Summary
ここでは、エキスタチン適用対応フィルム地形画像の自動解析するフィルムの調製から突出力を評価するために使用する実験手法を詳しく説明します。
Abstract
多数の生物学的文脈で動物細胞を機械的な力を開発することによって、環境物理的にやり取りする必要があります。これらのうち、牽引力はよ特徴付けられた、されているが、基板に直交細胞突起力測定技術の不足があります。付着性のセルの基板上で突出力を測定する実験装置を考案しました。準拠ホルムバール シート メッキ細胞変形この基板、ナノメートル スケールでの原子間力顕微鏡 (AFM) によって生成された地形にマップされます。フォース値は、前方の細胞構造の幾何学に基づく変形分布の解析から、抽出されます。したがって、時間の経過とともに細胞の個々 の突出の単位によって力を測定できます。この手法は、力の発生とその突起を含む多くの細胞プロセス制御の研究を有効になります。ここでは、その人間の大食細胞によって形成されるエキスタチンによって生成された前方力を測定への応用について述べる.
Introduction
動物細胞は、物理的に行列とその環境1を構成する他の細胞と対話します。これは、移行、体を内面化、外部情報を取得を区別するために必要です。このようなプロセスでセルは機械力を生成する必要がある、その生物学的挙動、例えば増殖の監督と近年多くの研究が示している、力を生成し、その環境をプローブする細胞の能力の影響か分化2,3。ターンでは、細胞の力の測定は力生成の規制を勉強し、細胞行動と組織の運命4,5にその意義を理解する主要な援助です。
近年では、その環境では6セルを出せる力を測定する多数の技術の開発を目撃しました。これらの大半は牽引力細胞出す携帯電話プローブまたは変形可能な基板をはめると、明らかに尽力されています。しかし、細胞外の環境に突起に関連する機械的な力測定技術の不足に苦しむ、日でなく特徴にしています。
この制限を克服するためには基板に直交に加わる力を測定する手法を提案します。それは細胞細胞基質の変形を測定し、軍の関与を推測することが可能となって、直交方向に変形することができます薄い弾性シートをめっきで構成されます。基板形状、原子間力顕微鏡によるナノスケールの分解能で測定し、変形から力の評価は、前方の細胞構造7,8,の幾何学の知識に依存しています9。
ここでは、セットアップとエキスタチン、三次元環境10、11、間葉系移行の大食細胞によって形成される前方接着構造によって生成された力を測定への応用について述べる 12,13,14,15,16,17。この手法が力の発生とその突起を含む多くの細胞プロセス制御の理解を進めると考えています。
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Protocol
1. ホルムバール コーティング グリッドの準備
- 純粋なアセトンで電子顕微鏡グリッドをきれいしてろ紙に乾燥させる.純粋なエタノールと顕微鏡スライドをきれい、レンズ ペーパーで拭くし、ブロワーでほこりを取り除きます。
- ホルムバールの下の部分でのソリューションを含むフィルム キャスト装置の漏斗にエタノール洗浄ガラス スライドを垂直方向に配置します。漏斗の上をカバーしてください。
- レベルがスライドの 3 分の 2 に達するまでホルムバール溶液 (二塩化エチレンは 0.5%) 100 mL アトマイザー電球が付いているポンプします。
- 1 分のためのソリューションにスライドをしてください。
- 安定パラレルテク ホルムバール ソリューションを排出する装置のバルブを開きます。10 15 mL/秒の流量が 30-80 nm のホルムバール フィルムを得られます。フィルムの厚さは、ホルムバール溶液の濃度によって、排水速度によって決まります。
注: バルブをゆっくり開いて、圧力を介して空気弁で排水率を制御できます。排水をより速くより厚いフィルム。実習でホルムバール流量から膜厚を予測することは困難だから我々 ホルムバール映画のいくつかのバッチを準備し、AFM による厚さを制御 (手順 2 を参照)。 - 商工会議所からスライドを削除し、繊細な任意の液体ホルムバールを削除するろ紙上で乾燥させます。
- かみそりの刃を持つホルムバール フィルムから 20 mm × 50 mm の四角形をカットします。
- クリーンの蒸留水をビーカーを記入し、ゆっくりと映画をオフにフロートするために水に垂直方向にスライドを突入: フィルムは水面に浮かぶべきであります。
- 光沢のあるフィルム上のグリッドを場所乾燥アセトン洗浄が立ち向かいます。
- グリッドのいくつかの上に丸いガラス coverslip (Ø 12 mm) を配置します。この coverslip の膜厚を測定するのに役立つでしょう (手順 2 を参照)。
