Summary
Здесь мы описываем изоляции кишечных глиальных клеток из кишечника подслизистой хелат двухвалентной катионов и затем инкубации в решение восстановления неферментативного ячейки с помощью последовательного инкубаций ЭДТА. Обшивка результирующая ячейка подвеска на поли D-лизин и Ламинин приводит высокообогащенного культуры подслизистую глиальных клеток для функционального анализа.
Abstract
Кишечные нервной системы (ENS) состоит из нейронов и кишечных глиальных клеток (EGCs), которые проживают в гладких мышц стенки, подслизистой и lamina propria. EGCs играют важную роль в кишечнике гомеостаза путем выпуска различных трофических факторов и способствовать целостности эпителиальных барьер. Большинство исследований первичных кишечных глиальных культур используют клетки изолированы от myenteric сплетения после ферментативные диссоциации. Здесь описан неферментативного метод, чтобы изолировать и культуры EGCs от кишечных подслизистой и lamina propria. После ручного удаления слоя продольных мышц EGCs были освобождены от lamina propria и подслизистой с помощью последовательного инкубаций HEPES-амортизированное ЭДТА, следуют инкубации в коммерчески доступных неферментативного клеток решение восстановления. ЭДТА инкубаций были достаточно, чтобы лишить большинство эпителия слизистой оболочки от lamina propria, что позволяет освободить подслизистую EGCs решение восстановления клеток. Любые остаточные lamina propria и гладких мышц была отвергнута наряду с myenteric глии. EGCs были легко определить по их способности выразить глиальных фибриллово кислой белка (СВМС). Только около 50% суспензию клеток содержится СВМС + клеток после завершения инкубаций тканей и до обшивки на поли D-лизин/Ламинин подложке. Однако, после 3 дней культивирования клеток в глиальных клеток нейротрофического фактора (GDNF)-содержащих Культура СМИ, популяции клеток, придерживаясь пластины с покрытием субстрат состоящий из > 95% кишечных глии. Мы создали гибрид мыши линию путем разведения hGFAP-Cre мыши к линии репортер Роза tdTomato отслеживать процент СВМС + клеток с использованием эндогенного клеток флуоресцентным. Таким образом не myenteric кишечных глии могут быть изолированы неферментативного методами и культивировали в течение 5 дней.
Introduction
Интерес к функции кишечных глиальных клеток (EGCs) неуклонно увеличивается из-за их признанной роли в кишечнике целостности и гомеостаза1,2. Кроме того EGCs варьируются в зависимости от их расположения вдоль тракта GI,3,,4. EGCs выпуска различных трофических факторов, включая глиальных клеток нейротрофического фактора (GDNF), способствовать кишки моторики1,5 и реагировать микробной субпродуктов6,7. Исследования показали, что население EGC неоднороден и что их функция варьируется в зависимости от подслизистую ли они находятся в пределах myenteric сплетения1,7. К примеру EGCs в подслизистой вклад плотных8. Дифференциальные СВМС выражение и фосфорилирования в EGCs были связаны с болезнью Паркинсона, предлагая их возможную связь с фенотипом кишки этого расстройства9. Недавно было отмечено, что потеря Менің ядерных белков в изолированных культур EGCs от проксимального отдела кишечника подслизистой было достаточно, чтобы побудить выражение гормон гастрин10. В результате было предложено, что EGCs может быть происхождение двенадцатиперстной кишки gastrinomas, тип нейроэндокринные опухоли10. В совокупности эти примеры подчеркивают актуальность изучения поведения и функции изолированных EGCs нейропатической расстройств и рака11.
Проблема в области остается как изолировать и изучить один или оба EGC населения в пробирке. Родословная трассировки эксперименты показали, что EGCs в подслизистой и lamina propria исходят из клеток-предшественников в myenteric сплетения7. Хотя есть несколько опубликованных изоляции протоколов, доступных для создания культуры myenteric EGCs12,13,14,,1516,17, 18,19, ни предназначается специально для изоляции подслизистую/lamina propria EGC населения. Существующие протоколы для изоляции EGC специально использовать сочетание механического разделения или microdissection гладких мышц, в сочетании с ферментативной диссоциации, в конечном итоге отбрасывая слоя слизистой оболочки клеток.
Цель этой рукописи заключается в демонстрации шаги не ферментативно изолировать первичной EGCs от lamina propria в vitro исследований. Поскольку Есть нет маркеров, которые специально отличить myenteric EGCs от тех в подслизистой, чтобы изолировать подслизистую EGCs эксплуатировался пространственное разделение эпителия слизистой оболочки от гладких мышц. В дополнение комбинируя ЭДТА Хелаты с неферментативного диссоциации, EGCs были изолированы от подслизистой в отличие от гладких мышц, которая была отвергнута наряду с EGCs связанные Интер myenteric. Дальнейшее разделение подслизистой и lamina propria EGCs происходило путем культивирования клеток на глиальных клеток friendly субстратов, например, поли D-лизин и Ламинин.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все описанные эксперименты на животных были утверждены Комитетом в университете штата Мичиган по использованию и уходу за животных.
1. Подготовка Ламинин решений и стерильных поли D-Лизин (PDL)
- По крайней мере за один день до изоляция клетки, подготовьте поли D-Лизин (PDL) и Ламинин покрытием пластин.
Примечание: 6-Ну и 12-ну пластины были подготовлены в зависимости от экспериментальных целей. Как правило 12-ну пластины были использованы для количественного анализа с использованием западных помарках; в то время как 6-ну пластины были использованы для проведения газобетона (стерильные) coverslips для иммуногистохимии. 24-ну пластины были использованы для культуры EGCs для Ca2 + поток изображений. - Разбавьте акций решения с сверхчистого культуры ткани класса, DNase свободных и РНКазы свободной воды в культуре ткани капюшон с НЕРА фильтрации воздуха.
