Summary
Her beskriver vi isolering av enteric-gliacellene fra intestinal submucosa bruke sekvensiell EDTA incubations for å chelate divalent kasjoner og inkubasjon i ikke-enzymatisk celle gjenopprettingsløsning. Kontaktflate resulterende celle suspensjon på poly-D-lysine og laminin resulterer i en høyanriket kultur av submucosal gliacellene for funksjonsanalyse.
Abstract
Innstigning nervesystemet (ENS) består av nevroner og enteric gliacellene (EGCs) som ligger i glatt muskel veggen, submucosa og lamina propria. EGCs spille en viktig rolle i tarmen homeostase gjennom utgivelsen av ulike trophic faktorer og bidra til integriteten til epithelial barrieren. De fleste studier av primære enteric glial kulturer bruke celler isolert fra myenteric plexus etter enzymatisk dissosiasjon. Her, er en ikke-enzymatisk metode for å isolere og kultur EGCs fra intestinal submucosa og lamina propria beskrevet. Etter manuell fjerning av langsgående muskel laget, ble EGCs frigjort fra lamina propria og submucosa med sekvensiell HEPES-bufret EDTA incubations etterfulgt av inkubasjon i kommersielt tilgjengelige ikke-enzymatisk celle gjenopprettingsløsning. EDTA-incubations var tilstrekkelig til å fjerne de fleste epithelial mucosa fra lamina propria, slik at cellen Gjenopprettingsløsningen å frigjøre de submucosal EGCs. Eventuelle gjenværende lamina propria og glatt muskel ble forkastet sammen med myenteric glia. EGCs var lett identifiseres av deres evne til å uttrykke glial fibrillary Sure protein (GFAP). Bare ca 50% av cellen suspensjon inneholdt GFAP + celler etter fullfører vev incubations og før plating på poly-D-lysin/laminin underlaget. Men etter 3 dager for dyrking cellene i glial celle-avledet nevrotropisk faktor (GDNF)-inneholder kultur medier, celle befolkningen følge substrat-belagt plater består av > 95% enteric glia. Vi laget en hybrid musen linje av avl hGFAP-grobunn musen til ROSA-tdTomato reporter linjen spore hvor stor prosentandel til GFAP + celler ved hjelp av endogene celle fluorescens. Dermed kan ikke-myenteric enteric glia, isolert av ikke-enzymatisk metoder og kultivert i minst 5 dager.
Introduction
Interesse i funksjonen for enteric gliacellene (EGCs) har stadig økt på grunn av deres anerkjente roller i tarmen integritet og homeostase1,2. I tillegg varierer EGCs plasseringen langs GI spor3,4. EGCs utgivelse ulike trophic faktorer inkludert glial celle-avledet nevrotropisk faktor (GDNF), bidra til å gut motilitet1,5 og svare på mikrobiell biprodukter6,7. Studier har indikert at befolkningen EGC er heterogene og at deres funksjon varierer avhengig av om de er submucosal eller bor innen myenteric plexus1,7. For eksempel bidrar EGCs i submucosa til tett veikryss8. Differensial GFAP uttrykk og fosforylering i EGCs har vært knyttet til Parkinsons sykdom, foreslå sine mulig kobling til tarmen fenotypen av denne uorden9. Nylig ble det observert at tapet av kjernefysiske protein menin i isolerte kulturer av EGCs fra den proksimale intestinal submucosa var tilstrekkelig til å indusere uttrykk av hormonet gastrin10. Som et resultat, ble det foreslått at EGCs kan være opprinnelsen til duodenalsår gastrinomas, en slags Nevroendokrine10. Samlet understreker disse eksemplene relevansen av studere atferd og funksjon av isolerte EGCs i nevropatisk lidelser og kreft11.
Utfordringen i feltet forblir isolere og studere en eller begge EGC populasjoner i vitro. Linjen spore eksperimenter har vist at EGCs i submucosa og lamina propria stammer fra progenitor celler i myenteric plexus7. Selv om det er flere publiserte isolasjon protokoller tilgjengelig å generere kulturer av myenteric EGCs12,13,14,15,16,17, 18,19, ingen mål spesifikt isolasjon av submucosal/lamina propria EGC befolkningen. Eksisterende protokoller EGC isolering bruker spesifikt en kombinasjon av mekanisk separasjon eller microdissection av den glatte muskulaturen kombinert med enzymatisk dissosiasjon, til slutt forkaster mucosal celle laget.
Målet med dette manuskriptet er å vise trinnene for å isolere ikke-enzymatisk primære EGCs fra lamina propria for i vitro studier. Siden det er ingen indikatorer som spesielt skiller myenteric EGCs fra de i submucosa, utnyttes romlige separasjon epithelial mucosa fra glatt muskel for å isolere submucosal EGCs. Dessuten, ved å kombinere EDTA chelation med ikke-enzymatisk dissosiasjon, ble EGCs isolert fra submucosa i motsetning til den glatte muskulaturen, som ble forkastet sammen med tilknyttede inter-myenteric-EGCs. Ytterligere separasjon av submucosa og lamina propria EGCs oppstod ved dyrking cellene i glial celle-vennlig underlag, f.eks poly-D-lysine og laminin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk beskrevet ble godkjent av University of Michigans komité for bruk og vare på dyrene.
1. forberedelse av Sterile Poly-D-lysine (PDL) og Laminin
- Minst én dag før cellen aisolering, forberede poly-D-lysine (PDL) og laminin belagt plater.