- それに合うようにサイズ変更された白いステッカーで顕微鏡スライドをカバーします。映画全体がスライドに準拠してまでフローティング ホルムバール フィルムの境界線に垂直方向にスライドを浸しなさい。ろ紙をスライドから余分な水分を削除して、それは室温で一晩乾燥させてください。
2. 膜厚の測定
- ピンセットでスライドからそれをデタッチする、coverslip の周りホルムバールをカットします。
- ペンで、coverslip の下のグリッドの位置をマークします。
- Coverslip からデタッチするマーク グリッドの周りホルムバールをカットします。したがって、穴残りホルムバール シートで、膜厚を測定することができます。PBS の coverslip をカバーし、顕微鏡のスライド ガラスの上に置きます。
- ゴールデン ストライプ春の先端に表示されないかどうかを確かめて、原子間力顕微鏡ガラス ブロックのシリコン窒化カンチレバーをマウントします。
注: 感度とカンチレバーのばね定数する必要があります以前較正されて PBS で。 - AFM モジュール上にガラス ブロックをマウントし、顕微鏡の上にモジュールを配置します。
- 観測室ホルムバール コーティング coverslip を置き、500 μ L の PBS でそれをカバーします。
- コンタクト モードと 0.5 nN の力セット ポイントで原子間力顕微鏡を用いたホルムバール シートの穴の境界線をスキャンします。
- 高さ測定の参照としてガラス coverslip 表面を使用し、断面の高さとホルムバール厚を評価 (実行ホルムバール バッチごとの少なくとも 10 測定)。
3. グリッド上のセルのシード
- 無菌フードの下で上、両面粘着テープのストリップ (12 mm × 3 mm) を配置します。
- ホルムバール コーティング グリッドをピンセットで切り取って逆さまに接着剤ストリップ (グリッドの縁のみがテープに接続する必要があります)。ホルムバール フィルムは、coverslip に直面する必要があります。
- まあ文化にこのデバイスを置きます。
- ひと単球16から区別される 10 の4大食細胞を含む FCS なし RPMI の 10 μ L の液滴を配置します。
注: を確認ホルムバール コーティングの損傷を防ぐためにピペット チップでグリッドに触れないようにします。 - (37 ° C、5% CO2) 細胞付着させる 30 分間インキュベートします。
- 2 ml の 10% の FCS を含む RPMI の井戸を埋めます。
- 細胞の AFM 観察する前に付着する CO2を 5% と 37 ° C で 2 時間デバイスを孵化させなさい。
4 Podosome 誘起変形の地形計測
- ガラス底ペトリ皿に倍増した両面粘着テープの 2 つのストリップを固執します。
2 つのストリップ間の距離はグリッドの直径よりも小さくなる必要があります。 - 慎重に粘着テープからマクロファージとメッキ グリッドをデタッチします。
- 裏返して、グリッド セルをガラスに直面するために、2 つの接着剤のストリップ間グリッドを固執します。
- 2 つのグリッドは、新しい倍増両面接着剤のストリップ修正: AFM チップにアクセス可能なグリッドの中央の領域を残して 2 つの接着剤ストリップしたがってサンドイッチされ、グリッド。
グリッドが固定もあり、ねじれていない; 注: を確認します。そうでなければ AFM カンチレバーはホルムバール表面に近づくことができるかもしれない。 - 10 mM HEPES (pH 7.4) を添加した予熱の 37 ° C 培養液 (10 %fcs と RPMI) 2 mL をシャーレをご記入ください。
- 37 ° C 皿ヒーターに培養皿を置きます。
- 原子間力顕微鏡ステージ上皿ヒーターをインストールします。
- 37 ° C で安定化システムします。
- 0.5 nN の力で接触モード エキスタチンを検索する最初のグローバル イメージを作成し、ホルムバール地形 3 Hz で約 20 nm 大ピクセルします。
メモ: は、グリッドの端近くをスキャンしないでください。
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Representative Results
上記のプロトコルでは、マクロファージ エキスタチン ホルムバール基板上で前突荷重を定量化する実験のセットアップを準備する方法について説明します。これは原子間力顕微鏡を使って実現されますが、図 1に示します。
エキスタチン JPK データ処理ソフトウェアを使用しての下の膨らみの地形イメージを分析する場合、3 次多項式適合は各スキャン ラインから独立して減算する必要があります。Podosome 誘起バンプの高さの最大値は、画像の側に z カラー スケールを追加することによって評価できます。TIFF 形式でエクスポートされた後、三次元地形画像では専用自家製 ImageJ マクロ利用可能なオンライン8を使用してをさらに解析します。このマクロは修正された高さイメージ上の膨らみが決まりし、力マップ (図 2) を生成によるとパラメーターを与えられた: ホルムバール フィルムの厚さと podosome リングの半径。さらに、マクロもホルムバール表面に各検出されたバルジの座標、高さ計算力の値とテキストのファイルを生成します。
