Biology

בליטה מיקרוסקופ כוח: שיטה לכמת כוחות שפותחה על ידי בליטות תא

Published: June 16, 2018 doi: 10.3791/57636

Anaïs Bouissou*¹, Amsha Proag*¹, Marion Portes¹, Vanessa Soldan², Stéphanie Balor², Christophe Thibault^3,4, Christophe Vieu^3,4, Isabelle Maridonneau-Parini¹, Renaud Poincloux¹

¹Institut de Pharmacologie et Biologie Structurale, IPBS, Université de Toulouse, CNRS, UPS, ²METi, ³CNRS, LAAS, ⁴Univ de Toulouse, INSA

* These authors contributed equally

Summary

כאן, אנחנו מפרטים את הטכניקות ניסיוני המשמשים להערכת כוחות בליטה podosomes להחיל על סרט תואם, משלב הכנת הסרט לניתוח אוטומטי של תמונות הטופוגרפי.

Abstract

בהקשרים ביולוגיים רבים, תאים בעלי חיים צריך אינטראקציה פיזית עם הסביבה שלהם על ידי פיתוח כוחות מכני. בין אלה, כוחות המתיחה היה מאופיין היטב, אך יש חוסר של טכניקות המאפשר מדידת כוחות בליטה שהופעל על ידי תאים orthogonally המצע שלהם. תיכננו התקנה ניסיוני. למדידת כוחות בליטה שהופעל על ידי תאים חסיד על המצע שלהם. תאי ציפוי על גליון Formvar תואם לעוות את המצע, הטופוגרפיה וכתוצאה מכך ממופה על ידי מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) את המשקל ננומטר. כוח ערכים המחולצים ואז ניתוח של הפרופיל דפורמציה בהתבסס על הגיאומטריה של המבנים התאיים protrusive. לפיכך, ניתן למדוד את הכוחות שהופעל על ידי היחידות בולט בודדים של תא חי לאורך זמן. טכניקה זו תאפשר המחקר של יצירת כח ורגולציה שלה בתהליכי הסלולר רבים המערבים בליטה. כאן, אנו מתארים את היישום שלה כדי למדוד את הכוחות protrusive שנוצר על ידי podosomes הנוצרת על-ידי מקרופאגים אנושי.

Introduction

תאים בעלי חיים אינטראקציה פיזית עם המטריקס, התאים האחרים המהווים את הסביבה שלהם¹. פעולה זו נדרשת כדי להעביר, להפנים גופות, לרכוש מידע חיצוני או להבדיל. בתהליכי כזה, התא צריך להקרין כוחות מכני ומשפיע, כמו מחקרים רבים הראו בשנים האחרונות, היכולת של תא כדי ליצור כוחות, לחקור את הסביבה שלה התנהגות ביולוגית, בימוי למשל התפשטות או בידול²^,³. בתורו, המדידה של כוחות הסלולר היא מכשיר מרכזי לימוד ויסות כוח הדור ולהבין את המשמעות שלה תא התנהגות ורקמות גורל⁴^,⁵.

בשנים האחרונות עדים על התפתחות טכניקות רבות כדי למדוד את הכוחות תא יכול להפעיל על הסביבה שלה⁶. רוב אלה סייעו חושפים שהמתיחה כוחות כי תאים להפעיל כפי שהם מושכים על הגששים ניידים או מצע deformable. עם זאת, הכוחות מכניים מעורבים בליטה לסביבת חוץ-תאית סובלים מחסור של טכניקות מדידה והם עד היום לא טוב מאופיין.

כדי להתגבר על מגבלה זו, אנו מציגים שיטה למדידת כוחות המופעל orthogonally אל המצע. זה מורכב ב ציפוי חיים תאים בגיליון אלסטי דק אשר ניתן לעוות בכיוון אורתוגונלית, דבר המאפשר למדוד דפורמציה המצע על ידי התאים ולהסיק את הכוחות המעורבים. המצע הטופוגרפיה נמדד עם רזולוציה הננומטרי באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי, הערכת כוחות של דפורמציה מסתמך על הידע של הגיאומטריה של מבנים הסלולר protrusive⁷^,⁸^, ⁹.

