Summary
Her presenterer vi en protokoll for å teste anlegg virulens med anlegget patogen Magnaporthe grisea. Denne rapporten vil bidra til storskala screening av pathotypes av sopp isolerer og tjene som et utgangspunkt for å forstå motstandsdyktig mekanismer for planter under molekylær avl.
Abstract
Planter har et kraftig system for å forsvare seg mot potensielle trusler av patogene sopp. For agriculturally viktig planter, men gjeldende tiltak for å bekjempe slike patogener bevise for konservative og dermed ikke tilstrekkelig effektiv, og de kan potensielt utgjøre miljørisiko. Derfor er det svært nødvendig å identifisere vert-motstand faktorene å hjelpe inne kontrollerende anlegget sykdommer naturlig gjennom identifikasjon av motstandsdyktig germplasm, isolering og karakterisering av motstand gener og molekylære oppdrett av motstandsdyktig kultivarer. I denne forbindelse, det er behov å etablere en nøyaktig, rask og omfattende inoculation metode å avle og utvikle anlegget motstand gener. Ris sprenge fungal patogen Magnaporthe grisea forårsaker alvorlig sykdomssymptomer og yield tap. M. grisea har nylig dukket opp som en modell organisme for å studere mekanismer av plante-fungal patogen interaksjoner. Derfor rapportere vi utviklingen av en plante virulens test metoden som gjelder M. grisea. Denne metoden gir både spray inoculation med en conidial suspensjon og såret inoculation med mycel kuber eller dråper av conidial suspensjon. Det viktigste trinnet i såret inoculation metoden for frittstående ris blader er å lage sår på anlegget blader, som unngår forstyrrelser forårsaket av verten gjennomtrenging motstand. Dette spray/såret protokollen bidrar til rask, nøyaktig og omfattende screening av pathotypes av M. grisea isolerer. Dette integrert og systematisk anlegget infeksjon metoden vil tjene som et utgangspunkt for å få et bredt perspektiv av problemene i anlegget patologi.
Introduction
Ris blast, forårsaket av M. grisea, er en av de mest alvorlige sykdommene for ris varianter verdensomspennende1,2. Prosessen som M. grisea infiserer Salix inkluderer conidia produksjon og overflate vedlegg, en conidia spiring og appressorium formasjon, en formasjon av penetrasjon pinne og smittsomme hypha differensiering, og en sykdom spre 3. alle disse stadiene er vanlig i mange andre plante patogene sopp, og, faktisk, en blokade av helst enkelt forhindrer infeksjon av Salix. Den økonomiske betydningen og genetisk tractability, M. grisea har dukket opp som en modell organisme for å studere mekanismer av plante-fungal patogen interaksjoner1,4. Derfor vil studere molekylære grunnlaget for disse utviklingsstadier i M. grisea bidra til å belyse molekylære mekanismer underliggende fungal virusets og identifikasjon av kandidat målet gener for screening og utforme roman soppmidler5.
Nylige rapporter om M. grisea infeksjon har fokusert på molekylære mekanismer av pre penetrasjon scenene, spesielt conidiation, appressorium dannelse, penetrasjon pinnene og smittsomme vekst3, 6. det er derfor viktig å utvikle en detaljert protokoll for å teste M. grisea infeksjon. Her presenterer vi en detaljert metode for en infeksjon test som benytter spray-mediert infeksjon analyser med en conidial suspensjon og inoculation av sår med mycelial pluggene til M. grisea. I denne rapporten fokuserer protokollen på kultur stammer, utarbeidelse av den conidiation løsningen for sprøyting og mycelial plug-mediert inoculation planter med M. grisea. Denne fremgangsmåten er beskrevet i detalj nedenfor, og en skjematisk visning viser hele arbeidsflyten metoden og en typisk lesjon er vist i figur 1 og 2, henholdsvis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. spray Inoculation med en suspensjon av M. grisea Conidia
-
Fungal kultur for M.grisea
- Forberede havremel tomat agar (OTA) kultur medium fungal stammer.
- Veie 30-50 g av havremel, legge dette til 800 mL destillert/ikke-ionisert vann (ddH2O) og koke blandingen i 30 min i elektrisk potten.
- Filtrere kokt havregryn juice i begeret gjennom et stykke gasbind.
- Legge til 150 mL av tomatjuice og 20 g agar filtratet i begeret og legge ddH2O opptil 1000 mL.
