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Biology

Isolement des cellules gliales entériques de la sous-muqueuse et de la Lamina Propria de la souris adulte

Published: August 15, 2018 doi: 10.3791/57629
Automatic Translation
1,4, 1, 1, 1, 1, 3, 1,2, 1,2,5
1Department of Internal Medicine-Gastroenterology, University of Michigan, 2Department of Molecular and Integrative Physiology, University of Michigan, 3Department of Molecular, Cellular and Developmental Biology, University of Michigan, 4Department of Gastrointestinal Surgery, The First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, 5Division of Gastroenterology, University of Arizona College of Medicine

Summary

Nous décrivons ici l’isolement de cellules gliales-entérique de la sous-muqueuse intestinale à l’aide des incubations EDTA séquentielles pour chélater les cations divalents, puis incubation dans une solution de récupération non enzymatique cellulaire. Placage de la suspension de cellules qui en résultent sur le poly-D-lysine et de la laminine se traduit par une culture fortement enrichie des cellules gliales sous-muqueux analyse fonctionnelle.

Abstract

Le système nerveux entérique (ENS) est constitué de neurones et les cellules gliales entériques (EGCs) qui résident dans la paroi musculaire lisse, la sous-muqueuse et la lamina propria. EGCs jouent un rôle important dans l’homéostasie intestinale grâce à la publication de divers facteurs trophiques et contribuent à l’intégrité de la barrière épithéliale. La plupart des études des cultures primaires de gliales entériques utilisent des cellules isolées de plexus myentérique après dissociation enzymatique. Ici, on décrit une méthode non enzymatique d’isoler et de la culture de EGCs de la sous-muqueuse intestinale et de la lamina propria. Après la suppression manuelle de la couche musculaire longitudinale, EGCs furent libérés de la lamina propria et de la sous-muqueuse en utilisant des incubations tampon HEPES EDTA séquentielles, suivies d’une incubation dans une solution de récupération disponibles dans le commerce non enzymatique cellulaire. Les incubations d’EDTA ne suffisaient pas à dépouiller la majeure partie de la muqueuse épithéliale de la lamina propria, permettant à la solution de récupération des cellules afin de libérer les sous-muqueuse EGCs. Toute résiduelle lamina propria et le muscle lisse a été écartée avec la glie myentériques. EGCs ont été facilement identifiés par leur capacité à exprimer la protéine fibrillaire acide gliale (GFAP). Seulement environ 50 % de la suspension cellulaire contenaient GFAP + cellules après des incubations de tissu et avant la culture sur le substrat de poly-D-lysine/laminine. Toutefois, après 3 jours de culture de cellules de facteurs neurotrophiques cellule gliale (GDNF)-contenant des milieux de culture, la population de cellules adhérant aux plaques recouvertes de substrat composé de > 95 % glie entérique. Nous avons créé une lignée de souris hybride en croisant une souris hGFAP-Cre à la ligne de journaliste ROSA-tdTomato pour suivre le pourcentage de cellules GFAP + à l’aide de la fluorescence des cellules endogènes. Ainsi, non-myentérique glie entérique peut être isolé par des méthodes non enzymatiques et cultivée pendant au moins 5 jours.

Introduction

Intérêt pour la fonction des cellules gliales entériques (EGCs) a cessé d’augmenter en raison de leur rôle reconnu dans le tube digestif l’intégrité et l’homéostasie du1,2. En outre, EGCs varient selon leur emplacement le long du tractus GI3,4. EGCs libérer différents facteurs trophiques, y compris les facteurs neurotrophiques cellule gliale (GDNF), contribuent à gut motilité1,5 et répondre aux sous-produits microbienne6,7. Des études ont indiqué que la population de l’EGC est hétérogène et que leur fonction varie selon qu’ils sont sous-muqueux ou résident dans le plexus myentérique1,7. Par exemple, EGCs dans la sous-muqueuse contribuent à des jonctions serrées,8. Differential expression GFAP et phosphorylation de EGCs ont été liés à la maladie de Parkinson, ce qui suggère leur lien possible avec le phénotype de l’intestin de ce trouble9. Récemment, on a fait observer que la perte de la protéine nucléaire de menin en cultures isolées de EGCs de la sous-muqueuse intestinale proximale est suffisante pour induire l’expression de l’hormone gastrine10. En conséquence, il a été proposé que EGCs pourraient être à l’origine de gastrinomas duodénal, un type de tumeurs neuro-endocrines10. Collectivement, ces exemples mettent en évidence l’importance d’étudier le comportement et la fonction de EGCs isolés dans les troubles neuropathiques et cancer11.

Le défi dans le domaine reste comment isoler et étudier un ou des deux EGC populations in vitro. Lignage trace des expériences ont démontré que EGCs dans la sous-muqueuse et de la lamina propria proviennent de cellules progénitrices du de plexus myentérique7. Bien qu’il existe plusieurs protocoles d’isolement publiées disponibles pour générer des cultures de myentérique EGCs12,13,14,15,16,17, 18,19, aucun vise particulièrement l’isolement de la population de EGC sous-muqueuse/lamina propria. Les protocoles existants pour l’isolement de l’EGC spécifiquement utilisent une combinaison de la séparation mécanique ou la microdissection du muscle lisse combiné avec dissociation enzymatique, finit par jeter la couche de cellules muqueuses.

L’objectif de ce manuscrit est pour montrer les étapes pour isoler non enzymatique EGCs primaires de la lamina propria pour des études in vitro . Puisqu’il n’y a aucun marqueur qui distinguent spécifiquement EGCs myentérique de ceux dans la sous-muqueuse, la séparation spatiale de la muqueuse épithéliale du muscle lisse a été exploitée pour isoler EGCs sous-muqueux. De plus, en combinant la chélation EDTA avec dissociation non enzymatique, EGCs ont été isolés de la sous-muqueuse contraste avec le muscle lisse, qui a été mis au rebut avec les EGCs inter-myentérique associé. Nouvelle séparation de la sous-muqueuse et de la lamina propria EGCs se sont produits en cultivant des cellules gliales substrats cellulaires de l’environnement, par exemple, poly-D-lysine et laminine.

