Summary
여기, 우리 podosomes 지형 이미지의 자동 분석 영화의 준비에서 규격 필름에 적용 되는 돌출 세력을 평가 하는 데 사용 하는 실험 기법을 상세하게.
Abstract
수많은 생물학 문맥에서 동물 세포를 기계적인 힘을 개발 하 여 그들의 환경과 물리적으로 상호 작용 해야 합니다. 이러한 가운데, 견인 힘 잘 성격을 나타낸, 하지만 그들의 기판에 기가 세포에 의해 발휘 된 돌출 힘의 측정을 허용 하는 기술의 부족. 우리는 그들의 기질에 부착 세포에 의해 발휘 된 돌출 힘을 측정 하는 실험 설치 설계. 셀 규격 Formvar 시트에 도금이 기판 변형 하 고 결과 지형 나노미터 스케일에 원자 힘 현미경 (AFM)으로 매핑됩니다. 강제 값 다음 밀어내 세포 구조의 형상에 따라 변형 프로 파일의 분석에서 추출 됩니다. 따라서, 살아있는 세포의 개별 튀어나온 단위에 의해 발휘 된 힘은 시간이 지남에 따라 측정할 수 있습니다. 이 기술은 힘 생성 및 돌출을 포함 하는 많은 세포질 과정에 그것의 규칙의 연구를 수 있게 된다. 여기, 우리 인간의 세포에 의해 형성 하는 podosomes에 의해 생성 된 밀어내 힘을 측정 하는 응용 프로그램을 설명 합니다.
Introduction
동물 세포 매트릭스와 그들의 환경1을 구성 하는 다른 세포와 물리적으로 상호 작용. 이것이, 시체를 내 면화, 외부 정보를 마이그레이션하거나 차별화 그들을 위해 필요 합니다. 그런 과정에서 셀 기계적인 힘을 생성 해야 합니다 및 힘을 생성 하 고 환경 조사에 셀의 능력 영향 확산 예를 들어 감독의 생물 학적 행동으로 수많은 연구 최근 몇 년 동안, 또는 차별화2,3. 차례로, 세포의 힘의 측정 힘 세대의 규정을 연구 하 고 셀 행동과 조직의 운명4,5에 그것의 연루를 이해 주요 원조 이다.
최근 몇 년 동안 셀의 환경6에 행사할 수 있는 힘을 측정 하기 위해 수많은 기술의 개발을 목격 했다. 이들의 대부분 공개 견인 힘 세포 그들은 모바일 프로브 또는 변형 기판에 끌어 발휘 하는 수단이 되었습니다. 그러나, 기계적인 힘 extracellular 환경으로 돌출에 관련 된 측정 기술의 부족에서 고통 되며 날짜 잘 특징.
이 제한을 극복 하기 위해 우리는 기가 기판에가 해지는 힘을 측정 하는 방법을 제시. 그것은 도금을 측정 하는 세포에 의해 기판 변형 고 참여 세력을 추론할 수 직교 방향으로 변형 수 얇은 탄성 시트에 살아있는 세포로 구성 되어있습니다. 기판 지형 나노 분해능 원자 힘 현미경 검사 법을 사용 하 여 측정 되 고 밀어내 세포 구조7,8, 의 기하학의 지식에 의존 하는 변형에서 세력의 평가 9.
여기, 우리는 설치 및 podosomes, 밀어내 접착 구조 3 차원 환경10,11, 그들의 엽 마이그레이션에 대 한 대 식 세포에 의해 형성 된에 의해 생성 된 힘을 측정 하는 응용 프로그램 설명 12,13,14,15,,1617. 우리는이 기술은 힘 생성 및 돌출을 포함 하는 많은 세포질 과정에 그것의 규칙의 이해를 미리 것입니다 믿습니다.
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Protocol
1입니다. 격자 Formvar 코팅의 준비
- 순수한 아세톤과 전자 현미경 격자를 청소 하 고 필터 종이에 그들을 건조. 다음 깨끗 한 순수 에탄올, 현미경 슬라이드 렌즈 종이로 닦 고는 송풍기와 먼지를 제거.