כאן, אנו מתארים את הכיוונון ויישומה למדידת הכוחות שנוצר על ידי podosomes, מבנים אדהזיה protrusive הנוצרת על-ידי מקרופאגים להעברת mesenchymal שלהם סביבות תלת-ממדי¹⁰^,¹¹^, ¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷. אנו מאמינים כי טכניקה זו תקדם את ההבנה של יצירת כח ורגולציה שלה בתהליכי הסלולר רבים המערבים בליטה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת רשתות מצופים Formvar

מיקרוסקופ אלקטרונים רשתות עם אצטון טהור ונקי ומניחים אותם על נייר סינון. לאחר מכן נקיים שקופית מיקרוסקופ עם אתנול טהור, לנגב עם נייר עדשה, להסיר את האבק עם מפוח.
מקום של שקופיות זכוכית ניקיתי אתנול אנכית המשפך של מכשיר הליהוק סרט המכיל פתרון של Formvar בחלק התחתון. לכסות את החלק העליון של המשפך.
משאבת 100 מ של Formvar פתרון (0.5% באתילן dichloride) עם הנורה atomizer ב עד רמת מגיע שני שלישים של השקופית.
לשמור את השקופית הפתרון עבור 1 דקות.
. פתח את הברז של המכשיר כדי לנקז את הפתרון Formvar ב זרם קבוע קצב זרימה של 10 עד 15 מ ל/s תניב סרט Formvar של 30-80 ננומטר. העובי של הסרט נקבעת על ידי הריכוז של הפתרון Formvar על ידי קצב ניקוז.
הערה: קצב ניקוז יכול להיות נשלט על-ידי איוור את הלחץ באמצעות שסתום האוויר החוצה על-ידי לאט פתיחת המסתם. מהר יותר הניקוז, עבה הסרט. בפועל, כי זה קשה לחזות את עובי הסרט לפי קצב זרימה Formvar, אנו להכין מספר אצוות של סרטים Formvar ולשלוט עובי שלהם על ידי מיקרוסקופ כוח אטומי (ראה שלב 2).
הסר את השקופית מן החדר, לייבש אותו בעדינות על נייר סינון כדי להסיר את כל Formvar נוזלי.
גוזרים מלבן 20 מ"מ x 50 מ"מ מהסרט Formvar עם סכין גילוח.
מילוי גביע עם מים מזוקקים נקיים, לאט מזנקת השקופית אנכית אל המים לעוף. הסרט: הסרט אמור לצוף על פני המים.
מקום יבש ניקיתי אצטון רשתות על הסרט, מבריק פונות למעלה.
המקום של coverslip זכוכית עגול (Ø 12 מ מ) על כמה מן הרשתות. Coverslip זה ישמש כדי למדוד את עובי הסרט (ראה שלב 2).
מכסים שקופית מיקרוסקופ עם מדבקה לבנה, גודלה משתנה כך שיתאים. טובלים את השקופית אנכית על הגבול של הסרט Formvar צף עד כל הסרט לאנאפוליס השקופית. להסיר את המים העודפים השקופית עם נייר סינון ולתת לזה להתייבש בטמפרטורת החדר למשך הלילה.

2. מדידת עובי הסרט

חותכים את Formvar סביב coverslip עם פינצטה כדי לנתק את זה מתוך השקופית.
סמן את המיקום של הרשת תחת coverslip עם עט.
חותכים את Formvar מרחבי הרשת מסומן כדי לנתק אותו מן coverslip. לכן יהיה חור בגליון Formvar הנותרים, שיאפשר למדוד את עובי הסרט. לכסות את coverslip עם PBS והנח אותו על משטח זכוכית על המיקרוסקופ.
הר של זיז ניטריד סיליקון על הבלוק זכוכית מיקרוסקופ כוח אטומי, מוודא שהפס הזהב אינו מכוסה על-ידי הקצה של האביב.
הערה: הרגישות ואת קבוע הקפיץ הזיז צריך לקבל קודם לכן היה מכויל ב- PBS.
לטעון את גוש זכוכית על גבי המודול AFM ולאחר מכן הצב את המודול לתוך המיקרוסקופ.
מניחים את coverslip מצופים Formvar על תא תצפית, לכסות את זה עם µL 500 ל- PBS.
סרוק את הגבול של החור בגליון Formvar באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי ב מצב הקשר ונקודת ערכת כוח 0.5 nN.
פני השטח coverslip זכוכית כהפניה למדידות גובה ושימוש להעריך את עובי Formvar כמו הגובה של חתך הרוחב (לבצע מדידות לפחות 10 לכל Formvar אצווה).

