Summary
Hier, detail we de experimentele technieken gebruikt om te evalueren van de uitsteeksel krachten die podosomes van toepassing op een compatibele film, vanaf de voorbereiding van de film naar de geautomatiseerde analyse van topografische beelden.
Abstract
In talrijke biologische contexten moeten dierlijke cellen fysiek interageren met hun omgeving door de ontwikkeling van mechanische krachten. Onder deze, tractie krachten goed gekarakteriseerd zijn geweest, maar er is een gebrek aan technieken waardoor de meting van uitsteeksel krachten uitgeoefend door cellen orthogonaal op hun ondergrond. We ontwierpen een experimentele opstelling het uitsteeksel krachten uitgeoefend door Adherente cellen aan hun substraat te meten. Cellen verguld op een compatibele Formvar vel vervormen dit substraat en de resulterende topografie wordt toegewezen door atomaire kracht microscopie (AFM) op de nanometerschaal. Geldende waarden worden vervolgens geëxtraheerd uit een analyse van het profiel van de vervorming op basis van de geometrie van de protrusive cellulaire structuren. Vandaar, de door de individuele vooruitstekende eenheden van een levende cel uitgeoefende krachten kunnen worden gemeten na verloop van tijd. Deze techniek kan de studie van strijdkrachtgeneratie en de verordening in de vele cellulaire processen waarbij uitsteeksel. Hier beschrijven we de toepassing de protrusive krachten gegenereerd door podosomes gevormd door menselijke macrofagen te meten.
Introduction
Dierlijke cellen interactie fysiek met de matrix en de andere cellen die hun omgeving1vormen. Dit is vereist voor hen om te migreren, internaliseren van organen, externe informatie verwerven of differentiëren. In dergelijke processen, de cel mechanische krachten moet genereren en, zoals tal van studies hebben getoond in de afgelopen jaren, de mogelijkheid van een cel te genereren van krachten en sonde zijn omgeving beïnvloedt de biologische werking, leiding bijvoorbeeld proliferatie of differentiatie2,3. Op zijn beurt, is de meting van cellulaire krachten een grote steun te bestuderen van de regulering van de strijdkrachtgeneratie en begrijpen de implicatie in cel gedrag en weefsel lot4,5.
De afgelopen jaren getuige geweest van de ontwikkeling van talrijke technieken voor het meten van de krachten die een cel op de omgeving-6 uitoefenen kan. De meerderheid van deze geweest instrumenteel in het openbaren van dat de tractie dwingt dat cellen uitoefenen als zij trek op mobiele sondes of een vervormbare substraat. Echter de mechanische krachten die betrokken zijn in uitsteeksel in de extracellulaire omgeving lijden onder een gebrek aan meettechnieken en zijn tot nu toe niet goed gekenmerkt.
Om deze beperking ondervangen, presenteren we een methode voor het meten van krachten uitgeoefend orthogonaal op de ondergrond. Het bestaat uit het plating levende cellen op een dunne elastische blad dat in de orthogonale richting vervormen kan, waardoor het mogelijk is om te meten van substraat vervorming door de cellen en het afleiden van de krachten die betrokken zijn. Topografie van het substraat wordt gemeten met de nanoschaal resolutie met behulp van atomaire kracht microscopie en de evaluatie van de troepen uit vervorming is gebaseerd op de kennis van de geometrie van de protrusive cellulaire structuren7,-8, 9.
Hier beschrijven we de opstelling en de toepassing ervan voor het meten van de krachten die worden gegenereerd door podosomes, protrusive hechting structuren gevormd door macrofagen voor hun mesenchymale migratie in driedimensionale omgevingen10,11, 12,13,14,15,16,17. Wij zijn van mening dat deze techniek het begrip van strijdkrachtgeneratie en de verordening in de vele cellulaire processen waarbij uitsteeksel zal vooraf.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bereiding van Formvar beklede rasters
- Elektronenmicroscopie rasters met pure aceton schoon en droog ze op filterpapier. Vervolgens schoon een microscoopglaasje met pure ethanol, veeg met een lens papier en verwijder stof met een blower.