- 하단 부분에 Formvar의 솔루션을 포함 하는 영화 캐스팅 장치의 퍼 널에 에탄올 청소 유리 슬라이드를 수직으로 놓습니다. 깔때기의 정상을 커버.
- 수준 슬라이드의 2/3에 도달할 때까지 분무기 전구와 Formvar 솔루션 (에틸렌 dichloride에 0.5%)의 100 mL를 펌프.
- 1 분 동안 솔루션에 슬라이드를 유지.
- 꾸준한에 Formvar 솔루션 드레인 장치 밸브를 엽니다. 15 mL/s 10의 유량 30-80 nm의 Formvar 영화를 얻을 것입니다. 영화의 두께 Formvar 용액의 농도 배수 장치 비율에 의해 결정 됩니다.
참고: 배수 속도는 압력 을 통해 공기를 밖으로 밸브 밸브를 천천히 열어 배기에 의해 제어할 수 있습니다. 빨리 배수, 두꺼운 영화. 실제로, Formvar 유량에서 필름 두께 예측 하기 어렵기 때문에 우리 Formvar 영화의 여러 배치를 준비 하 고 AFM에 의해 그들의 두께 제어 (단계 2 참조). - 상공에서 슬라이드를 제거 하 고 섬세 하 게 어떤 액체 Formvar 제거 하려면 필터 종이에 그것을 건조.
- 면도날으로 Formvar 영화에서 20 m m x 50 m m 사각형으로 잘라.
- 깨끗 한 증류수로 비 커를 천천히 빠지게 슬라이드 수직으로 영화에서 부동 물: 영화 물 표면에 플 로트 해야 합니다.
- 영화, 빛나는 장소 건조 아세톤 청소 격자 얼굴.
- 라운드 유리 coverslip (Ø 12 mm) 격자의 몇 가지에 배치 합니다. 이 coverslip 필름 두께 측정 될 것입니다 (2 단계 참조).
- 그것에 맞게 크기 조정 흰색 스티커와 현미경 슬라이드를 커버. 전체 영화 슬라이드에 준수 될 때까지 부동 Formvar 영화의 테두리에서 수직으로 슬라이드를 찍어. 필터 종이 슬라이드에서 과잉의 물을 제거 하 고 실 온에서 하룻밤 말리.
2입니다. 두께의 측정
- 주위는 coverslip Formvar 슬라이드에서 그것을 분리 하는 핀셋으로 잘라.
- 펜으로는 coverslip 아래의 표에서의 위치를 표시 합니다.
- coverslip에서 그것을 분리 하는 표시 된 그리드 주위 Formvar 잘라. 있을 것입니다 따라서 구멍 나머지 Formvar 시트, 필름 두께 측정할 수 있게 됩니다. PBS 가진 coverslip 커버 하 고 현미경, 유리 슬라이드에 배치.
- AFM 유리 블록, 골든 스트라이프 봄의 끝에 의해 포함 되지 않는 다는 것을 확인에 실리콘 나이트 라 이드 캔틸레버를 탑재 합니다.
참고: 감도 캔틸레버의 스프링 상수 한다은 이전 조정 되었습니다 PBS에. - AFM 모듈에 유리 블록을 탑재 하 고 모듈 현미경에 놓습니다.
- 관측 실에 Formvar 코팅 coverslip 놓고 PBS의 500 µ L로 그것을 커버 합니다.
- 접촉 모드와 0.5 nN 힘 세트 포인트에서 AFM을 사용 하 여 Formvar 시트에 구멍의 테두리를 검색 합니다.
- 높이 측정, 유리 coverslip 표면 참조로 사용 하 고 횡단면의 높이 Formvar 두께 평가 (Formvar 배치 당 적어도 10 측정을 수행).
3. 시드 셀 격자에
- 살 균 후드는 coverslip에 양면 접착 테이프의 스트립 (12 m m x 3 m m)을 넣어.
- 핀셋으로 Formvar 코팅 그리드 밖으로 잘라내어 (격자의 가장자리에만 테이프에 붙어 있이 필요가) 접착 스트립에 거꾸로 넣어. Formvar 영화는 coverslip 얼굴을 해야 합니다.
