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घुसपैठ बल माइक्रोस्कोपी: एक विधि के लिए सेल की दखलंदाजी से विकसित बलों यों तो

Published: June 16, 2018 doi: 10.3791/57636
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 2, 3,4, 3,4, 1, 1
1Institut de Pharmacologie et Biologie Structurale, IPBS, Université de Toulouse, CNRS, UPS, 2METi, 3CNRS, LAAS, 4Univ de Toulouse, INSA
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम विस्तार प्रयोगात्मक बलों है कि podosomes एक आज्ञाकारी फिल्म पर लागू होते हैं, स्थलाकृतिक छवियों के स्वचालित विश्लेषण के लिए फिल्म की तैयारी से मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया तकनीक ।

Abstract

कई जैविक संदर्भों में, पशु कोशिकाओं यांत्रिक बलों के विकास के द्वारा अपने पर्यावरण के साथ शारीरिक रूप से बातचीत करने की जरूरत है । इन के अलावा, कर्षण बलों अच्छी तरह से किया गया है, लेकिन वहां की घुसपैठ की अनुमति तकनीक की कमी उनके सब्सट्रेट करने के लिए orthogonally कोशिकाओं द्वारा लागू बलों की माप है । हम एक प्रयोगात्मक सेटअप अपने सब्सट्रेट पर अनुयाई कोशिकाओं द्वारा लागू की घुसपैठ बलों को मापने के लिए बनाया गया है । इस सब्सट्रेट और जिसके परिणामस्वरूप स्थलाकृति ख़राब एक अनुरूप Formvar शीट पर चढ़ाया कोशिकाओं नैनोमीटर पैमाने पर परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (AFM) द्वारा मैप किया जाता है. बल मूल्यों तो विरूपण प्रोफ़ाइल के एक विश्लेषण से संदखल सेलुलर संरचनाओं की ज्यामिति के आधार पर निकाले जाते हैं । इसलिए, एक जीवित कोशिका की व्यक्तिगत फैलाई इकाइयों द्वारा लागू बलों समय के साथ मापा जा सकता है । इस तकनीक के कई सेलुलर में दखल शामिल प्रक्रियाओं में बल पीढ़ी और उसके विनियमन के अध्ययन में सक्षम हो जाएगा । यहां, हम अपने आवेदन का वर्णन करने के लिए मानव मैक्रोफेज द्वारा गठित podosomes द्वारा उत्पंन घुसपैठ बलों को मापने ।

Introduction

पशु कोशिकाओं मैट्रिक्स और अंय कोशिकाओं है कि उनके1पर्यावरण का गठन के साथ शारीरिक रूप से बातचीत । यह उनके लिए आवश्यक है स्थानांतरित करने के लिए, internalize निकायों, बाहरी जानकारी प्राप्त, या अंतर । इस तरह की प्रक्रियाओं में, सेल यांत्रिक बलों उत्पन्न करना चाहिए और, के रूप में कई अध्ययनों से हाल के वर्षों में दिखाया गया है, एक सेल की क्षमता बलों और अपने पर्यावरण की जांच उत्पन्न करने के लिए अपने जैविक व्यवहार को प्रभावित करता है, उदाहरण प्रसार के लिए निर्देशन या विभेद२,३. बदले में, सेलुलर बलों की माप एक प्रमुख सहायता के लिए बल पीढ़ी के विनियमन का अध्ययन और सेल व्यवहार और ऊतक भाग्य4,5में इसके निहितार्थ समझ है ।

हाल के वर्षों में कई तकनीकों के विकास के लिए बलों है कि एक सेल अपने6पर्यावरण पर लागू कर सकते है उपाय देखा है । इनमें से अधिकांश कर्षण बलों है कि कोशिकाओं के रूप में वे मोबाइल जांच या एक विकृत सब्सट्रेट पर खींचने के लिए लागू होने का खुलासा करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है । हालांकि, यांत्रिक extracellular वातावरण में दखल में शामिल बलों माप तकनीक की कमी से ग्रस्त है और अच्छी तरह से नहीं की तारीख के लिए कर रहे हैं ।