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Protocol

Toutes les expériences animales décrites ont été approuvées par le Comité de l’Université du Michigan sur l’utilisation et l’entretien des animaux.

1. préparation des Solutions de laminine et de stériles de Poly-D-lysine (PDL)

  1. Au moins un jour avant l’isolement cellulaire, préparer des poly-D-lysine (PDL) et la laminine revêtue de plaques.
    Remarque : Les plaques 6 puits tant de 12 puits ont été préparés selon les objectifs expérimentaux. En règle générale, les plaques de 12 puits étaient utilisées pour l’analyse quantitative des transferts western ; considérant que, en plaques 6 puits étaient utilisées pour conserver les autoclavés (stérile) lamelles couvre-objet pour immunohistochemistry. plaques 24 puits ont été utilisées pour la culture de EGCs pour Ca2 + imagerie de flux.
  2. Diluer les solutions mères avec la classe de vitroplants ultrapure, sans DNase et RNase-libre de l’eau sous une hotte de culture tissulaire avec air HEPA filtré.
  3. Stérilisation des lamelles de verre
    1. Tenez la lamelle avec une pince stérile et y plonger les lamelles dans un bécher d’éthanol à 100 % pendant 15 min. laisser l’éthanol s’évapore dans la hotte de la culture de tissus et les placer dans les plaques 6 puits.
    2. Vous pouvez également placer plusieurs lamelles individuellement sur papier buvard épais de 2 mm dans un récipient en plastique, puis autoclave.

2. plaques de couche

Remarque : effectuez ces étapes sous une hotte à flux laminaire vitroplants stérile.

  1. Décongeler 1 mg/mL de bouillon de PDL et diluer 01:10 avec de l’eau la grade des vitroplants stérile, afin que la concentration finale est de 100 µg/mL. Utiliser 2 mL par puits pour enduire les plaques 6 puits, 1 mL pour couvrir un puits d’une plaque de 12 puits et 0,5 mL pour un puits dans les plaques 24 puits. Stocker la PDL diluée restante en aliquotes de 12 mL à-20 ° C.
  2. Après avoir laissé la PDL enrober les puits pendant au moins 1 h, enlever la PDL avec une pipette stérile. Les plaques à l’air laisser sécher complètement sous une hotte à flux laminaire vitroplants.
    Remarque : Après avoir enlevé la solution PDL avec une pipette stérile, il peut être utilisé deux fois plus dans 1 semaine après en passant à travers un filtre de 0,22 µm et de stockage à 4 ° C.
  3. Décongeler le stock de laminine sur la glace pour éviter la formation de gel.
    Remarque : Non diluée laminine devient solide Lorsque chauffé au-dessus de 8 ° C.
  4. Diluer la laminine stock (0,5 mg/mL) 01:50 avec de Dulbecco stérile Phosphate Buffered Saline (SPD) pour obtenir une concentration finale de 10 µg/mL. Enregistrez la laminine diluée dans 12 mL parties aliquotes à-20 ° C.
  5. Ajouter laminine diluée dans les puits contenant séché PDL. Utiliser 1 mL pour couvrir la surface de 6 puits et 0,5 mL pour recouvrir le fond des plaques 12 puits. Pour les lamelles, ajouter 400 µL de laminine diluée pour les lamelles couvre-objet pour atteindre la couverture de la surface.
  6. Incuber les plaques revêtues à 37 ° C pendant 2 h, si la plaque est utilisée le jour même (revêtement rapide). Si ce n’est pas le cas, sceller les plaques d’une pellicule plastique et stocker pendant la nuit à 4 ° C (revêtement lent).
    Remarque : L’étanchéité est essentielle pour éviter la contamination et séchage.
  7. Enlever la solution de la laminine soigneusement avec une pipette pour éviter d’égratigner la surface. Laver délicatement les puits trois fois avec SPD stérile.
  8. Ajouter les milieux gliales complet à chaque bien et maintenir les plaques à 37 ° C jusqu’au moment d’ajouter la suspension de l’EGC.
    NOTE : Poly-D lysine et laminine enduit plaques peuvent être conservés pendant 3 jours à 4 ° C. Enduire les plaques de plusieurs jours à l’avance et ensuite conserver à 4 ° C, laver les plaques avec SPD stérile trois fois. Ajouter 2 mL de SPD stérile dans chaque puits après le lavage final. Sceller la plaque avec parafilm et conserver à 4 ° C. Il est essentiel de veiller à ce que la laminine se dessécher.

3. préparation des Solutions d’Isolation

  1. Préparer la solution de dissociation EDTA/HEPES/SPD. Pour 500 mL de la solution, utilisez SPD stérile (sans calcium et magnésium) pour faire une solution finale d’EDTA HEPES et 5 mM de 10 mM. À 490 mL de la SPD, ajouter 5 mL de tampon HEPES 1 M et 5 mL de solution EDTA 0,5 M. Conserver à 4 ° C jusqu'à l’utilisation.
  2. Préparer les médias de remise en suspension de cellules gliales en utilisant les réactifs énumérés au tableau 1.
  3. Préparation des milieux de culture gliale utilisant les réactifs cités dans le tableau 2.
    Remarque : Les milieux de croissance gliales contenant GDNF peuvent être stockés pendant une semaine à 4 ° C.

4. retrait du Segment Intestinal

Remarque : Les souris pouvaient libre accès à la nourriture et d’eau avant l’euthanasie par la méthode drop de l’isoflurane et le retrait d’un organe vital. On a utilisé des souris C57BL/6 supérieures à 8 semaines d’âge. Les deux sexes ont été utilisés sans différences notables dans la préparation.