3. זריעת תאי על רשתות

ברדס סטרילי, לשים רצועה (12 מ"מ x 3 מ"מ) של דבק דו צדדי coverslip.
לגזור רשת מצופה Formvar עם פינצטה ושים אותו הפוך על רצועת דבק (רק השפה של הרשת צריך לצרף את הקלטת). הסרט Formvar צריך להתמודד עם coverslip.
לשים התקן זה תרבות היטב.
המקום droplet 10 µL של RPMI ללא FCS המכיל 10⁴ מקרופאגים תריז ומונוציטים האנושי¹⁶.
הערה: הקפד לא לגעת הרשת עם הטיפ פיפטה כדי למנוע פגיעה הציפוי Formvar.
תקופת דגירה של 30 דקות (37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂) לתת תאים ולהתבטא.
למלא את הבאר עם 2 מ של RPMI המכיל 10% FCS.
דגירה את המכשיר עבור 2 h-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂לתת תאים לדבוק לפני התצפית AFM.

4. טופוגרפיה מדידות של העיוותים הנוצרות על-ידי Podosome

תוקע שתי רצועות של דבק צדדית הוכפל על רצפת הזכוכית צלחת פטרי.
הערה: המרחק בין שתי רצועות צריך להיות קטן יותר הקוטר רשת.
ניתוק בקפידה את רשת מצופה מקרופאגים מהקלטת דבק.
הפוך את הרשת על מנת לקבל את התאים מול הזכוכית ולהישאר ברשת בין שתי רצועות דבק.
תיקון הרשת עם שתי רצועות חדש דבק צדדית הוכפל: הרשת ובכך להיות דחוקה בין שתי רצועות דביקות, עזיבת האזור המרכזי של הרשת להנגיש הטיפ AFM.
הערה: ודא כי הרשת טוב קבוע, לא המעוות; אחרת הזיז AFM לא יוכל להתקרב השטח Formvar.
למלא את צלחת פטרי עם 2 מיליליטר מחומם מראש-37 ° C תרבות בינוני (RPMI עם 10% FCS) בתוספת 10 מ מ HEPES (pH 7.4).
במקום המנה תרבות על תנור מנה 37 º C.
להתקין את התנור מאכל על הבמה AFM.
. תן למערכת ייצוב ב 37 º C.
במצב קשר עם כוח 0.5 nN, להפוך תמונה הגלובלית הראשונה לאתר podosomes, ולאחר מכן סרוק את הטופוגרפיה Formvar-3 הרץ עם פיקסל nm-גדול כ-20.
הערה: להימנע סריקה בקרבת קצות הרשת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הפרוטוקול הנ ל מתאר כיצד להכין את הגדרת הניסוי לכמת חדירת כוחות שהוחלו על-ידי macrophage podosomes על מצע Formvar. זו מושגת באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי, מודגם באיור1.

בעת ניתוח תמונת הטופוגרפי של גבשושיות וזיזים מתחת podosomes שימוש בתוכנת עיבוד נתונים JPK, פולינום מדרגה שלישית מתאים צריך להיות מופחתים מכל שורה הסריקה באופן עצמאי. הגובה המרבי של podosome-induced בליטות יכול להיות מוערך על ידי הוספת בקנה מידה צבע z בשולי התמונה. לאחר שהיא יוצאה בתבנית TIFF, טופוגרפיים שהתמונה נוסף ניתוח שימוש ייעודי תוצרת בית ImageJ מאקרו זמין באינטרנט⁸. פקודת מאקרו זו מאתרת גבשושיות וזיזים בתמונה גובה המתוקן ותשואות מפת כוח (איור 2) על פי נתון פרמטרים: Formvar הסרט בעובי ואת podosome הטבעת רדיוס. בנוסף, המאקרו מניב גם קובץ טקסט עם קואורדינטות, גובה כוח מחושב ערך עבור כל בליטה שזוהו על-פני Formvar.

תהליך זה חל גם במקרה של רכישות זמן לשגות. המאקרו אז מעקב אחר כל בליטה מנקודת זמן הביניים ואילך לאחור, בקשת אימות המשתמש אם מתעורר ספק.

איור 1 : הגדרת הניסוי
איור סכמטי של ההתקנה ניסיוני. התאים הם נזרע על רשת מיקרוסקופ אלקטרונים מצופה עם סרט Formvar דק, תואם, מניחים את הרשת, תאים כלפי מטה, בתוך צלחת פטרי. כאשר והקפדה מצע, מקרופאגים טופס כחיוניים אדהזיה דינמי מאוד מבנים הנקרא podosomes. הטופוגרפיה של הסרט Formvar מתחת התאים ואז הוא תמונה באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי. Podosome חלות כוחות אורתוגונלית המצע, והתוצאה להיות גבשושיות וזיזים על פני השטח שלו.