-
Utarbeidelse av experimental materialer
- Nyt 50 frø av ris (Oryza sativa) cultivar Lijiangxintuan-heigu (LTH) i ddH2O for 3 d eller suge 50 frø bygg (Hordeum vulgare cv Golden lover) i ddH2O for ca 1 d.
- Pakk frøene av ris eller bygg i fuktig gasbind og spire dem på fuktig filter papir i ca 30 Petri retter med en diameter på 10 cm x 10 cm på 28 ° C. Ris seedet spiring tiden er ca 2-3 d, er Bygg frø spiring tiden ca 2 d. Relativ fuktighet i drivhuset er ca 70%.
- Plant seedlings ris eller bygg i potter autoklaveres potting jord og vanning og da dekke dem med et lag av vermikulitt.
- Plasser plantene i egnet glasshouse eller vekst skap ved 25 ° C i ca 1 ~ 2 uker.
- Skjær 3 lag med filter papir i sirkler med sterilt kirurgisk saks (hver sirkel bør ha en 8 cm diameter) og plassere dem på 100 mm steril plast-plater.
- Legge til ddH2O hver rett å suge filter papir.
- Kontroller filteret papiret er helt våt, men legger ingen ekstra vann.
- Fjerne alle overflødig vann med en vakuumpumpe.
- Sted 2 sterilt tannpirkere i kultur retten å støtte ris/Bygg bladene; Space tannpirkere ~ 2-3 cm fra hverandre.
- Samle bladene av ris 2 uker etter sådde frøene eller ta bladene av Bygg 7 d etter sådde frøene.
- Bruker 4 - til 6-leaf seedlings ris/bygg, klipp nedre del av stilken ~ 5 cm fra toppen og samle bladene.
-
Spray inoculation protokollen
- Kultur fungal belastningen på OTA plater i en termostatstyrt inkubator (25 ° C) for ~ 4 d.
- Legg ~ 2 mL ddH2O bruke en 0,5 - 5 mL Pipetter til hver 4 dager gamle plate.
- Med en inokuleringen sløyfe, skrape mycelia av M. grisea vill-type belastning og mutert stamme til mycelia rusk.
- Samle mycelia rusk og overføre den til en ny OTA-plate. Ta mycelia rusk og blåse tørr i ren benken.
- Dekk platen med 3 lag med gasbind å sikre fuktigheten kreves for veksten av conidia i drivhus ved 25 ° C i dag (14 h) og 23 ° C i natt (10 h) for 24-48 h.
- Legg 2 mL av ddH2O til hver rett og skrape conidia forsiktig med steril bomull vattpinner etterfulgt av en filtrering gjennom 2 lag av linsen papir. Pass på at du ikke skraper overflaten av kultur medium.
- Overføre conidia suspensjon i en ny 50 mL tube med en 100-1000 µL pipette.
- Sentrifuge for 5 min på et minimum av 5000 x g ved 25 ° C.
- Fjern nedbryting og resuspend pellets for å gi 2 x 104 conidia per mL i en 0.025% (v/v) Tween-20 løsning. Tween-20 løsningen er vanligvis ca 10-20 mL.
- Hell spore suspensjon i en håndholdt sprøyta.
- Spay ca 10 mL av conidial suspensjon på ris bladene av 2-uke-gamle ris frøplanter eller bygg blader av 7 dager gamle bygg seedlings og ruge dem ved 25 ° C i en mørk, fuktig kammer for ~ 24 h. Spray kontroll planter med 0.025% (v/v) Tween-20 løsning.
- Overføre bladene til en annen fuktig kammer under fluorescerende lys ved 25 ° C for en fotoperiode 12 h.
- Registrere sykdommen symptomer på 5 d etter inoculation. Undersøke syke ris/Bygg bladene ~ 6 cm i lengde. Evalueringen standard er ifølge scoring system for blast motstand av International ris Research Institute (IRRI). Detaljene i scoring system for blast motstand er vist i tabell 1.
- Fotografere bladene for å evaluere infeksjon av de testede stammene. Infeksjonen ble vurdert antall lesjoner per 3,6 cm2.
2. såret Inoculation med mycel kuber eller dråper av Conidial suspensjon av M. grisea
- Bruker en anatomisk nål, skrap tre 2-3 cm lange sår i viktigste venene frittliggende ris/Bygg blader; ta vare ikke for å trenge bladene.
- Skrapte bladene oppføre tannpirkere og spray en 0.02% (v/v) Tween-20 løsning på bladene danner et lag av dråper.
- Kuttet en 0,5 cm x 0,5 cm mycelial plugg for hver M. grisea stamme (vill-type, mutant, supplement stammer eller andre test stammer) fra en OTA plate.