-
Стерилизующие стекла coverslips
- Удерживая coverslip стерильным пинцетом и погрузите coverslips в стакан 100% этанола на 15 мин разрешить этанола испаряются в культуре ткани капот и затем место в 6-ну пластины.
- Кроме того место несколько coverslips индивидуально на 2 мм толщиной промокательную бумагу в пластиковый контейнер и затем автоклава.
2. покрытие пластин
Примечание: выполните эти шаги под капотом ламинарный поток стерильного культуры ткани.
- Размораживание 1 мг/мл СНО фондового и разбавить 1:10 класс водой стерильные, культуры тканей, так что конечная концентрация 100 мкг/мл. Используйте 2 мл на хорошо промазывать 6-ну пластины, 1 мл для покрытия одной скважиной плиты 12-Ну и 0,5 мл для одной скважины в 24-ну пластины. Храните остальные разбавленным PDL в 12 мл аликвоты при-20 ° C.
- После позволяя PDL пальто скважин для по крайней мере 1 h, удалите PDL с стерильной пипеткой. Разрешить пластины в воздух сухой полностью под культуры ткани Ламинарный шкаф.
Примечание: После удаления PDL решение с стерильной пипеткой, он может быть использован дважды больше в течение 1 недели после прохождения через фильтр 0,22 мкм и хранить при 4 ° C. - Оттепель Ламинин запас на льду, чтобы избежать образования геля.
Примечание: Неразбавленный Ламинин становится твердой, когда нагревается выше 8 ° C. - Разбавьте Ламинин фондовой (0.5 мг/мл) 1:50 с стерильных Дульбекко фосфат буфер солевой (DPBS) для получения конечной концентрации 10 мкг/мл. Хранить разбавленные Ламинин в 12 мл аликвоты при-20 ° C.
- Добавьте разбавленные Ламинин скважинах содержащих сушеные PDL. Используйте 1 мл для покрытия 6-ну поверхности и 0,5 мл для покрытия нижней части 12-ну пластин. Для coverslips добавьте 400 мкл разбавленного Ламинин coverslips для достижения поверхности покрытия.
- Инкубируйте пластины с покрытием при 37 ° C 2 h, если плита используется тот же день (быстрое покрытие). Если нет, то печать пластины с полиэтиленовой пленкой и хранить на ночь при 4 ° C (медленно покрытие).
Примечание: Уплотнение имеет решающее значение для избежания высыхания и загрязнения. - Удаление решения Ламинин тщательно с пипетку, чтобы избежать царапин на поверхности. Осторожно промойте лунки три раза с стерильных DPBS.
- Добавьте полный глиальных рост СМИ к каждому хорошо и поддерживать пластины при 37 ° C до готовности добавить EGC подвеска.
Примечание: Поли-D лизина и Ламинин покрытием плиты можно хранить в течение 3 дней при 4 ° C. Слой пластины несколько дней вперед и затем хранить при 4 ° C, мыть тарелки с стерильных DPBS три раза. Добавьте 2 мл стерильного DPBS каждой скважины после окончательной стирки. Уплотнение пластины с парафина и хранить при 4 ° C. Важно обеспечить что Ламинин не высыхает.
3. Подготовка решений изоляции
- Приготовляют раствор диссоциации ЭДТА/HEPES/DPBS. Для 500 мл раствора используйте стерильные DPBS (без кальция и магния), чтобы сделать окончательное решение 10 мм 5 мм и HEPES ЭДТА. 490 мл DPBS добавьте 5 мл 1 М HEPES буфера и 5 мл 0,5 М ЭДТА Стоковый раствор. Хранить при 4 ° C до использования.
- Подготовьте СМИ ресуспендирования глиальных клеток, с использованием реагентов, перечисленные в таблице 1.
- Подготовьте глиальных роста средств массовой информации с использованием реагентов, перечисленные в таблице 2.
Примечание: Глиальные питательных сред, содержащих GDNF могут храниться на одну неделю на 4 ° C.
4. удаления кишечную сегмента
Примечание: Мышей разрешается свободный доступ к продовольствию и воде до euthanization изофлюрановая метода drop и удаление жизненно важного органа. Были использованы более чем 8 недель возраста мышей C57Bl/6. Обоих полов были использованы без заметного различия в подготовке.
- Усыпить мышь с передозировкой изофлюрановая и место лежа в рассечения лоток. Закрепить конечностей и стерилизовать живота с 70% этиловом спирте. Палатка кожи пинцетом, а затем открыть живота с ножницами.
- Поднимите печени и определить дистальной части желудка/пилоруса. Затем удалите 7 см проксимального отдела кишечника. Будьте осторожны, чтобы не рвать в кишечнике.
-
Удерживая пилоруса пинцетом портной прочь брыжейка.
- Используйте тупой диссекции с задней части ножничного выскоблить прочь адэрентных поджелудочной железы.
- Поместите кишечных сегмента в ледяной DPBS без Ca2 + или мг2 + (рис. 1A).
Примечание: Другие слои кишки или кишечника могут также быть удалены используя ту же технику.
- Использование, 5 или 10 мл шприц придает тупой конец иглы 20 G для промывки фекальных содержимое со льдом холодной DPBS (рис. 1B).
- Разделите сегменты 3 см, чтобы удалить продольных мышц, используя технику, первоначально описанные Smith et al. кишечника 12 и вносятся изменения в Sundaresan и др. 10.
Примечание: 30 мл раствора ЭДТА/HEPES/DPBS изоляции используются кишечные сегментов от до двух мышей. - Разорвать около 4 см для разделения деревянной палочкой от кончика хлопка. Замочите деревянной палочкой в DPBS (рис. 1 c).
- Вставьте один из кишечника сегментов гладко на пропитанные stick (рисунок 2A-C).
- Удаление адэрентных брыжейка еще прилагается с помощью иглы нос щипцы (Рисунок 2D).
