Summary
Aqui, detalhamos as técnicas experimentais utilizadas para avaliar as forças de saliência que podosomes aplicar sobre um filme compatível, desde a preparação do filme para a análise automatizada de imagens topográficas.
Abstract
Em inúmeros contextos biológicos, células animais precisam interagir fisicamente com o seu ambiente através do desenvolvimento de forças mecânicas. Entre estes, as forças de tração foram bem caracterizadas, mas há uma falta de técnicas que permite a medição de protrusão forças exercidas pelas células ortogonalmente à sua carcaça. Nós projetamos uma instalação experimental para medir as forças de protrusão exercidas pelas células aderentes em sua carcaça. Células banhadas em uma folha de Formvar compatível com deformam o substrato e a topografia resultante é mapeada por microscopia de força atômica (AFM) à escala nanométrica. Valores de força então são extraídos de uma análise do perfil deformação baseado na geometria das estruturas celulares cêntrica. Portanto, as forças exercidas pelas unidades individuais salientes de uma célula viva podem ser medidas ao longo do tempo. Esta técnica permitirá que o estudo da geração de força e sua regulação em muitos processos celulares que envolvem protrusão. Aqui, descrevemos o seu aplicativo para medir as forças cêntrica geradas por podosomes formado por macrófagos humanos.
Introduction
As células animais interagirem fisicamente com a matriz e as outras células que constituem o seu ambiente1. Isso é necessário para que eles migram, internalizar os corpos, adquirir informações externas ou diferenciar. Em tais processos, a célula deve gerar forças mecânicas e, como numerosos estudos têm demonstrado ao longo dos últimos anos, a capacidade de uma célula para gerar forças e sonda ambiente influencia seu comportamento biológico, dirigindo por exemplo proliferação ou diferenciação de2,3. Por sua vez, a medição de forças celulares é uma grande ajuda para estudar o Regulamento de geração de força e entender a sua implicação na célula destino4,comportamento e tecido5.
Últimos anos têm testemunhado o desenvolvimento de inúmeras técnicas para medir as forças que uma célula pode exercer sobre seu ambiente6. A maioria destes têm sido fundamentais para revelar que a tração forças que células exercem como eles puxam em sondas móveis ou um substrato deformável. No entanto, as forças mecânicas envolvidas em protrusão no ambiente extracelular sofrem com a falta de técnicas de medição e são até à data não bem caracterizada.
Para contornar essa limitação, apresentamos um método para medir forças exercidas ortogonalmente ao substrato. Ela consiste no chapeamento de células vivas em uma folha fina e elástica que pode deformar-se na direção ortogonal, tornando possível medir a deformação do substrato pelas células e deduzir as forças envolvidas. Topografia de substrato é medida com resolução nanoescala usando microscopia de força atômica e a avaliação das forças de deformação baseia-se no conhecimento da geometria do cêntrica estruturas celulares7,8, 9.
Aqui, descrevemos a configuração e a sua aplicação para medir as forças geradas pela podosomes, estruturas de adesão cêntrica formadas por macrófagos para sua migração mesenquimal em ambientes tridimensionais10,11, 12,13,14,15,16,17. Acreditamos que esta técnica vai avançar a compreensão da geração de força e sua regulação em muitos processos celulares que envolvem protrusão.
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Protocol
1. preparação de grades Formvar-revestido
- Limpar grelhas de microscopia eletrônica com acetona pura e secá-las com papel de filtro. Em seguida, limpe uma lâmina de microscópio com etanol puro, limpe com um papel de lente e retire a poeira com um ventilador.
- Coloque uma lâmina de vidro limpa de etanol verticalmente no funil de um dispositivo de fundição de filme contendo uma solução de Formvar na parte inferior. Cubra a parte superior do funil.
- Bomba de 100 mL de solução de Formvar (0,5% de dicloreto de etileno) com o bulbo atomizador até o nível atingir dois terços do slide.
- Manter a corrediça na solução por 1 min.
- Abra a válvula do dispositivo para drenar a solução de Formvar em um fluxo constante. Uma taxa de fluxo de 10 a 15 mL/s irá produzir um filme de Formvar de 30-80 nm. A espessura do filme é determinada pela concentração da solução de Formvar e pela taxa de drenagem.
