Summary
在这里, 我们提出了一个测试植物致病力的植物病原菌稻瘟病的协议.这份报告将有助于大规模筛选真菌分离株的致病型, 作为了解植物在分子育种过程中耐药性机制的良好出发点。
Abstract
植物拥有强大的系统来抵御致病真菌的潜在威胁。然而, 对于农业上重要的植物来说, 目前防治这种病原体的措施过于保守, 因而没有足够的效率, 而且可能造成环境风险。因此, 通过对抗病种质的鉴定、抗性基因的分离和鉴定以及分子育种, 确定寄主抗性因子, 以帮助自然控制植物病害是非常必要的。抗病品种。在这方面, 需要建立一个准确、快速、大规模的接种方法来培育和发展植物抗病基因。稻瘟病真菌病原菌引起严重的疾病症状和产量损失。近年来, m . 菌已成为研究植物真菌病原体相互作用机制的模型有机体。因此, 我们报告了植物毒性试验方法的发展, 这是特定的m. 菌。这种方法提供两种喷雾接种与孢子悬浮和伤人接种与菌丝立方体或孢子悬浮液滴。分离水稻叶片伤后接种方法的关键步骤是在植物叶片上制造伤口, 避免因寄主侵彻阻力而引起的干扰。这种喷雾/伤后的协议有助于快速, 准确, 大规模筛选致病型菌的分离株. 这种综合和系统的植物感染方法将作为一个良好的出发点, 以获得广泛的观点, 植物病理学的问题。
Introduction
水稻稻瘟病是1、2世界水稻品种中最严重的病害之一. 附着胞菌感染寄主植物的过程包括孢子的产生和表面附着、孢子萌发和的形成、渗透 peg 的形成和传染性菌丝分化以及疾病的传播。3. 所有这些阶段在许多其他植物病原真菌中很常见, 事实上, 任何单一阶段的封锁都可以防止寄主植物的感染。由于其经济重要性和遗传驯良, m . 菌已成为研究植物-真菌病原体相互作用机制1,4的模型有机体。因此, 研究m . 菌的这些发育阶段的分子基础将有助于阐明真菌致病性的分子机制和候选靶基因的鉴定, 以筛选和设计新的杀菌剂5。
最近有关m . 菌感染的报告着重于前侵染阶段的分子机制, 特别是 conidiation、附着胞形成、穿透钉和传染性生长3,6. 因此, 必须制定一项详细的议定书, 以测试m . 菌感染。在此, 我们提出了一个感染测试的详细方法, 利用喷雾介导的感染化验与孢子悬浮和接种的伤口, 菌丝插头的m。在本报告中, 该议定书的重点是菌株的培养, conidiation 溶液的制备, 以及菌丝栓介导的植物与m. 菌的接种。下面详细介绍了这些步骤, 并分别显示了图 1和表2中显示方法的整个工作流和典型病变的示意图视图。
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Protocol
1. 用悬浮菌孢子进行喷雾接种
-
菌的真菌培养
- 为真菌菌株制备燕麦番茄琼脂 (OTA) 培养基。
- 重 30-50 克燕麦片, 加入到800毫升的蒸馏/去离子水 (ddH2O) 和煮沸的混合物为30分钟在电热锅。
- 用一块纱布把煮过的燕麦汁过滤到烧杯中。
- 在烧杯中加入150毫升番茄汁和20克琼脂, 加入 ddH2O 至1000毫升。
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实验材料的制备
- 在大麦2o 中浸泡约50 种水稻 (稻) 品种 Lijiangxintuan-heigu (LTH) 在 ddH2o 3 d 或浸泡约50粒大麦 (ddH的 cv 金承诺), 约 1 d。
- 将大米或大麦的种子裹在潮湿的纱布中, 在湿润的滤纸上发芽, 在大约30培养皿中, 直径为10厘米 x 10 厘米, 28 摄氏度。水稻种子萌发时间约为 2-3 维, 大麦种子萌发时间约为2。温室相对湿度约为70%。
- 用蒸压灌封土和浇水, 然后用一层蛭石将大米或大麦的幼苗种植在盆中。
- 将植物放置在合适的温室或生长柜中, 温度在25摄氏度左右, 约 1 ~ 2 周。
- 用无菌手术剪刀切开3层滤纸, 用不育的外科剪 (每个圆应该有一个8厘米直径) 并且安置他们到100毫米无菌的塑料板材。
- 添加 ddH2O 到每道菜浸泡过滤纸。
- 确保过滤纸是完全湿的, 但添加没有额外的水。
- 用真空泵除去多余的水。
- 将2不育牙签放入培养皿中, 以支持大米/大麦叶;间隔 2-3 厘米的牙签。
- 在播种种子后, 在播种后的2周内收集大米的叶子, 或取去大麦的叶子 7 d。
- 用4到6叶的水稻/大麦幼苗, 从顶部到5厘米处切下茎下部, 收集叶子。
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喷雾接种协议
- 在恒温孵化器 (25 °c) 中, 对 OTA 板上的真菌菌株进行培养, 4 d。
- 添加〜2毫升的 ddH2O 使用 0.5-5 毫升吸管, 每4天老板。
- 用接种循环, 将m . 型菌的菌丝和突变株刮成菌丝碎屑。
- 收集菌丝碎片, 并将其转移到一个新的 OTA 板块。把菌丝碎片和吹干在干净的长凳上。
- 盖板与3层纱布, 以确保在温室中的孢子生长所需的湿度在25摄氏度在白天 (14 小时) 和23°c 在夜间 (10 h) 24-48 h。
- 在每道菜上加入2毫升的 ddH2O, 用不育的棉签轻轻地刮出孢子, 然后通过2层透镜纸过滤。注意不要刮伤培养基的表面。