- Plaats een glasplaatje met ethanol-schoongemaakt, verticaal in de trechter van een film gieten apparaat met een oplossing van Formvar in het onderste deel. Betrekking hebben op de top van de trechter.
- Pomp 100 mL oplossing van Formvar (0,5% in ethyleendichloride) met de verstuiver lamp, totdat het niveau tweederde van de dia bereikt.
- Houd de dia in de oplossing voor 1 min.
- Open de klep van het apparaat voor de afvoer van de Formvar-oplossing in een gestage stroom. Een debiet van 10 tot 15 mL/s levert een film van de Formvar van 30-80 nm. De dikte van de film wordt bepaald door de concentratie van de oplossing van de Formvar en het tarief van de riolering.
Opmerking: Het tarief van de drainage kan worden gecontroleerd door de ontluchting de druk via het ventiel lucht-out door het ventiel langzaam te openen. Hoe sneller de drainage, hoe dikker de film. In de praktijk, want het is moeilijk te voorspellen de laagdikte van het debiet van de Formvar, wij bereiden meerdere batches van Formvar films en controle van hun dikte door de AFM (zie stap 2). - Verwijderen van de dia uit de zaal en droog het fijn op filterpapier te verwijderen van een vloeibare Formvar.
- Knip een rechthoek 20 x 50 mm uit de Formvar film met een scheermesje.
- Vul een bekerglas met zuiver gedestilleerd water en langzaam duik de dia verticaal in het water te zweven uit de film: de film moet drijven op het wateroppervlak.
- Plaats droge aceton gereinigd rasters op de film, glanzende onder ogen zien.
- Plaats een ronde glazen dekglaasje aan (Ø 12 mm) op een paar van de rasters. Deze dekglaasje aan zal dienen om de laagdikte te meten (zie stap 2).
- Bedek een microscoopglaasje met een witte sticker aangepast zodat het past. Dompel de dia verticaal aan de grens van de zwevende Formvar film totdat de hele film houdt zich aan de dia. Verwijderen van overtollig water uit de dia met filtreerpapier en laten drogen bij kamertemperatuur 's nachts.
2. meting van de laagdikte
- Snijd de Formvar rond het dekglaasje aan met een pincet om het loskoppelen van de dia.
- De locatie van het raster onder het dekglaasje aan Markeer met een pen.
- Snijd de Formvar rond de gemarkeerde raster om het loskoppelen van het dekglaasje aan. Er zal dus een gat in de resterende Formvar blad, dat toelaten zal om de laagdikte te meten. Bedek het dekglaasje aan met PBS en plaats het op een glasplaatje op de Microscoop.
- Monteer een siliciumnitride cantilever op het AFM glazen blok, ervoor te zorgen dat de gouden streep wordt niet gedekt door het uiteinde van de veer.
Opmerking: De gevoeligheid en de lente-constante van de uitkraging moeten hebben eerder gekalibreerd in PBS. - Monteren van het blok glas op de AFM-module en plaats vervolgens de module naar de Microscoop.
- Plaats de Formvar beklede dekglaasje aan op de kamer observatie en bedek het met 500 µL van PBS.
- Scannen van de rand van het gat in het blad van de Formvar met behulp van AFM in contact modus en een 0.5 nN kracht instelpunt.
- Gebruik het glasoppervlak dekglaasje aan als de referentie voor hoogte metingen, en evalueren van de dikte van de Formvar als de hoogte van de dwarsdoorsnede (uitvoeren ten minste 10 metingen per Formvar partij).
3. enten van cellen op rasters
- Onder een steriele motorkap, zetten een strook (12 mm x 3 mm) van dubbelzijdige plakband een dekglaasje aan.
- Knip uit een raster van Formvar-coating met een pincet en leg het ondersteboven op de zelfklevende strip (alleen de rand van het raster moet worden aangesloten op de tape). De film van de Formvar moet onder ogen zien het dekglaasje aan.
- Dit apparaat op een cultuur goed zetten.
- Plaats een droplet 10 µL van RPMI zonder FCS met 104 macrofagen onderscheiden van menselijke monocyten16.
