुरमुट की उपस्थिति अनुयाई glial कोशिकाओं की उपज कम प्रवाह के माध्यम से EDTA गर्मी प्रदर्शन के महत्व को रेखांकित करने के माध्यम से लगभग स्पष्ट है, संकेत है कि उपकला कोशिकाओं लेमिना से हटा दिया गया है propria कोर । इसके अलावा, सेल वसूली समाधान में गर्मी के बाद कम से १,५०० x g गति पर केंद्रापसारक प्रभावी रूप से एक कम पैदावार के लिए अग्रणी गोली में व्यवहार्य कोशिकाओं के सभी इकट्ठा नहीं किया । आमतौर पर, ४०,००० से १००,००० कोशिकाओं EGCs के अनुरूप आकृति विज्ञान संस्कृति में दिन 3 से दृढ़ता से पालन किया ।

glial-जुड़े एंटीबॉडी के साथ Immunohistochemical विश्लेषण, संकेत दिया कि 3 दिन से अनुयाई बनी हुई सेल क्लस्टर GFAP, S100b, और Sox 10 सकारात्मक10,16 (आंकड़ा 5 ए) थे. वर्तमान अध्ययन में, पवित्रता के इस एक ही डिग्री कोशिकाओं permeabilizing और प्रवाह cytometry (चित्रा 5B-एफ) द्वारा विश्लेषण द्वारा मनाया गया । सबम्यूकोसल/लेमिना propria glial कोशिकाओं को अलग करने के बाद, प्रवाह cytometry से पता चला कि कोशिकाओं के बारे में ५१% GFAP + (चित्रा 5B) थे, GFAP की उपस्थिति का सुझाव-नकारात्मक कोशिका प्रकार, जैसे, उपकला, टेम, endothelial, न्यूरॉन कोशिकाओं, उपकला और लेमिना propria में मौजूद करने के लिए जाना जाता myofibroblasts. संस्कृति में 3 दिनों के बाद, GFAP की संख्या + सेल जनसंख्या का ९५% से अधिक प्रतिनिधित्व कोशिकाओं मूल मीडिया को हटाने के बाद विश्लेषण किया, धीरे से पंजाबियों के साथ धोने और फिर ताजा मीडिया (चित्रा 5C) जोड़ने । दिलचस्प है, प्रवाह विश्लेषण उच्च और कम GFAP प्रोटीन व्यक्त आबादी (चित्रा 5C) से पता चला । दरअसल, कोशिकाओं के immunofluorescent विश्लेषण से पता चला कि क्लस्टर की परिधि के लिए GFAP के उच्च स्तर (चित्रा 4c, 4d) व्यक्त करते थे । एक साथ लिया, विश्लेषण के दो प्रकार के EGC परिपक्वता या भेदभाव की स्थिति में मतभेद का संकेत हो सकता है । सामूहिक रूप से, α-SMA + (myofibroblast सेल मार्कर), ई-cadherin + (उपकला कोशिका मार्कर) का प्रतिशत है, और 9.5 + (न्यूरॉन सेल मार्कर) कोशिकाओं से कम था 5% (चित्रा 5d-F). इन परिणामों के पूर्व अध्ययन के साथ संगत थे EGCs के immunofluorescent लेबलिंग का उपयोग कर के बारे में दिखा ९३% GFAP + कोशिकाओं 10. प्रवाह विश्लेषण कोशिकाओं को प्लेटों का पालन करने की अनुमति के महत्व को रेखांकित करता है क्योंकि यह प्रदूषित कोशिका आबादी के हटाने की अनुमति देता है संस्कृतियों के लगभग 5% शामिल ।