- 将孢子悬浮液转移到一个新的50毫升管与 100-1000 µL 吸管。
- 离心机为5分钟, 最小为 5000 x 克25摄氏度。
- 除去上清和并用重悬颗粒, 在 0.025% (v/v) Tween-20 溶液中每毫升 2 x 104的孢子。Tween-20 溶液通常约为 10-20 毫升。
- 将孢子悬浮液倒入手持式喷雾器中。
- 将约10毫升的孢子悬浮液喷洒在2周大的水稻幼苗上, 或在7天大的大麦幼苗上的大麦叶上, 在黑暗中孵化25摄氏度, 湿润室为 ~ 24 h. 用 0.025% (v/v) Tween-20 溶液喷洒控制装置。
- 在25摄氏度的光照下, 将叶子转移到另一个潮湿的房间中, 周期为12小时。
- 在接种后记录 5 d 的疾病症状。检查长度为6厘米的病米/大麦叶片。评价标准是根据国际水稻研究所 (IRRI) 抗稻瘟病评分系统进行的。表 1列出了抗爆性评分系统的详细情况。
- 拍摄树叶以评估受试菌株的感染情况。感染是由每3.6 厘米2的病灶数量来评估的。
2. 用菌丝体或孢子悬浮液滴进行的伤杆菌接种
- 使用解剖针, 在分离的大米/大麦叶片的主脉上刮三 2-3 厘米长的伤口;注意不要穿透树叶。
- 把刮过的叶子放在牙签上, 在叶子上喷洒 0.02% (v/v) Tween-20 溶液, 形成一层水滴。
- 从 OTA 板上切下0.5 厘米 x 0.5 厘米的菌丝塞, 为每株m菌菌株 (野生型、突变体、补体菌株或其他试验菌株)。
- 将菌丝塞或25µL 滴孢子悬浮在受伤的叶子上, 在潮湿的房间里孵化25摄氏度的叶子, 3-8 d。
- 检查 5-7 d 接种后的病变。检查方法与喷雾接种方法相同 (见步骤 1.3.13)。
- 检查长度为6厘米的病米/大麦叶片, 并拍摄它们以评估受试菌株的感染情况。感染是由每3.6 厘米2的病灶数量来评估的。
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Representative Results
该技术的整个工作流如图 1所示。对14天的易感水稻幼苗 (CO-39 cv) 或7天大的大麦叶片进行了植物感染检测,7、8、9。为了测试水稻叶片的感染情况, 制备了 P131 菌野生型菌株的孢子悬浮 (1.0 x 105孢子 /毫升) 和 Com1 删除突变株, 然后喷洒到14天大易感性的叶鞘上。CO-39 幼苗, 然后保存在一个潮湿的房间 5 d10。P131-inoculated CO-39 叶表现出典型的水稻稻瘟病的健壮性病变, 但 Com1-inoculated 叶明显感染缺陷, 不能引起完全感染 (图 2a).野生型菌株 P131 是181988年由你-梁彭获得的一种菌株。MoKMT2H 零突变体 (ΔMoKMT2H) 是由曹等人在实验室中使用目标基因置换策略11获得的。Com1突变体是由杨等人在你-梁彭的实验室10中分离出来的。
为了检查ΔMoKMT2H菌是否能通过创面感染宿主细胞, 野生稻植株的擦伤叶通过喷雾法或伤后法接种ΔMoKMT2H菌丝塞11。ΔMoKMT2H喷出的叶片与 P131/wild-type 菌株相比, ΔMoKMT2H感染无明显缺陷;然而, 观察到ΔMoKMT2H 通过伤口接种的叶子有明显的缺陷 (图 2A)。为了进一步测试植物感染的大麦叶, 健康或受伤的叶子 (cv 金色承诺) 接种了孢子滴或菌丝插头, 分别是 Com1, ΔMoKMT2H, 或 P131。在接种 5 d 后, 典型的稻瘟病病变在ΔMoKMT2H或 P131 菌株接种的叶片上完全发育, 而 Com1 突变体的叶片上发现的小病灶较少 (图 2 B)。
图 1: 一种说明植物感染的方案.植物种子发芽在土壤中的塑料盆 (50 毫米2 x 50 毫米深, 有一个排水孔), 两个种子每壶, 和幼苗生长在一个温室。大田板上种植了稻瘟病菌的培养和接种。对于孢子喷洒接种方法, 在 0.02% (v/v) Tween-20 溶液中悬浮孢子悬浮, 并喷洒到水稻/大麦植株上。对于划伤接种方法, 刮过的大米/大麦植株叶片被放在塑料板上, 然后用菌丝塞或孢子悬浮剂接种。然后, 所有处理过的植物叶片为24小时的深色培养, 光培养为12小时。最后, 记录了单位内3.6 厘米2的菌落数。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: Com1 和 MoKMT2H 是水稻叶片孢子形成和致病性的必要条件。(A) 本小组显示通过孢子喷雾 (左) 或菌丝塞 (右) 接种水稻叶片, 其孢子来自m . 菌野型 P131、突变体Com1或ΔMoKMT2H。在菌丝栓介导的接种后, 对水稻叶片进行了7维的典型叶片观察。在菌丝栓介导的接种后, 观察到 5 d 的典型病变。(B)通过孢子喷雾 (左) 或菌丝塞 (右) 接种大麦叶。作为模拟治疗控制, 0.025% (v/v) Tween-20 溶液的体积是喷洒的。在伤口接种中, P131 的数目已由 Cao等改变。11. 子囊菌真菌中的MoKMT2H是 Ash1 的功能性同源, 它与 H3K4 和 H3K36 甲基化11有牵连。酒吧 = 1 厘米。Δcom1突变体对水稻和大麦幼苗的毒力显著降低10。请单击此处查看此图的较大版本.