-
Используйте чистые лезвия или скальпель сделать два продольных Никс вдоль кишечника, где был брыжейка прилагается (Рисунок 2E).
- Влажные кончик хлопок с DPBS. Руб., кончик увлажненный хлопок продольно вдоль мышцы, чтобы ослабить продольные мышцы/myenteric сплетение (LMMP). Затем переместите кончик хлопка горизонтально, чтобы дразнить от LMMP от круговой мышцы по длине сегмента кишечника во время удаления LMMP.
- Удерживая кончик палочки между большим и указательным пальцами стабилизации сегмента среднего и четвертый палец (Рисунок 2F). Когда закончите, LMMP будет легко слезает сегмента кишечника.
- Желательно удалить LMMP отделяются от кишечной трубки и придает ватный тампон Если заготовка EGCs из myenteric сплетения.
- Используйте лезвием бритвы для свежевать открытые кишечных сегмент продольно, чтобы удалить из деревянной палочкой.
- Храните раздели кишечных тканей (преимущественно слизистой и подслизистой плюс круговой мышцы) в DPBS на льду. Повторите шаги 4.4-4.11, до тех пор, пока готовятся все кишечные сегментов.
5. снятие эпителия слизистой оболочки
- С тонкой ножницами нарежьте небольшими кусочками ~0.5 см кишечника.
- Место ткани в стерильных 50 мл конические пластиковых пробирок, содержащие 30 мл ледяной раствора ЭДТА/HEPES/DPBS.
- Рок ткани содержащих раствор на 4 ° C на 10 минут, наклоняется ~ 60 в минуту.
- Предварительно смачивают 5 мл пластиковых дозаторов, закупорить буфере ЭДТА/HEPES/DPBS вверх и вниз один раз, а затем использовать предварительно смоченной пипеткой Пипетка ткани и буфера подвески вверх и вниз (Тритурация) 20 раз выбить эпителия слизистой оболочки.
- Соберите ткани от инкубации ЭДТА, поливая смесь через стрейнер клеток Нейлон 100 мкм. Отказаться от мутной слизи заполненные проточный (рис. 3).
- Место ткани, сохранена в сетчатый фильтр в новый Тюбик 50 мл конические центрифуги, содержащие 30 мл льда холодной ЭДТА/HEPES/DPBS с помощью иглы нос щипцами.
- Повторите ЭДТА/HEPES/DPBS инкубации во второй раз, тряся ткани на 4 ° C на 10 минут, наклоняется ~ 60 в минуту для отрезания дополнительные эпителия слизистой оболочки.
- Предварительно смачивают 5 мл пипетки с буфером и затем Пипетка ткани подвески вверх и вниз 20 раз выбить слизистой клетки.
Примечание: Ткани будут склонны придерживаться внутри пипеткой, как больше из эпителия снимается. - Собирать ткани после второй инкубации, поливая смесь через стрейнер клеток Нейлон 100 мкм и отбросить через поток. Второй поток через должно быть заметно менее мутная, чем первый (рис. 3).
- Повторите инкубаций ЭДТА 10 мин, пока решение не будет почти ясно (около 3-4 инкубаций в зависимости от количества ткани и эффективности Тритурация) (рис. 3).
6. сбор кишечных глиальных клеток от Lamina Propria и подслизистой
- Передача ткани из нейлона ситечко для 15 мл конические пластиковых пробирок, содержащий 5 мл решения восстановления коммерчески доступных ячеек и рок на 25 – 30 мин при 4 ° C.
-
Нарезанных нежно 10 x, чтобы отделить кишечных глиальные клетки от lamina propria.
- Через 40 мкм фильтр фильтр и сбора фильтрата в чистой 50 мл трубки.
- Промывайте ткань нейлон фильтр с 1 мл DPBS.
- Отменить ткани и передачи ~ 5-6 мл фильтрата в чистые 15 мл конические центрифуги.
- Спиновые фильтрата в 2000 x g в центрифугу размахивая ведро для 5 мин при 4 ° C.
- Вновь приостановите глиальных клеток содержащие гранул в по крайней мере в 1 мл ресуспендирования буфера, нежно закупорить Пелле вверх и вниз с 500 мкл кончиком пипетки. Избегайте введения пузыри.
Примечание: При необходимости количество скважин и плиты громкость ресуспендирования. Например 1,2 мл для одного 6-ну плита; 2.4 mL для двух 6-ну пластин; 2.4 mL для одного 12-ну пластины. - Пипетка 200 мкл суспензии клеток в каждой скважине 6-ну или 100 мкл для 12-ну PDL-Ламинин покрытием пластин, содержащие глиальных роста средств массовой информации.
- Не беспокоить блюда после добавления клетки к пластинам и размещение в инкубаторе 37 ° C, чтобы максимальное количество клеток присоединиться.
Примечание: Здоровый подготовки клеток будет приложить в течение 6-8 ч, но ждать по крайней мере 24 часа перед изменением СМИ, нежно дозирование от средств массовой информации наряду с non сторонник клетки. - Использование ячейки для экспериментов 3 – 4 дня после того, как они помещаются в культуре (рис. 4). Выполните immunofluorescent анализ с использованием антител, представляющих интерес для конкретных белковых маркеров (Таблица 3). К примеру СВМС, S100b и p75NTR или Sox10 был использован здесь. E-Кадгерины или альфа-гладких мышц актина антитела были использованы для оценки степени загрязнения от других типов клетки.
7. immunofluorescent окрашивание
- Аспирационная СМИ от культур и дважды промыть PBS.
- Исправьте культур для 20 мин при комнатной температуре с параформальдегида 4%.
- Снимите фиксатор и затем промойте 3 раза с PBS.
- Разрушения клеток с PBS, содержащие 0,2% Тритон X-100 при комнатной температуре.