- 문화에이 장치를 잘 넣어.
- 장소 104 대 식 세포를 포함 하는 FCS 없이 RPMI의 10 µ L 드롭릿 인간 monocytes16에서 분화 했다.
참고: 확인을 Formvar 코팅의 손상을 방지 하기 위해 피 펫 팁 그리드를 건드리지 않도록 주의. - 30 분 (37 ° C, 5% CO2) 셀 준수를 품 어.
- 10 %FCS 포함 된 RPMI의 2 mL와 잘 작성.
- AFM 관찰 하기 전에 준수 세포를 37 ° C, 5% CO2 에서 2 h에 대 한 장치를 품 어.
4. 지형 변형 Podosome 유도의 측정
- 유리 바닥 페 트리 접시에 두 배로 양면 접착 테이프의 두 스트립을 스틱.
주: 2 개의 지구 사이 거리 격자 직경 보다 작은 이어야 한다. - 신중 하 게 접착 테이프에서 대 식 세포와 도금 그리드를 분리 합니다.
- 뒤집어 그리드 셀 유리를 직면 하 고 있기 위하여 그리고 두 접착제 스트립 사이의 눈금 막대기.
- 수정 2 그리드 새로운 두 배로 양면 접착제의 제거: 그리드 AFM 팁에 액세스할 수는 격자의 중앙 영역을 떠나 두 접착제 스트립 사이 끼여 될 이렇게 것 이다.
참고: 격자 잘 고정 하지 트위스트; 있는지 확인 그렇지 않으면 AFM 캔틸레버 Formvar 표면 접근 수 되지 않을 수 있습니다. - 10 mM HEPES (pH 7.4)와 보충 사전 온수 37 ° C 배양 (RPMI fcs가 10%)의 2 개 mL를 페 트리 접시를 채우십시오.
- 37 ° C 접시 히터에 문화 접시를 놓습니다.
- AFM 무대에 접시 히터를 설치 합니다.
- 37 ° c.에 안정화 시스템
- 0.5 nN 힘으로 접촉 모드에서 podosomes를 찾을 첫 번째 글로벌 이미지를 만들고 약 20 nm 큰 픽셀 3 Hz에서 Formvar 지형 스캔.
참고: 격자의 가장자리 주변을 스캔 하지 마십시오.
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Representative Results
위의 프로토콜 돌출 세력 대 식 세포 podosomes Formvar 기판에 의해 적용 척도를 실험 설치 하는 방법을 설명 합니다. 이 AFM을 사용 하 여 이루어집니다 하 고 그림 1에 나와 있다.
JPK 데이터 처리 소프트웨어를 사용 하 여 podosomes 아래 부푼 것의 지형 이미지를 분석할 때 3도 다항식 적합 해야 공제 하지 각 스캔 라인에서 독립적으로. Podosome 유도 범프의 최대 높이 이미지 측면 z 색 눈금을 추가 하 여 평가 될 수 있다. TIFF 형식으로 수출 되 고, 후 지형 이미지 전용된 집 만든 ImageJ 매크로 사용할 수 온라인8를 사용 하 여 추가 분석 이다. 이 매크로 부푼 것에서 수정된 높이 이미지 및 힘 지도 (그림 2) 수익률에 따라 주어진 매개 변수: Formvar 필름 두께 podosome 반지 반경. 또한, 매크로 Formvar 표면에 각 검색된 돌출에 대 한 좌표, 높이 및 계산된 힘 값 텍스트 파일을 생성 됩니다.
이 프로세스는 또한 시간 경과 인수 경우 적용 됩니다. 매크로 다음 추적 각 돌출 중간 시간 지점에서 앞으로 및 뒤로, 어떤 의혹 든 지 발생 하는 경우 사용자 확인을 요청 합니다.