इस अध्ययन में एक लक्ष्य के लिए एक GFAP-सक्रिय रिपोर्टर का उपयोग करने के लिए आगे विश्लेषण के लिए कोशिकाओं के प्रवाह cytometry की सुविधा और EGC संवर्धन की डिग्री की तुलना में एक अंतर्जात फ्लोरोसेंट मार्कर (6 अंक) का उपयोग किया गया । hGFAP-Cre माउस लाइन मूल रूप से खिलवाड़ और सहकर्मियों 20द्वारा वर्णित किया गया था । संक्षेप में, Cre recombinase मानव glial fibrillary एसिड प्रोटीन (hGFAP) प्रवर्तक के २.२ केबी के नियंत्रण में रखा गया था । इस प्रकार, किसी भी सेल इस hGFAP प्रमोटर लिखित लाल फ्लोरोसेंट रिपोर्टर tdTomato व्यक्त की । tdTomato रिपोर्टर के साथ लेबल किया गया कक्ष जनसंख्या ऊपर वर्णित EGC आइसोलेशन कार्यविधियों को निष्पादित करने से पहले, आंतों और कोलन (फिगर 6A, घमण्ड) के जमे हुए अनुभागों का उपयोग करके सीटू में विज़ुअलाइज़ की गई थी. EDTA/सेल रिकवरी अलगाव और 3 दिनों के लिए कोशिकाओं संवर्धन प्रदर्शन करने के बाद, इन चूहों से EGCs आसानी से अपने अंतर्जात प्रतिदीप्ति (चित्रा 6C) द्वारा पहचाना गया । हालांकि GFAP + कोशिकाओं यकीनन समीपस्थ आंत में अधिक कई हैं4,21, tdTomato + EGCs भी बृहदांत्र में मनाया गया (चित्रा घमण्ड). tdTomato+ फ्लोरोसेंट hGFAP द्वारा सक्रिय रिपोर्टर का प्रयोग-Cre भी hGFAP की bimodal जनसंख्या से पता चला-tdTomato + कोशिकाओं (चित्रा 6D) के रूप में immunofluorescent प्रोटीन (चित्रा GFAP) के 5C विश्लेषण का उपयोग कर मनाया । हालांकि यह बताया गया है कि नहीं सभी EGCs एक्सप्रेस GFAP प्रोटीन4, इस बिंदु GFAP अभिव्यक्ति के स्तर में अंतर को प्रतिबिंबित हो सकता है । औसत पर, कोशिकाओं का विश्लेषण के बारे में ६६% tdTomato प्रतिदीप्ति के उच्चतम स्तर का प्रदर्शन किया । इसलिए, EDTA/सेल रिकवरी प्रोटोकॉल के लिए छोटी आंत और रिपोर्टर द्वारा लेबल बृहदांत्र जीन अभिव्यक्ति में मतभेदों की जांच भर में EGCs के सबसेट को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

इस प्रोटोकॉल जैव रासायनिक अध्ययन और पश्चिमी दाग विश्लेषण के लिए अपेक्षाकृत शुद्ध GFAP + glial कोशिकाओं की एक पर्याप्त संख्या उत्पंन 10. glial कोशिका जवाबदेही, एक 3 दिन glial सेल प्रस्तुत करने का प्रदर्शन हार्मोन के साथ इलाज किया गया था cholecystokinin (CCK) या गैस्ट्रीन को प्रेरित करने के लिए सीए2 + फ्लक्स (चित्रा 7A-7B)10. परिणाम से पता चला है कि इन GFAP + अनुयाई कोशिकाओं extracellular को अपने ज्ञात प्रवेश glial समारोह प्रदर्शन करने की क्षमता का प्रदर्शन एगोनिस्ट जवाब दिया ।