Merk: Både 6-vel og 12-brønnen ble utarbeidet avhengig av eksperimentelle målene. Vanligvis ble 12-vel platene brukt for kvantitativ analyse ved hjelp av vestlige blots; mens, 6-vel platene ble brukt til å holde autoklaveres (sterilt) coverslips for immunohistochemistry. 24-vel platene ble brukt til kultur EGCs for Ca2 + flux bildebehandling. - Fortynne lager løsninger med ultrapure vev kultur klasse, DNase-fri og RNase-fritt vann i vev kultur hette med HEPA-filtrert luft.
-
Sterilisering glass coverslips
- Hold dekkglassvæske med sterilt tang og fordype coverslips i et beaker av 100% etanol i 15 min. Tillat etanol å fordampe i vev kultur panseret og deretter plassere i 6-vel platene.
- Alternativt sted flere coverslips individuelt på 2 mm tykt blotting papir i en plastbeholder og deretter autoclave.
2. coating plater
Merk: disse trinnene under sterilt vev kultur laminær strømning hette.
- Tine 1 mg/mL PDL lager og fortynnes 1:10 med sterilt, vev kultur klasse vann slik at siste konsentrasjonen er 100 µg/mL. Bruk 2 mL per brønn til coat 6-vel tallerkener, 1 mL å dekke en brønn av en 12-vel plate og 0,5 mL for en brønn i 24-vel platene. Lagre gjenværende utvannet PDL i 12 mL dele på 20 ° C.
- Etter at PDL til coat brønnene minst 1t, fjerne PDL med en bakteriefri pipette. La platene til luft tørr fullstendig under vev kultur laminær strømning hette.
Merk: Etter fjerner PDL løsningen med en bakteriefri pipette, kan det være brukes to ganger mer innen 1 uke etter passerer gjennom filtere 0.22 µm og lagring på 4 ° C. - Tine laminin aksjen på is å unngå gel formasjon.
Merknad: Ufortynnet laminin blir solid når varmet over 8 ° C. - Fortynn laminin lager (0,5 mg/mL) 1:50 med sterilt Dulbecco fosfat bufret saltvann (DPBS) å få en endelig konsentrasjon av 10 µg/mL. Lagre den utvannet laminin i 12 mL dele på 20 ° C.
- Legg utvannet laminin fordelt med tørket PDL. Bruke 1 mL å dekke 6-vel overflaten og 0,5 mL å dekke bunnen av 12-vel platene. For coverslips, legge til 400 µL av fortynnet laminin coverslips å oppnå dekning.
- Inkuber belagt plater på 37 ° C 2 h, hvis platen brukes samme dag (rask belegg). Hvis ikke, forsegle platene med plast brytes og lagre over natten ved 4 ° C (langsom belegg).
Merk: Tetting er avgjørende for å unngå tørking og forurensning. - Fjerne den laminin løsningen med en pipette for å unngå riper overflaten. Forsiktig vaske brønnene tre ganger med sterilt DPBS.
- Legge til fullstendig glial vekst medier til hver godt og opprettholde platene på 37 ° C helt klar til å legge til EGC suspensjon.
Merk: Poly-D lysin og laminin belagt plater kan lagres i 3 dager på 4 ° C. Pels platene dagene fremover og deretter lagre på 4 ° C, vask retter med sterilt DPBS tre ganger. Tilsett 2 mL steril DPBS hver brønn etter siste vask. Forsegle platen med parafilm og lager på 4 ° C. Det er viktig å sikre at laminin ikke tørke.
3. forberedelse av isolasjon løsninger
- Forberede EDTA/HEPES/DPBS dissosiasjon løsningen. For 500 mL løsningen, bruker du sterilt DPBS (uten kalsium og magnesium) å lage en endelig løsning av 10 mM HEPES og 5 mM EDTA. Legge til 5 mL 1 M HEPES buffer og 5 mL 0,5 M EDTA lagerløsning 490 mL av DPBS. Lagre på 4 ° C før bruk.
- Forberede glial celle rørets media bruke reagensene oppført i tabell 1.
- Forberede glial vekst medier bruke reagensene oppført i tabell 2.
Merk: Glial vekst medier som inneholder GDNF kan lagres i en uke på 4 ° C.
4. fjerning av Intestinal segmentet
Merk: Mus fikk gratis tilgang til mat og vann før euthanization av isoflurane slipp-metoden og fjerning av et viktig organ. C57BL/6 mus større enn 8 ukens av alderen ble brukt. Begge kjønn ble brukt uten merkbar forskjeller i utarbeidelse.
- Euthanize musen med en overdose av isoflurane og plasser ryggen i en dissecting skuff. PIN ekstremiteter og sterilisere magen med 70% etanol. Telt huden med tang og åpne magen med saks.
- Løft leveren og identifisere den distale mage/pylorus. Deretter fjerne 7 cm proksimale tarmen. Vær forsiktig med å rive tarmen.
-
Hold pylorus med tang mens snipping bort til mesentery.
- Bruk sløv disseksjon med baksiden av saks for å skrape bort tilhenger bukspyttkjertelen.
- Plass intestinal segmentet i iskalde DPBS uten Ca2 + eller Mg2 + (figur 1A).
Merk: Andre segmenter av tarmen eller kolon kan også fjernes ved hjelp av samme teknikk.
- Bruk en 5 eller 10 mL sprøyte knyttet til en sløv slutten 20 G nål å skylle ut fecal innholdet med is kaldt DPBS (figur 1B).
- Dele tarmen i 3 cm segmenter å fjerne langsgående muskelen ved hjelp av teknikken først beskrevet av Smith et al. 12 og som endret i Sundaresan et al. 10.
Merk: Intestinal segmenter fra opptil to mus brukes per 30 mL av HEPES/EDTA/DPBS isolasjon løsningen. - Bryte ca 4 cm skille trepinne fra bomull spissen. Suge trestav i DPBS (figur 1 c).
- Sett en av intestinal segmentene jevnt på fuktet pinne (figur 2A-C).