그림 1 : 실험 설치
실험적인 체제의 구조 그림입니다. 셀은 얇은, 준수 Formvar 필름으로 코팅 하는 전자 현미경 그리드에 시드 고 그리드, 세포 배양 접시 안에, 아래로 향하게 배치 됩니다. 기판에 고착 해 서, 세포 podosomes 이라는 미크론 매우 동적 접착 구조를 형성 합니다. 셀 아래 Formvar 필름의 지 세는 다음 AFM을 사용 하 여 몇 군데. Podosome 표면에 부푼 귀 착될 기판에 직교 세력을 적용 합니다.
그림 2 : 기판 변형 및 podosomes에 의해 발휘 하는 힘
편향 (왼쪽된 패널)과 높이 (중간 패널, 높이 대 한 색상 코드)를 표시 하는 셀의 뒷면에 Formvar 영화 지형 영화에 관찰 bulges 개별 podosomes에 의해 변형에 해당 합니다. 각 podosome에 의해 적용 되는 힘은 모델에 의해 평가 (오른쪽 패널, 각 자리 한 podosome에 해당 하며 힘 값은 색으로 구분 된). 눈금 막대: 5 µ m.
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Discussion
물질의 성질
우리의 경우 Formvar, 변형 막에 대 한 재료의 선택은 몇 가지 요구 사항을 충족 해야 합니다. 자료는 가시 광선에 투명 하 고 밝은 분야 및 형광 현미경 관측을 허용 하도록 제한 된 자동 형광을 전시 해야 합니다. 박막의 거칠기 있어야 잘 10 nm 세포 접착에 있는 지형 효과 방지 하 고 AFM 화상 진 찰에 의해 세포 유도 돌출의 명확한 관측을 허용. 마지막으로, 영의 계수 및 재료의 두께에 따라, 막의 강성 해야 podosome 사이트에서 생성 하는 일반적인 스트레스에 대 한 몇 가지 관찰 deformability를 유지 하면서 podosomes의 형성을 유도 하기 위해 충분히 높은 주위는 10-100 kPa. Formvar 소재, 30-80 nm의 박막에 이러한 모든 제약 사이 좋은 타협 이다. 그것은 그 Formvar 막의 두께 조정 하 여 그 강성 조정 될 수 있다 podosomes7의 mechanosensing 속성을 공부를 알.
재현성 및 Formvar 준비의 품질
Formvar의 몇몇 배치가 격자에 주름을 제시 하 고 따라서 사용할 수 있습니다:이 밝은 필드 이미지에 미리 볼 수 있습니다. 우리의 경험에서 우리가 여러 격자 한 조건에 대 한 때문에 필요로 때로는 격자의 장착은 완벽 한 표나 이동 되 면 트위스트. Formvar 필름의 두께 예상된 힘에 적응 해야 합니다. 두꺼운 필름, 엄격한에 그것은, 하지만 낮은 변형 될, 관측을 더 어렵게 만드는. 반대로, 가장 얇은 영화, 더 깨지기 쉬운 그것은 그리고 그것을 찢 어 하지 않고 조작 하기 어려운.
캔틸레버 지형 측정에 의해 적용 되는 힘의 영향
podosome의 nanomechanical 활동에 영향을 미치는 또는 AFM 프로브와 함께 영화를 변형 없이 영화 변형 측정을 얻으려면, AFM 이미징 동안 적용 제어 세력에 결정적 이다. 실제로, 이미징 동안 과도 한 힘을 적용 한과 돌출 높이 그리고 이렇게 돌출 힘의 발생할 수 있습니다. 즉, 훨씬 아래 튀어나온 사이트의 마구간 힘이이 힘을 제한할 필요가 있다. 피코 뉴턴의 몇 수백 주위 이미징 동안 적용 된 힘을 제한 하는 것이 좋습니다.