Nota: A taxa de drenagem pode ser controlada por abrindo lentamente a válvula de ventilação a pressão através da válvula de ar-para fora. A drenagem mais rápida, mais grosso o filme. Na prática, porque é difícil de prever a espessura da película da taxa de fluxo de Formvar, preparamos vários lotes de Formvar filmes e controlar sua espessura por AFM (consulte a etapa 2). - Remover o slide da câmara e secar delicadamente o papel de filtro para remover qualquer líquido Formvar.
- Corte um retângulo de 20 x 50 mm do filme Formvar com uma lâmina de barbear.
- Encha um copo com água destilada limpa e lentamente mergulhar o slide verticalmente na água a flutuar fora do filme: o filme deve flutuar na superfície da água.
- Grades de acetona-limpo secos lugar no filme, brilhante face para cima.
- Coloque algumas das grades de uma lamela de vidro redonda (Ø 12 mm). Esta lamela servirá para medir a espessura da película (consulte a etapa 2).
- Cobri uma lâmina de microscópio com um adesivo branco redimensionado para ajustá-lo. Mergulhe o slide verticalmente na fronteira do filme Formvar flutuante até o filme inteiro adere ao slide. Remover o excesso de água do slide com papel de filtro e deixe secar à temperatura ambiente durante a noite.
2. medição de espessura de filme
- Corte o Formvar próximo a lamela com uma pinça para desconectá-lo do slide.
- Marque a localização da grade sob a lamela com uma caneta.
- Corte o Formvar em torno da grade marcada para desconectá-lo da lamela. Portanto, haverá um buraco na folha Formvar restante, que permitirá medir a espessura da película. Cobrir a lamela com PBS e coloque-a sobre uma lâmina de vidro no microscópio.
- Monte um cantilever de nitreto de silício sobre o bloco de vidro AFM, certificando-se que a listra dourada não é coberta pela ponta da primavera.
Nota: A sensibilidade e a constante de mola do cantilever devem ter anteriormente foi calibrados em PBS. - Montar o bloco de vidro para o módulo AFM e em seguida, coloque o módulo no microscópio.
- Colocar a lamela Formvar revestido na câmara de observação e cubra-o com 500 µ l de PBS.
- Digitalize a borda do buraco na folha de Formvar usando o AFM em modo de contato e um ponto de ajuste de força nN 0,5.
- Usar a superfície da lamela de vidro como a referência para medições de altura e avaliar a espessura de Formvar como a altura da secção transversal (executar pelo menos 10 medidas por lote de Formvar).
3. semeadura de células nas grades
- Sob uma capa estéril, colocar uma faixa (12 x 3 mm) de fita adesiva dupla-face sobre uma lamela.
- Cortar uma grade Formvar revestido com uma pinça e colocá-lo de cabeça para baixo sobre a fita adesiva (apenas o aro da grade deve ser anexado à fita). O filme de Formvar precisa encarar a lamela.
- Colocar este dispositivo em uma cultura bem.
- Coloque uma gota de 10 µ l de RPMI sem FCS contendo 104 macrófagos diferenciados de monócitos humanos16.
Nota: Certifique-se de não tocar na grelha com a ponta da pipeta para não danificar o revestimento de Formvar. - Incube durante 30 min (37 ° C, 5% CO2) para permitir que células aderem.
- Encha o poço com 2 mL de RPMI contendo 10% FCS.
- Incube o dispositivo para 2 h a 37 ° C e 5% CO2 deixar células aderem antes observação AFM.
4. topografia medições das deformações induzida por Podosome
- Cole duas tiras de fita adesiva duplicou face um fundo de vidro, placa de Petri.
Nota: A distância entre as duas tiras deve ser menor que o diâmetro da grade. - Cuidadosamente retire a grade chapeada com macrófagos da fita adesiva.
- Vire a grelha invertida para que as células de frente para o vidro e enfiar a grade entre as duas tiras adesivas.
- Fix a grade com duas novas tiras de adesivo duplicou face: grade assim vai ser imprensada entre duas tiras de adesivo, deixando a área central da grade acessível à ponta AFM.
Nota: Certifique-se que a grade está bem fixo e não torcido; caso contrário o cantilever AFM não poderá se aproximar da superfície Formvar. - Encha o prato de Petri com 2 mL de meio de cultura previamente aquecida a 37 ° C (RPMI com 10% de FCS) suplementado com 10 mM HEPES (pH 7,4).
- Coloque o prato de cultura em um aquecedor de prato de 37 ° C.
- Instale o aquecedor de prato no palco AFM.
- Deixe o sistema estabilizar a 37 ° C.
- No modo de contato com uma força de 0,5 nN, fazer uma primeira imagem global para localizar podosomes e depois digitalizar a topografia de Formvar a 3 Hz com um pixel aproximadamente 20 nm-grande.
