Summary
Her, detalj vi eksperimentelle teknikker brukes til å evaluere protrusion styrkene som podosomes gjelder på en kompatibel film, fra forberedelse av filmen til automatisk analyse av topografiske bilder.
Abstract
I mange biologiske sammenhenger må dyreceller bruke fysisk miljøet ved å utvikle mekaniske krefter. Blant disse, trekkraft styrker har vært godt karakterisert, men det er en mangel på teknikker slik at måling av protrusion styrkene utøves av cellene ortogonalt deres substrat. Vi utviklet en eksperimentelle oppsett å måle protrusion styrkene utøves av tilhenger cellene på deres substrat. Celler belagt på en kompatibel Formvar deformere dette underlaget og resulterende topografi er tilordnet av atomic force mikroskopi (AFM) i nanometer skala. Force verdier er deretter trukket ut fra en analyse av deformasjon profil basert på geometrien av protrusive cellular strukturer. Derfor kan styrker utøves av individet utstående enheter av en levende celle måles over tid. Denne teknikken gjør studiet av styrkegenerering og dens regulering i mange mobilnettet prosesser som involverer protrusion. Her beskriver vi programmet å måle protrusive krefter generert av podosomes dannet av menneskelig makrofager.
Introduction
Dyreceller samhandle fysisk med matrisen og de andre cellene som utgjør deres miljø1. Dette er nødvendig for dem å migrere, internalisere organer, hente eksterne informasjon eller skille. I slike prosesser, cellen må generere mekaniske krefter og, som mange studier har vist de siste årene, muligheten for en celle for å generere styrker og sonde omgivelsene påvirker virkemåten biologiske, regi for eksempel spredning eller differensiering2,3. Igjen, er måling av mobilnettet styrker en stor hjelp til studere regulering av styrkegenerering og forstå dens innblanding i cellen atferd og vev skjebne4,5.
De siste årene har vært vitne til utviklingen av mange teknikker å måle kreftene som en celle kan øve på sin omgivelsene6. Fleste av disse har vært medvirkende i avslørende trekkraft styrker at celler utøve de dra på mobile sonder eller en deformerbare substrat. Men de mekaniske kreftene involvert i protrusion ekstracellulære Environment lider av mangel på måling teknikker og er ennå ikke godt preget.
For å overkomme denne begrensningen, presenterer vi en metode for å måle styrker utøvde ortogonalt til underlaget. Det består i plating levende celler på et tynt elastisk ark som kan deformere ortogonale retning og gjør det mulig å måle substrat deformasjon av cellene og utlede kreftene som er involvert. Substrat topografi måles med nanoskala oppløsning bruker atomic force mikroskopi og evaluering av styrker fra deformasjon avhengig av kunnskap om geometrien av protrusive cellulære strukturer7,8, 9.
Her beskriver vi oppsettet og dens anvendelse å måle styrkene generert av podosomes, protrusive vedheft strukturer av makrofager for deres mesenchymal overføring i tredimensjonale omgivelser10,11, 12,,13,,14,,15,,16,,17. Vi tror at denne teknikken vil fremme forståelsen av styrkegenerering og dens regulering i mange mobilnettet prosesser som involverer protrusion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse av Formvar-belagt rutenett
- Rengjør elektronmikroskop rutenett med ren aceton og tørk dem på filter papir. Rengjør et mikroskop lysbilde med ren etanol, tørk med linsen papir og fjerne støv med en vifte.
- Plass en etanol-renset objektglass loddrett i trakten av filmen casting enhet som inneholder en løsning av Formvar i den nedre delen. Dekk toppen av trakten.
- Pumpe 100 mL Formvar løsning (0,5% i etylen dichloride) med atomizer pære inntil nivået når to tredjedeler av lysbildet.
- Holde lysbildet i løsningen for 1 min.
- Åpne ventilen på enheten å tømme Formvar løsningen i en jevn strøm. En flow rate på 10 til 15 mL/s vil gi en Formvar film av 30-80 nm. Tykkelsen på filmen bestemmes av konsentrasjonen av Formvar løsningen og drenering prisen.
Merk: Drenering hastigheten kan kontrolleres av lufting press via luft ut ventilen ved sakte åpner ventilen. Jo raskere drenering, jo tykkere filmen. I praksis, fordi det er vanskelig å forutsi filmen tykkelse fra Formvar flow rate, vi forbereder flere grupper av Formvar filmer og kontrollere sin tykkelse av AFM (se trinn 2). - Fjern lysbildet fra kammeret og tørk den delikat på filter papir å fjerne alle flytende Formvar.