- Проинкубируйте permeabilized клетки с блокирования решений состоит из анти курица МГГ, анти кролика или мыши IgG против втечение 2 ч при комнатной температуре.
-
Инкубируйте клетки с первичных антител на ночь, например, СВМС (1:1, 000).
- Промойте клетки 3 раза с PBS. Если выполнение colocalization перейти к шагу 7,7.
- Инкубировать следующий набор первичных антител для по крайней мере 2 ч при комнатной температуре, но желательно на ночь при 4 ° C. Используйте в разведении кролика анти С100 1: 1000 или 1: 500 разбавления мыши анти p75NTR.
Примечание: Все антитела разводят в PBS. - Промойте клетки 3 раза с PBS для удаления первичного антитела. Затем она подогревает промыть клетки с соответствующим дневно тегами вторичные антитела втечение 2 ч при комнатной температуре (Таблица 3).
- Промойте 3 раза с PBS для удаления вторичные антитела.
- Маунт coverslips слайды с помощью 1 – 2 капли монтажа СМИ с DAPI и посмотреть клетки под микроскопом флуоресцентные.
8. проточной цитометрии
- Удалить адэрентных глиальные клетки для проточной цитометрии, промыв клетки один раз с DPBS, а затем добавьте 0,25% трипсина ЭДТА в производителя протокол. Инкубируйте клетки в решении при 37 ° C на 3 мин Terminate Пищеварение трипсина ЭДТА, собирая клетки в полной глиальных клеток роста средств массовой информации.
- Собирать клетки центрифугированием при 400 x g 5 минут, а затем вновь приостановить клетки в PBS.
- Исправьте клетки с параформальдегида 4% за 10 мин и затем разрушения с 0,2%, X-100 Triton в PBS, как описано в шаге 7.4.
- Заблокировать ячейки с PBS, содержащей 1% BSA и ткани конкретных иммуноглобулина для 20 минут, например, осел анти курица IgY (IgG) (H + L) (1:1, 000) или Коза осла против IgG (H + L) (1:1, 000).
- Инкубировать клетки с первичного антитела СВМС (1:2, 000), E-Кадгерины (1: 400), α-гладких мышц актина (1: 500) или Pgp9.5 (1: 500) на ночь при 4 ° C.
-
Смыть антитела с PBS.
- Проинкубируйте комплекс антиген антитело с дневно тегами вторичные антитела инкубированы при комнатной температуре за 30 мин.
- Используйте отдельный Алиготе клетки инкубировали с вторичное антитело в качестве элемента управления изотипа. Обе популяции клеток промывают и высокомобильна в PBS до проточной цитометрии.
- Анализировать две популяции клеток на проточный цитометр стробирования на живой клетки.
9. подготовка ткани мыши от hGFAP-Cre:tdTomato мышей
Примечание: CDNA Lox-стоп-Lox-tdTomato выражена в Роза Локус22,23 (Джексон Labs, #007914) и генерирует эндогенного флуоресценции когда разводят для мыши, выражая Cre рекомбиназа (hGFAP-Cre). В situ анализ выполняется путем создания разделов замороженные ткани.
- Исправьте кишечных тканей в параформальдегида 4% за 1 час и затем обезвоживает на ночь в 1 М сахарозы в ФБР.
- Внедрить ткани в коммерчески приобрели оптимального раскроя ткани (OCT) соединение состоит из поливинилового спирта 10% и 4,2% полиэтиленгликоль, а затем привязать замораживание в жидком азоте.
- Подготовить 5 мкм cryosections, а затем смонтировать с помощью antifade монтаж СМИ с DAPI.
- Для проточной цитометрии, подготовить EGCs от hGFAP-Cre:tdTomato+ мышей, как описано в шагах 4.1 – 6.5.
- Trypsinize клетки от пластины после 3 дней в культурах как шаг 8.1 и затем исправить за 10 мин в параформальдегида 4%.
- Анализировать клетки изолированы от Cre отрицательной мышей параллельно с клетки изолированы от hGFAP-Cre:tdTomato+ мышей на проточный цитометр.
Примечание: Ворота были построены, чтобы избежать мертвых клеток и мусора.
10. Ca2 + потока изображений
- Инкубировать EGCs, покрытые 3 мкм на пластине 24-ну Fluo-4-ам при 37 ° C за 30 мин.
- Изображение Ca2 + сигнал в коммерчески приобрели Tyrode решения с помощью вращающийся диск Конфокальный микроскоп и возбуждения волны 480 Нм (F480) после добавления CCK или гастрина пептид. Анализ изображений было сообщено в Sundaresan и др. 10 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Парфюмерные считались неудачными, если СВМС + клетки не присоединиться и распространяться в течение 24 ч (рис. 4A). Количество глиальных клеток не удалось пока после 24 часов, когда клетки придерживался и появляются признаки распространения в плоской агрегатах (рис. 4B). Клетки на краю кластеров склонны расширять длинные процессы и выразил классические глиальных маркеров, например, СВМС, S100b и p75НТР (рис. 4 c, 4 D)10,16. На 2-й день глиальные клетки плотно присоединились к поверхности, позволяет non сторонник населения, чтобы ополоснуть прочь с PBS. Большинство плавающей клеток эпителия и lamina propria клетки вместе с ячейки мусор. Присутствие этих плавучих скопления клеток снижение урожайности адэрентных глиальных клеток, подчеркнув важность выполнения инкубаций ЭДТА, до тех пор, пока поток через почти ясно, сигнализации, что эпителиальные клетки были удалены из пластинки propria ядро. Кроме того центрифугированием при скоростях ниже 1500 x g после инкубации в решение восстановления клеток не собирали эффективно всех жизнеспособных клеток в гранулах, ведущих к сокращению урожайности. Как правило 40 000 до 100 000 клеток морфологически согласуется с EGCs твердо придерживались на 3 день в культуре.