Nota: Evite varredura perto das bordas da grade.
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Representative Results
O protocolo acima descreve como preparar a instalação experimental para quantificar as forças de protrusão aplicadas pelos macrófagos podosomes sobre um substrato de Formvar. Isto é conseguido usando AFM e é ilustrado na Figura 1.
Ao analisar uma imagem topográfica de protuberâncias abaixo podosomes usando o software de processamento de dados JPK, um polinômio de terceiro grau se encaixam convém subtrair cada linha de varredura independentemente. A altura máxima de colisões podosome-induzida pode ser avaliada pela adição de uma escala de cores de z no lado da imagem. Após ser exportados no formato TIFF, a imagem topográfica é mais analisada usando um dedicado caseiro ImageJ macro disponível on-line8. Essa macro localiza protuberâncias na imagem corrigida de altura e produz um mapa de força (Figura 2) de acordo com dados de parâmetros: raio de anel Formvar filme espessura e podosome. Além disso, a macro também produz um arquivo de texto com as coordenadas, altura e força computada valor para cada protuberância detectado na superfície Formvar.
Esse processo também se aplica no caso de aquisições de lapso de tempo. A macro então rastreia cada protuberância do ponto de tempo médio em diante e para trás, solicitando a validação do usuário, se surgir alguma dúvida.
Figura 1 : Instalação experimental
Ilustração esquemática da instalação experimental. Células são semeadas em uma grade de microscopia eletrônica, revestida com uma película fina Formvar compatível com e a grade é colocada, células virado para baixo, dentro de uma caixa de Petri. Quando aderindo a um substrato, os macrófagos formam estruturas de adesão altamente dinâmico de submicron chamadas podosomes. A topografia do filme Formvar sob as células então é fotografada usando AFM. Podosome aplicar forças ortogonais ao substrato, que resultam em protuberâncias em sua superfície.
Figura 2 : Deformação de substrato e forças exercidas por podosomes
Topografia do filme Formvar no lado inverso das células mostrando a deflexão (painel esquerdo) e altura (painel do meio, códigos de cores para a altura). As protuberâncias observadas no filme correspondem a deformação por podosomes individuais. A força aplicada por cada podosome é avaliada pelo modelo (painel à direita, cada ponto corresponde a um podosome e força os valores são codificados por cores). Barra de escala: 5 µm.
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Discussion
Propriedades do material
A escolha do material para a membrana deformável, no nosso caso Formvar, precisa cumprir alguns requisitos. O material deve ser transparente à luz visível e apresentam fluorescência auto limitada para permitir as observações em campo claro e microscopia de fluorescência. A rugosidade do filme fino deve estar abaixo de 10 nm para evitar qualquer efeito topográfico na adesão celular e para permitir a observação clara das saliências induzida por célula por imagens de AFM. Finalmente, a rigidez da membrana, que depende do módulo de Young e espessura do material, precisa ser alto o suficiente para induzir a formação de podosomes, mantendo alguns deformabilidade observável para as típicas tensões geradas em sites podosome que são em torno de 10-100 kPa. Material de Formvar, preparado em filmes finos de 30-80 nm é um bom compromisso entre todas essas restrições. Vale notar que, por meio do ajuste da espessura da membrana Formvar, sua rigidez pode ser ajustado para estudar as propriedades de mechanosensing de podosomes7.
Reprodutibilidade e qualidade da preparação de Formvar
Alguns lotes de Formvar apresentar dobras na grelha e são, portanto, inutilizáveis: isto pode ser visto previamente em imagens de campo brilhante. Em nossa experiência, temos múltiplas grades para uma condição porque às vezes a montagem da grade não é perfeita e a grade se move ou fica torcido. A espessura do filme Formvar precisa ser adaptado à força esperada. É mais grosso do filme, a mais aguerrida, mas menor as deformações será, dificultando a observação. Por outro lado, quanto mais fino o filme, o mais frágil é e o mais difícil de manipular sem rasgar.
Influência da força aplicada pelo cantilever em medições de topografia
Para obter uma medição da deformação filme sem afetar a nanomechanical atividade da podosome ou deformar o filme com a sonda AFM, é crucial para o controle das forças aplicadas durante a imagem latente de AFM. Com efeito, aplicar força excessiva durante a imagem latente pode levar a uma superestimação da protrusão altura e, portanto, da força de protrusão. Em outras palavras, há uma necessidade de limitar essa força muito abaixo da força da tenda do site saliente. É recomendável limitar as forças aplicadas durante a imagem latente em torno de algumas centenas de pico-newtons.