इस सीमा को दूर करने के लिए, हम एक विधि सब्सट्रेट करने के लिए orthogonally लागू बलों को मापने के लिए उपस्थित । यह कोशिकाओं और deduce शामिल बलों द्वारा सब्सट्रेट विकृति को मापने के लिए संभव बनाने, ओर्थोगोनल दिशा में ख़राब कर सकते हैं कि एक पतली लोचदार शीट पर जीवित कोशिकाओं चढ़ाना में होते हैं । सब्सट्रेट स्थलाकृति नेनो परमाणु बल माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर संकल्प के साथ मापा जाता है और विरूपण से बलों के मूल्यांकन में दखलंदाजी सेलुलर संरचनाओं की ज्यामिति के ज्ञान पर निर्भर करता है7,8, 9.

यहाँ, हम सेटअप और उसके अनुप्रयोग का वर्णन podosomes द्वारा उत्पन्न बलों को मापने के लिए, तीन आयामी वातावरण में उनके mesenchymal प्रवास के लिए मैक्रोफेज द्वारा गठित दखल आसंजन संरचनाओं10,11, 12,13,14,15,16,17. हमें विश्वास है कि इस तकनीक के कई सेलुलर में दखल शामिल प्रक्रियाओं में बल पीढ़ी और उसके विनियमन की समझ अग्रिम होगा ।

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Protocol

1. Formvar-लेपित ग्रिड की तैयारी

  1. शुद्ध एसीटोन के साथ स्वच्छ इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ग्रिड और फिल्टर कागज पर उन्हें सूखी । तो शुद्ध इथेनॉल के साथ एक खुर्दबीन स्लाइड साफ, एक लेंस कागज के साथ पोंछ और एक धौंकनी के साथ धूल हटा दें ।
  2. कम हिस्से में Formvar का एक समाधान युक्त एक फिल्म कास्टिंग डिवाइस के कीप में एक इथेनॉल साफ गिलास स्लाइड खड़ी रखें । फ़नल के शीर्ष को कवर करता है.
  3. पंप Formvar सॉल्यूशन की १०० एमएल (०.५% ईथीलीन dichloride में) की पिचकारी बल्ब के साथ जब तक लेवल दो तिहाई स्लाइड तक नहीं पहुंचती ।
  4. स्लाइड को 1 मिनट के लिए समाधान में रखें ।
  5. डिवाइस के वाल्व खोलने के लिए एक स्थिर स्ट्रीम में Formvar समाधान नाली । 10 से 15 मिलीलीटर/एस की एक प्रवाह दर 30-80 एनएम के एक Formvar फिल्म उपज होगी । फिल्म की मोटाई Formvar समाधान की एकाग्रता और जल निकासी दर से निर्धारित होता है ।
    नोट: जल निकासी दर धीरे वाल्व खोलने के द्वारा हवा से बाहर वाल्व के माध्यम से दबाव वेंट द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है । जल निकासी की तेजी, मोटा फिल्म । व्यवहार में, क्योंकि यह Formvar प्रवाह दर से फिल्म मोटाई की भविष्यवाणी करने के लिए मुश्किल है, हम Formvar फिल्मों के कई बैचों तैयार है और AFM द्वारा उनकी मोटाई पर नियंत्रण (चरण 2 देखें) ।
  6. कक्ष से स्लाइड निकालें और किसी भी लिक्विड Formvar को निकालने के लिए उसे नाजुक रूप से फ़िल्टर काग़ज़ पर सुखाएं ।
  7. एक उस्तरा ब्लेड के साथ Formvar फिल्म से एक 20 मिमी x ५० mm आयत काट ।
  8. साफ आसुत जल के साथ एक चोंच भरें और धीरे से स्लाइड के पानी में खड़ी डुबकी को दूर नाव फिल्म: फिल्म पानी की सतह पर नाव चाहिए ।
  9. फिल्म पर ड्राई एसीटोन-जरुर ग्रिड लगाएं, चमकदार चेहरा ऊपर ।
  10. ग्रिड के कुछ पर एक गोल गिलास coverslip (Ø 12 मिमी) प्लेस । इस coverslip फिल्म मोटाई मापने के लिए सेवा करेंगे (चरण 2 देखें) ।
  11. कवर एक सफेद यह फिट करने के लिए आकृति परिवर्तन स्टिकर के साथ एक खुर्दबीन स्लाइड । स्लाइड को तैरते Formvar फिल्म की सीमा पर अनुलंब रूप में डिप करें जब तक कि पूरी फिल्म स्लाइड का पालन नहीं करती । फिल्टर पेपर के साथ स्लाइड से अतिरिक्त पानी निकालें और रात के तापमान पर इसे सूखने दें ।