Figure 1
चित्रा 1: सेट अप और माउस आंतों की तैयारी. (क) निकाली गई आँतों सहित बर्फ पर स्थापित अलगाव की तस्वीर. (ख) 5 मिलीलीटर की तस्वीर-एक 20 ग्राम कुंद अंत सुई से जुड़ी मल सामग्री फ्लश करने के लिए सिरिंज । (ग) एक लकड़ी कपास झाड़ू के अंत इंजीनियर (~ 4 सेमी) DPBS बफर में भिगोने । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: आंतों को साफ और अनुदैर्ध्य मांसपेशी/myenteric जाल (LMMP) को दूर करने के लिए इस्तेमाल कदम । (A-C) एक गीला लकड़ी छड़ी पर एक आंत्र खंड फिसलने । (घ) अनुयाई अन्त्रपेशी को हटाना । (ङ) एक उस्तरा ब्लेड के साथ आंत निक । (च) LMMP को नम सूती झाड़ू से निकालना । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: EDTA की गर्मी के बाद अनुक्रमिक प्रवाह के माध्यम से । दिखाया प्रवाह के उदाहरण है 4 अनुक्रमिक तीन 7 सेमी आंत्र खंडों का उपयोग करने से 5 मिमी EDTA/DPBS में HEPES और फिर triturated के साथ 10 मिनट के लिए मशीन का प्रयोग 20 बार । प्रतिनिधि प्रवाह के माध्यम से एक १०० µm नायलॉन जाल छलनी के माध्यम से डालने के बाद दिखाया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: EGC छवियां 24 ज चढ़ाना के बाद । resuspend कोशिकाओं की हल्की सूक्ष्म परीक्षा 24 ज चढ़ाना के बाद । (एक) दिखाया एक गरीब तैयारी चल उपकला कोशिका के झुरमुट (तीर) और मलबे दिखा के एक प्रतिनिधि उदाहरण है । कोई अनुयाई EGCs 24 घंटे के बाद मनाया गया (ख) दिखाया सेल अलगाव और resuspension में जो EGCs के पैच PDL/Laminin लेपित प्लेटों का पालन के बाद एक उत्कृष्ट तैयारी 24 ज का एक प्रतिनिधि उदाहरण है । छवियां एक डिजिटल कैमरा के साथ एक औंधा फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप पर कब्जा कर लिया गया । स्केल बार्स = ५०० µm (A-B) । (ग) EGC कोशिकाओं के एक पैच की उच्च शक्ति देखने GFAP एंटीबॉडी (हरी) के साथ दाग की परिधि पर लेबल के एक उच्च तीव्रता के साथ कोशिकाओं को दिखा । कोशिकाओं के कई डबल नाभिक दिखाया (arrowhead, DAPI, नीला) । (घ) Colocalization के GFAP (हरा) के साथ S100 (लाल) या p75NTR (लाल). स्केल बार्स = 20 µm (C-D) । कोशिकाओं को एक antifade रिएजेंट और DAPI (ब्लू नाभिक) के साथ रखा गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: वयस्क माउस के ग्रहणी लेमिना propria से पृथक प्रवेश glial कोशिकाओं के प्रवाह cytometry । (क) ३ दिन के बाद EGC संस्कृतियों पर GFAP, S100B और Sox10 का इम्यूनोफ्लोरेसेंस. तीरों से संकेत Sox 10 पॉजिटिव नाभिक । स्केल बार्स = 20 µm (Sundaresan एट अल से अनुमति के साथ प्रयोग किया जाता है । 10). (बी) GFAP के सकारात्मक कोशिकाओं का प्रतिशत लेपित प्लेटों (प्रतिदीप्ति तीव्रता (या आगे तितर बितर, एक्स-अक्ष) बनाम साइड स्कैटर (Y-अक्ष) पर चढ़ाना से पहले । (ग) GFAP का प्रतिशत धनात्मक (घ) α-SMA धनात्मक (ङ) ई-cadherin धनात्मक (च) और वि९.५ धनात्मक कोशिकाओं 3 daysafter चढ़ाना. मृत कोशिकाओं और मलबे से बचने के लिए गेट्स का निर्माण किया गया । दिखाया (साइड स्कैटर) कोशिकाओं की संख्या के सापेक्ष फ्लोरोसेंट आबादी का मतलब प्रतिशत है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्र 6: hGFAP-Cre+: tdTomato+ वयस्क माउस के ग्रहणी लेमिना propria से पृथक की गई एंट्रेंस glial कोशिकाओं की पहचान. अंतर्जात tdTomato फ्लोरोसेंट (लाल) छवियों (एक) आंत में एक डिजिटल कैमरा के साथ एक चरण इसके विपरीत फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप पर कब्जा कर लिया गया । इनसेट DAPI छवि (ब्लू नाभिक) के साथ विलय के अलावा एक ही । (B) DAPI के साथ कोलन मर्ज किए गए. (ग) glial कोशिकाओं (लाल) hGFAP से अलग-Cre: dtTomato+ चूहों और PDL/Laminin सब्सट्रेट पर 3 दिनों के लिए प्रसंस्कृत । स्केल बार्स = ५० µm. (D) tdTomato कोशिकाओं का प्रवाह cytometric विश्लेषण । दिखाया GFAP का मतलब है% + कोशिकाओं ± SEM 3 अलग तैयारी के लिए (प्रस्तुत करने के प्रति 3 चूहों) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्रा 7:2 Ca के वीडियो+ हार्मोन उपचार के बाद फ्लक्सs. EGCs 24 पर चढ़ाया-well PDL और laminin लेपित प्लेटें glial विकास मीडिया में 3 दिनों के लिए संस्कृति थे । कोशिकाओं फ्रा-2 के 3 µ एम के साथ पूर्व लोड किया गया ३७ डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए हूं और फिर (एक) १०० एनएम cholecystokinin (CCK) या (बी) १०० एनएम गैस्ट्रीन के साथ इलाज किया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए ।