איור 2 : דפורמציה המצע וכוחות שהופעל על ידי podosomes
הטופוגרפיה של הסרט Formvar בצד ההפוך של תאי מראה סטיה (החלונית הימנית) וגובה (בחלונית האמצעית, הקודים של הצבע עבור גובה). גבשושיות וזיזים שנצפה בסרט תואם להרכב מאת podosomes בודדים. הכוח שהוחלו על-ידי כל podosome מחושבת על ידי המודל (לוח נכון, כל ספוט מקביל podosome אחד, כוח ערכים מובחנים זה מזה). סרגל קנה מידה: 5 מיקרומטר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

תכונות החומר

הבחירה של החומר עבור ממברנה deformable, במקרה שלנו Formvar, צריך למלא כמה דרישות. החומר חייב להיות שקוף האור הנראה ולהציג קרינה פלואורסצנטית אוטומטי מוגבלת כדי לאפשר תצפיות בשדה בהירים ואת פלורסצנטיות מיקרוסקופ. המראה המחוספס של הסרט דק חייב להיות מתחת 10 ננומטר כדי להימנע הטופוגרפי השפעה על התא אדהזיה וכדי לאפשר תצפית ברורה של בליטות המושרה תא על-ידי הדמיה AFM. בסופו של דבר, הנוקשות של הקרום, אשר תלויה מודולוס של הצעירים, עובי החומר, צריך להיות גבוה מספיק כדי לגרום להיווצרות podosomes תוך שמירה על כמה ודפורמביליות הנצפה על הלחצים טיפוסי נוצר באתרים podosome אשר הם סביב 10-100 kPa. Formvar, ובחומר בסרטים דק של 30-80 ננומטר הוא פשרה טובה בין כל האילוצים הללו. ראוי לשים לב כי על-ידי כיוונון העובי של קרום Formvar, נוקשות שלה יכול להיות מותאם כדי ללמוד את המאפיינים mechanosensing של podosomes⁷.

הפארמצבטית איכותית Formvar

כמה קבוצות של Formvar להציג את הקפלים על הרשת, ולכן הם לא שמיש: ניתן לראות מראש על שדה בהיר תמונות. מניסיוננו, אנחנו צריכים רשתות מרובות עבור תנאי אחד כי לפעמים ההרכבה של הרשת אינו מושלם, הרשת נע או מעוות. העובי של הסרט Formvar צריך להיות מותאם הכוח הצפוי. עבה הסרט, את במצב זה, אך נמוך יותר העיוותים יהיו, ביצוע תצפית קשה יותר. לעומת זאת, רזה הסרט, שברירית יותר זה, קשה יותר לתמרן בלי לקרוע אותו.

ההשפעה של הכוח שהוחלו על-ידי שלוחה על טופוגרפיה ומדידות

לקבל מידה של הסרט להרכב מבלי להשפיע על הפעילות nanomechanical של podosome או עיוות את הסרט עם החללית AFM, זה הכרחי כדי כוחות שליטה חלה במהלך דימות AFM. אכן, הפעלת כוח מופרז במהלך ההדמיה עלול להוביל הערכה מופרזת הגובה בליטה ובכך של הכוח בליטה. במילים אחרות, יש צורך להגביל את הכוח הזה הרבה מתחת הכוח דוכן של אתר בולטות. אנו ממליצים להגביל את הכוחות יישומית במהלך דימות סביב כמה מאות פיקו-ניוטונים.