- Klipp ut et rektangel 20 x 50 mm fra Formvar filmen med et barberblad.
- Fylle et beaker med rent destillert vann og sakte stuper lysbildet loddrett i vannet å flyte av filmen: filmen skal flyter på vannoverflaten.
- Sted tørr aceton-renset nett på filmen, skinnende ansiktet opp.
- Plass en runde glass dekkglassvæske (Ø 12 mm) på noen av rutenettene. Denne dekkglassvæske vil tjene til å måle tykkelsen film (se trinn 2).
- Dekke et mikroskop lysbilde med en hvit merkelapp endret for å passe den. Dypp lysbildet vertikalt på grensen av flytende Formvar filmen til hele filmen følger lysbildet. Fjerne overflødig vann fra lysbildet med filter papir og la det tørke i romtemperatur over natten.
2. måling av filmen tykkelse
- Skjær Formvar rundt dekkglassvæske med pinsett fjerne det fra lysbildet.
- Merk plasseringen i rutenettet under dekkglassvæske med en penn.
- Skjær Formvar rundt det merkede rutenettet for å ta det fra dekkglassvæske. Det vil derfor være et hull i den gjenværende Formvar ark, som tillater for å måle film tykkelsen. Dekker dekkglassvæske med PBS og plassere den på et glass lysbilde på mikroskopet.
- Montere en silicon nitride cantilever på AFM glass blokken, gjør at golden stripen ikke dekkes av spissen av våren.
Merk: Den sensitivitet og vår konstant hengende bør ha tidligere kalibrert i PBS. - Montere glass blokken på modulen AFM, og plasser modulen på mikroskopet.
- Plasser Formvar-belagt dekkglassvæske på observasjon kammeret og dekke det med 500 µL av PBS.
- Skanne kanten av hullet i Formvar arket med AFM i kontakt og en 0,5 nN force settpunkt.
- Bruke den dekkglassvæske glassoverflaten som referanse for høyde målinger og evaluere Formvar tykkelse som høyden av tverrsnittet (utføre minst 10 mål per Formvar satsvis).
3. seeding celler i rutenett
- Under sterilt hette, sette en stripe (12 mm x 3 mm) for dobbeltsidig teip på en dekkglassvæske.
- Klippe ut et Formvar-belagt rutenett med pinsett og putte den opp-ned på selvklebende strip (bare kanten av rutenettet må knyttes til båndet). Formvar filmen må møte i dekkglassvæske.
- Plasser denne enheten i en kultur godt.
- Plass en 10 µL dråpe RPMI uten FCS som inneholder 104 makrofager differensiert fra menneskelige monocytter16.
Merk: Sørg for ikke å berøre rutenettet med Pipetter spissen å hindre skadelig Formvar belegget. - Inkuber i 30 min (37 ° C, 5% CO2) for å la celler følge.
- Fyll opp godt med 2 mL RPMI inneholder 10% FCS.
- Inkuber enheten for 2t på 37 ° C og 5% CO2 la celler følge før AFM observasjon.
4. topografi målinger av Podosome-indusert deformasjoner
- Holde to strimler av doblet-sidig teip på et glass bunn Petriskål.
Merk: Avstanden mellom to strimler bør være mindre enn diameteren rutenett. - Nøye koble rutenettet belagt med makrofager fra teip.
- Slå av rutenettet opp ned for å få cellene mot glasset og stikke rutenettet mellom to limet strimler.
- Fastsette rutenettet med to nye strimler av doblet-sidig lim: rutenettet vil dermed være klemt mellom to teipen, forlate sentrale området av rutenettet tilgjengelig til AFM spissen.
Merk: Kontroller at rutenettet er godt fast og ikke vridd; ellers kanskje AFM hengende ikke kunne nærme Formvar overflaten. - Fyll Petriskål med 2 mL forvarmet 37 ° C kultur medium (RPMI med 10% FCS) med 10 mM HEPES (pH 7.4).
- Plass kultur rett på en 37 ° C parabolen ovn.
- Installere retten ovnen på AFM scenen.
- La systemet stabilisere på 37 ° C.
- I kontakt modus med 0,5 nN styrker, gjør et første globale bilde å finne podosomes og deretter skanne Formvar topografi ved 3 Hz med en ca 20 nm-store pixel.