घटक जोड़ा जा करने के लिए खंड अंतिम एकाग्रता
DMEM/F12 ४४.५ एमएल _
भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) 5 मिलीलीटर 10
पेनिसिलिन-Streptomycin ५०० µ l १०० IU/एमएल पेन
Streptomycin १०० µ g/मिलि Strep
Gentamicin (५० mg/एमएल स्टॉक) 20 µ l 20 µ g/mL

तालिका 1: Glial कक्ष का संयोजन मीडिया को पुनर्रचना ।

घटक जोड़ा जा करने के लिए खंड अंतिम एकाग्रता
DMEM/F12 ४४ एमएल _
भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) 5 मिलीलीटर 10
पेनिसिलिन-Streptomycin (100x) ५०० µ l १०० IU/एमएल (पेन)
१०० µ जी/एमएल (Strep)
Gentamicin (५० mg/एमएल स्टॉक) 20 µ l 20 µ g/mL
GDNF (10 µ g/एमएल स्टॉक) ५० µ l 10 एनजी/
L-Glutamine (२०० mM stock) ५०० µ l 2 मिमी

तालिका 2: Glial सेल विकास मीडिया की संरचना ।

घटक इम्यूनोफ्लोरेसेंस कमजोर पड़ने प्रवाह Cytometry कमजोर पड़ने
चिकन विरोधी GFAP 1 को ५०० 1 को २०००
खरगोश विरोधी S100 1 को ५०० 1 को ५००
माउस एंटी-p75 NTR 1 को ५०० 1 को ५००
बकरी विरोधी ई-cadherin 1 को ४००
माउस विरोधी-9.5 1 को ५००
बकरी विरोधी एक चिकनी मांसपेशी Actin 1 को ५००
Alexa Fluor ४८८ बकरी विरोधी चिकन IgY 1 को १००० 1 को १०००
Alexa Fluor ५६८ बकरी विरोधी माउस आईजीजी 1 को १००० 1 को १०००
Alexa Fluor ५९४ गधा विरोधी खरगोश आईजीजी 1 को १०००
Alexa Fluor ४८८ गधा विरोधी बकरी आईजीजी 1 को १०००

तालिका 3: एंटीबॉडी की सूची

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Discussion

EGCs आंत homeostasis में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, और यह अलग और उंहें इन विट्रो मेंअध्ययन करने के लिए आवश्यक है । इस प्रोटोकॉल में, वयस्क माउस आंत के लेमिना propria से EGCs अलग करने के लिए एक सरल तरीका में प्रवेशात्मक glial समारोह का अध्ययन शुरू किया गया था ।