  1. Euthanasier la souris avec une surdose d’isoflurane et le placer en position couchée dans un plateau de dissection. Épingler les extrémités et stériliser l’abdomen avec l’éthanol à 70 %. Tente la peau avec une pince, puis ouvrez l’abdomen avec des ciseaux.
  2. Soulevez le foie et identifier l’estomac distal/pylore. Retirez ensuite les 7 cm de l’intestin proximal. Veillez à ne pas se déchirer l’intestin.
  3. Tenir le pylore avec pinces en coupant loin du mésentère.
    1. Utiliser par dissection par clivage avec le dos de la ciseaux à racler loin pancréas adhérent.
    2. Placer le segment intestinal dans le SPD glacee sans Ca2 + ou Mg2 + (Figure 1 a).
      Remarque : Autres segments de l’intestin ou du côlon peuvent également être supprimées en utilisant la même technique.
  4. Utiliser une seringue de 5 ou 10 mL attaché à une aiguille de 20 G extrémité émoussée pour débusquer le contenu fécal avec de la glace froide SPD (Figure 1 b).
  5. Diviser l’intestin en segments de 3 cm pour enlever le muscle longitudinal en utilisant la technique décrite initialement par Smith et al. 12 et modifiée dans le Sundaresan et al. 10.
    NOTE : Des segments intestinaux de jusqu'à deux souris sont utilisés par 30 mL de la solution d’isolation HEPES/EDTA/SPD.
  6. Se détachent environ 4 cm pour séparer le bâton en bois de la pointe de coton. Tremper la baguette de bois dans le SPD (Figure 1).
  7. Glisser un des segments intestinaux en douceur sur le bâton mouillé (Figure 2 a-C).
  8. Retirez le mésentère adhérente encore attachée à l’aide de pinces à becs (Figure 2D).
  9. Utiliser une lame de rasoir propre ou scalpel pour faire deux entailles longitudinales le long de l’intestin où le mésentère était attaché (Figure 2E).
    1. Mouiller le bout de coton avec le SPD. Frottez le bout de coton humidifié longitudinalement le long du muscle pour desserrer le plexus du muscle longitudinal/myentérique (LMMP). Puis déplacez la pointe coton horizontalement pour taquiner loin la LMMP du muscle circulaire sur toute la longueur du segment intestinal au moment du retrait du LMMP.
    2. Tenir l’extrémité de la baguette entre le pouce et l’index tout en stabilisant le segment avec le milieu et le quatrième doigt (Figure 2F). Lorsque vous avez terminé, la LMMP se détachera facilement le segment intestinal.
  10. Jeter la LMMP dépouillé du tube intestinal et attaché sur le tampon de coton à moins que la récolte EGCs de plexus myentérique est souhaitée.
  11. Utilisez une lame de rasoir pour flay ouvrir le segment intestinal longitudinalement à retirer le bâton de bois.
  12. Stocker le tissu intestinal dénudé (principalement la muqueuse et sous-muqueuse plus muscle circulaire) au SPD sur la glace. Répétez les étapes 4.4 – 4.11 jusqu'à ce que tous les segments intestinaux sont préparés.

5. suppression de la muqueuse épithéliale

  1. Coupez les intestins en petits morceaux de ~0.5 cm avec des ciseaux.
  2. Placer le tissu dans un tube à centrifuger conique stérile de 50 mL contenant 30 mL de solution d’EDTA/HEPES/SPD glacée.
  3. Roche la solution contenant du tissu à 4 ° C pendant 10 min à 60 ~ s’incline par min.
  4. Humidifier avant une pipette en plastique de 5 mL en pipettant également, le tampon HEPES/EDTA/SPD et descendre une fois et ensuite utiliser la pipette lingette pour Pipeter le tissu et mettre en mémoire tampon suspension haut et bas (trituration) 20 fois pour déloger la muqueuse épithéliale.
  5. Recueillir le tissu de l’incubation de l’EDTA en versant le mélange à travers un tamis de cellule 100 µm en nylon. Jeter le trouble remplis de mucus accréditives (Figure 3).
  6. Placez le tissu retenu dans la passoire dans un nouveau tube à centrifuger conique 50 mL contenant 30 mL de glace froide EDTA/HEPES/SPD, à l’aide de pinces à becs.
  7. Répétez l’incubation EDTA/HEPES/SPD une seconde fois en balançant le tissu à 4 ° C pendant 10 min à 60 ~ s’incline par min pour enlever la muqueuse épithéliale supplémentaire.
  8. Humidifier avant une pipette de 5 mL avec le tampon et Pipeter puis la suspension des tissus et descendre 20 fois pour déloger les cellules muqueuses.
    NOTE : Le tissu aura tendance à coller à l’intérieur de la pipette que davantage de l’épithélium est enlevé.
  9. Recueillir le tissu après la seconde incubation en versant le mélange à travers un tamis de cellule de nylon de 100 µm et jeter le débit à travers. Le deuxième intermédiaire devrait être sensiblement moins trouble que la première (Figure 3).
  10. Répéter les incubations d’EDTA 10 min jusqu'à ce que la solution est presque clairement (environ 3 à 4 incubations selon la quantité de tissu et de l’efficacité de la trituration) (Figure 3).