- Fjerne tilhenger mesentery fortsatt festet ved hjelp av p-nese pinsett (figur 2D).
-
Bruk en ren barberblad eller skalpell gjøre to langsgående kutt langs tarmen der mesentery var festet (figur 2E).
- Våt bomull spissen med DPBS. Gni fuktet bomull spissen langs langs muskler til å løsne langsgående muskel/myenteric plexus (LMMP). Deretter Flytt bomull spissen horisontalt å erte bort LMMP fra sirkulær muskelen langs intestinal segmentet under LMMP fjerning.
- Hold spissen på staven mellom tommel og pekefinger samtidig stabilisere segmentet med midten og fjerde finger (figur 2F). Når fullført, vil LMMP lett skrelle av intestinal segmentet.
- Kast LMMP strippet fra intestinal røret og knyttet til bomullspinnen med mindre høsting EGCs fra myenteric plexus er ønsket.
- Bruk et barberblad for å flå åpne intestinal segmentet langs å fjerne fra trepinne.
- Lagre den strippet tarmen tissue (hovedsakelig mucosa og submucosa pluss rundskriv muskel) i DPBS på is. Gjenta trinn 4.4-4.11 til alle intestinal segmenter er forberedt.
5. fjerning av epitelial Mucosa
- Skjær tarmen i mindre biter ~0.5 cm med fine saks.
- Plass vevet i et sterilt 50 mL konisk sentrifuge rør inneholder 30 mL av iskalde EDTA/HEPES/DPBS løsning.
- Rock vev som inneholder løsningen ved 4 ° C i 10 min på ~ 60 vippes per min.
- Pre fukt en 5 mL plastikk pipe av pipettering EDTA/HEPES/DPBS bufferen opp og ned én gang og deretter bruke den pre-fuktet pipette Pipetter vevet og buffer suspensjon opp og ned (føden) 20 ganger å dislodge epithelial mucosa.
- Samle vev fra den EDTA inkubering ved å helle blandingen gjennom en 100 µm nylon celle sil. Kast den grumset Slim-fylt gjennomflytsenhet (Figur 3).
- Plasser vevet beholdt i silen inn i et nytt 50 mL konisk sentrifuge rør inneholder 30 mL av is kaldt EDTA/HEPES/DPBS bruker p-nese tang.
- Gjenta den EDTA/HEPES/DPBS inkubering en gang av rocking vev ved 4 ° C i 10 min på ~ 60 vippes per min å fjerne ekstra epithelial mucosa.
- Pre fukt en 5 mL pipette med bufferen og deretter Pipetter vev suspensjon opp og ned 20 ganger å dislodge slimete cellene.
Merk: Vevet vil tendere til å holde seg til i pipette som flere av epitel fjernes. - Samle vev etter den andre inkubering ved å helle blandingen gjennom en 100 µm nylon celle sil og forkaste flyten gjennom. Andre gjennomflytsenhet bør være merkbart mindre grumset enn først (Figur 3).
- Gjenta 10 min EDTA incubations til løsningen er nesten klart (ca 3 til 4 incubations avhengig av mengden vev og effektiviteten av føden) (Figur 3).
6. samling av innstigning gliacellene fra Lamina Propria og Submucosa
- Overføre vev fra nylon silen slik 15 mL konisk sentrifuger som inneholder 5 mL av kommersielt tilgjengelig celle gjenopprettingsløsning og rock i 25-30 minutter på 4 ° C.
-
Triturate forsiktig 10 x for å distansere enteric gliacellene fra lamina propria.
- Filtrere gjennom en 40 µm og samle filtratet i en ren 50 mL tube.
- Skyll vev på nylon filter med 1 mL av DPBS.
- Forkaste vevet og overføre ~ 5-6 mL filtratet slik rent 15 mL konisk sentrifuge.
- Spin filtratet 2000 x g i en svingende bøtte centrifuge for 5 min på 4 ° C.
- Nytt avbryte den glial cellen inneholder pellet minst 1 mL av rørets buffer ved forsiktig pipettering pellet opp og ned med 500 µL pipette tips. Unngå å innføre bobler.
Merk: Lydstyrken rørets behov av brønner og plater. For eksempel 1.2 mL til en 6-vel plate; 2.4 mL for to 6-og plater; 2.4 mL for en 12-vel plate. - Pipetter 200 µL av cellen suspensjon i hver brønn av 6-godt eller 100 µL for en 12-vel PDL-laminin belagt plater som inneholder glial vekst medier.
- Ikke forstyrr retter etter å legge til cellene i platene og plassere i 37 ° C inkubator å tillate maksimalt antall celler å følge.
Merk: En sunn forberedelse av celler vil knytte innen 6-8 h men vente minst 24 timer før du endrer media av forsiktig pipettering av mediene sammen med ikke-tilhenger celler. - Bruk cellene for eksperimenter 3-4 dager etter at de er plassert i kultur (Figur 4). Utføre immunofluorescent analyse ved hjelp av antistoffer interesse bestemt protein markører (tabell 3). For eksempel ble GFAP, S100b og p75NTR eller Sox10 brukt her. E-cadherin eller alpha glatt muskel begrepsordbok antistoffer ble brukt til å vurdere graden av forurensning fra andre celletyper.
7. immunofluorescent flekker
- Sug opp media av kulturer og skyll to ganger med PBS.
- Fastsette kulturer for 20 min ved romtemperatur med 4% paraformaldehyde.
- Fjerne bindemiddel og skyll 3 ganger med PBS.
- Permeabilize cellene med PBS 0,2 prosent Triton X-100 ved romtemperatur.
- Inkuber permeabilized cellene med blokkering løsninger består av anti-kylling IgY, anti-kanin eller anti-mus IgG for 2 timer ved romtemperatur.