एक कपास झाड़ू के साथ अनुयाई अन्त्रपेशी और LMMP को हटाने glia और परिपत्र मांसपेशी के बीच रहने वाले अंतर myenteric अनुदैर्ध्य के कुछ निकालता है, सबम्यूकोसल सतह के लिए बफ़र्स की पहुंच बढ़ जाती है और बड़ी केशिकाओं की बहुत निकालता है . बाद लाल रक्त अंतिम संस्कृतियों को दूषित कोशिकाओं की संख्या कम कर देता है । EDTAी की श्रृंखला दूर पट्टी उपकला म्यूकोसा लेमिना propria और सबम्यूकोसल glia, जो chelating समाधान करने के लिए जोखिम के बाद नाजुक हो सकता है उजागर । या तो मिलाते हुए आंदोलन, भंवर या triturating (दोहराव ऊपर और नीचे pipetting) को ध्यान से किया जाना चाहिए और कोशिकाओं को अत्यधिक नुकसान से बचने के लिए समय पर । Trituration यहां इस्तेमाल किया क्योंकि तकनीक अनुयाई, व्यवहार्य glial कोशिकाओं की एक और अधिक सुसंगत उपज में हुई थी । मिलाते बुलबुले परिचय और कोशिका व्यवहार्यता लेपित प्लेटों के लिए सेल पालन द्वारा आकृति विज्ञान का मूल्यांकन कम करने के लिए खड़ा था । ऊतक 5 मिलीलीटर पिपेट के साथ ऊतक को प्रभावी ढंग से triturate करने के लिए के टुकड़े में कटौती की जानी चाहिए < 0.5 सेमी ।

आम तौर पर, 7 सेमी से कम 3 चूहों के क्षेत्रों के बारे में 20-30% प्रवाह, जो तब immunocytochemistry और qPCR के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है पर एक 6 अच्छी तरह से थाली को कवर करने के लिए पर्याप्त EGCs उत्पन्न करने के लिए पर्याप्त है । हालांकि, अधिक कोशिकाओं को ऐसे पश्चिमी दाग के रूप में जैव रासायनिक तरीकों के लिए आवश्यक हो सकता है अध्ययन जीन की अभिव्यक्ति के स्तर पर निर्भर करता है । हालांकि, प्रकार 1 कोलेजन या Matrigel संक्षिप्त पाली-डी-lysine/Laminin सब्सट्रेट करने के लिए एक विकल्प के रूप में जांच की थी, उपकला कोशिका आबादी का अधिक पालन मनाया गया था, अंत में अन्य कोशिका प्रकार के साथ EGC संस्कृतियों के प्रदूषण में वृद्धि . इसके अलावा, प्रकार 1 कोलेजन मजबूती से प्लेटों को पालन नहीं किया था और आसानी से सतह से उखाड़ फेंका था जब मीडिया बदल रहा है । Fibronectin एक और सब्सट्रेट है कि24इस्तेमाल किया गया है, लेकिन यहां परीक्षण नहीं किया गया । Laminin जाहिरा तौर पर बंधन और तंत्रिका-शिखा व्युत्पंन कोशिकाओं के भेदभाव को बढ़ाता है25। हालांकि, laminin के बहुत सारे भिंन हो सकते हैं, सेल पालन और पैदावार प्रभावित । संस्कृतियों के माइक्रोबियल संदूषण समय के बारे में 5% हुई और बाँझ एजेंट, तकनीक और एंटीबायोटिक दवाओं के उपयोग द्वारा एक ंयूनतम करने के लिए रखा गया था । रोधी एजेंट का उपयोग वैकल्पिक था ।