6. collecte des cellules gliales entériques de la Lamina Propria et de la sous-muqueuse

  1. Transférer le tissu de la passoire en nylon dans un tube à centrifuger conique 15 mL contenant 5 mL de la solution de récupération de cellules disponibles dans le commerce et la roche pendant 25 à 30 min à 4 ° C.
  2. Triturer doucement 10 x pour dissocier les cellules gliales entériques de la lamina propria.
    1. Filtrer sur un filtre de 40 µm et recueillir le filtrat dans un tube propre 50 mL.
    2. Rincer le tissu sur le filtre en nylon avec 1 mL de SPD.
    3. Jetez le tissu et transférer les ~ 5-6 mL de filtrat dans un tube à centrifuger conique propre de 15 mL.
    4. Faites tourner le filtrat à 2 000 x g dans une centrifugeuse de seau se balançant pendant 5 min à 4 ° C.
  3. Resuspendre le culot contenant des cellules glial dans au moins 1 mL de solution tampon de resuspension en pipettant également, le culot de haut en bas avec une pointe de pipette 500 µL doucement. Éviter d’introduire des bulles.
    Remarque : Régler le volume de la remise en suspension comme nécessaire pour le nombre de puits et d’assiettes. Par exemple, 1,2 mL pour une boîte de 6 puits ; 2,4 mL pour deux plaques 6 puits ; 2,4 mL pour une plaque de 12 puits.
  4. Pipeter 200 µL de la suspension cellulaire dans chaque puits de la 6 puits ou 100 µL pour un 12-PDL-laminine enduite plats contenant des milieux de culture gliale.
  5. Ne pas déranger les plats après avoir ajouté les cellules pour les assiettes et placer dans un incubateur à 37 ° C pour permettre le nombre maximal de cellules d’adhérer.
    Remarque : Une préparation saine des cellules sera fixer dans les 6 – 8 h mais attendez au moins 24 h avant de changer les médias par pipetage doucement hors des médias ainsi que les cellules non adhérentes.
  6. Utiliser les cellules pour des expériences de 3 à 4 jours après leur mise en culture (Figure 4). Effectuer des analyses par immunofluorescence utilisant des anticorps d’intérêt pour les marqueurs de protéines spécifiques (tableau 3). Par exemple, GFAP, S100b et p75NTR ou Sox10 a été utilisé ici. E-cadhérine ou anticorps anti-actine alpha muscle lisse ont servi à évaluer le degré de contamination des autres types de cellules.

7. immunofluorescence

  1. Aspirer les médias sur les cultures et les rincer deux fois avec du PBS.
  2. Difficulté les cultures pendant 20 min à température ambiante avec paraformaldéhyde à 4 %.
  3. Retirez le fixateur et puis rincer 3 fois avec du PBS.
  4. Permeabilize les cellules avec du PBS contenant 0,2 % Triton X-100 à température ambiante.
  5. Incuber les cellules perméabilisées avec blocage des solutions constituées en anti-chicken IgY, lapin ou anti-souris IgG pendant 2 h à température ambiante.
  6. Incuber les cellules avec des anticorps primaires pendant la nuit, par exemple, GFAP (1:1, 000).
    1. Rincer les cellules 3 fois avec du PBS. Si effectuant la co-localisation passez à l’étape 7,7.
  7. Incuber l’ensemble suivant d’anticorps primaires pendant au moins 2 h à température ambiante, mais de préférence la nuit à 4 ° C. Utilisez une dilution de 1/1000 de lapin anti-S100 ou une dilution de 1/500 de souris anti-p75NTR.
    Remarque : Tous les anticorps sont dilués dans du PBS.
  8. Rincer les cellules 3 fois avec du PBS pour éliminer les anticorps primaires. Puis incuber les cellules rincés avec les anticorps secondaires-le tag fluorescent appropriés pendant 2 h à température ambiante (tableau 3).
  9. Rincer 3 fois avec du PBS pour éliminer les anticorps secondaires.
  10. Monter les lamelles sur les diapositives à l’aide de 1 à 2 gouttes du support de montage au DAPI et Découvre les cellules sous un microscope à fluorescence.

8. cytométrie en flux

  1. Enlevez les cellules gliales adhérentes pour la cytométrie en rinçant les cellules une fois avec le SPD et puis ajouter 0,25 % de trypsine-EDTA par protocole du fabricant. Incuber les cellules dans la solution de trypsine-EDTA à 37 ° C pendant 3 min. terminer la digestion par le prélèvement de cellules dans les milieux de culture de cellules gliales complet.
  2. Recueillir les cellules par centrifugation à 400 x g pendant 5 min et puis remettre en suspension les cellules dans du PBS.
  3. Fixer les cellules avec du paraformaldéhyde 4 % pendant 10 min et puis permeabilize avec 0,2 % de Triton X-100 dans du PBS comme décrit au point 7.4 de l’étape.
  4. Bloquer les cellules avec du PBS contenant 1 % de BSA et l’immunoglobuline spécifique de tissus pour 20 min, par exemple, âne anti-chicken IgY (IgG) (H + L) (1:1 000) ou anti-chèvre âne IgG (H + L) (1:1, 000).
  5. Incuber les cellules avec l’anticorps primaires GFAP (1:2, 000), E-cadhérine (1 : 400), actine muscle lisse-α (1/500) ou Pgp9.5 (1/500) pendant une nuit à 4 ° C.
  6. Laver l’anticorps avec du PBS.
    1. Incuber le complexe antigène-anticorps avec des anticorps secondaires fluorescent-étiquetées incubés à température ambiante pendant 30 min.
    2. Utiliser une portion distincte de cellules incubées avec l’anticorps secondaire pour servir au contrôle de l’isotype. Les deux populations de cellules sont lavées et remis en suspension dans du PBS avant la cytométrie en flux.
    3. Analyser les deux populations de cellules sur un cytomètre en flux de blocage sur les cellules vivantes.

9. préparation des tissus de souris de la hGFAP-Cre:tdTomato souris

NOTE : Le cDNA de Lox-STOP-Lox-tdTomato s’exprime de la ROSA locus22,23 (Jackson Labs, #007914) et génère une fluorescence endogène lorsque accouplée à une souris exprimant la recombinase Cre (hGFAP-Cre). In situ de l’analyse est réalisée en générant des coupes de tissus congelés.