-
Inkuber cellene med primære antistoffer over natten, f.eks GFAP (1:1, 000).
- Skyll cellene 3 ganger med PBS. Hvis utfører colocalization fortsette til trinn 7.7.
- Inkuber neste sett av primær antistoffer for minst 2 timer ved romtemperatur, men helst overnatting på 4 ° C. Bruk en 1:1000 fortynning av kanin anti-S100 eller en 1:500 fortynning av musen anti-p75NTR.
Merk: Alle antistoffer er utvannet i PBS. - Skyll cellene 3 ganger med PBS fjerne primære antistoffer. Deretter ruge skylles cellene med de riktige fluorescently-merket sekundære Antistoffene for 2 timer ved romtemperatur (tabell 3).
- Skyll 3 ganger med PBS fjerne sekundære antistoffer.
- Montere coverslips på lysbilder med 1-2 dråper montering media DAPI og vise cellene under fluorescerende mikroskop.
8. flowcytometri
- Fjerne tilhenger gliacellene for flowcytometri ved skylling cellene gang med DPBS, og legg deretter til 0,25% trypsin-EDTA per produsentens protokollen. Inkuber cellene i trypsin-EDTA løsning på 37 ° C i 3 min. Terminate fordøyelsen ved å samle cellene i fullstendig glial celle vekst medier.
- Samle cellene av sentrifugering 400 x g i 5 minutter, og deretter å suspendere cellene i PBS.
- Fastsette cellene med 4% paraformaldehyde i 10 min og deretter permeabilize med 0,2% Triton X-100 i PBS som beskrevet i trinn 7.4.
- Blokkere cellene med PBS som inneholder 1% BSA og vev bestemt immunglobulin for 20 min, f.eks esel anti-kylling IgY (IgG) (H + L) (1:1, 000) eller esel anti-geit IgG (H + L) (1:1, 000).
- Inkuber celler med primære antistoffer GFAP (1:2, 000), E-cadherin (1:400), α-glatt muskel utgangen (1:500) eller Pgp9.5 (1:500) natten på 4 ° C.
-
Vask bort antistoffer med PBS.
- Inkuber antigen-antistoff komplekset med fluorescently-merket sekundære antistoffer ruges i romtemperatur i 30 min.
- Bruke en separat aliquot celler inkubert med sekundær antistoff som kontrollen isotype. Populasjonene av celler er vasket og resuspended i PBS før flowcytometri.
- Analysere to bestander av celler i en flyt cytometer ved gating på live cellene.
9. forberede musen vev fra hGFAP-Cre:tdTomato mus
Merk: Lox-stopp-Lox-tdTomato cDNA uttrykkes fra ROSA locus22,23 (Jackson Labs, #007914) og genererer endogene fluorescens når oppdrettet til mus uttrykke grobunn recombinase (hGFAP-grobunn). In situ analyse utføres ved å generere frossent deler.
- Fikse tarmen tissue i 4% paraformaldehyde 1t og deretter tørke over natten i 1 M sukrose i PBS.
- Embed vevet i kommersielt kjøpt optimal kutte vev (OCT) sammensatte består av 10% polyvinylalkohol og 4,2% polyetylenglykol, og deretter fest fryse i flytende nitrogen.
- Forberede 5 µm cryosections og deretter montere bruker en antifade montering media med DAPI.
- For flowcytometri, forberede EGCs fra hGFAP-Cre:tdTomato+ mus som beskrevet i trinnene 4.1-6.5.
- Trypsinize cellene fra platen etter 3 dager i kulturer som trinn 8.1 og deretter ordne på 10 min i 4% paraformaldehyde.
- Analysere celler isolert fra grobunn Negative mus parallelt med celler isolert fra hGFAP-Cre:tdTomato+ mus på en flyt cytometer.
Merk: Gates ble bygget for å unngå døde celler og rusk.
10. Ca2 + Flux Imaging
- Inkuber EGCs belagt på en 24-vel plate med 3 µM Fluo-4-er på 37 ° C i 30 min.
- Bilde Ca2 + signalet i kjøpt kommersielt Tyrode løsning å bruke spinning disk AC confocal mikroskop og en eksitasjon bølgelengde på 480 nm (F480) etter tilføyer CCK eller gastrin peptid. Bildeanalyse ble rapportert i Sundaresan et al. 10 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Forutbetalt ble ansett mislykket hvis GFAP + celler ikke overholde og spre innen 24 timer (figur 4A). Kan ikke fastslå antall gliacellene før etter 24 h når cellene overholdt og viste bevis for å spre til flat aggregater (figur 4B). Celler i utkanten av klynger tendens til å utvide lange prosesser og klassiske glial markører, f.eks GFAP, S100b og p75NTR (figur 4C, 4 D)10,16. 2nd -dag overholder gliacellene strengt overflaten slik at befolkningen ikke-tilhenger å bli skylt bort med PBS. De fleste av flytende cellene var epitel og lamina propria cellene med celle rusk. Tilstedeværelsen av disse flytende celle klumper redusert avkastningen av tilhenger gliacellene understreker viktigheten av å utføre EDTA incubations til gjennomflytsenhet er nesten klar, signaliserer at epitelceller er fjernet fra lamina propria kjerne. I tillegg sentrifugering hastighet lavere enn 1500 x g etter incubating inne cellen gjenopprettingsløsning ikke effektivt samle alle levedyktig i pellets fører til redusert avkastning. Vanligvis overholdt 40 000 til 100.000 celler morphologically samsvar med EGCs fast dag 3 i kultur.