돌출 힘 평가 위한 모델
에 변환 하려면 AFM 지형 측정 힘 값, 경계 조건 정의 하 고 강제로 응용 프로그램의 공간 구성을 알고이 필요 하다. Podosomes의 경우 우리는 그것의 분자 기구의 현재 정보에 따라 모델과이 모델 변형 프로필 지형 관찰8일치 제공 확인을 제안 했다. 더 정확 하 게, 우리 polymerizing 수직 걸 필 라 멘 트 중앙 모듈 기판 추진 및 그것에 당기 주변 모듈 접착 단백질의 반지에 의해 포위의 밀도가 핵심 모델링. 행동 하는이 두 모듈 기판 변형 유한 요소 시뮬레이션, 힘-변형 관계에 지도 사용 하 여 결정 했다. 숫자 이렇게 덕분에 우리는 정확 하 게 측정 하는 데 필요한 그 링 직경 및 기판 두께 보여주는 힘-변형 관계에 각 기하학 매개 변수의 영향 특징. 기판에 돌출의 높이 h 와 F 1 podosome에 의해 적용으로 표현 될 수 있습니다 힘의 관계 F = C0 E / (1-υ2) e3/r2 h여기서, E = 2.1 GPa Formvar의 영의 계수는 그리고 υ = 0.3의 포아송 비율7, C0 2.7 일정 평등 이며 e 와 r 각각 필름 두께 podosome radius8나타냅니다. 각 조건에 대 한 연구 의 평균 값은 podosomes의 형광 이미지에서 얻은 했다.
돌출 힘 현미경 검사 법의 응용
돌출 힘 현미경 수익성에 사용 되었다 세포 podosome 힘 생성에 특정 단백질의 중요성을 테스트, podosome 반지18 의 기계적 역할을 설명 및 힘의 spatio 시간적 상관 관계 공개 podosomes8의 네트워크 내에서 가까운 이웃 사이 세대.
셀 여러 생물 학적 과정에 그들의 환경에 내 다 발견 되었습니다. 침략 적인 종양 세포 기질 저하19에 필수적인 invadopodia, 라는 밀어내 구조를 사용 합니다. 림프 톨 그들의 transcellular diapedesis endothelium20동안 내 피 세포로 내 다 보였다. 세포 세포 상호 작용의 경우 또한 휴대 튀어나온 구조에 의존: 이것은 내 피 세포21, T 세포의 항 원 인식에 대 한 경우 셀 퓨전 multinucleated osteoclasts 또는 myotubes는의 개시에 대 한 22 , 23 , 24. 마지막으로, 국제화 프로세스 먹어서 사용 휴대 걸 기반 구조 대상 주위 그 프로젝트와 같은 바디25. 튀어나온 구조에 의해 생성 된 힘을 공부 하 고 확실히이 과정에 놀이에 메커니즘에 도움이 됩니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언.
Acknowledgments
저자는 그들의 초기 기여가이 작품에 Matthieu 산체스와 프랑수 아즈 Viala에 대 한 그들의 비디오 촬영 및 편집에 대 한 애 나 Labernadie, 기욤 Charrière와 패트릭 Delobelle에 감사. 이 작품은 않았나 국립 드 라 Recherche (ANR14-CE11-0020-02), 부 어 라 라 Fondation 검색 Médicale (FRM DEQ2016 0334894), INSERM 계획 암, Fondation 툴루즈 암, 인간 프론티어 과학 프로그램 (RGP0035/2016)에 의해 지원 되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 200 mesh nickel grids | Electron Microscopy Sciences | G200-Ni | |
| Filter paper | Sigma-Aldrich | 1001-055 | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 10235612 | |
| White stickers 26 x 70 mm | Avery | DP033-100 | |
| Film casting device with valve in its outlet | Electron Microscopy Sciences | 71305-01 | |
| Razorblades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
| Ethanol | VWR | 1.08543.0250 | |
| Acetone | VWR | 20066.321 | |
| Formvar 0.5% solution in ethylene dichloride | Electron Microscopy Sciences | 15820 | |
| 12 mm coverslips | VWR | 631-0666 | |
| Inverted microscope | Carl Zeiss | Axiovert 200 | |
| Atomic Force Microscope | JPK Instruments | NanoWizard III | |
| Temperature-controlled sample holder | JPK Instruments | BioCell | |
| Silicon nitride cantilever with a nominal spring constant of 0.01 N/m | Veeco Instruments | MLCT-AUHW | |
| PBS | Gibco | 14190-094 | |
| Double-sided adhesive tape | APLI AGIPA | 118100 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 31870-025 | |
| FCS | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| 35 mm glass-bottom Petri dishes | WPI | FD35-100 |
References
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