Merk: Unngå skanning nær rutenettet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Over protokollen beskriver hvordan å forberede det eksperimentelle setup å kvantifisere protrusion styrker av macrophage podosomes på et Formvar substrat. Dette oppnås ved hjelp av AFM er illustrert i figur 1.
Når du analyserer en topografiske bilde av buler under podosomes ved hjelp av JPK databehandling programvaren, skal et tredje grad polynom passer uavhengig trekkes fra hver skanning linje. Den maksimale høyden på podosome-indusert støt kan vurderes ved å legge til en z-fargeskala på siden av bildet. Etter eksporteres i TIFF-format, analyseres videre topografiske bildet med en dedikert hjemmelaget ImageJ makroen tilgjengelig online8. Denne makroen finner buler på korrigert høyde bildet og gir kart force (figur 2) i henhold til gitt parametere: Formvar filmen tykkelse og podosome ring radius. I tillegg gir makroen også en tekstfil med koordinater, høyde og beregnede verdien for hver oppdaget bule på Formvar overflaten.
Denne prosessen gjelder også ved time-lapse oppkjøp. Makroen så spor hver bule fra midten tidspunktet fremover og bakover, ber brukeren validering hvis noen tvil oppstår.
Figur 1 : Eksperimentelle oppsett
Skjematisk illustrasjon av eksperimentelle. Celler er seeded på et elektronmikroskop rutenett belagt med en tynn, kompatibel Formvar film og rutenettet er plassert, celler vender ned, inne i en Petriskål. Når følge et substrat, danne makrofager submicron svært dynamisk vedheft strukturer kalles podosomes. Topografien Formvar filmen under cellene er da fotografert med AFM. Podosome gjelder styrker ortogonale underlaget, som resulterer i buler på overflaten.
Figur 2 : Substrat deformasjon og styrker utøves av podosomes
Topografi Formvar filmen på baksiden av cellene viser nedbøyning (venstre panel) og høyde (midtre panelet, fargekoder for høyde). Buler observert på filmen tilsvarer deformasjon av personlige podosomes. Kraften fra hver podosome vurderes ved modellen (høyre panel, hver spot tilsvarer en podosome og makt er fargekodet). Skala bar: 5 µm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Materialegenskaper
Valg av materiale for deformerbare membranen, i vårt tilfelle Formvar, må oppfylle noen få krav. Materialet må være gjennomsiktig til synlig lys og utstillingen begrenset auto fluorescens å tillate observasjoner i lyse og fluorescens mikroskopi. Råhet av tynne filmen må være godt under 10 nm å unngå noen topografiske effekt på celleadhesjon og å tillate klart observasjon av de celle-indusert utstikkende deler av AFM tenkelig. Til slutt, stivhet av membranen, som avhenger av unge modulus og tykkelsen av materialet, må være høy nok til å indusere dannelsen av podosomes samtidig noen observerbare deformability for typiske stress generert på podosome nettsteder som er rundt 10-100 kPa. Formvar materiale, utarbeidet i tynne filmer av 30-80 nm er et bra kompromiss mellom alle disse begrensningene. Det er verdt å merke seg at ved å justere tykkelsen på Formvar membran, kan dens stivheten justeres for å studere mechanosensing egenskapene til podosomes7.
Reproduserbarhet og kvaliteten på Formvar forberedelse
Noen grupper av Formvar presentere kaster på risten og er derfor ubrukelig: Dette kan sees på forhånd på lyse feltet bilder. I vår erfaring, trenger vi flere rutenett for ett vilkår fordi noen ganger montering av rutenettet er ikke perfekt og rutenettet flyttes eller får vridd. Tykkelsen på Formvar filmen må tilpasses den forventede kraften. Jo tykkere filmen, den stivere er, men lavere deformasjoner vil være, gjør observasjon vanskeligere. Omvendt, det tynnere filmen, de mer skjøre det og det vanskeligere å manipulere uten å rive det.
Påvirkning av kraften fra hengende på topografi målinger
For å få en måling av deformasjon filmen uten påvirker nanomechanical aktiviteten til podosome eller deformeres filmen med AFM sonde, er det avgjørende å kontroll styrker brukes under AFM bildebehandling. Faktisk kan bruke overdreven force under bildebehandling føre til en overvurdering protrusion høyde og dermed protrusion kraft. Med andre ord, er det behov for å begrense denne styrken langt under stall kraft utstående området. Vi anbefaler begrense anvendt styrker under bildebehandling rundt til noen hundrevis av pico-Newton.