Opmerking: Zorg ervoor dat niet aan te raken van het raster met de pipet tip Voorkom beschadiging van de Formvar-coating. - Incubeer gedurende 30 min (37 ° C, 5% CO2) om te laten cellen houden.
- Vul de put met 2 mL RPMI met 10% FCS.
- Laat het apparaat gedurende 2 uur bij 37 ° C en 5% CO2 cellen houden voordat AFM observatie laten inwerken.
4. topografie metingen van Podosome-geïnduceerde vervormingen
- Plak twee stroken plakband verdubbeld-zijdige op een glazen bodem petrischaal.
Opmerking: De afstand tussen de twee stroken moet kleiner zijn dan de diameter van het raster. - Zorgvuldig het loskoppelen van de grid verguld met macrofagen van het plakband.
- Schakel het raster ondersteboven om de cellen tegenover het glas en plak het net tussen de twee zelfklevende strips.
- Fix het raster met twee nieuwe strips van een double-sided lijm: de grid zal dus worden ingeklemd tussen twee zelfklevende strips, toegankelijk naar de AFM tip verlaten van het centrale gedeelte van het raster.
Opmerking: Zorg ervoor dat het raster is goed vast en niet verdraaid; anders misschien de AFM uitkraging niet zitten kundig voor aanpak van het Formvar oppervlak. - Vul de petrischaal met 2 mL van het kweekmedium voorverwarmde 37 ° C (RPMI met 10% FCS) aangevuld met 10 mM HEPES (pH 7.4).
- Zet de schotel van cultuur op een 37 ° C schotel verwarmingssysteem.
- Installeer de schotel kachel in het werkgebied van de AFM.
- Laat het systeem stabiliseren bij 37 ° C.
- Breng een eerste globale beeld te vinden podosomes in contact modus met een 0.5 nN kracht, en vervolgens scannen de topografie van de Formvar bij 3 Hz met een ongeveer 20 nm-grote pixel.
Opmerking: Vermijd scannen in de buurt van de randen van het raster.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het bovenstaande protocol beschrijft hoe voor te bereiden van de experimentele opstelling te kwantificeren uitsteeksel krachten door macrofaag podosomes op een substraat Formvar toegepast. Dit wordt bereikt met behulp van AFM en wordt geïllustreerd in Figuur 1.
Bij het analyseren van een topografische beeld van uitstulpingen onder podosomes de JPK gegevensverwerking softwarematig, moet een derdegraads veelterm passen worden afgetrokken van elke scanlijn onafhankelijk. De maximale hoogte van podosome-geïnduceerde hobbels kan worden beoordeeld door het toevoegen van een z-kleurenschaal aan de kant van de afbeelding. Na in TIFF-indeling worden geëxporteerd, wordt het topografische beeld verder geanalyseerd met behulp van een speciale zelfgemaakte ImageJ macro beschikbaar online8. Deze macro zoekt uitstulpingen op de hoogte van de gecorrigeerde afbeelding en een kracht kaart (Figuur 2) levert volgens gegeven parameters: Formvar film dikte en podosome ring straal. Daarnaast levert de macro ook een tekstbestand met de coördinaten, de hoogte en de kracht van de berekende waarde voor elke gedetecteerde bobbel op het oppervlak van de Formvar.
Dit proces is ook van toepassing in het geval van time-lapse acquisities. De macro vervolgens houdt elke Ardennen vanaf het punt midden tijd vanaf en achteruit, aanvragen van gebruiker validatie als betwijfeld.
Figuur 1 : Experimentele opzet
Schematische illustratie van de experimentele opstelling. Cellen worden overgeënt op een raster van elektronenmicroscopie bedekt met een dunne, conform Formvar film en het raster geplaatst, cellen naar beneden, in een petrischaal. Wanneer vast te houden aan een substraat, vormen macrofagen submicron hoogdynamische hechting structuren genaamd podosomes. De topografie van de film van de Formvar onder de cellen is dan beeld met behulp van de AFM. Podosome toepassing krachten loodrecht op de drager vervagen, waardoor de uitstulpingen op het oppervlak.