このプロセスは、時間経過の買収の場合も適用されます。マクロ、トラック各膨らみ中間時点から以降と後方に疑義が生じた場合、ユーザーの検証を要求します。
図 1: 実験のセットアップ
実験装置の模式図。セルは薄い、準拠ホルムバール皮膜で被覆された電子顕微鏡グリッドにシードし、グリッドを配置すると、下向き、シャーレ内のセル。基板に付着すると、マクロファージはエキスタチンと呼ばれるサブミクロン非常にダイナミックな接着構造を形成します。セルの下にあるホルムバール フィルムの地形は AFM を用いたイメージを作成です。Podosome は、その表面に膨らみ、基板に直交の力を適用します。
図 2: 基質の変形やエキスタチンによって力
たわみ (左側のパネル) と高さ (中央のパネル、高さの色コード) を示す細胞の逆側ホルムバール フィルムの地形。映画で観察されたバルジは、個々 エキスタチンによって変形に対応します。各 podosome によって適用されるフォースがモデルによって評価される (正しいパネルで、1 つの podosome に対応する各スポットとフォース値は色分けされて)。スケール バー: 5 μ m。
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Discussion
材料特性
ホルムバール、私たちのケースで、変形可能な膜材料の選択は、いくつかの要件を満たす必要があります。材料必要がある可視光線を通す、明視野と蛍光顕微鏡で観察できるように限られた自己蛍光を展示します。薄膜の粗さは、10 をかなり下回っている必要があります nm 細胞接着に対する任意の地形の影響を避けるために、AFM イメージングによる細胞突起のクリアな観察を許可します。最後に、膜のヤング率と材料の厚さに依存する剛性が podosome サイトで発生する典型的な応力のいくつかの観察可能な変形性能を維持しながらエキスタチンの形成を誘導するのに十分高いする必要があります。周りが 10-100 kPa。ホルムバール素材、30-80 nm の薄膜の準備は、これらすべての制約との間の良い妥協点です。ホルムバール膜の厚さを調整することにより、剛性をエキスタチン7の力覚の特性を研究し調整できることに気づいて価値があります。
再現性とホルムバール準備の質
ホルムバールのいくつかのバッチ グリッド上のひだを提示し、そのためは使用できません: このあらかじめ明視野画像を見られるかもしれない。私たちの経験では必要があります複数のグリッド 1 つの条件グリッド移動または取得時のグリッドの実装は完璧ではないのでツイストします。ホルムバール フィルムの厚みは、予想される力に適応する必要があります。膜厚が厚くよりスピーディーしますですが、より低い変形、観測を困難にします。逆に、薄いフィルムより壊れやすいです、それを引き裂くことがなく操作するより困難。
地形計測カンチレバーによって適用されるフォースの影響
Podosome のナノ力学的活動に影響を与えるまたは AFM 探針を用いたフィルムを変形せずフィルム変形の測定を取得するには、制御力 AFM イメージング中に適用することが重要です。確かに、イメージング中に無理な力を適用する突起高さとこうして突起力過大につながる可能性があります。つまり、突出のサイトの失速の力をはるかに下回るこの力を制限する必要があります。応用力の周り数百ピコ ニュートンのイメージ投射の間に制限することをお勧めします。
突起力評価のためのモデル
AFM 地形計測をフォース値に変換するには、必要がある境界条件を定義し、力の空間構成を知っています。エキスタチン、場合提案するモデル分子組織の現在の知識に基づいて、このモデルが変形プロファイル地形観測8と一貫性を提供されることを確認します。正確には、基板を押して中央モジュールとそれを引っ張る周辺モジュールとして接着性蛋白のリングに囲まれた垂直のアクチン フィラメントの重合の密度の高い核をモデル化。力-変形角関係につながる有限要素シミュレーション機能これら 2 つのモジュールによる基板の変形が決定されました。この手法のおかげで力-変形角関係に及ぼす各幾何学的パラメーターを特徴と、正確に測定するために必要なリングの直径と基板の厚さのを示します。基板のバルジの高さhとF 1 podosome によって適用に表されることがあります力の関係F = C0 E/(1 υ2) e3/r2 h、どこで E = 2.1 GPa はホルムバールのヤングυ = 0.3 のポアソン比7C0は 2.7 に等しい定数とeとrそれぞれ示すフィルムの厚さと podosome 半径8。各条件rの平均値はエキスタチンの蛍光画像から得られました。