Иммуногистохимический анализ глиальных связанного антителами, указал, что ячейка кластеров что остается приверженцем день 3 были СВМС, S100b и Sox 10 положительных10,16 (Рисунок 5A). В текущем исследовании такая же степень чистоты было отмечено permeabilizing клетки и анализируя подачей cytometry (Рисунок 5B-F). Сразу же после изоляции подслизистую/Lamina propria глиальных клеток, проточной цитометрии показали, что около 51% клеток СВМС + (Рисунок 5B), указывающей на присутствие СВМС отрицательных типов клеток, например, эпителиальные, кроветворения, эндотелия, нейрональные клетки, знаны, что существуют в эпителий и lamina propria миофибробласты. После 3 дней в культуре, число СВМС + клеток представлено свыше 95% населения ячейки, проанализированы после удаления исходного носителя, нежно полоскания с PBS и затем добавить свежие СМИ (рис. 5 c). Интересно, что поток анализ показал высокого и низкого общего белка выражая населения (рис. 5 c). Действительно immunofluorescent анализ клеток показало, что, как правило, на периферии кластеров выразить более высоких уровней СВМС (рис. 4 c, 4 D). Взятые вместе, два вида анализа может указывать различия в статусе погашения или дифференциация EGC. Коллективно, процент α-SMA + (Миофибробласт ячейке маркер), E-Кадгерины + (эпителиальных клеток маркер) и Pgp 9.5 + клеток (нейрональные клетки маркер) было меньше, чем 5% (Рисунок 5 d-F). Эти результаты согласуются с предварительного исследования с использованием immunofluorescent маркировки EGCs показаны около 93% СВМС + клеток 10. Анализ потока подчеркивает важность предоставления клетки придерживаться пластины, так как он позволяет удаление загрязняющих клеточных популяций, составляют приблизительно 5% культур.
Целью в данном исследовании было использовать активированный СВМС репортер для облегчения проточной цитометрии клеток для дальнейшего анализа и сравнить степень обогащения EGC, используя маркер эндогенного флуоресцентные (рис. 6). Линия hGFAP-Cre мыши первоначально была описана Мессинг и coworkers 20. Короче говоря КРР рекомбиназа был помещен под контролем 2.2 КБ промотора человека глиальных фибриллово кислоты белка (hGFAP). Таким образом любой ячейке, переписывание этой hGFAP промоутер выразил красной флуоресцентной репортер tdTomato. Популяции клеток, помечены tdTomato репортер был визуализирован в situ используя Замороженные разделы кишечника и толстой кишки (рис. 6A, 6B) перед выполнением процедуры изоляции EGC, описанные выше. После выполнения восстановления изоляция ЭДТА/клетки и культивирования клеток в течение 3 дней, EGCs от этих мышей были легко определить по их эндогенных флуоресцирования (рис. 6 c). Хотя СВМС + клетки возможно более многочисленны в проксимальном кишечника4,21, tdTomato + EGCs были также замечены в толстой кишке (Рисунок 6B). Использование флуоресцентных репортер tdTomato+ , активируются hGFAP-Cre также показали Бимодальная населения hGFAP-tdTomato + клеток (.рис. 6 d) как с использованием immunofluorescent анализа общего белка (рис. 5 c). Хотя сообщалось, что не все EGCs Экспресс СВМС белка4, этот пункт может отражать различия в уровне СВМС выражения. В среднем около 66% клеток проанализирована выставлены самый высокий уровень tdTomato флуоресценции. Таким образом протокол восстановления ЭДТА/клетки могут использоваться для изолировать подмножество EGCs всей тонкой кишки и толстой кишки, обозначены репортер для изучения различий в экспрессии генов.
Этот протокол создан достаточное количество относительно чистой СВМС + глиальных клеток для биохимических исследований и Западный анализ помаркой 10. чтобы продемонстрировать оперативность глиальных клеток, 3-дневный глиальных клеток приготовительная лечили гормонов холецистокинин (CCK) или гастрина побудить Ca2 + поток (рис. 7A-7B)10. Результаты показали, что эти СВМС + адэрентных клеток ответил на внеклеточные агонисты, демонстрируя их способность выставлять известной функции кишечных глиальных.