Immunohistochemical analyse med glial-assosiert antistoffer, indikerte at cellen klynger som forble tilhenger av dag 3 var GFAP og S100b Sox 10 positive10,16 (figur 5A). I denne studien, ble dette samme grad av renhet observert av permeabilizing cellene og analyse av flowcytometri (figur 5B-F). Umiddelbart etter isolere submucosal/Lamina propria gliacellene, avslørt flowcytometri at ca 51% av cellene var GFAP + (figur 5B), foreslå tilstedeværelsen av GFAP-negativ celletyper, f.eks epithelial, blodkreft, endothelial, neuronal celler, myofibroblasts kjente i epitel og lamina propria. Etter 3 dager i kultur, antall GFAP + celler representert over 95% av befolkningen celle analysert etter fjerner det opprinnelige mediet, forsiktig skylling med PBS og deretter legge frisk media (figur 5C). Interessant, avslørte flyt analyse høyt og lavt GFAP protein-uttrykke populasjoner (figur 5C). Faktisk avdekket immunofluorescent analyse av cellene at utkanten av klynger tendens til å uttrykke høyere nivåer av GFAP (figur 4C, 4 D). Sammen kan de to typene analyse tyde forskjeller i EGC modenhet eller differensiering status. Kollektivt, andelen α-SMA + (myofibroblast celle markør), E-cadherin + (tarmepitelet markør), og Pgp 9.5 + (neuronal celle markør) celler var mindre enn 5% (figur 5 d-F). Disse resultatene var i samsvar med tidligere studier utført ved hjelp av immunofluorescent merking av EGCs viser 93% GFAP + celler 10. Flyt analyse understreker viktigheten av slik at cellene å overholde platene siden fjerning av forurensende celle populasjoner bestående av ca 5% av kulturer.
Et mål i denne studien var å bruke GFAP-aktivert reporter å lette flowcytometri av cellene for videre analyse og sammenligne graden av EGC berikelse med en endogen fluorescerende markør (figur 6). HGFAP-grobunn musen linjen ble opprinnelig beskrevet av Messing og kolleger 20. I korthet, ble grobunn-recombinase plassert under kontroll av 2,2 kb av arrangøren av menneskelig glial fibrillary syre protein (hGFAP). Dermed uttrykt en celle transkribere denne hGFAP promoter røde fluorescerende reporter tdTomato. Befolkningen cellen merket med tdTomato reporter var visualisert i situ med frosne deler av tarmen og kolon (figur 6A, 6B) før du utfører EGC isolasjon fremgangsmåtene ovenfor. Etter utfører EDTA/mobiltelefon gjenvinning isolering og dyrking cellene for 3 dager, ble EGCs fra disse musene lett identifiseres av deres endogene fluorescens (figur 6C). Selv om GFAP + celler uten tvil er mer tallrike i den proksimale tarmen4,21, tdTomato + EGCs ble også observert i tykktarmen (figur 6B). Bruker tdTomato+ fluorescerende reporteren aktivert av hGFAP-grobunn også avdekket en bimodale befolkning på hGFAP-tdTomato + celler (figur 6D) observert ved hjelp av immunofluorescent analyse av GFAP protein (figur 5C). Selv om det har blitt rapportert at ikke alle EGCs uttrykke GFAP protein4, kan dette punktet gjenspeile forskjeller i nivået av GFAP uttrykk. I gjennomsnitt utstilt ca 66% av cellene analysert høyeste tdTomato fluorescens. EDTA/celle utvinning protokollen kan derfor brukes til å isolere delsett av EGCs gjennom tynntarm og tykktarm merket av reporteren undersøke forskjellene i genuttrykk.
Denne protokollen generert et tilstrekkelig antall ren GFAP + gliacellene for biokjemiske studier og western blot analyse 10. for å demonstrere glial celle respons, en 3-dagers glial celle prep ble behandlet hormoner cholecystokinin (CCK) eller gastrin å indusere Ca2 + flux (figur 7A-7B)10. Resultatene viste at disse GFAP + tilhenger cellene svarte på ekstracellulære agonister demonstrere deres evne til å vise kjente enteric glial funksjon.
Figur 1: satt opp og utarbeidelse av musen-tarmen. (A) bilde av isolasjon på isen inkludert utdraget tarmen. (B) bilde av 5 mL-sprøyten festet til en 20 G sløv slutten nål å skylle ut fekal innhold. (C) ingeniør slutten av tre bomullspinne (~ 4 cm) soaking i bufferen som DPBS. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: fremgangsmåten brukes til å rense tarmen og fjerne langsgående muskel/myenteric plexus (LMMP). (A-C) Skyve en intestinal segment på en fuktet trestav. (D) fjerning av tilhenger mesentery. (E) skår tarmen med et barberblad. (F) fjerne LMMP med en fuktig bomullspinne. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: sekvensiell flyt-throughs etter EDTA incubations. Vises eksempler på flyt-throughs fra 4 sekvensiell incubations bruker tre 7 cm intestinal segmenter ruges i 10 min med 5 mM EDTA / 10mM HEPES i DPBS og deretter til triturated 20 ganger. Representant flyt-throughs etter strømme gjennom en 100 µm nylon maske sil vises. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: EGC bilder 24 timer etter plating. Lys mikroskopisk undersøkelse av resuspended celler 24 timer etter plating. (A) vist er et representativt eksempel på en dårlig prep viser flytende tarmepitelet klumper (pil) og rusk. Ingen tilhenger EGCs ble observert etter 24 h. (B) vist er et representativt eksempel på en utmerket prep 24 timer etter at cellen aisolering og rørets som flekker av EGCs overholder PDL/Laminin belagt plater. Bildene ble tatt på en invertert fluorescerende mikroskop med et digitalkamera. Skalere barer = 500 µm (AB). (C) høy effekt visning av en oppdatering av EGC celler beiset med GFAP antistoff (grønn) viser celler i periferien med en høyere intensitet av merking. Flere av cellene viste dobbel kjerner (arrowhead, DAPI, blå). (D) Colocalization av GFAP (grønn) med S100 (rød) eller p75NTR (rød). Skalere barer = 20 µm (C-D). Cellene ble montert med en antifade reagens og DAPI (blå kjerner). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Flow cytometri av innstigning gliacellene isolert fra den duodenalsår lamina propria voksen museklikk. (A) Immunofluorescence av GFAP, S100B og Sox10 på EGC kulturer etter 3 dager. Pilene angir Sox 10 positiv kjerner. Skalere barer = 20 µm (brukt med tillatelse fra Sundaresan et al. 10). (B) prosentandel til GFAP positiv celler før plating på belagt plater (fluorescens intensitet (eller frem scatter, x-aksen) versus siden xy (y-aksen). (C) prosentandel til GFAP positiv (D) α-SMA positiv (E) E-cadherin positive (F) og Pgp 9.5 positiv celler 3 daysafter plating. Gates ble bygget for å unngå døde celler og rusk. Vist er mener andelen fluorescerende befolkningen i forhold til antall celler (siden XY). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: Identifikasjon av innstigning gliacellene isolert fra den duodenalsår lamina propria av hGFAP-grobunn+: tdTomato+ voksen mus. Endogene tdTomato fluorescerende (rød) bilder ble tatt på en fase kontrast fluorescerende mikroskop med et digitalt kamera i tarmen (A). (innsatt) Samme som A unntatt sammen med DAPI bilde (blå kjerner). (B) kolon sammen med DAPI. (C) Enteric gliacellene (rød) isolert fra hGFAP-Cre:dtTomato+ mus og kultivert for 3 dager på PDL/Laminin substrat. Skalere barer = 50 µm. (D) flyt cytometric analyse av tdTomato celler. Vist er det bety % av GFAP + celler ± SEM for 3 forskjellige preparater (3 mus per prep). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: Video av Ca2 + flukser etter hormone behandling. EGCs belagt på 24-vel PDL og laminin belagt plater ble kultivert i glial vekst medier for 3 dager. Cellene var forhåndslastet med 3 µM av Fura-2-AM for 20 min på 37 ° C og deretter behandlet med (A) 100 nM cholecystokinin (CCK) eller (B) 100 nM gastrin. Klikk her for å laste ned denne filen.
| Komponenter | Volum som skal legges til | Siste konsentrasjon |
| DMEM/F12 | 44,5 mL | _ |
| Fosterets bovin Serum (FBS) | 5 mL | 10% |
| Penicillin-Streptomycin | 500 ΜL | 100 IU/mL penn |
| Streptomycin | 100 µg/mL Strep | |
| Gentamicin (50 mg/mL stock) | 20 ΜL | 20 µg/mL |
Tabell 1: Sammensetning av Glial celle rørets Media.
| Komponenter | Volum som skal legges til | Siste konsentrasjon |
| DMEM/F12 | 44 mL | _ |
| Fosterets bovin Serum (FBS) | 5 mL | 10% |
| Penicillin-Streptomycin (100 x) | 500ΜL | 100 IU/mL (Pen) |
| 100 µg/mL (Strep) | ||
| Gentamicin (50 mg/mL stock) | 20 ΜL | 20 µg/mL |
| GDNF (10 µg/mL stock) | 50 ΜL | 10 ng/mL |
| L-glutamin (200 mM stock) | 500ΜL | 2 mM |
Tabell 2: Sammensetning av Glial celle vekst medier.
| Komponenter | Immunofluorescence fortynning | Flow cytometri fortynning |
| Kylling anti-GFAP | 1 til 500 | 1 til 2000 |
| Kanin anti-S100 | 1 til 500 | 1 til 500 |
| Musen anti-p75 NTR | 1 til 500 | 1 til 500 |
| Goat anti-E-cadherin | 1 400 | |
| Musen anti-Pgp9.5 | 1 til 500 | |
| Goat anti-en-glatt muskel utgangen | 1 til 500 | |
| Alexa Fluor 488 geit anti-kylling IgY | 1 til 1000 | 1 til 1000 |
| Alexa Fluor 568 geit anti-musen IgG | 1 til 1000 | 1 til 1000 |
| Alexa Fluor 594 esel anti-kanin IgG | 1 til 1000 | |
| Alexa Fluor 488 esel anti-geit IgG | 1 til 1000 |
Tabell 3: Liste over antistoffer
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
EGCs spille viktige roller i tarmen homeostase, og det er viktig å isolere og studere dem i vitro. I denne protokollen, ble en enkel metode for å isolere EGCs fra lamina propria av voksen mus tarmen introdusert for å studere enteric glial funksjon.
Fjerne tilhenger mesentery og LMMP med en bomullspinne fjerner noen av inter-myenteric glia ligger mellom langsgående og sirkulære muskelen, øker tilgjengeligheten av buffere til submucosal overflaten og fjerner mye av større kapillærene . Sistnevnte reduserer antall røde blodlegemer forurensende endelige kulturene. Serien av EDTA incubations fjerner epithelial mucosa utsette lamina propria og submucosal glia, som kan være sårbare etter eksponering for chelaterande løsninger. Omrøring enten ved risting, vortexing eller triturating (opp og ned pipettering) skal utføres nøye og tidsbestemt å unngå overdreven skader cellene. Føden ble brukt her fordi teknikken resulterte i en mer konsistent avkastning av tilhenger, levedyktig gliacellene. Risting tendens til å introdusere bobler og redusere celle levedyktighet vurdert morphologically av cellen overholdelse belagt plater. Vevet kuttes i biter < 0,5 cm til effektivt triturate vev med 5 mL pipette.