2. फिल्म मोटाई का मापन

  1. इसे स्लाइड से अलग करने के लिए coverslip के आसपास Formvar को चिमटी से काटें ।
  2. पेन के साथ coverslip के अंतर्गत ग्रिड का स्थान चिह्नित करें.
  3. coverslip से अलग करने के लिए चिह्नित ग्रिड के आसपास Formvar काटें । इसलिए शेष Formvar शीट में एक छेद होगा, जो फिल्म की मोटाई मापने के लिए अनुमति देगा । पंजाबियों के साथ coverslip कवर और यह माइक्रोस्कोप पर एक गिलास स्लाइड पर जगह है ।
  4. AFM ग्लास ब्लॉक पर एक सिलिकॉन नाइट्राइड ब्रैकट माउंट, यकीन है कि सुनहरा धारी वसंत की नोक से कवर नहीं कर रहा है ।
    नोट: ब्रैकट की संवेदनशीलता और वसंत स्थिरांक को पहले पंजाबियों में तुले हुए होना चाहिए था ।
  5. माउंट AFM मॉड्यूल पर कांच ब्लॉक, और फिर माइक्रोस्कोप पर मॉड्यूल जगह है ।
  6. अवलोकन कक्ष पर Formvar-लेपित coverslip रखें और इसे ५०० µ के साथ कवर करें ।
  7. संपर्क मोड में AFM का उपयोग कर Formvar शीट में छेद की सीमा स्कैन और एक ०.५ एनएन बल सेट बिंदु ।
  8. ऊंचाई माप के लिए संदर्भ के रूप में कांच coverslip सतह का उपयोग करें, और पार की ऊंचाई खंड के रूप में Formvar मोटाई का मूल्यांकन (Formvar बैच प्रति कम से कम 10 माप प्रदर्शन) ।

3. ग्रिड पर सीडिंग कक्ष

  1. एक बाँझ डाकू के तहत, एक coverslip पर डबल पक्षीय चिपकने वाला टेप के एक पट्टी (12 मिमी x 3 मिमी) डाल दिया ।
  2. चिमटी के साथ एक Formvar-लेपित ग्रिड में कटौती और यह ऊपर नीचे चिपकने वाली पट्टी पर डाल (केवल ग्रिड के रिम को टेप से जुड़ी होने की जरूरत है) । Formvar फिल्म को coverslip का सामना करने की जरूरत है ।
  3. इस उपकरण को एक संस्कृति में अच्छी तरह से रखो ।
  4. RPMI के 10 µ एल छोटी बूंद 104 मानव monocytes16से विभेदित मैक्रोफेज युक्त बिना प्लेस ।
    नोट: Formvar कोटिंग हानिकारक को रोकने के लिए पिपेट टिप के साथ ग्रिड को छूने के लिए नहीं सुनिश्चित करें ।
  5. 30 मिनट के लिए मशीन (३७ ° c, 5% CO2) कोशिकाओं का पालन करने दें ।
  6. 10% FCS युक्त RPMI के 2 मिलीलीटर के साथ अच्छी तरह से भरें ।
  7. ३७ ° c और 5% CO 2 पर 2 h के लिए डिवाइस AFM अवलोकन से पहले कोशिकाओं का पालन करने दें ।