Figuur 2 : Substraat vervorming en krachten uitgeoefend door podosomes
Topografie van de film van de Formvar op de achterzijde van de cellen met doorbuiging (linkerdeel) en hoogte (middelste paneel, kleurcodes voor hoogte). De uitstulpingen waargenomen op de film komen overeen met de vervorming door individuele podosomes. De kracht die door elke podosome wordt geëvalueerd door het model (rechterpaneel elke vlek correspondeert met één podosome en kracht waarden zijn kleurgecodeerde). Schaal bar: 5 µm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Materiaaleigenschappen
De keuze van het materiaal voor het vervormbare membraan, in ons geval Formvar, moet aan een aantal voorwaarden voldoen. Het materiaal moet worden transparant voor zichtbaar licht en fluorescentie vertonen beperkte auto zodat opmerkingen in helder veld en fluorescentie microscopie. De ruwheid van de dunne film moet goed minder dan 10 nm te vermijden topografische effect op cel adhesie en duidelijke observatie van de cel-geïnduceerde uitsteeksels door AFM imaging. Tot slot, de stijfheid van het membraan, dat hangt af van de Youngs modulus en dikte van het materiaal, moet hoog genoeg zijn voor het opwekken van de vorming van podosomes terwijl sommige waarneembare vervormbaarheid voor de typische beklemtoont gegenereerd op podosome sites die zijn rond 10-100 kPa. Formvar materiaal, bereid in dunne lagen van 30-80 nm is een goed compromis tussen al deze beperkingen. Het is vermeldenswaard dat door de dikte van het Formvar-membraan tuning, zijn stijfheid kan worden aangepast om te bestuderen van de eigenschappen van de mechanosensing van de podosomes7.
Reproduceerbaarheid en de kwaliteit van Formvar voorbereiding
Sommige partijen Formvar presenteren plooien op de grid en zijn daarom onbruikbaar: dit kan worden gezien tevoren op helder veld beelden. In onze ervaring, we moeten meerdere rasters voor één voorwaarde omdat soms de montage van het raster niet perfect is en het raster verplaatst of wordt gedraaid. De dikte van de Formvar film moet worden aangepast aan de verwachte kracht. Hoe dikker de film, de stijver is zal, hoe lager de vervormingen echter, waardoor observatie moeilijker. Omgekeerd, hoe dunner de film, de kwetsbaarder is en het moeilijker om te manipuleren zonder het te scheuren.
Invloed van de kracht die door de uitkraging op topografie metingen
Voor het verkrijgen van een meting van de vervorming van de film zonder invloed op de activiteit van de nanomechanical van de podosome of de film vervormen met de sonde van de AFM, is het van cruciaal belang aan controle krachten tijdens de AFM imaging toegepast. Inderdaad, buitensporig geweld toe te passen tijdens de beeldvorming kan leiden tot een overschatting van de hoogte van het uitsteeksel en dus van de kracht van het uitsteeksel. Met andere woorden, is er een noodzaak om te beperken deze kracht ver onder de kracht van de kraam van de uitstekende site. Het is raadzaam om de beperking van de toegepaste krachten tijdens de beeldvorming rond tot enkele honderden pico-Newton.
Model voor uitsteeksel dwingen evaluatie
Om te converteren AFM Topografische metingen naar kracht waarden, is het noodzakelijk te bepalen van de randvoorwaarden en te weten van de ruimtelijke configuratie van kracht toepassing. In het geval van podosomes voorgesteld hebben wij een model op basis van de huidige kennis van de moleculaire organisatie en geverifieerd dat dit model vervorming profielen consistent met topografische opmerkingen8 verstrekt. Meer precies, gemodelleerd we de dichte kern van verticale actine-filamenten omgeven door een ring van adhesie-eiwitten als een centrale module duwen van het substraat en een perifere trekken op het actinemonomeren. Substraat vervorming door beide modules handelen werd bepaald met behulp van eindige elementen simulaties, wat leidt tot een kracht-vervorming relatie. Dankzij deze numerieke benadering gekenmerkt we de invloed van elke geometrische parameter op de relatie van kracht-vervorming, waaruit blijkt dat ring diameter en substraat dikte moest precies worden gemeten. De verhouding tussen de hoogte h van een bobbel in het substraat en de kracht F toegepast door één podosome kan worden uitgedrukt als F = C0 E / (1-υ2) e3/r2 h, waar E = 2.1 GPa is de Youngs modulus van Formvar en υ = 0,3 zijn Poisson verhouding7, C0 is een constante gelijk naar 2.7 en e en r duiden respectievelijk film dikte en podosome RADIUS-8. Voor elke voorwaarde, was de gemiddelde waarde van r fluorescentie beelden van podosomes verkregen.