Modell for protrusion tvinge evaluering
Slik konverterer AFM topografiske mål i kraft verdier, er det nødvendig å definere at betingelser og vite romlige konfigurasjonen av force søknad. Når det gjelder podosomes foreslått vi en modell basert på gjeldende kunnskap om sin molekylære organisasjon og bekreftet at denne modellen gitt deformasjon profiler samsvar med topografiske observasjoner8. Mer presist, modellert vi tett kjernen i polymerizing vertikal begrepsordbok filamenter omgitt av en ring av vedheft proteiner som en sentral modul skyve underlaget og en ekstern modul trekke på den. Substrat deformasjon av disse to modulene fungerende identifiserte bruker begrenset element simuleringer, fører til en force-deformasjon relasjon. Takket være denne numeriske preget vi påvirker hver geometriske parameteren force-deformasjon forholdet, viser at ringen diameter og underlaget tykkelse måtte måles nøyaktig. Forholdet mellom høyde h av en kul i underlaget og force F av en podosome kan uttrykkes som F = C0 E /(1-υ2) e/r2 3t, hvor E = 2.1 GPa er de unge modulus av Formvar og υ = 0,3 sin Poisson forholdet7, C0 er en konstant lik 2.7 og e og r henholdsvis betegne filmen tykkelse og podosome radius8. For hver tilstand, ble gjennomsnittlig verdi av r Hentet fra fluorescens bilder av podosomes.
Anvendelser av Protrusion Force mikroskopi
Protrusion force mikroskopi ble lønnsomt brukt i makrofager å teste betydningen av spesifikke proteiner på podosome styrkegenerering, demonstrere mekanisk rollen podosome ring18 og avsløre spatio-temporale sammenhenger av makt generasjon mellom nabo innenfor podosomes8.
Celler har blitt funnet for å stikke i deres miljø i flere biologiske prosesser. Invasiv tumorceller bruke protrusive strukturer kalles invadopodia, som er avgjørende for ekstracellulær matrix fornedrelse19. Lymfocytter har vist seg å stikke til endotelceller under deres transcellular diapedesis endotelet20. Noen forekomster av celle-celle samhandling også avhengige mobilnettet stikker strukturer: Dette er tilfellet for antigen anerkjennelse av T-celler på endotelceller21og initiering av cellen smelting som fører til multinucleated osteoklast eller myotubes 22 , 23 , 24. endelig internalisering prosesser som fagocytose bruk cellular utgangen-baserte strukturer prosjektet rundt målet kroppen25. Studere styrkene generert av stikker strukturer vil sikkert hjelpe belyse mekanismer på spill i disse prosessene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Forfatterne er takknemlig til Anna Labernadie, Guillaume Charrière og Patrick Delobelle for deres første bidrag til dette arbeidet og Matthieu Sanchez og Françoise Viala for deres hjelp med filming og redigering. Dette arbeidet har blitt støttet av l'Agence Nationale de la Recherche (ANR14-CE11-0020-02), la Fondation pour la Recherche Médicale (FRM DEQ2016 0334894), INSERM Plan kreft, Fondation Toulouse kreft og menneskelige Frontier Science Program (RGP0035/2016).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 200 mesh nickel grids | Electron Microscopy Sciences | G200-Ni | |
| Filter paper | Sigma-Aldrich | 1001-055 | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 10235612 | |
| White stickers 26 x 70 mm | Avery | DP033-100 | |
| Film casting device with valve in its outlet | Electron Microscopy Sciences | 71305-01 | |
| Razorblades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
| Ethanol | VWR | 1.08543.0250 | |
| Acetone | VWR | 20066.321 | |
| Formvar 0.5% solution in ethylene dichloride | Electron Microscopy Sciences | 15820 | |
| 12 mm coverslips | VWR | 631-0666 | |
| Inverted microscope | Carl Zeiss | Axiovert 200 | |
| Atomic Force Microscope | JPK Instruments | NanoWizard III | |
| Temperature-controlled sample holder | JPK Instruments | BioCell | |
| Silicon nitride cantilever with a nominal spring constant of 0.01 N/m | Veeco Instruments | MLCT-AUHW | |
| PBS | Gibco | 14190-094 | |
| Double-sided adhesive tape | APLI AGIPA | 118100 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 31870-025 | |
| FCS | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| 35 mm glass-bottom Petri dishes | WPI | FD35-100 |
References
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. Tissue Cells Feel and Respond to the Stiffness of Their Substrate. Science. 310, 1139-1143 (2005).