7 cm segmenter fra minst 3 mus er generelt tilstrekkelig til å generere nok EGCs for å dekke en 6-vel plate på ca 20-30% confluency, som kan brukes for immunocytochemistry og qPCR. Flere celler kan imidlertid være nødvendig for biokjemiske metoder som vestlige blots avhengig uttrykk av genet studerte. Selv skriver inn 1 kollagen eller Matrigel ble kort undersøkt som et alternativ til poly-D-lysin/Laminin underlaget, større etterlevelse av epitelial celle befolkningen ble observert, til slutt øker forurensning av EGC kulturer med andre celletyper . I tillegg type 1 kollagen overholder ikke fast platene og var lett forskyves fra overflaten når du endrer media. Fibronectin er et annet medium som har vært brukt24, men ble ikke testet her. Laminin øker angivelig bindingen og differensiering av neural-crest avledet celler25. Men mange laminin kan variere, påvirker celle etterlevelse og gir. Mikrobiell forurensning av kulturer skjedde ca 5% av tiden og ble holdt på et minimum ved bruk av steril reagenser, teknikk og antibiotika. Bruk av soppdrepende reagensen var tilleggsutstyr.
Stor begrensning av protokollen her er standardisering av agitasjon fjerne epitel uten å skade de underliggende EGCs. Videre kan ikke vurdering av preparatet gjøres umiddelbart siden det avhenger av cellen overholdelse belagt plater. Tre områder å fokusere på når du feilsøker inkluderer: 1) bruk av fersk PDL og laminin til coat platene; 2) minimere tiden fra disseksjon til begynnelsen av EDTA incubations ved å øke antall assistenter; 3) kvantifisere tid og metoden brukes til å agitere vev for å effektivt fjerne epitel og deretter til EGCs. Utvide tiden i ett av disse trinnene øker EGC skjørhet og sannsynligheten for at de ikke vil gjenopprettes når belagt i vekst medier. Selv føden metoden å dissociate epitel ble brukt her, rister og vortexing ble også testet med inkonsekvente resultater kanskje fordi det er mer operatør avhengige og vanskelig å kvantifisere. Når belagt avkastningen av tilhenger celler var større hvis cellene ikke ble forstyrret 16-24 h.
Metoden som presenteres her ble endret etter den opprinnelige studien av Smith et al. 12, som fokuserte på isolere i LMMP. Smith tilnærming ble brukt her bare å fjerne og slette LMMP slik at de fleste av gliacellene isolert ville stammer fra submucosa og lamina propria. I tillegg uten enzymatisk fordøyelsen er myenteric-EGCs ikke lett frigjort12. Likevel, siden det er ingen spesifikke indikatorer for myenteric mot submucosal glia, tilstedeværelse av gliacellene fra inter-myenteric plexus kan ikke utelukkes. Rosenbaum et al. rapportert flyt cytometric analyse av EGCs uttrykke forbedret grønne fluorescerende protein (EGFP) fra hGFAP promoter. De brukte svært små mus (postnatal dag 7) og isolert EGCs fra hele tarmen av enzymatisk fordøyelsen19. I tillegg ble flyt cytometric analyse utført etter to uker med å opprettholde forhold som fremmet frittflytende neurosphere formasjon. Selv om forfatterne rapportert at neurospheres svært uttrykt både GFAP og S100b, uttrykt de flytende celle aggregatene også sterkt α-SMA, tyder på at utvidelsen av myofibroblast celle befolkningen oppfordret gliosphere utvikling i kontrast flat som morfologi beskrevet her. Derfor, mens interessant, studien er ikke direkte sammenlignbare med denne protokollen. Derimot morfologi av celler kombinert med betydelig mindre α-SMA + celler foreslår at EGCs beskrevet i denne protokollen ikke viser 3-dimensjonale morfologi i 3 til 5 - dagers kultur perioden. Likevel bruke både protokollen her og metoden Rosenbaum fluorescerende reporter å identifisere og isolere GFAP + celler som vil forbedre investigator's evne til å gjøre levende celle profilering.
Avslutningsvis beskriver gjeldende protokollen isolering av innstigning gliacellene fra submucosa med en ikke-enzymatisk tilnærming. Hele protokollen tar ca 3 timer fra musen disseksjon til første plating pre belagt vev kultur platene. Mest tid intensiv trinn i protokollen er fjerning og utarbeidelse av tarmen for den første EDTA inkubering. Forbereder platene og lagring i DPBS anbefales sterkt. Suksessen av preparat avhenger effektiv fjerning av epitel uten å skade de underliggende EGCs og overholdelse av PDL/Laminin belagt plater i 24 h. primære EGCs er nyttige for i vitro studier som biokjemiske analyse, Ca2 + flukser og adenoviral transfections10. Det er forventet at evnen til å isolere EGCs fra submucosa eller LMMP vil tillate videre studier å definere forskjellene i EGC vekst egenskaper, differensiering og morfologi bruke hele genomet tilnærminger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å erkjenne støtte fra R37 DK045729 (til JLM), R01 AR060837 (å HX) og University of Michigan Gastrointestinal Research Center molekylær Core P30 DK034933.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly-D lysine (1 mg/mL stock) | Sigma | A-003-E | Dilute 1:10 |
| Laminin (0.5 mg/mL stock) | Sigma | L4544 | Dilute to 10 µg/mL on ICE |
| EDTA (0.5 M) | Lonza | 51201 | Dilute 1:100 in DPBS |
| HEPES (1 M) | Corning | 36216004 | Dilute 1:100 in DPBS |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | HyClone | SH30028.02 | |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Gentamicin (50 mg/mL stock) | Life Technologies | 15750060 | |
| GDNF (10 µg stock) | Sigma | SRP3200 | |
| L-Glutamine (200 mM stock) | Life Technologies | 25030-081 | |
| Chicken anti-GFAP | Thermo Fisher Scientific | PA1-10004 | |
| Goat anti-a-Smooth Muscle Actin | Abcam | ab112022 | |
| Mouse anti-Pgp9.5 | Novus Biologicals | NB600-1160 | |
| Goat anti-E-cadherin | R&D Systems | AF748 | |
| Rabbit S100 | Abcam | ab34686 | |
| Mouse p75 NTR | Millipore | MAB5592 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Chicken IgY | Invitrogen | A-11039 | |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG | Invitrogen | A-11055 | |
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG | Invitrogen | A-11004 | |
| Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG | Invitrogen | R-37119 | |
| Prolong Gold antifade Reagent with DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36931 | |
| Fungizone (Amphotericin B) 250 µg/mL | Life Technologies | 15290-018 | |
| L-Fura-2-AM | Invitrogen | F-14201 | |
| CCK peptide | Anaspec, Fremont, CA | AS-20741 | |
| Gastrin peptide (Gastrin-17) | Abbiotec, Bloomington, IN | 350188 | |
| Nylon Mesh Celll Strainer (100 µm) | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Nylon Mesh Celll Strainer (40 µm) | Fisher Scientific | 22363547 | |
| Disposable Serologic Pipet 5 mL | Fisher Scientific | 13-678-11D | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25200-056 |
References
- Grubisic, V., Gulbransen, B. D. Enteric glia: the most alimentary of all glia. Journal of Physiology. 595 (2), 557-570 (2017).