Рисунок 1: набор и подготовку мыши кишечника. (A) картина изоляции на льду, включая извлеченные кишечника. (B) картина 5 мл шприц, придает 20 G тупой конец иглы для промывки фекальных содержимое. (C) инженерные конец деревянной ватным тампоном (~ 4 см), замачивания в буфер DPBS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: шаги используется для очистки кишечника и удаления продольные мышцы/myenteric сплетение (LMMP). (A-C) Раздвижные кишечных сегмента на смоченные деревянной палочкой. (D) удаление адэрентных брыжейка. (E) уменьшение поперечного сечения в кишечнике с лезвием бритвы. (F) удаление LMMP с влажным ватным тампоном. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: последовательный поток throughs после ЭДТА инкубаций. Изображены примеры потока throughs из 4 последовательного инкубаций, с использованием трех 7 см кишечного сегментов инкубированы для 10 мин с 5 мм ЭДТА/10 HEPES в DPBS и затем порошкового 20 раз. Показываются представитель потока throughs после заливки через сетчатый Нейлон 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: EGC фото 24 ч после плакировка. Легкие микроскопическое исследование ресуспензированы клетки 24 ч после покрытия. Показано на рисунке (A) является представительной примером бедных prep, показывая плавающей скопления эпителиальных клеток (стрелка) и мусора. Не сторонник EGCs наблюдались после 24 ч. (B) показано является представитель примером отличная подготовка 24 часа после того, как изоляция клетки и ресуспендирования в котором патчи EGCs придерживаться Ламинин PDL покрытием пластин. Изображения были захвачены на Перевернутый флуоресцентный микроскоп с цифровой камерой. Масштаб баров = 500 мкм (A-B). (C) высокой мощности мнение патч EGC клеток окрашенных с СВМС антитела (зеленый), показаны на периферии клетки с большей интенсивностью маркировки. Некоторые из клеток показали двойной ядер (стрелки, DAPI, синий). (D) Colocalization из СВМС (зеленый) с S100 (красный) или p75NTR (красный). Масштаб баров = 20 мкм (C-D). Клетки были установлены с antifade реактивом и DAPI (синий ядер). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: проточная цитометрия кишечных глиальных клеток, которые изолированы от двенадцатиперстной кишки lamina propria взрослой мыши. (A) иммунофлюоресценции СВМС, S100B и Sox10 на ЦЭУ культур после 3 дней. Стрелки указывают Sox 10 положительных ядер. Масштаб баров = 20 мкм (используется с разрешения Sundaresan и др. 10). (Б) процент СВМС позитивных клеток перед обшивкой на пластины с покрытием (интенсивности флуоресценции (или вперед точечные, ось x) против стороны точечной (ось y). (C) процент СВМС позитивные (D) α-SMA позитивные (E) E-Кадгерины положительные (F) и Pgp 9.5 позитивные клетки 3 daysafter покрытие. Ворота были построены, чтобы избежать мертвых клеток и мусора. Показана средняя доля населения флуоресцентные относительно количество клеток (сторона разброс). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6: Определение кишечного глиальных клеток, которые изолированы от двенадцатиперстной кишки lamina propria hGFAP-Cre+: tdTomato+ взрослых мышь. Эндогенные tdTomato флуоресцентные (красный) изображения были захвачены на этап контраст флуоресцентный микроскоп с цифровой камерой в кишечнике (A). (вставка) Так же, как Кроме слилась с DAPI изображения (синий ядер). (B) Колон слилась с DAPI. (C) кишечная глиальных клеток (красный), изолированных от hGFAP-Cre:dtTomato+ мышей и культивировали в течение 3 дней на PDL/Ламинин субстрата. Масштаб баров = 50 µm. (D) гранулярных анализ потока tdTomato клеток. Показана средняя % СВМС + клетки ± SEM для 3 различных препаратов (3 мышей за приготовительные). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 7: Видео Ca2 + потоков после гормонального лечения. EGCs покрытием на 24-ну PDL и Ламинин покрытием плиты были культивировали в глиальных роста средств массовой информации в течение 3 дней. Клетки были предварительно загружены с 3 мкм фура-2-ам для 20 минут при 37 ° C и затем были относиться с (A) 100 Нм холецистокинин (CCK) или (B) 100 Нм гастрина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
| Компоненты | Объем должен быть добавлен | Конечная концентрация |
| DMEM/F12 | 44.5 мл | _ |
| Плода бычьим сывороточным (ФБС) | 5 мл | 10% |
| Пенициллин стрептомицином | 500 МКЛ | Ручка 100 МЕ/мл |
| Стрептомицин | Strep 100 мкг/мл | |
| Гентамицин (50 мг/мл бульона) | 20 МКЛ | 20 мкг/мл |
Таблица 1: Состав СМИ ресуспендирования глиальных клеток.
| Компоненты | Объем должен быть добавлен | Конечная концентрация |
| DMEM/F12 | 44 мл | _ |
| Плода бычьим сывороточным (ФБС) | 5 мл | 10% |
| Пенициллин стрептомицином (100 x) | 500ΜL | 100 МЕ/мл (пен) |
| 100 мкг/мл (острый) | ||
| Гентамицин (50 мг/мл бульона) | 20 МКЛ | 20 мкг/мл |
| GDNF (10 мкг/мл бульона) | 50 МКЛ | 10 нг/мл |
| L-глютамин (бульон 200 мм) | 500ΜL | 2 мм |
Таблица 2: Состав питательных сред глиальных клеток.
| Компоненты | Иммунофлюоресценции разрежения | Цитометрии разрежения потока |
| Анти СВМС курица | 1 до 500 | 1-2000 |
| Кролик анти S100 | 1 до 500 | 1 до 500 |
| НТР анти p75 мыши | 1 до 500 | 1 до 500 |
| Коза анти E-Кадгерины | 1-400 | |
| Анти Pgp9.5 мышь | 1 до 500 | |
| Коза анти-гладкомышечные актина | 1 до 500 | |
| Alexa Fluor 488 коза анти курица IgY | 1 до 1000 | 1 до 1000 |
| Alexa Fluor 568 коза анти мыши IgG | 1 до 1000 | 1 до 1000 |
| Alexa Fluor 594 осла анти кролик IgG | 1 до 1000 | |
| Alexa Fluor 488 осла анти коза IgG | 1 до 1000 |
Таблица 3: Перечень антител
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
EGCs играют важную роль в кишечнике гомеостаза, и важно, чтобы изолировать и изучить их в пробирке. В этом протоколе простой метод для изоляции EGCs от lamina propria кишки, Взрослый мышь была введена для исследования интестинальной глиальных функции.
Удаление адэрентных брыжейка и LMMP с ватным тампоном удаляет некоторые из Интер myenteric глии, проживающих между продольной и круговой мышцы, увеличивает доступность содержимого буферов в подслизистую поверхности и удаляет большую часть больше капилляров . Последний уменьшает количество красных кровяных клеток, загрязняя окончательный культур. Серия ЭДТА инкубаций отбрасывать эпителия слизистой оболочки, подвергая lamina propria и подслизистую глии, который может быть хрупким после воздействия хелатирующий решения. Психомоторное возбуждение, путем встряхивания, vortexing или истирание (повторяющихся вверх и вниз, закупорить) должны быть выполнены аккуратно и приурочен, чтобы избежать чрезмерного повреждения клеток. Тритурация был использован здесь, потому что техника привели к более последовательным доходность сторонником, жизнеспособных глиальных клеток. Встряхивания, как правило, представить пузыри и уменьшить жизнеспособность клеток морфологически оценены сотовый присоединению к пластины с покрытием. Ткань должна быть разрезать на куски < 0,5 см, чтобы эффективно нарезанных ткани с Пипетка 5 мл.