| 规模 | 描述 |
| 1 | 小棕色斑点针点大小 |
| 2 | 小圆形到稍拉长, 坏死的灰色斑点, 直径约1-2 毫米, 有明显的棕色边缘。病灶主要见于上叶 |
| 3 | 病变类型与2相同, 但有显著的病变在 theupper 叶上。 |
| 4 | 典型易感爆炸病变, 3 毫米或更长, 感染不到4% 的 theleaf 地区 |
| 5 | 典型易感爆炸病变, 3 毫米或更长, 感染不到4-10% 的叶面积 |
| 6 | 典型易感爆炸病变, 3 毫米或更长, 感染不到11-25% 的叶面积 |
| 7 | 典型易感爆炸病变, 3 毫米或更长, 感染不到26-50% 的叶面积 |
| 8 | 典型易感爆炸性病变, 3 毫米或更长, 感染不到51-75% 的叶面积, 许多叶死亡 |
| 9 | 典型易感爆炸病变, 3 毫米或更长, 感染超过75% 的叶面积 |
表 1: 抗爆性能评分系统.该表由国际水稻研究所 (IRRI) 引用。
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Discussion
植物抗病基因在预防病原体感染方面起着至关重要的作用, 包括真菌病原体1、12。稻瘟病已被用来作为一个模型, 以了解病原体种群结构的性质, 并确定植物抗病基因4。因此, 有必要对主要品种的抗病基因型和无毒基因型进行大规模的检测, 以确定可持续栽培的抗病植物。此外, 无毒基因型在田间病原体中的优势, 使得寄主品种12、13不同抗病基因型的合理分布成为必然。然而, 目前的接种方法通常干扰筛选的抗药性和病原体鉴定14,15,16,17。
在此, 我们提出了一种快速、准确的检测植物感染的方法。这种接种方法适用于在抗性基因克隆过程中, 在育种试验和子代种群表型中鉴定抗病植物。在这里, 我们建立了一个方法, 接种受伤的植物叶片与m。由于寄主抗性在防止病原体传播中起着重要作用, 这种体外法对经试验的水稻叶片造成了创伤, 并在伤口上接种了稻瘟病, 便于直接感染叶子不需要穿透叶子表皮和表皮细胞壁。此外, 这种接种方法适用于不同的叶龄。接种结果稳定、准确。该方法可用于接种菌丝, 鉴定真菌菌株的致病性, 只产生少量的孢子。
这项议定书将进一步有助于我们了解真菌中保存的致病机制, 以及允许真菌抵抗和抑制其宿主13的先天免疫力的病原体特异因素。然而, 伤口接种不适用时, 试图确定的速度孢子入侵和菌丝扩张。但在自然状态下, 喷雾接种法能较好地反映病原体的致病性。喷雾接种法操作简便, 有利于提高工作效率。这些结果表明, 准确稳定的接种方法是筛选植物抗病基因和确定致病性的必要条件。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了北京农业大学 (YQ201603) 的专项科研项目和北京教育委员会 (KM201610020005) 科学项目的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Filter paper | GE Healthcare brand(Sweden) | 10311387 | |
| 50-mL tube | CORNING(Amercia) | 430290 | |
| Centrifuge | Eppendorf(Amercia) | 5804R | |
| Culture dish | Thermofisher(Amercia) | 150326 | |
| 0.5-5 mL pipette | Eppendorf | 4920000105 | |
| 100-1000uL pipette | Eppendorf | 4920000083 | |
| Vacuum pump | Leybold | D25B | |
| Dissection needle | FST | 26000-35 | |
| Incubator | MEMMERT | PYX313 | |
| Inoculation ring | Greiner Bio One | 731175 |
References
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