यहां प्रोटोकॉल की प्रमुख सीमा आंदोलन का मानकीकरण है अंतर्निहित EGCs को नुकसान पहुंचाए बिना उपकला को दूर करने के लिए । इसके अलावा, तैयारी का आकलन तुरंत नहीं किया जा सकता है क्योंकि यह लेपित प्लेटों के सेल पालन पर निर्भर करता है । तीन क्षेत्रों पर ध्यान केंद्रित करने के लिए जब समस्या निवारण में शामिल हैं: 1) कोट प्लेटों के लिए ताजा PDL और laminin का उपयोग; 2) सहायकों की संख्या में वृद्धि के द्वारा EDTA गर्मी शुरू करने के लिए विच्छेदन से समय को कम; 3) ऊतक को प्रभावी ढंग से उपकला को दूर करने के लिए आंदोलन करने के लिए इस्तेमाल किया समय और विधि यों तो EGCs. इन चरणों में से या तो में समय बढ़ाने EGC कमजोरी बढ़ जाती है और संभावना है कि वे ठीक नहीं होगा जब विकास मीडिया में चढ़ाया । हालांकि उपकला अलग कर देना करने के लिए trituration विधि यहाँ इस्तेमाल किया गया था, मिलाते हुए और भंवर भी असंगत परिणाम के साथ परीक्षण कर रहे थे शायद क्योंकि यह अधिक ऑपरेटर निर्भर है और यों तो मुश्किल है । एक बार अनुयाई कोशिकाओं की उपज चढ़ाया अगर कोशिकाओं को 16 के लिए परेशान नहीं किया गया था अधिक से अधिक था-24 एच ।

विधि यहां प्रस्तुत स्मिथ एट अल द्वारा मूल अध्ययन के अनुसार संशोधित किया गया था । 12, जो LMMP को अलग करने पर केंद्रित था । स्मिथ दृष्टिकोण यहां केवल हटाने और LMMP को त्यागने के लिए इस्तेमाल किया गया था कि glial कोशिकाओं के अधिकांश अलग-म्यूकोसा और लेमिना propria से उत्पंन होगा । इसके अलावा, एंजाइमी पाचन के बिना, myenteric EGCs12आसानी से मुक्त नहीं कर रहे हैं । फिर भी, के बाद से वहां myenteric बनाम सबम्यूकोसल glia के लिए कोई विशिष्ट मार्करों, अंतर myenteric जाल से glial कोशिकाओं की उपस्थिति शामिल नहीं किया जा सकता है । Rosenbaum एट अल. ने hGFAP प्रमोटर से बढ़ाया ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (EGFP) EGCs व्यक्त की प्रवाह cytometric विश्लेषण की सूचना दी । वे बहुत ही युवा चूहों का इस्तेमाल किया (जन्मोत्तर दिन 7) और एंजाइमी पाचन द्वारा पूरी आंत से पृथक EGCs19. इसके अलावा, प्रवाह cytometric विश्लेषण शर्तों है कि मुक्त अस्थाई neurosphere गठन पदोंनत बनाए रखने के दो सप्ताह के बाद किया गया था । हालांकि लेखकों ने बताया कि neurospheres उच्च दोनों GFAP और S100b व्यक्त की, अस्थाई सेल समुच्चय भी दृढ़ता से व्यक्त की α-SMA, सुझाव है कि myofibroblast कोशिका जनसंख्या के विस्तार के विपरीत gliosphere विकास को प्रोत्साहित किया फ्लैट शीट की तरह आकृति विज्ञान यहां वर्णित है । इसलिए, जबकि दिलचस्प, अध्ययन सीधे इस प्रोटोकॉल के लिए तुलनीय नहीं है । इसके विपरीत, काफी कम α-SMA + कोशिकाओं के साथ युग्मित कोशिकाओं की आकृति विज्ञान सुझाव है कि इस प्रोटोकॉल में वर्णित EGCs 3 से 5 दिन संस्कृति अवधि के दौरान 3 आयामी आकृति विज्ञान प्रदर्शित नहीं करते । फिर भी, दोनों प्रोटोकॉल यहां और Rosenbaum विधि एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर का उपयोग करने की पहचान और GFAP को अलग + कोशिकाओं है कि अंवेषक है जीने सेल रूपरेखा करने की क्षमता में सुधार होगा ।