  1. Difficulté de tissu intestinal de paraformaldéhyde à 4 % pendant 1 h et puis déshydrater pendant la nuit à 1 M de sucrose dans du PBS.
  2. Incorporer le tissu en acheté dans le commerce optimale couper des tissus (OCT) composé composé de 10 % d’alcool polyvinylique et 4,2 % polyéthylène glycol et clin d’oeil puis congélation dans l’azote liquide.
  3. Préparer 5 µm cryosections, puis montez à l’aide d’un antifade montage média au DAPI.
  4. Pour la cytométrie en flux, préparer EGCs de la hGFAP-Cre:tdTomato+ de souris comme décrit aux points 4.1 à 6,5.
  5. Trypsinize les cellules de la plaque après 3 jours de cultures comme étape 8.1 et fixer ensuite pendant 10 min dans de paraformaldéhyde à 4 %.
  6. Analyser les cellules isolées de souris Cre négatif en parallèle avec les cellules isolées de la hGFAP-Cre:tdTomato+ de souris sur un cytomètre en flux.
    Remarque : Portes furent construits pour éviter les débris et les cellules mortes.

10. Ca2 + imagerie de Flux

  1. Incuber EGCs plaqués sur une plaque de 24 puits avec 3 µM Fluo-4-h à 37 ° C pendant 30 min.
  2. Image du signal Ca2 + dans une solution de Tyrode achetés dans le commerce à l’aide d’un microscope confocal de disque de filature et une longueur d’onde d’excitation de 480 nm (F480) après avoir ajouté le peptide CCK ou gastrine. Analyse d’images a été signalée en Sundaresan et al. 10 .

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Representative Results

Preps étaient considérés comme infructueuses si GFAP + cellules n’ont pas adhérer et se propager dans les 24 heures (Figure 4 a). Le nombre de cellules gliales ne pourrait pas être déterminé qu’après 24 h, lorsque les cellules ont adhéré et montraient des signes de propagation en agrégats de plates (Figure 4 b). Cellules au bord des grappes ont tendance à étendre les processus longs et exprimé marqueurs gliales classiques, par exemple, GFAP, S100b et p75NTR (Figure 4, 4D)10,16. Le 2ème jour, les cellules gliales ont adhéré étroitement à la surface, permettant à la population non adhérents à être rincé loin avec du PBS. La plupart des cellules flottantes étaient épithéliale et lamina propria cellules ainsi que des débris cellulaires. La présence de ces amas de cellules flottant réduit le rendement des cellules gliales adhérentes, soulignant l’importance d’effectuer les incubations d’EDTA jusqu'à ce que le cheminement est presque clair, que les cellules épithéliales ont été retirés de la lamina de signalisation propria base. En outre, centrifugation à une vitesse inférieure à 1 500 x g après incubation dans la solution de récupération des cellules n’a pas effectivement perçu toutes les cellules viables dans une pastille conduisant à des rendements réduits. En général, 40 000 à 100 000 cellules morphologiquement compatibles avec EGCs adhère fermement par jour 3 dans la culture.

L’analyse immunohistochimique gliales associées aux anticorps, a indiqué que la cellule grappes qu’adhérentes est resté par jour 3 étaient GFAP et S100b Sox 10 positif10,16 (Figure 5 a). Dans la présente étude, ce même degré de pureté a été observé par perméabiliser les cellules et l’analyse par cytométrie en flux (Figure 5 b-F). Immédiatement après l’isolement de cellules gliales sous-muqueuse/Lamina propria, écoulement cytometry a révélé qu’environ 51 % des cellules étaient GFAP + (Figure 5 b), suggérant la présence de GFAP négatif les types de cellules, par exemple, épithéliales, hématopoïétique, cellules endothéliales, neuronales, myofibroblastes qui existent encore dans l’épithélium et de la lamina propria. Après 3 jours de culture, le nombre de cellules GFAP + représentée plus de 95 % de la population de cellules analysée après avoir retiré le support d’origine, rincer doucement avec du PBS et en ajoutant ensuite les supports neufs (Figure 5). Fait intéressant, analyse des flux a révélé haute et basse des populations exprimant protéine GFAP (Figure 5). En effet, l’analyse par immunofluorescence des cellules a révélé que la périphérie de l’amas ont tendance à exprimer des niveaux plus élevés de l’accord-cadre (Figure 4, 4D). Pris ensemble, les deux types d’analyse peuvent indiquer des différences dans l’état de maturité ou de différenciation EGC. Collectivement, le pourcentage de α-SMA + (marqueur de cellules de myofibroblastes), E-cadhérine + (marqueur de cellules épithéliales) et Pgp 9.5 + cellules (marqueur de cellules neuronales) a été inférieure à 5 % (Figure 5-F). Ces résultats sont en accord avec l’étude préalable effectuée à l’aide d’étiquetage par immunofluorescence de EGCs montrant environ 93 % GFAP + cellules 10. L’analyse des flux souligne l’importance de permettre aux cellules d’adhérer aux plaques, car il permet l’élimination de la contamination des populations cellulaires comprenant environ 5 % des cultures.