- Paszek, M. J., et al. Tensional Homeostasis and the Malignant Phenotype. Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- Gilbert, P. M., Weaver, V. M. Cellular Adaptation to Biomechanical Stress across Length Scales in Tissue Homeostasis and Disease. Seminars in Cell & Developmental Biology. 67, 141-152 (2017).
- Vining, K. H., Mooney, D. J. Mechanical Forces Direct Stem Cell Behaviour in Development and Regeneration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2017).
- Roca-Cusachs, P., Conte, V., Trepat, X. Quantifying Forces in Cell Biology. Nature Cell Biology. 19, 742-751 (2017).
- Labernadie, A., et al. Protrusion Force Microscopy Reveals Oscillatory Force Generation and Mechanosensing Activity of Human Macrophage Podosomes. Nature Communications. 5, 5343 (2014).
- Proag, A., et al. Working Together: Spatial Synchrony in the Force and Actin Dynamics of Podosome First Neighbors. ACS Nano. 9, 3800-3813 (2015).
- Proag, A., Bouissou, A., Vieu, C., Maridonneau-Parini, I., Poincloux, R. Evaluation of the Force and Spatial Dynamics of Macrophage Podosomes by Multi-Particle Tracking. Methods. 94, 75-84 (2016).
- Cougoule, C., et al. Three-Dimensional Migration of Macrophages Requires Hck for Podosome Organization and Extracellular Matrix Proteolysis. Blood. 115, 1444-1452 (2010).
- Cougoule, C., et al. Blood Leukocytes and Macrophages of Various Phenotypes Have Distinct Abilities to Form Podosomes and to Migrate in 3d Environments. European Journal of Cell Biology. 91, 938-949 (2012).
- Guiet, R., et al. Macrophage Mesenchymal Migration Requires Podosome Stabilization by Filamin A. Journal of Biological Chemistry. 287, 13051-13062 (2012).
- Maridonneau-Parini, I. Control of Macrophage 3d Migration: A Therapeutic Challenge to Limit Tissue Infiltration. Immunology Review. 262, 216-231 (2014).
- Park, H., et al. Tyrosine Phosphorylation of Wiskott-Aldrich Syndrome Protein (Wasp) by Hck Regulates Macrophage Function. Journal of Biological Chemistry. 289, 7897-7906 (2014).
- Van Goethem, E., et al. Macrophage Podosomes Go 3d. European Journal of Cell Biology. 90, 224-236 (2011).
- Van Goethem, E., Poincloux, R., Gauffre, F., Maridonneau-Parini, I., Le Cabec, V. Matrix Architecture Dictates Three-Dimensional Migration Modes of Human Macrophages: Differential Involvement of Proteases and Podosome-Like Structures. Journal of Immunology. 184, 1049-1061 (2010).
- Verollet, C., et al. Hiv-1 Reprograms the Migration of Macrophages. Blood. 125, 1611-1622 (2015).
- Bouissou, A., et al. Podosome Force Generation Machinery: A Local Balance between Protrusion at the Core and Traction at the Ring. ACS Nano. 11, 4028-4040 (2017).
- Lizarraga, F., et al. Diaphanous-Related Formins Are Required for Invadopodia Formation and Invasion of Breast Tumor Cells. Cancer Research. 69, 2792-2800 (2009).
- Carman, C. V., et al. Transcellular Diapedesis Is Initiated by Invasive Podosomes. Immunity. 26, 784-797 (2007).
- Sage, P. T., et al. Antigen Recognition Is Facilitated by Invadosome-Like Protrusions Formed by Memory/Effector T Cells. Journal of Immunology. 188, 3686-3699 (2012).
- Sens, K. L., et al. An Invasive Podosome-Like Structure Promotes Fusion Pore Formation During Myoblast Fusion. Journal of Cell Biology. 191, 1013-1027 (2010).
- Takito, J., et al. The Transient Appearance of Zipper-Like Actin Superstructures During the Fusion of Osteoclasts. Journal of Cell Science. 125, 662-672 (2012).
- Shilagardi, K., et al. Actin-Propelled Invasive Membrane Protrusions Promote Fusogenic Protein Engagement During Cell-Cell Fusion. Science. 340, 359-363 (2013).
- Freeman, S. A., et al. Integrins Form an Expanding Diffusional Barrier That Coordinates Phagocytosis. Cell. 164, 128-140 (2016).