अंत में, वर्तमान प्रोटोकॉल एक गैर एंजाइमी दृष्टिकोण का उपयोग करके उपम्यूकोसा से प्रवेश glial कोशिकाओं के अलगाव का वर्णन करता है । पूरे प्रोटोकॉल के बारे में 3 माउस विच्छेदन से पूर्व लेपित ऊतक संस्कृति प्लेटों पर प्रारंभिक चढ़ाना के लिए एच लेता है । सबसे अधिक समय प्रोटोकॉल में गहन कदम हटाने और पहली EDTA मशीन के लिए आंतों की तैयारी है । प्लेटें और DPBS में भंडारण की तैयारी दृढ़ता से सिफारिश की है । तैयारी की सफलता के लिए अंतर्निहित EGCs और पालन को नुकसान पहुँचाए बिना उपकला के कुशल हटाने पर निर्भर करता है PDL/Laminin लेपित प्लेटों के भीतर 24 ज. प्राथमिक EGCs इन विट्रो में के लिए उपयोगी है जैव रासायनिक विश्लेषण जैसे अध्ययन, Ca2 + फ्लक्स और adenoviral transfections10. यह प्रत्याशित है कि या तो उपम्यूकोसा या LMMP से EGCs को अलग करने की क्षमता आगे के अध्ययन की अनुमति के लिए EGC विकास के गुणों में अंतर को परिभाषित करेगा, भेदभाव और पूरे जीनोम दृष्टिकोण का उपयोग आकृति विज्ञान ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक को R37 DK045729 (JLM), R01 AR060837 (सेमी) और मिशिगन गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल अनुसंधान केंद्र आणविक कोर P30 DK034933 के विश्वविद्यालय से समर्थन स्वीकार करना चाहते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly-D lysine (1 mg/mL stock) Sigma A-003-E Dilute 1:10
Laminin (0.5 mg/mL stock) Sigma L4544 Dilute to 10 µg/mL on ICE
EDTA (0.5 M) Lonza 51201 Dilute 1:100 in DPBS
HEPES (1 M) Corning 36216004 Dilute 1:100 in DPBS
Cell Recovery Solution Corning 354253
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) HyClone SH30028.02
DMEM/F-12 Thermo Fisher Scientific 11320033
Penicillin-Streptomycin (100x) Life Technologies 15140-122
Gentamicin (50 mg/mL stock) Life Technologies 15750060
GDNF (10 µg stock) Sigma SRP3200
L-Glutamine (200 mM stock) Life Technologies 25030-081
Chicken anti-GFAP Thermo Fisher Scientific PA1-10004
Goat anti-a-Smooth Muscle Actin  Abcam ab112022
Mouse anti-Pgp9.5  Novus Biologicals NB600-1160
Goat anti-E-cadherin  R&D Systems AF748
Rabbit S100  Abcam ab34686
Mouse p75 NTR  Millipore MAB5592
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Chicken IgY Invitrogen A-11039
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG Invitrogen A-11055
Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG Invitrogen A-11004
Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG Invitrogen R-37119
Prolong Gold antifade Reagent with DAPI Thermo Fisher Scientific P36931
Fungizone (Amphotericin B) 250 µg/mL Life Technologies 15290-018
L-Fura-2-AM Invitrogen F-14201
CCK peptide Anaspec, Fremont, CA AS-20741
Gastrin peptide (Gastrin-17) Abbiotec, Bloomington, IN 350188
Nylon Mesh Celll Strainer (100 µm) Fisher Scientific 22363549
Nylon Mesh Celll Strainer (40 µm) Fisher Scientific 22363547
Disposable Serologic Pipet 5 mL Fisher Scientific 13-678-11D
0.25% Trypsin-EDTA (1x) Life Technologies 25200-056

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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जीव विज्ञान अंक १३८ ग्रहणी hGFAP-Cre tdTomato EDTA केलेशनथेरेपी EGCs कै2 + फ्लक्स Sox10 GFAP
वयस्क माउस के श्लेष्मा और लेमिना Propria से प्रवेश Glial कोशिकाओं का अलगाव
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Wang, Z., Ocadiz-Ruiz, R.,… More

Wang, Z., Ocadiz-Ruiz, R., Sundaresan, S., Ding, L., Hayes, M., Sahoo, N., Xu, H., Merchant, J. L. Isolation of Enteric Glial Cells from the Submucosa and Lamina Propria of the Adult Mouse. J. Vis. Exp. (138), e57629, doi:10.3791/57629 (2018).

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