4. Podosome प्रेरित विकृति की स्थलाकृति माप

  1. एक गिलास नीचे पेट्री डिश पर दोगुना पक्षीय चिपकने वाला टेप के दो स्ट्रिप्स छड़ी ।
    नोट: दो स्ट्रिप्स के बीच की दूरी ग्रिड व्यास से छोटी होनी चाहिए.
  2. सावधानी से चिपकने वाला टेप से मैक्रोफेज के साथ मढ़वाया ग्रिड अलग ।
  3. क्रम में शीशे का सामना करना पड़ कोशिकाओं और दो चिपकने वाला स्ट्रिप्स के बीच ग्रिड छड़ी के लिए ग्रिड उल्टा बारी ।
  4. डबल-तरफा चिपकने के दो नए स्ट्रिप्स के साथ ग्रिड को ठीक करें: ग्रिड इस प्रकार दो चिपकने वाली स्ट्रिप्स के बीच सैंडविच हो जाएगा, AFM टिप करने के लिए सुलभ ग्रिड के मध्य क्षेत्र छोड़ने.
    नोट: सुनिश्चित करें कि ग्रिड अच्छी तरह से तय है और मुड़ नहीं है; अंयथा AFM ब्रैकट Formvar सतह से संपर्क करने में सक्षम नहीं हो सकता है ।
  5. 10 मिमी HEPES (पीएच ७.४) के साथ पूरक-पूर्व गरम ३७ ° c संस्कृति मध्यम (RPMI 10% FCS के साथ) के 2 मिलीलीटर के साथ पेट्री पकवान भरें ।
  6. एक ३७ डिग्री सेल्सियस डिश हीटर पर संस्कृति पकवान प्लेस ।
  7. AFM स्टेज पर डिश हीटर स्थापित करें ।
  8. सिस्टम को ३७ ° c पर स्थिर करने दें ।
  9. एक ०.५ एनएन बल के साथ संपर्क मोड में, podosomes का पता लगाने के लिए एक पहली वैश्विक छवि बनाने, और फिर एक लगभग 20 एनएम-बड़े पिक्सेल के साथ 3 हर्ट्ज पर Formvar स्थलाकृति स्कैन.
    नोट: ग्रिड के किनारों के पास स्कैनिंग से बचें.

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Representative Results

इसके बाद के संस्करण प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे प्रयोगात्मक सेटअप तैयार करने के लिए एक Formvar सब्सट्रेट पर मैक्रोफेज podosomes द्वारा लागू की घुसपैठ बलों यों तो । यह AFM का उपयोग कर प्राप्त की है और चित्रा 1में सचित्र है ।

जब JPK डेटा प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर podosomes के नीचे उभारों की एक स्थलाकृतिक छवि का विश्लेषण, एक तीसरी डिग्री बहुपद फिट स्वतंत्र रूप से प्रत्येक स्कैन लाइन से घटाया जाना चाहिए । podosome-प्रेरित धक्कों की अधिकतम ऊंचाई छवि के किनारे पर एक जेड रंग पैमाने जोड़कर मूल्यांकन किया जा सकता है । TIFF स्वरूप में निर्यात किया जा रहा, के बाद स्थलाकृतिक छवि आगे एक समर्पित घर निर्मित ImageJ मैक्रो ऑनलाइन उपलब्ध8का उपयोग कर विश्लेषण है । यह मैक्रो सही ऊंचाई छवि पर उभारों को रेखांकित और एक बल नक्शा (चित्रा 2) दिए गए मापदंडों के अनुसार पैदावार: Formvar फिल्म मोटाई और podosome अंगूठी त्रिज्या । इसके अलावा, स्थूल भी Formvar सतह पर प्रत्येक पाया उभार के लिए निर्देशांक, ऊंचाई और गणना बल मूल्य के साथ एक पाठ फ़ाइल पैदावार ।