L’objectif dans cette étude était d’utiliser un journaliste GFAP-activé pour faciliter l’écoulement cytometry des cellules pour une analyse plus approfondie et de comparer le degré d’enrichissement EGC à l’aide d’un marqueur fluorescent endogène (Figure 6). La lignée de souris hGFAP-Cre a été initialement décrite par Messing et collaborateurs 20. En bref, la recombinase Cre a été placée sous le contrôle de 2,2 kb du promoteur humain gliales protéine fibrillaire acide (hGFAP). Ainsi, n’importe quelle cellule transcrire ce promoteur hGFAP a exprimé la journaliste fluorescent rouge tdTomato. La population de cellules marquée avec le journaliste de tdTomato a été visualisée in situ à l’aide de coupes congelées de l’intestin et du côlon (Figure 6 a, 6 b) avant d’effectuer les procédures d’isolement EGC décrites ci-dessus. Après que l’isolement de récupération EDTA/cellule d’exécuter et de mise en culture des cellules pour 3 jours, EGCs de ces souris ont été facilement identifiés par leur fluorescence endogène (Figure 6). Bien que les cellules GFAP + sont sans doute plus nombreux dans l' intestin proximal4,21, tdTomato + EGCs ont aussi été observés dans le côlon (Figure 6 b). À l’aide de la journaliste fluorescent tdTomato+ activé par la hGFAP-Cre a aussi révélé une population bimodale de hGFAP-tdTomato + cellules (Figure 6) tel qu’observé en utilisant l’analyse par immunofluorescence de l’accord-cadre de protéine (Figure 5). Bien qu’il a été rapporté que EGCs pas tous expriment de protéine GFAP4, ce point peut refléter des différences dans le niveau d’expression de la GFAP. En moyenne, environ 66 % des cellules analysées présentaient le plus haut niveau de la fluorescence de la tdTomato. Par conséquent, le protocole de récupération EDTA/cellule pourrait servir à isoler des sous-ensembles de EGCs tout au long de l’intestin grêle et le côlon, marqués par le journaliste d’examiner les différences dans l’expression des gènes.

Ce protocole a généré un nombre suffisant de relativement pure GFAP + cellules gliales d’études biochimiques et analyse par western blot 10. pour illustrer la réactivité de la cellule gliale, une préparation de cellules gliales de 3 jours a été traitée avec les hormones la cholécystokinine (CCK) ou de la gastrine pour induire des flux de Ca2 + (Figure 7 a-7 b)10. Les résultats ont montré que ces cellules adhérentes GFAP + a répondu aux agonistes extracellulaires démontrant leur capacité à exposer la fonction gliale entérique connue.

Figure 1
Figure 1 : Set up et préparation de l’intestin des souris. (A) photo d’isolement mis en place sur la glace, y compris les extraits des intestins. Photo (B) de 5 mL-seringue jointe à une aiguille d’extrémité émoussée 20 G afin d’éliminer les matières fécales. (C) Engineered extrémité d’un coton-tige en bois (environ 4 cm) trempage dans le tampon de SPD. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : étapes utilisées pour nettoyer les intestins et enlever le plexus du muscle longitudinal/myentérique (LMMP). (A-C) Glisser un segment intestinal sur un bâton en bois mouillé. (D) retrait du mésentère adhérente. (E) entaille l’intestin avec une lame de rasoir. (F) enlever la LMMP avec un coton-tige humide. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : séquentielle Flow-through après des incubations EDTA. Exemples de la poste des 4 incubations séquentielles à l’aide de trois segments intestinaux 7 cm incubées pendant 10 min avec 5 mM EDTA / 10mM HEPES SPD et puis le trituré 20 fois sont montré. Représentant flow-through après avoir versé à travers un tamis de maille de nylon de 100 µm est indiqués. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : EGC images 24h après placage. Léger examen microscopique des cellules resuspendues 24h après l’ensemencement. (A) affichée est un exemple représentatif d’une préparation de pauvre montrant des amas de cellules épithéliales flottant (flèche) et les débris. Aucun adhérent EGCs ont été observés après 24 h. (B) affichée est un exemple représentatif d’une excellente préparation 24 h après l’isolement cellulaire et la remise en suspension dans lequel correctifs de EGCs ont adhéré à la PDL/Laminin revêtement de plaques. Des images ont été capturées sur un microscope inversé à fluorescent avec un appareil photo numérique. Barreaux de l’échelle = 500 µm (A-B). Vue de haute puissance (C) une touffe de cellules EGC colorées avec les anticorps GFAP (vert), montrant des cellules à la périphérie avec une intensité plus élevée de l’étiquetage. Plusieurs des cellules ont montré des noyaux doubles (bleu arrowhead, DAPI,). (D) colocalisation de GFAP (vert) avec S100 (rouge) ou p75NTR (rouge). Barreaux de l’échelle = 20 µm (C-D). Les cellules ont été montés avec un réactif antifade et DAPI (bleus noyaux). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : cytométrie en flux des cellules gliales entériques, isolé de la lamina propria duodénale de la souris adulte. (A) par Immunofluorescence de GFAP, S100B et Sox10 sur cultures EGC après 3 jours. Les flèches indiquent les Sox 10 noyaux positifs. Barreaux de l’échelle = 20 µm (utilisé avec la permission de Sundaresan et al. 10). les cellules positives (B) pourcentage de la GFAP avant l’ensemencement sur plaques revêtues (intensité de fluorescence (ou forward scatter, axe x) versus diffusion latérale (axe y). (C) pourcentage de GFAP positif (D) α-SMA positive (E) E-cadhérine positif (F) et Pgp 9.5 électrodéposition de cellules positives 3 daysafter. Portes ont été construits pour éviter les débris et les cellules mortes. Montré est le pourcentage moyen de la population fluorescent par rapport au nombre de cellules (diffusion latérale). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Identification des cellules gliales entériques, isolé de la lamina propria duodénale de la Cre-hGFAP+: souris adulte tdTomato+ . TdTomato endogène fluorescent (rouge) images ont été capturées sur un microscope fluorescent à contraste de phase avec un appareil photo numérique dans l’intestin (A). (en médaillon) Même que A sauf a fusionné avec image DAPI (bleus noyaux). Colon (B) a fusionné avec DAPI. Entérique (C) les cellules gliales (rouge) isolés de hGFAP-Cre:dtTomato+ souris et mis en culture pendant 3 jours sur substrat PDL/laminine. Barreaux de l’échelle = 50 µm. (D) cytométrie de cellules tdTomato. Montré est la moyenne % de cellules ± GFAP + SEM pour 3 préparations différentes (3 souris par prep). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : Vidéo de Ca2 + flux après traitement hormonal. EGCs plaqué sur 24 puits PDL et laminine enduit plaques ont été cultivés dans les milieux de culture gliale pendant 3 jours. Les cellules étaient pré-chargés avec 3 µM de Fura-2-AM pendant 20 min à 37 ° C et ensuite ont été traitées avecun100 nM la cholécystokinine (CCK) ou (B) 100 gastrine nM. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Composants Volume à ajouter Concentration finale
DMEM/F12 mL 44,5 _
Sérum fœtal (SVF) 5 mL 10 %
Pénicilline-streptomycine 500 ΜL Pen 100 UI/mL
Streptomycine Strep 100 µg/mL
Gentamicine (50 mg/mL de bouillon) 20 ΜL 20 µg/mL

Tableau 1 : Composition des médias remise en suspension des cellules gliales.