Modelo para avaliação de força de protrusão
Para converter medidas topográficas AFM em valores de força, é necessário definir as condições de contorno e de saber a configuração espacial de aplicação de força. No caso de podosomes, propusemos um modelo baseado no conhecimento atual da sua organização molecular e verificou que este modelo forneceu perfis de deformação consistentes com observações topográficas8. Mais precisamente, nós modelado denso núcleo de polimerização de filamentos de actina vertical circundados por um anel de proteínas de adesão como um módulo central, empurrando o substrato e um módulo periférico empurrá-la. Deformação de substrato por estes dois módulos agindo foi determinada utilizando simulações de elementos finitos, levando a uma relação de força-deformação. Graças a essa abordagem numérica, temos caracterizada a influência de cada parâmetro geométrico sobre a relação de força-deformação, mostrando que espessura de diâmetro e substrato de anel precisava ser medidos precisamente. A relação entre a altura h de uma protuberância no substrato e a força F aplicada por um podosome pode ser expressa como F = C0 E / (1-υ2) e3/r2 h, onde E = 2.1 GPa é o módulo de Young de Formvar e υ = 0,3 sua relação de Poisson7, C0 é uma constante igual a 2,7 e e e r denotam respectivamente filme espessura e podosome raio8. Para cada condição, o valor médio de r foi obtido imagens de fluorescência de podosomes.
Aplicações da microscopia de força de protrusão
Microscopia de força de protrusão foi utilizada lucrativamente em macrófagos para testar a importância das proteínas específicas na geração de força podosome, demonstrar o papel mecânico do anel podosome18 e revelar correlações espaço-temporal da força geração entre vizinhos dentro da rede de podosomes8.
As células foram encontradas para se projetar em seu ambiente em vários processos biológicos. As células do tumor invasivo usam movimentos protusivos estruturas chamadas invadopodia, que são essenciais para a degradação de matriz extracelular19. Linfócitos foram mostrados para projetam-se em células endoteliais durante sua transcellular diapedese através do endotélio20. Algumas instâncias de interação célula-célula também contam com celulares salientes estruturas: Este é o caso de reconhecimento de antígeno de células T em células endoteliais21e de início de fusão celular que leva para osteoclastos multinucleados ou myotubes 22 , 23 , 24. finalmente, os processos de internalização como celular de uso de fagocitose baseada em actina estruturas esse projeto ao redor do alvo corpo25. Estudar as forças geradas pelos salientes estruturas certamente vai ajudar a lançar luz sobre os mecanismos em jogo nestes processos.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Os autores agradecem a Anna Labernadie, Guillaume Charrière e Patrick Delobelle pela sua contribuição inicial para este trabalho e Matthieu Sanchez e Françoise Viala por sua ajuda com filmagem e edição de vídeo. Este trabalho tem sido apoiado pela L'Agence Nationale de la Recherche (ANR14-CE11-0020-02), la de derramar Fondation de la Recherche Médicale (FRM DEQ2016 0334894), INSERM plano de câncer, câncer de Toulouse Fondation e humano Frontier Science Program (RGP0035/2016).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 200 mesh nickel grids | Electron Microscopy Sciences | G200-Ni | |
| Filter paper | Sigma-Aldrich | 1001-055 | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 10235612 | |
| White stickers 26 x 70 mm | Avery | DP033-100 | |
| Film casting device with valve in its outlet | Electron Microscopy Sciences | 71305-01 | |
| Razorblades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
| Ethanol | VWR | 1.08543.0250 | |
| Acetone | VWR | 20066.321 | |
| Formvar 0.5% solution in ethylene dichloride | Electron Microscopy Sciences | 15820 | |
| 12 mm coverslips | VWR | 631-0666 | |
| Inverted microscope | Carl Zeiss | Axiovert 200 | |
| Atomic Force Microscope | JPK Instruments | NanoWizard III | |
| Temperature-controlled sample holder | JPK Instruments | BioCell | |
| Silicon nitride cantilever with a nominal spring constant of 0.01 N/m | Veeco Instruments | MLCT-AUHW | |
| PBS | Gibco | 14190-094 | |
| Double-sided adhesive tape | APLI AGIPA | 118100 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 31870-025 | |
| FCS | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| 35 mm glass-bottom Petri dishes | WPI | FD35-100 |
References
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