Как правило, достаточно, чтобы генерировать достаточно EGCs для покрытия одной пластины 6-ну около 20 – 30% сегментов 7 см от по крайней мере 3 мышей confluency, который затем может использоваться для иммуноцитохимии и ПЦР. Однако больше клеток может потребоваться для биохимических методов, таких как западной помарки в зависимости от уровня экспрессии гена учился. Хотя, тип 1 коллагена или Matrigel кратко рассматривался как альтернатива поли D-лизин/Ламинин субстрата, более строгому эпителиальных клеток населения было отмечено, в конечном счете растущее загрязнение EGC культур с другими типами клеток . Кроме того коллаген типа 1 не твердо придерживаться пластины и было легко выбили из поверхности при изменении средства массовой информации. Фибронектин является другой субстрат, который был используется24, но здесь не тестировался. Ламинин, видимо, повышает привязки и дифференциация нейронные крест производных клетки25. Однако, много Ламинин может варьироваться, влияющих сотовый присоединению и урожайность. Микробной контаминации культур произошло около 5% из времени и было сведено к минимуму с помощью стерильных реагентов, техники и антибиотиков. Использование противогрибковых реагента была необязательной.
Основным ограничением протокола здесь является стандартизация агитации чтобы удалить без повреждения основной EGCs эпителия. Кроме того Оценка подготовки не может быть сделана немедленно, поскольку она зависит от сотовый присоединению к пластины с покрытием. Три области, чтобы сосредоточить внимание на при устранении неполадок включают: 1) использование свежих PDL и Ламинин пальто плит; 2) свести к минимуму время от вскрытия для начала инкубаций ЭДТА, увеличив количество помощников; 3) определяют время и метод, используемый для агитировать ткани для эффективного удаления эпителия, а затем EGCs. Продление времени в любом из этих шагов увеличивает EGC хрупкость и вероятность того, что они не восстановится, когда покрытие в средствах массовой информации роста. Хотя здесь используется метод Тритурация, чтобы отделить эпителия, тряски и vortexing были также протестированы с противоречивые результаты возможно потому, что это больше оператор зависимых и трудно подсчитать. После того, как покрытие доходность адэрентных клеток был больше, если бы клетки были не нарушается для 16-24 ч.
Метод, представленный здесь была изменена согласно оригинальные исследования Smith et al. 12, которая сосредоточена на изоляции LMMP. Смит подход был использован здесь только для удаления и удалить LMMP, так что большинство глиальных клеток, которые изолированы будет происходить от подслизистой и lamina propria. Кроме того без ферментативного пищеварения, myenteric EGCs не являются легко освобожденных12. Тем не менее поскольку есть без конкретных маркеры для myenteric против подслизистую глии, нельзя исключить наличие глиальных клеток из сплетения Интер myenteric. Розенбаум et al. сообщили анализа потока гранулярных EGCs, выражая расширенной зеленого флуоресцентного белка (EGFP) от hGFAP промоутер. Они использовали очень молодых мышей (послеродовой день 7) и изолируются ферментативного пищеварения19EGCs от всего кишечника. Кроме того был проведен анализ гранулярных потока после двух недель поддержание условий, которые способствовали формирование свободного плавающего нейросферы. Хотя авторы сообщили, что neurospheres сильно выражена как общего, так и S100b, плавающий агрегаты клеток также сильно выражена α-SMA, предполагая, что расширение популяции клеток Миофибробласт призвал gliosphere развития в отличие от в морфологии плоский лист, как описано здесь. Таким образом хотя интересно, исследование не является непосредственно сопоставимы с этот протокол. Напротив, морфологию клеток в сочетании с значительно меньше α-SMA + клетки показывают, что EGCs, указанных в настоящем Протоколе не проявляют 3-мерной морфология в период 3 5 - дней культуры. Тем не менее протокол здесь и Розенбаум метод используют флуоресцентные репортер идентифицировать и изолировать СВМС + клеток, которые позволят улучшить способность следователя жить клеток профилирования.