- Sette mycelial pluggene eller 25 µL dråper av conidial suspensjon på sårede blader og ruge bladene ved 25 ° C i en fuktig kammer for 3-8 d.
- Undersøke lesjoner på 5-7 d etter vaksinering. Eksamen er den samme som for spray inoculation metoden (se trinn 1.3.13).
- Undersøk syke ris/Bygg bladene ~ 6 cm i lengde og fotografere dem for å evaluere infeksjon av de testede stammene. Infeksjonen ble vurdert antall lesjoner per 3,6 cm2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hele arbeidsflyten for teknikken er vist i figur 1. Anlegget infeksjon analyser ble utført på 14 dager gamle utsatt ris planter (O. sativa cv CO-39) eller utsatt 7 dager gamle bygg (H. vulgare cv Golden lover)7,8,9. For å teste for en infeksjon på ris bladene, en conidial suspensjon (1.0 x 105 sporer/mL) av M. grisea vill-type belastning P131 og Com1 sletting mutert stamme var forberedt og deretter sprayet på blad sheaths av 14-dag-gamle utsatt CO-39 frøplanter, som deretter ble holdt i et fuktig kammer for 5 d-10. P131-inokulert CO-39 etterlater vises typisk robust lesjoner av ris blast, men Com1-inokulert bladene viste åpenbare infeksjon feil og kunne ikke framprovosere en full infeksjon (figur 2A). Vill-type belastningen P131 er en påkjenning innhentet av deg-Liang Peng i 198818. MoKMT2H null mutant (ΔMoKMT2H) ble innhentet av Cao et al. i vår lab bruker en mål genet erstatning strategi11. Com1 mutant ble isolert av Yang et al. i du-Liang Peng lab10.
Hvis du vil kontrollere om M. grisea ΔMoKMT2H kan infisere verten cellene til sår, abraded blader av vill-type ris planter ble inokulert med mycelial pluggene til ΔMoKMT2H via metoden spray eller såret metode11. Bladene som var spray-inokulert med ΔMoKMT2H avdekket ingen åpenbar feil i ΔMoKMT2H infeksjon sammenlignet med P131/vill-type belastningen; Imidlertid ble åpenbart feil observert i bladene vaksinere med ΔMoKMT2H via sår (figur 2A). Å teste videre anlegget infeksjon med Bygg blader, sunn eller såret blader (cv Golden lover) ble inokulert med conidial dråper eller mycelial plugger, henholdsvis Com1, ΔMoKMT2Heller P131. På 5 d etter vaksinasjon, hadde typisk ris blast lesjoner fullt utviklet på bladene vaksinere med enten ΔMoKMT2H eller P131 belastning, mens færre og mindre lesjoner funnet på bladene vaksinere med Com1 mutant (figur 2 B).
Figur 1 : En ordning illustrerer anlegget infeksjon. Anlegget var spirer i jord i plast Potter (50 mm2 x 50 mm dyp, med drenering hull), to frø per pott og seedlings ble dyrket i drivhus. Kulturen og vaksinasjoner til blast sopp M. grisea var vokst på OTA plater. For conidia sprøyting inoculation metoden, ble conidia suspensjon suspendert i en 0.02% (v/v) Tween-20 løsning og sprayet på ris/Bygg planter. For metoden riper inoculation ble skrapte ris/Bygg anlegg bladene satt på plast-plater og deretter inokulert av en mycelial plugg eller conidia suspensjon. Og deretter alle behandlet anlegget bladene var mørk-kulturperler 24 h og lys-kulturperler 12 h. Til slutt, antall kolonier i enheter av 3,6 cm2 ble spilt inn. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Com1 og MoKMT2H kreves for en conidium formasjon og virusets på ris blader. (A) dette panelet viser inoculation ris forlater via conidia spray (venstre) eller mycelial plugg (høyre) med conidia fra M. grisea vill-type P131, mutant Com1eller ΔMoKMT2H. Typisk blader ble observert 7 d etter mycelial plug-mediert inoculation, som ble gjennomført på abraded ris blader. Typisk lesjoner ble observert 5 d etter mycelial plug-mediert inoculation. (B) Bygg blader ble inokulert via conidia spray (venstre) eller mycelial plugg (høyre). Som en uekte behandling, ble det samme volumet av en 0.025% (v/v) Tween-20 løsning sprayet. For såret inoculation, har figuren av P131 blitt endret fra Cao et al. 11. MoKMT2H i den ascomycete sopp er en funksjonell homolog av Ash1, som er involvert i H3K4 og H3K36 metylering11. Baren = 1 cm. Δcom1 mutanter ble betydelig redusert virulens på ris og bygg seedlings10. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Skala | Beskrivelse |