מודל להערכה כוח בליטה

כדי להמיר מדידות הטופוגרפי AFM כוח ערכים, יש צורך להגדיר את תנאי גבול וכדי לדעת תצורת המרחב של כוח הבקשה. במקרה של podosomes, הצענו מודל המבוסס על הידע הנוכחי של הארגון המולקולרי שלה ולאמת כי מודל זה סיפק דפורמציה פרופילים עקבית עם תצפיות הטופוגרפי⁸. ליתר דיוק, אנחנו המודל הליבה צפופה של polymerizing חוטים אנכיים אקטין מוקף טבעת של אדהזיה חלבונים כמו מודול מרכזי דוחף את המצע ומודול היקפיים למשוך אותה. המצע דפורמציה מאת אלה שני מודולים, מתנהגת נקבע באמצעות סימולציות סופיים, שמוביל יחסים כוח-דפורמציה. בזכות גישה זו מספריים, אנחנו מאופיין את ההשפעה של כל פרמטר גיאומטריים על היחס כוח-דפורמציה, מציג את טבעת קוטר ו המצע עובי צריך להימדד במדויק. היחס בין גובה h יבלוט במצע, הכוח F שהוחלו על-ידי podosome אחד עלול להתבטא כמו F = C₀ E / (1-υ²) e³/r² h, איפה E = 2.1 ממוצע הציונים הוא האלסטיות של Formvar ו υ = 0.3 שלו יחס פואסון⁷, C₀הוא שווה מתמיד 2.7 ו- e ו- r בהתאמה מציינות את הסרט עובי ו podosome ברדיוס⁸. עבור כל תנאי, הערך הממוצע של r היה המתקבלים פלורסצנטיות תמונות של podosomes.

יישומים של מיקרוסקופ כוח בליטה

מיקרוסקופ כוח בליטה שימש רווחי מקרופאגים כדי לבחון את החשיבות של חלבונים ספציפיים על יצירת כח podosome, להדגים את תפקיד מכני הטבעת podosome¹⁸ ולחשוף מתאמים-עתיים מכוח דור בין שכנים קרובים בתוך הרשת של podosomes⁸.

נמצאו תאים לבלוט אל סביבתם מספר תהליכים ביולוגיים. תאים גידול פולשני להשתמש protrusive מבנים הנקרא invadopodia, המהווה מרכיב חיוני מטריצה חוץ-תאית השפלה¹⁹. לימפוציטים הוכחו בולטות לתאי אנדותל במהלך שלהם diapedesis transcellular דרך אנדותל²⁰. חלק מהמופעים של תא-תא אינטראקציה גם לסמוך על הסלולרי בולטות מבנים: זהו המקרה עבור זיהוי אנטיגן של תאי T על תאי אנדותל²¹, ועבור אתחול של פיוז'ן תא שמובילה multinucleated osteoclasts או myotubes ²² ^, ²³ ^, ²⁴. סוף סוף, הפנמה תהליכים כגון phagocytosis לשימוש סלולרי מבוסס אקטין מבני הפרויקט סביב המטרה גוף²⁵. לומד את הכוחות שנוצר על ידי בולטות המבנים יהיה בהחלט לעזור לשפוך אור על המנגנונים שמשתתפים בתהליכים אלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

שאין ניגודי אינטרסים הכריז.

Acknowledgments

המחברים מודים אנה Labernadie, גיום Charrière, פטריק Delobelle על תרומתה הראשונית לעבודה זו, מתיו סנצ'ז, פרנסואז Viala על עזרתם עם צילום וידאו ועריכה. עבודה זו היא נתמכה על ידי l'Agence נאסיונאל דה לה Recherche (ANR14-CE11-0020-02), la Fondation pour la Médicale רשרש (עקרות DEQ2016 0334894), INSERM תוכנית סרטן, סרטן Fondation טולוז, הגבול האנושי המדע תוכנית (RGP0035/2016).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
200 mesh nickel grids	Electron Microscopy Sciences	G200-Ni
Filter paper	Sigma-Aldrich	1001-055
Microscope slides	Fisher Scientific	10235612
White stickers 26 x 70 mm	Avery	DP033-100
Film casting device with valve in its outlet	Electron Microscopy Sciences	71305-01
Razorblades	Electron Microscopy Sciences	72000
Ethanol	VWR	1.08543.0250
Acetone	VWR	20066.321
Formvar 0.5% solution in ethylene dichloride	Electron Microscopy Sciences	15820
12 mm coverslips	VWR	631-0666
Inverted microscope	Carl Zeiss	Axiovert 200
Atomic Force Microscope	JPK Instruments	NanoWizard III
Temperature-controlled sample holder	JPK Instruments	BioCell
Silicon nitride cantilever with a nominal spring constant of 0.01 N/m	Veeco Instruments	MLCT-AUHW
PBS	Gibco	14190-094
Double-sided adhesive tape	APLI AGIPA	118100
RPMI 1640	Gibco	31870-025
FCS	Sigma-Aldrich	F7524
HEPES	Sigma-Aldrich	H0887
35 mm glass-bottom Petri dishes	WPI	FD35-100