Toepassingen van uitsteeksel Force microscopie
Uitsteeksel kracht microscopie werd winstgevend gebruikt in macrofagen te testen van het belang van specifieke proteïnen op podosome strijdkrachtgeneratie, tonen de mechanische rol van de podosome ring18 en onthullen spatio-temporele correlaties van kracht generatie tussen naaste buren binnen het netwerk van podosomes8.
Cellen zijn gebleken uitsteken in hun omgeving in verscheidene biologische processen. Invasieve tumorcellen gebruiken protrusive structuren genaamd invadopodia, die essentieel voor de extracellulaire matrix afbraak19 zijn. Lymfocyten is gebleken tijdens hun diapedesis van de transcellulair tot en met het endotheel20in endotheliale cellen uitsteken. Sommige gevallen van cel-cel interactie ook rekenen op cellulaire structuren uitsteekt: dit is het geval voor antigeen erkenning van T-cellen op de endotheliale cellen21, en voor de opening van de celfusie die naar multinucleaire osteoclasten of naar myotubes leidt 22 , 23 , 24. ten slotte internalisering processen zoals fagocytose gebruik mobiele actine gebaseerde structuren dat project rond het doel25lichaam. Bestuderen van de krachten die worden gegenereerd door uitstekende structuren zal zeker helpen licht werpen op de mechanismen spelen in deze processen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De auteurs zijn Anna Labernadie, Guillaume Charrière en Patrick Delobelle dankbaar voor hun eerste bijdrage aan dit werk en Matthieu Sanchez en Françoise Viala voor hun hulp bij de video filmen en bewerken. Dit werk werd ondersteund door l'Agence Nationale de la Recherche (ANR14-CE11-0020-02), la Fondation pour la Recherche Médicale (FRM DEQ2016 0334894), INSERM Plan kanker, Fondation Toulouse kanker en Human Frontier Science Program (RGP0035/2016).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 200 mesh nickel grids | Electron Microscopy Sciences | G200-Ni | |
| Filter paper | Sigma-Aldrich | 1001-055 | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 10235612 | |
| White stickers 26 x 70 mm | Avery | DP033-100 | |
| Film casting device with valve in its outlet | Electron Microscopy Sciences | 71305-01 | |
| Razorblades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
| Ethanol | VWR | 1.08543.0250 | |
| Acetone | VWR | 20066.321 | |
| Formvar 0.5% solution in ethylene dichloride | Electron Microscopy Sciences | 15820 | |
| 12 mm coverslips | VWR | 631-0666 | |
| Inverted microscope | Carl Zeiss | Axiovert 200 | |
| Atomic Force Microscope | JPK Instruments | NanoWizard III | |
| Temperature-controlled sample holder | JPK Instruments | BioCell | |
| Silicon nitride cantilever with a nominal spring constant of 0.01 N/m | Veeco Instruments | MLCT-AUHW | |
| PBS | Gibco | 14190-094 | |
| Double-sided adhesive tape | APLI AGIPA | 118100 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 31870-025 | |
| FCS | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| 35 mm glass-bottom Petri dishes | WPI | FD35-100 |
References
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. Tissue Cells Feel and Respond to the Stiffness of Their Substrate. Science. 310, 1139-1143 (2005).
- Paszek, M. J., et al. Tensional Homeostasis and the Malignant Phenotype. Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- Gilbert, P. M., Weaver, V. M. Cellular Adaptation to Biomechanical Stress across Length Scales in Tissue Homeostasis and Disease. Seminars in Cell & Developmental Biology. 67, 141-152 (2017).