- Gulbransen, B. D., Sharkey, K. A. Novel functional roles for enteric glia in the gastrointestinal tract. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 9 (11), 625-632 (2012).
- Rao, M., et al. Enteric Glia Regulate Gastrointestinal Motility but Are Not Required for Maintenance of the Epithelium in Mice. Gastroenterology. 153 (4), 1068-1081 (2017).
- Rao, M., et al. Enteric glia express proteolipid protein 1 and are a transcriptionally unique population of glia in the mammalian nervous system. Glia. , (2015).
- McClain, J., et al. Ca2+ responses in enteric glia are mediated by connexin-43 hemichannels and modulate colonic transit in mice. Gastroenterology. 146 (2), 497-507 (2014).
- Cunha Franceschi, R., et al. Enteric glial reactivity to systemic LPS administration Changes in GFAP and S100B protein. Neuroscience Research. 119, 15-23 (2017).
- Kabouridis, P. S., et al. Microbiota controls the homeostasis of glial cells in the gut lamina propria. Neuron. 85 (2), 289-295 (2015).
- Yu, Y. B., Li, Y. Q. Enteric glial cells and their role in the intestinal epithelial barrier. World Journal of Gastroenterology. 20 (32), 11273-11280 (2014).
- Clairembault, T., et al. Enteric GFAP expression and phosphorylation in Parkinson's disease. Journal of Neurochemistry. 130 (6), 805-815 (2014).
- Sundaresan, S., et al. Gastrin Induces Nuclear Export and Proteasome Degradation of Menin in Enteric Glial Cells. Gastroenterology. 153, 1555-1567 (2017).
- Gulbransen, B. D. Enteric Glia: The Origin of Duodenal Gastrinomas? Gastroenterology. , (2017).
- Smith, T. H., Ngwainmbi, J., Grider, J. R., Dewey, W. L., Akbarali, H. I. An in vitro preparation of isolated enteric neurons and glia from the myenteric plexus of the adult mouse. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
- Fried, D. E., Gulbransen, B. D. In situ Ca2+ imaging of the enteric nervous system. Journal of Visualized Experiments. (95), (2015).
- Bernstein, C. N., Vidrich, A. Isolation, identification, and culture of normal mouse colonic glia. Glia. 12 (2), 108-116 (1994).
- Jaeger, C. B. Isolation of enteric ganglia from the myenteric plexus of adult rats. Journal of Neural Transplantation & Plasticity. 5 (4), 223-232 (1995).
- Almond, S., Lindley, R. M., Kenny, S. E., Connell, M. G., Edgar, D. H. Characterisation and transplantation of enteric nervous system progenitor cells. Gut. 56 (4), 489-496 (2007).
- Ruhl, A., Trotter, J., Stremmel, W. Isolation of enteric glia and establishment of transformed enteroglial cell lines from the myenteric plexus of adult rat. Neurogastroenterology & Motility. 13 (1), 95-106 (2001).
- Boyen, G. B., et al. Distribution of enteric glia and GDNF during gut inflammation. BMC Gastroenterology. 11, 3 (2011).
- Rosenbaum, C., et al. Activation of Myenteric Glia during Acute Inflammation In Vitro and In Vivo. Public Library of Science One. 11 (3), e0151335 (2016).
- Zhuo, L., et al. hGFAP-cre transgenic mice for manipulation of glial and neuronal function in vivo. Genesis. 31 (2), 85-94 (2001).
- Boesmans, W., Lasrado, R., Vanden Berghe, P., Pachnis, V. Heterogeneity and phenotypic plasticity of glial cells in the mammalian enteric nervous system. Glia. 63 (2), 229-241 (2015).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
- Kabouridis, P. S., et al. The gut microbiota keeps enteric glial cells on the move; prospective roles of the gut epithelium and immune system. Gut Microbes. 6 (6), 398-403 (2015).
- Pomeranz, H. D., Sherman, D. L., Smalheiser, N. R., Tennyson, V. M., Gershon, M. D. Expression of a neurally related laminin binding protein by neural crest-derived cells that colonize the gut: relationship to the formation of enteric ganglia. The Journal of Comparative Neurology. 313 (4), 625-642 (1991).