यह प्रक्रिया समय-चूक अधिग्रहण के मामले में भी लागू होती है । स्थूल तो मध्य समय बिंदु के बाद और पीछे से प्रत्येक उभार पटरियों, प्रयोक्ता सत्यापन का अनुरोध अगर कोई संदेह उठता है ।

Figure 1
चित्रा 1 : प्रायोगिक सेटअप
प्रयोगात्मक सेटअप के योजनाबद्ध चित्रण । कोशिकाओं को एक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ग्रिड एक पतली, अनुरूप Formvar फिल्म के साथ लेपित पर वरीयता प्राप्त कर रहे है और ग्रिड रखा है, नीचे का सामना करना पड़ कोशिकाओं, एक पेट्री डिश के अंदर । जब एक सब्सट्रेट करने के लिए, मैक्रोफेज फार्म माइक्रोन अत्यधिक गतिशील आसंजन संरचनाओं podosomes बुलाया का पालन । कोशिकाओं के नीचे Formvar फिल्म की स्थलाकृति तो AFM का उपयोग कर छवि है । Podosome सब्सट्रेट है, जो अपनी सतह पर उभारों में परिणाम के लिए ओर्थोगोनल बलों लागू होते हैं ।

Figure 2
चित्रा 2 : सब्सट्रेट विरूपण और podosomes द्वारा लागू बलों
Formvar फिल्म की स्थलाकृति विक्षेपन (बाएं पैनल) और ऊंचाई (मध्य पैनल, ऊंचाई के लिए रंग कोड) को दर्शाती कोशिकाओं के रिवर्स साइड पर । उभार फिल्म पर मनाया व्यक्तिगत podosomes द्वारा विकृति के अनुरूप है । प्रत्येक podosome द्वारा लागू बल मॉडल (सही पैनल द्वारा मूल्यांकन किया गया है, प्रत्येक स्थान एक podosome के अनुरूप है और बल मूल्यों रंग कोडित रहे हैं) । स्केल बार: 5 µm ।

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Discussion

सामग्री गुण

विकृत झिल्ली के लिए सामग्री का चुनाव, हमारे मामले Formvar में, कुछ आवश्यकताओं को पूरा करने की जरूरत है । सामग्री दिखाई रोशनी के लिए पारदर्शी होना चाहिए और सीमित ऑटो प्रतिदीप्ति उज्ज्वल क्षेत्र और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी में टिप्पणियों की अनुमति के लिए प्रदर्शन. पतली फिल्म की किसी न किसी सेल आसंजन पर किसी भी स्थलाकृतिक प्रभाव से बचने के लिए और AFM इमेजिंग द्वारा सेल प्रेरित दखलंदाजी का स्पष्ट अवलोकन की अनुमति देने के लिए 10 एनएम के नीचे अच्छी तरह से होना चाहिए । अंत में, झिल्ली की कठोरता है, जो युवा मापांक और सामग्री की मोटाई पर निर्भर करता है, के लिए पर्याप्त उच्च को podosomes के गठन के लिए प्रेरित करते हुए ठेठ podosome साइटों पर उत्पंन तनाव के लिए कुछ चौकस विकृति रखने की जरूरत है जिसमें करीब 10-100 केपीए हैं । Formvar सामग्री, 30-80 एनएम की पतली फिल्मों में तैयार इन सभी बाधाओं के बीच एक अच्छा समझौता है । यह नजर रखने लायक है कि Formvar झिल्ली की मोटाई ट्यूनिंग द्वारा, अपने कठोरता को7podosomes के mechanosensing गुणों का अध्ययन करने के लिए समायोजित किया जा सकता है ।