- Vining, K. H., Mooney, D. J. Mechanical Forces Direct Stem Cell Behaviour in Development and Regeneration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2017).
- Roca-Cusachs, P., Conte, V., Trepat, X. Quantifying Forces in Cell Biology. Nature Cell Biology. 19, 742-751 (2017).
- Labernadie, A., et al. Protrusion Force Microscopy Reveals Oscillatory Force Generation and Mechanosensing Activity of Human Macrophage Podosomes. Nature Communications. 5, 5343 (2014).
- Proag, A., et al. Working Together: Spatial Synchrony in the Force and Actin Dynamics of Podosome First Neighbors. ACS Nano. 9, 3800-3813 (2015).
- Proag, A., Bouissou, A., Vieu, C., Maridonneau-Parini, I., Poincloux, R. Evaluation of the Force and Spatial Dynamics of Macrophage Podosomes by Multi-Particle Tracking. Methods. 94, 75-84 (2016).
- Cougoule, C., et al. Three-Dimensional Migration of Macrophages Requires Hck for Podosome Organization and Extracellular Matrix Proteolysis. Blood. 115, 1444-1452 (2010).
- Cougoule, C., et al. Blood Leukocytes and Macrophages of Various Phenotypes Have Distinct Abilities to Form Podosomes and to Migrate in 3d Environments. European Journal of Cell Biology. 91, 938-949 (2012).
- Guiet, R., et al. Macrophage Mesenchymal Migration Requires Podosome Stabilization by Filamin A. Journal of Biological Chemistry. 287, 13051-13062 (2012).
- Maridonneau-Parini, I. Control of Macrophage 3d Migration: A Therapeutic Challenge to Limit Tissue Infiltration. Immunology Review. 262, 216-231 (2014).
- Park, H., et al. Tyrosine Phosphorylation of Wiskott-Aldrich Syndrome Protein (Wasp) by Hck Regulates Macrophage Function. Journal of Biological Chemistry. 289, 7897-7906 (2014).
- Van Goethem, E., et al. Macrophage Podosomes Go 3d. European Journal of Cell Biology. 90, 224-236 (2011).
- Van Goethem, E., Poincloux, R., Gauffre, F., Maridonneau-Parini, I., Le Cabec, V. Matrix Architecture Dictates Three-Dimensional Migration Modes of Human Macrophages: Differential Involvement of Proteases and Podosome-Like Structures. Journal of Immunology. 184, 1049-1061 (2010).
- Verollet, C., et al. Hiv-1 Reprograms the Migration of Macrophages. Blood. 125, 1611-1622 (2015).
- Bouissou, A., et al. Podosome Force Generation Machinery: A Local Balance between Protrusion at the Core and Traction at the Ring. ACS Nano. 11, 4028-4040 (2017).
- Lizarraga, F., et al. Diaphanous-Related Formins Are Required for Invadopodia Formation and Invasion of Breast Tumor Cells. Cancer Research. 69, 2792-2800 (2009).
- Carman, C. V., et al. Transcellular Diapedesis Is Initiated by Invasive Podosomes. Immunity. 26, 784-797 (2007).
- Sage, P. T., et al. Antigen Recognition Is Facilitated by Invadosome-Like Protrusions Formed by Memory/Effector T Cells. Journal of Immunology. 188, 3686-3699 (2012).
- Sens, K. L., et al. An Invasive Podosome-Like Structure Promotes Fusion Pore Formation During Myoblast Fusion. Journal of Cell Biology. 191, 1013-1027 (2010).
- Takito, J., et al. The Transient Appearance of Zipper-Like Actin Superstructures During the Fusion of Osteoclasts. Journal of Cell Science. 125, 662-672 (2012).
- Shilagardi, K., et al. Actin-Propelled Invasive Membrane Protrusions Promote Fusogenic Protein Engagement During Cell-Cell Fusion. Science. 340, 359-363 (2013).
- Freeman, S. A., et al. Integrins Form an Expanding Diffusional Barrier That Coordinates Phagocytosis. Cell. 164, 128-140 (2016).