В заключение текущий протокол описывает изоляции кишечных глиальных клеток от подслизистой, используя неферментативного подход. Весь протокол занимает около 3 ч от мыши диссекции для первоначального покрытия на тарелках предварительно покрытых культуры ткани. Наиболее интенсивные шаг по времени в протоколе это удаление и подготовка кишечника для первой инкубации ЭДТА. Настоятельно рекомендуется подготовка пластины и хранения в DPBS. Успех подготовки зависит от эффективного удаления эпителий без повреждения основной EGCs и присоединению для PDL/Ламинин покрытием пластин в течение 24 ч. первичный EGCs полезны для в vitro исследования, такие как биохимический анализ, CA2 + флюсов и аденовирусных transfections10. Предполагается, что способность изолировать EGCs подслизистой или LMMP позволит дальнейшие исследования для определения различий в EGC свойства роста, дифференциации и морфологии, используя весь геном подходов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы отметить поддержку R37 DK045729 (чтобы JLM), R01 AR060837 (для HX) и в Университете Мичиган желудочно-исследовательский центр молекулярной Core P30 DK034933.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly-D lysine (1 mg/mL stock) | Sigma | A-003-E | Dilute 1:10 |
| Laminin (0.5 mg/mL stock) | Sigma | L4544 | Dilute to 10 µg/mL on ICE |
| EDTA (0.5 M) | Lonza | 51201 | Dilute 1:100 in DPBS |
| HEPES (1 M) | Corning | 36216004 | Dilute 1:100 in DPBS |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | HyClone | SH30028.02 | |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Gentamicin (50 mg/mL stock) | Life Technologies | 15750060 | |
| GDNF (10 µg stock) | Sigma | SRP3200 | |
| L-Glutamine (200 mM stock) | Life Technologies | 25030-081 | |
| Chicken anti-GFAP | Thermo Fisher Scientific | PA1-10004 | |
| Goat anti-a-Smooth Muscle Actin | Abcam | ab112022 | |
| Mouse anti-Pgp9.5 | Novus Biologicals | NB600-1160 | |
| Goat anti-E-cadherin | R&D Systems | AF748 | |
| Rabbit S100 | Abcam | ab34686 | |
| Mouse p75 NTR | Millipore | MAB5592 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Chicken IgY | Invitrogen | A-11039 | |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG | Invitrogen | A-11055 | |
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG | Invitrogen | A-11004 | |
| Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG | Invitrogen | R-37119 | |
| Prolong Gold antifade Reagent with DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36931 | |
| Fungizone (Amphotericin B) 250 µg/mL | Life Technologies | 15290-018 | |
| L-Fura-2-AM | Invitrogen | F-14201 | |
| CCK peptide | Anaspec, Fremont, CA | AS-20741 | |
| Gastrin peptide (Gastrin-17) | Abbiotec, Bloomington, IN | 350188 | |
| Nylon Mesh Celll Strainer (100 µm) | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Nylon Mesh Celll Strainer (40 µm) | Fisher Scientific | 22363547 | |
| Disposable Serologic Pipet 5 mL | Fisher Scientific | 13-678-11D | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25200-056 |
References
- Grubisic, V., Gulbransen, B. D. Enteric glia: the most alimentary of all glia. Journal of Physiology. 595 (2), 557-570 (2017).
- Gulbransen, B. D., Sharkey, K. A. Novel functional roles for enteric glia in the gastrointestinal tract. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 9 (11), 625-632 (2012).
- Rao, M., et al. Enteric Glia Regulate Gastrointestinal Motility but Are Not Required for Maintenance of the Epithelium in Mice. Gastroenterology. 153 (4), 1068-1081 (2017).
- Rao, M., et al. Enteric glia express proteolipid protein 1 and are a transcriptionally unique population of glia in the mammalian nervous system. Glia. , (2015).
- McClain, J., et al. Ca2+ responses in enteric glia are mediated by connexin-43 hemichannels and modulate colonic transit in mice. Gastroenterology. 146 (2), 497-507 (2014).
- Cunha Franceschi, R., et al. Enteric glial reactivity to systemic LPS administration Changes in GFAP and S100B protein. Neuroscience Research. 119, 15-23 (2017).
- Kabouridis, P. S., et al. Microbiota controls the homeostasis of glial cells in the gut lamina propria. Neuron. 85 (2), 289-295 (2015).
- Yu, Y. B., Li, Y. Q. Enteric glial cells and their role in the intestinal epithelial barrier. World Journal of Gastroenterology. 20 (32), 11273-11280 (2014).
- Clairembault, T., et al. Enteric GFAP expression and phosphorylation in Parkinson's disease. Journal of Neurochemistry. 130 (6), 805-815 (2014).
- Sundaresan, S., et al. Gastrin Induces Nuclear Export and Proteasome Degradation of Menin in Enteric Glial Cells. Gastroenterology. 153, 1555-1567 (2017).
- Gulbransen, B. D. Enteric Glia: The Origin of Duodenal Gastrinomas? Gastroenterology. , (2017).
- Smith, T. H., Ngwainmbi, J., Grider, J. R., Dewey, W. L., Akbarali, H. I. An in vitro preparation of isolated enteric neurons and glia from the myenteric plexus of the adult mouse. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
- Fried, D. E., Gulbransen, B. D. In situ Ca2+ imaging of the enteric nervous system. Journal of Visualized Experiments. (95), (2015).
- Bernstein, C. N., Vidrich, A. Isolation, identification, and culture of normal mouse colonic glia. Glia. 12 (2), 108-116 (1994).
- Jaeger, C. B. Isolation of enteric ganglia from the myenteric plexus of adult rats. Journal of Neural Transplantation & Plasticity. 5 (4), 223-232 (1995).
- Almond, S., Lindley, R. M., Kenny, S. E., Connell, M. G., Edgar, D. H. Characterisation and transplantation of enteric nervous system progenitor cells. Gut. 56 (4), 489-496 (2007).
- Ruhl, A., Trotter, J., Stremmel, W. Isolation of enteric glia and establishment of transformed enteroglial cell lines from the myenteric plexus of adult rat. Neurogastroenterology & Motility. 13 (1), 95-106 (2001).
- Boyen, G. B., et al. Distribution of enteric glia and GDNF during gut inflammation. BMC Gastroenterology. 11, 3 (2011).
- Rosenbaum, C., et al. Activation of Myenteric Glia during Acute Inflammation In Vitro and In Vivo. Public Library of Science One. 11 (3), e0151335 (2016).
- Zhuo, L., et al. hGFAP-cre transgenic mice for manipulation of glial and neuronal function in vivo. Genesis. 31 (2), 85-94 (2001).
- Boesmans, W., Lasrado, R., Vanden Berghe, P., Pachnis, V. Heterogeneity and phenotypic plasticity of glial cells in the mammalian enteric nervous system. Glia. 63 (2), 229-241 (2015).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
- Kabouridis, P. S., et al. The gut microbiota keeps enteric glial cells on the move; prospective roles of the gut epithelium and immune system. Gut Microbes. 6 (6), 398-403 (2015).
- Pomeranz, H. D., Sherman, D. L., Smalheiser, N. R., Tennyson, V. M., Gershon, M. D. Expression of a neurally related laminin binding protein by neural crest-derived cells that colonize the gut: relationship to the formation of enteric ganglia. The Journal of Comparative Neurology. 313 (4), 625-642 (1991).