Reproducibility और गुणवत्ता Formvar की तैयारी

ग्रिड पर Formvar वर्तमान परतों के कुछ बैचों और इसलिए अनुपयोगी हैं: यह उज्ज्वल क्षेत्र छवियों पर पहले से देखा जा सकता है । हमारे अनुभव में, हम एक शर्त के लिए कई ग्रिड की जरूरत है, क्योंकि कई बार ग्रिड के बढ़ते सही नहीं है और ग्रिड चलता है या मुड़ जाता है । Formvar फिल्म की मोटाई को अपेक्षित बल के अनुकूल बनाने की जरूरत है. मोटा फिल्म, कड़ा यह है, लेकिन कम विकृतियों होगा, प्रेक्षण और अधिक कठिन बना रही है । इसके विपरीत, पतली फिल्म, और अधिक नाजुक यह है और अधिक मुश्किल से इसे फाड़ के बिना हेरफेर ।

स्थलाकृति मापन पर ब्रैकट द्वारा लागू बल का प्रभाव

या तो podosome की nanomechanical गतिविधि को प्रभावित करने या AFM जांच के साथ फिल्म विकृत के बिना फिल्म विरूपण का एक माप प्राप्त करने के लिए, यह AFM इमेजिंग के दौरान लागू बलों को नियंत्रित करने के लिए महत्वपूर्ण है । दरअसल, इमेजिंग के दौरान अत्यधिक बल लगाने से घुसपैठ की ऊंचाई और इस प्रकार की दखलंदाजी बल को बढ़ावा मिल सकता है । दूसरे शब्दों में, इस बल को अभी तक फैला हुआ स्थल के स्टाल बल से नीचे सीमित करने की आवश्यकता है । हम कुछ पिको-ंयूटन के सैकड़ों के लिए चारों ओर इमेजिंग के दौरान लागू बलों सीमित सलाह देते हैं ।

दखल बल मूल्यांकन के लिए मॉडल

AFM स्थलाकृतिक माप बल मूल्यों में परिवर्तित करने के लिए, यह सीमा की स्थिति को परिभाषित करने के लिए और बल आवेदन के स्थानिक विन्यास पता करने के लिए आवश्यक है. podosomes के मामले में, हम अपने आणविक संगठन के वर्तमान ज्ञान के आधार पर एक मॉडल का प्रस्ताव किया और सत्यापित किया कि इस मॉडल विरूपण स्थलाकृतिक टिप्पणियों के साथ संगत प्रोफाइल प्रदान की8. अधिक संक्षेप में, हम polymerizing ऊर्ध्वाधर actin एक केंद्रीय सब्सट्रेट और एक परिधीय उस पर खींच मॉड्यूल धक्का मॉड्यूल के रूप में आसंजन प्रोटीन की एक अंगूठी से घिरा रेशा के घने कोर मॉडलिंग की । इन दो अभिनय मॉड्यूल द्वारा सब्सट्रेट विकृति परिमित तत्व सिमुलेशन का उपयोग कर निर्धारित किया गया था, एक बल विरूपण रिश्ते के लिए अग्रणी । इस संख्यात्मक दृष्टिकोण के लिए धन्यवाद, हम बल-विरूपण रिश्ते पर एक ज्यामितीय पैरामीटर के प्रभाव की विशेषता, कि अंगूठी व्यास और सब्सट्रेट मोटाई ठीक मापा जा करने के लिए आवश्यक दिखा. की ऊंचाई ज सब्सट्रेट और बल एफ में एक podosome द्वारा लागू की के बीच संबंध के रूप में व्यक्त किया जा सकता है f = C0 e/(1-υ2) e3/2 ज, जहां e = २.१ GPa है युवा है Formvar के मापांक और υ = ०.३ इसके Poisson अनुपात7, सी0 २.७ और ई और आर क्रमशः फिल्म मोटाई और podosome8त्रिज्या निरूपित करने के लिए एक निरंतर बराबर है । प्रत्येक शर्त के लिए, आर के औसत मूल्य podosomes के प्रतिदीप्ति छवियों से प्राप्त किया गया था ।