Composants Volume à ajouter Concentration finale
DMEM/F12 44 mL _
Sérum fœtal (SVF) 5 mL 10 %
Pénicilline-streptomycine (x 100) 500ΜL 100 UI/mL (Pen)
100 µg/mL (Strep)
Gentamicine (50 mg/mL de bouillon) 20 ΜL 20 µg/mL
GDNF (stock de 10 µg/mL) 50 ΜL 10 ng/mL
L-Glutamine (stock de 200 mM) 500ΜL 2 mM

Tableau 2 : Composition des milieux de culture de cellules gliales.

Composants Dilution d’immunofluorescence Dilution en cytométrie en flux
Poulet anti-GFAP 1 à 500 1 à 2000
Lapin anti-S100 1 à 500 1 à 500
La souris anti-p75 NTR 1 à 500 1 à 500
Chèvre anti-E-cadhérine 1 à 400
La souris anti-Pgp9.5 1 à 500
Chèvre anti-a-Smooth Muscle actine 1 à 500
Alexa Fluor 488 Goat anti-Chicken IgY 1 à 1000 1 à 1000
Alexa Fluor 568 Goat anti-mouse IgG 1 à 1000 1 à 1000
Alexa Fluor 594 anti-lapin d’âne IgG 1 à 1000
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Goat IgG 1 à 1000

Tableau 3 : Liste des anticorps

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Discussion

EGCs jouent un rôle important dans l’homéostasie intestinale, et il est essentiel d’isoler et d’étudier in vitro. Dans ce protocole, une méthode simple pour isoler EGCs de la lamina propria de l’intestin de souris adultes a été introduite pour étudier la fonction gliale entérique.

Enlever le mésentère adhérente et LMMP avec un coton-tige prélève un échantillon de la glie inter-myentérique résidant entre les muscles longitudinaux et circulaires, augmente l’accessibilité des tampons à la surface de la sous-muqueuse et supprime une grande partie des plus grande et capillaires . Ce dernier réduit le nombre de globules rouges contaminent les cultures finales. La série d’incubations EDTA dépouiller la muqueuse épithéliale exposant la lamina propria et la glie sous-muqueux, qui peut être fragile après exposition aux solutions chélatants. Agitation en secouant, Vortex ou trituration (répétitif et descendre de pipetage) doit être effectuée avec soin et programmée pour éviter des dommages excessifs aux cellules. Trituration a été utilisée ici, car la technique a donné lieu à un rendement plus uniforme des cellules gliales adhérentes et viables. Secousses avaient tendance à introduire des bulles et réduire la viabilité des cellules évaluée morphologiquement par adhérence cellulaire des plaques de revêtement. Le tissu doit être coupé en morceaux < 0,5 cm à broyer efficacement le tissu avec la pipette de 5 mL.

En général, les segments de 7 cm d’au moins 3 souris est suffisant pour générer assez EGCs pour couvrir une plaque de 6 puits à environ 20 – 30 % confluence, qui peut ensuite être utilisé pour l’immunocytochimie et qPCR. Cependant, plus les cellules peuvent être requises pour les méthodes biochimiques tels que transferts western selon le niveau d’expression du gène étudié. Même si, tapez 1 collagène ou Matrigel a été brièvement examiné comme une alternative au substrat poly-D-lysine/laminine, une plus grande adhésion de la population de cellules épithéliales a été observée, la contamination des cultures EGC avec d’autres types de cellules en fin de compte croissante . En outre, collagène de type 1 n’adhère pas fermement sur la plaque et était facilement délogé de la surface lors du changement des médias. La fibronectine est un autre substrat qui a été utilisé24, mais n’a pas testé ici. Laminine apparemment améliore la liaison et la différenciation de la crête neurale dérivée de cellules25. Cependant, beaucoup de laminine peut varier, un impact cellulaire adhésion et rendements. La contamination microbienne des cultures s’est produite à environ 5 % du temps et a été réduite au minimum par l’utilisation de réactifs stériles, de technique et d’antibiotiques. Utilisation du réactif antifongique était facultative.

La limitation majeure du protocole ici est la normalisation de l’agitation pour enlever l’épithélium sans endommager les EGCs sous-jacent. En outre, l’évaluation de la préparation ne peut faire immédiatement, car il dépend de l’adhérence cellulaire des plaques de revêtement. Comprennent trois domaines de se concentrer sur le dépannage des : 1) utilisation de frais PDL et laminine pour enduire les plaques ; 2) minimiser le temps de dissection à compter les incubations d’EDTA en augmentant le nombre d’assistants ; 3) quantifier le temps et la méthode utilisée pour agiter le tissu pour éliminer efficacement l’épithélium et puis les EGCs. Prolongation de délai dans une de ces étapes augmente la fragilité de l’EGC et la probabilité qu’ils ne récupérera pas de lorsque plaqué dans les milieux de culture. Bien que la méthode de trituration de dissocier l’épithélium a été utilisée ici, tremblements et agitation ont aussi été testés avec des résultats incohérents peut-être parce qu’il est plus opérateur dépendant et difficile à quantifier. Une fois plaqué le rendement des cellules adhérentes est plus élevée si les cellules n’étaient pas dérangés pendant 16 à 24 h.