突起力顕微鏡の応用
突起力顕微鏡は収益性の高い podosome 力生成の特定の蛋白質の重要性をテストし、podosome リング18の力学的役割を示す力の時空間的相関を明らかにする大食細胞で使用されました。エキスタチン8のネットワーク内に近い隣国間の世代。
いくつかの生物学的プロセスの環境に突出する細胞が見つかっています。侵襲性の腫瘍細胞は、細胞外マトリックス分解19に不可欠なそのと呼ばれる前方の構造を使用します。リンパ球は、内皮細胞に内皮細胞20を介して、transcellular 漏出時に突出する示されています。また、突出構造携帯依存細胞間相互作用のいくつかのインスタンス: これは内皮細胞21、T 細胞の抗原認識と多核巨細胞破骨細胞または細胞をもたらす細胞融合の開始のためのケース22,23,24します。 最後に、内部プロセス アクチンによる貪食使用携帯構造ターゲットの周りプロジェクトなどボディ25。構造の突出によって生成された力を勉強しては確かにこれらのプロセスの中で遊んでメカニズムに光を当てるを助けるが。
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Disclosures
利害の対立が宣言されていません。
Acknowledgments
著者は、ビデオ撮影と編集の初期活動をこの仕事とマチュー ・ サンチェスとフランソワーズ Viala アンナ Labernadie、ギヨーム ・ Charrière、パトリック ・ Delobelle に感謝しています。この作業は、l ' アジャンス ナシオナル デ ラ凝った (ANR14-CE11-0020-02)、ラ財団注ぐラ凝った Médicale (FRM DEQ2016 0334894)、INSERM 計画がん、財団トゥールーズがんや人間科学フロンティア (RGP0035/2016) によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 200 mesh nickel grids | Electron Microscopy Sciences | G200-Ni | |
| Filter paper | Sigma-Aldrich | 1001-055 | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 10235612 | |
| White stickers 26 x 70 mm | Avery | DP033-100 | |
| Film casting device with valve in its outlet | Electron Microscopy Sciences | 71305-01 | |
| Razorblades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
| Ethanol | VWR | 1.08543.0250 | |
| Acetone | VWR | 20066.321 | |
| Formvar 0.5% solution in ethylene dichloride | Electron Microscopy Sciences | 15820 | |
| 12 mm coverslips | VWR | 631-0666 | |
| Inverted microscope | Carl Zeiss | Axiovert 200 | |
| Atomic Force Microscope | JPK Instruments | NanoWizard III | |
| Temperature-controlled sample holder | JPK Instruments | BioCell | |
| Silicon nitride cantilever with a nominal spring constant of 0.01 N/m | Veeco Instruments | MLCT-AUHW | |
| PBS | Gibco | 14190-094 | |
| Double-sided adhesive tape | APLI AGIPA | 118100 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 31870-025 | |
| FCS | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| 35 mm glass-bottom Petri dishes | WPI | FD35-100 |
References
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