दखलंदाजी बल माइक्रोस्कोपी के अनुप्रयोग

घुसपैठ बल माइक्रोस्कोपी लाभ मैक्रोफेज में इस्तेमाल किया गया था podosome बल पीढ़ी पर विशिष्ट प्रोटीन के महत्व का परीक्षण, podosome अंगूठी18 की यांत्रिक भूमिका का प्रदर्शन और spatio-बल के लौकिक सहसंबंध प्रकट podosomes8के नेटवर्क के भीतर करीब पड़ोसियों के बीच पीढ़ी ।

कोशिकाओं को कई जैविक प्रक्रियाओं में अपने वातावरण में बहर पाया गया है । इनवेसिव ट्यूमर कोशिकाओं invadopodia कहा जाता है, जो extracellular मैट्रिक्स गिरावट19के लिए आवश्यक है बुलाया घुसपैठ संरचनाओं का उपयोग करें । लिम्फोसाइटों को endothelium20के माध्यम से अपने transcellular diapedesis के दौरान endothelial कोशिकाओं में बहर दिखाया गया है । सेल-सेल इंटरेक्शन के कुछ उदाहरण भी सेलुलर फैलाने संरचनाओं पर भरोसा करते हैं: यह endothelial कोशिकाओं21पर टी कोशिकाओं के प्रतिजन मान्यता के लिए मामला है, और सेल फ्यूजन की दीक्षा के लिए कि सुराग के लिए multinucleated osteoclasts या करने के लिए myotubes 22 , 23 , 24. अंत में, internalization प्रक्रियाओं जैसे phagocytosis का उपयोग सेलुलर actin-आधारित संरचना है कि परियोजना के चारों ओर लक्ष्य शरीर25। फैलाया संरचनाओं द्वारा उत्पंन बलों का अध्ययन निश्चित रूप से इन प्रक्रियाओं में खेलने में तंत्र पर प्रकाश डाला मदद मिलेगी ।

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Disclosures

ब्याज का कोई विरोध नहीं घोषित ।

Acknowledgments

लेखक अन्ना Labernadie, Guillaume Charrière और पैट्रिक Delobelle को इस काम में उनके आरंभिक योगदान के लिए और Matthieu सांचेज और Françoise Viala को वीडियो फिल्माने और संपादन के साथ उनकी मदद के लिए आभारी हैं. यह काम l'Agence नेशनल डे ला सभ्य (ANR14-CE11-0020-02), ला शौकीनों डालो ला सभ्य Médicale (FRM DEQ2016 ०३३४८९४), INSERM योजना कैंसर, स्नेहन तुलूज़ कैंसर और मानव फ्रंटियर विज्ञान कार्यक्रम (RGP0035/

Materials

Name Company Catalog Number Comments
200 mesh nickel grids Electron Microscopy Sciences G200-Ni
Filter paper Sigma-Aldrich 1001-055
Microscope slides Fisher Scientific 10235612
White stickers 26 x 70 mm Avery DP033-100
Film casting device with valve in its outlet Electron Microscopy Sciences 71305-01
Razorblades Electron Microscopy Sciences 72000
Ethanol VWR 1.08543.0250
Acetone VWR 20066.321
Formvar 0.5% solution in ethylene dichloride Electron Microscopy Sciences 15820
12 mm coverslips VWR 631-0666
Inverted microscope Carl Zeiss Axiovert 200
Atomic Force Microscope JPK Instruments NanoWizard III
Temperature-controlled sample holder  JPK Instruments BioCell
Silicon nitride cantilever with a nominal spring constant of 0.01 N/m Veeco Instruments MLCT-AUHW
PBS Gibco 14190-094
Double-sided adhesive tape APLI AGIPA 118100
RPMI 1640 Gibco 31870-025
FCS Sigma-Aldrich F7524
HEPES  Sigma-Aldrich H0887
35 mm glass-bottom Petri dishes WPI FD35-100

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Bouissou, A., Proag, A., Portes, M., Soldan, V., Balor, S., Thibault, C., Vieu, C., Maridonneau-Parini, I., Poincloux, R. Protrusion Force Microscopy: A Method to Quantify Forces Developed by Cell Protrusions. J. Vis. Exp. (136), e57636, doi:10.3791/57636 (2018).

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