La méthode présentée ici a été modifiée selon l’étude originale par Smith et al. 12, qui mettait l’accent sur l’isolation de la LMMP. L’approche de Smith a été utilisé ici uniquement pour retirer et jeter la LMMP afin que la plupart des cellules gliales isolés proviendrait de la sous-muqueuse et de la lamina propria. En outre, sans digestion enzymatique, les EGCs myentérique ne sont pas facilement libéré12. Néanmoins, puisqu’il n’y a aucun des marqueurs spécifiques pour myentérique versus glia sous-muqueux, la présence de cellules gliales de plexus myentérique inter ne peut être exclue. Rosenbaum et coll. ont signalé cytométrie de EGCs exprimant la protéine fluorescente verte améliorée (EGFP) du promoteur hGFAP. Ils utilisés très jeunes souris (jour après la naissance de 7) et isolement EGCs l’intestin entier par digestion enzymatique19. En outre, cytométrie a été réalisée après deux semaines de maintenir les conditions favorisant la formation Neurosphère flottant. Bien que les auteurs ont signalé que le neurospheres fortement exprimée tant GFAP et S100b, les agrégats de cellules flottant exprimé également fortement α-SMA, ce qui suggère que l’expansion de la population de cellules de myofibroblastes encouragé gliosphere développement en revanche à la morphologie de feuille plate comme décrite ici. Par conséquent, bien qu’intéressante, cette étude n’est pas directement comparable au présent protocole. En revanche, la morphologie des cellules couplé avec significativement moins α-SMA + cellules suggèrent que les EGCs décrites dans le présent protocole ne manifestent pas la morphologie 3D au cours de la période de culture de 3 à 5 jours. Néanmoins, ici, le protocole et la méthode Rosenbaum utilisent un journaliste fluorescent pour identifier et isoler les cellules GFAP +, ce qui amélioreront la capacité du chercheur à vivre cellule de profilage.

En conclusion, le protocole actuel décrit l’isolement des cellules gliales entériques de la sous-muqueuse en utilisant une approche non enzymatiques. L’ensemble du protocole prend environ 3 heures de dissection de la souris d’ensemencements initiaux sur les plaques de culture de tissus revêtus. Le plus intensif de temps dans le protocole est le retrait et la préparation des intestins pour la première incubation d’EDTA. Préparation des plaques et de stockage dans le SPD sont fortement recommandé. Le succès de la préparation dépend de l’élimination efficace de l’épithélium sans endommager les EGCs sous-jacente et l’adhérence aux plaques PDL/Laminin couché dans les 24 h. EGCs primaire sont utiles pour les études in vitro , telles que l’analyse biochimique, Ca2 + flux et transfections adénoviraux10. Il est prévu que la capacité d’isoler EGCs de la sous-muqueuse ou la LMMP permettra à d’autres études pour définir les différences dans les propriétés de croissance, la différenciation et la morphologie en utilisant des approches du génome entier EGC.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Les auteurs tiennent à souligner l’appui de DK045729 R37 (à JLM), AR060837 R01 (à HX) et l’Université du Michigan Gastrointestinal Research Center moléculaire Core P30 DK034933.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly-D lysine (1 mg/mL stock) Sigma A-003-E Dilute 1:10
Laminin (0.5 mg/mL stock) Sigma L4544 Dilute to 10 µg/mL on ICE
EDTA (0.5 M) Lonza 51201 Dilute 1:100 in DPBS
HEPES (1 M) Corning 36216004 Dilute 1:100 in DPBS
Cell Recovery Solution Corning 354253
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) HyClone SH30028.02
DMEM/F-12 Thermo Fisher Scientific 11320033
Penicillin-Streptomycin (100x) Life Technologies 15140-122
Gentamicin (50 mg/mL stock) Life Technologies 15750060
GDNF (10 µg stock) Sigma SRP3200
L-Glutamine (200 mM stock) Life Technologies 25030-081
Chicken anti-GFAP Thermo Fisher Scientific PA1-10004
Goat anti-a-Smooth Muscle Actin  Abcam ab112022
Mouse anti-Pgp9.5  Novus Biologicals NB600-1160
Goat anti-E-cadherin  R&D Systems AF748
Rabbit S100  Abcam ab34686
Mouse p75 NTR  Millipore MAB5592
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Chicken IgY Invitrogen A-11039
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG Invitrogen A-11055
Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG Invitrogen A-11004
Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG Invitrogen R-37119
Prolong Gold antifade Reagent with DAPI Thermo Fisher Scientific P36931
Fungizone (Amphotericin B) 250 µg/mL Life Technologies 15290-018
L-Fura-2-AM Invitrogen F-14201
CCK peptide Anaspec, Fremont, CA AS-20741
Gastrin peptide (Gastrin-17) Abbiotec, Bloomington, IN 350188
Nylon Mesh Celll Strainer (100 µm) Fisher Scientific 22363549
Nylon Mesh Celll Strainer (40 µm) Fisher Scientific 22363547
Disposable Serologic Pipet 5 mL Fisher Scientific 13-678-11D
0.25% Trypsin-EDTA (1x) Life Technologies 25200-056

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Numéro 138 duodénum hGFAP-Cre tdTomato biologie chélation EDTA EGCs Ca2 + flux Sox10 GFAP
Isolement des cellules gliales entériques de la sous-muqueuse et de la Lamina Propria de la souris adulte
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Wang, Z., Ocadiz-Ruiz, R., Sundaresan, S., Ding, L., Hayes, M., Sahoo, N., Xu, H., Merchant, J. L. Isolation of Enteric Glial Cells from the Submucosa and Lamina Propria of the Adult Mouse. J. Vis. Exp. (138), e57629, doi:10.3791/57629 (2018).

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