| 1 | Små brune flekker sylskarp størrelse |
| 2 | Små roundish litt avlang, nekrotisk grå flekker, ca 1-2 mm i diameter, med en tydelig brun margin. Lesjoner er hovedsakelig funnet på øvre bladene |
| 3 | Lesjon er lik 2, men betydelig antall lesjon er på theupper blader |
| 4 | Typisk utsatt blast lesjoner, 3 mm eller lengre, infiserer mindre enn 4% av theleaf |
| 5 | Typisk utsatt blast lesjoner, 3 mm eller lengre, infisere mindre enn 4-10% av området blad |
| 6 | Typisk utsatt blast lesjoner, 3 mm eller lengre, infisere mindre enn 11-25% av området blad |
| 7 | Typisk utsatt blast lesjoner, 3 mm eller lengre, infisere mindre enn 26-50% av området blad |
| 8 | Typisk utsatt blast lesjoner, 3 mm eller lengre, infisere mindre enn 51-75% av området blad, mange blader døde |
| 9 | Typisk utsatt blast lesjoner, 3 mm eller lengre, infisere mer enn 75% av området blad |
Tabell 1: et poengsystem for blast motstand. Tabellen er sitert fra International ris Research Institute (IRRI).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Plante sykdom motstand genene spiller en viktig rolle i å forebygge infeksjoner av patogener, inkludert sopp patogener1,12. Ris blast er brukt som modell å forstå naturen av patogen befolkningen strukturer og identifisere anlegget motstand gener4. Derfor er det nødvendig å undersøke sykdom motstand genotype og avirulence genotyper av de viktigste variantene av agricultural planter i stor skala å identifisere sykdom-motstandsdyktig planter som kan dyrkes kontinuerlig. Videre nødvendiggjøre fordelene avirulence genotyper feltet patogener rasjonell fordeling av de ulike motstandsdyktig genotyper vert varianter12,13. Men påvirke dagens vaksinering metoder vanligvis screening for motstand og patogen, identifikasjon,14,,15,,16,,17.
Her presenterer vi en rask og nøyaktig metode for å teste anlegg infeksjon. Denne inoculation metoden er egnet for identifikasjon av resistente planter under avl prøvelser og fenotypen av avkom innbyggere under kloning av motstand gener. Her etablert vi en metode for å vaksinere sårede anlegget blader med M. grisea. Fordi vert motstanden spiller en stor rolle i å forebygge spredningen av en patogen, denne i vitro metoden, som produserte sår på testet ris blader og inokulert ris eksplosjonen på såret, er nyttig for å lage en infeksjon direkte i bladene uten å trenge gjennom blad overhuden og epidermal cellen vegg. Videre er denne inoculation metoden egnet for ulike blad aldre. Vaksinering resultatene er stabil. Metoden såret vaksinering kan brukes for inoculation med mycelia for å identifisere virusets av sopp stammer som produserer bare lave mengder conidia.
Denne protokollen vil ytterligere bidra til vår forståelse av patogene mekanismer som er bevart i sopp, samt de patogen-spesifikke faktorene som tillater en sopp å motstå og undertrykke medfødt immunitet av dens vert13. Såret inoculation er imidlertid ikke tilgjengelig når du prøver å bestemme frekvensen av en conidial invasjon og mycelia ekspansjon. Men staten, spray inoculation metoden kan bedre reflektere virusets av en patogen. Spray inoculation metoden er enkel å betjene og bidrar til å forbedre arbeidseffektivitet. Til sammen plant disse resultatene indikerer en nøyaktig og stabil inoculation metode er nødvendig for screening motstand gener og bestemme virusets.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av spesiell vitenskapelig prosjektet Beijing landbruk University (YQ201603) og vitenskapelige prosjektet i Beijing pedagogiske Committee (KM201610020005).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Filter paper | GE Healthcare brand(Sweden) | 10311387 | |
| 50-mL tube | CORNING(Amercia) | 430290 | |
| Centrifuge | Eppendorf(Amercia) | 5804R | |
| Culture dish | Thermofisher(Amercia) | 150326 | |
| 0.5-5 mL pipette | Eppendorf | 4920000105 | |
| 100-1000uL pipette | Eppendorf | 4920000083 | |
| Vacuum pump | Leybold | D25B | |
| Dissection needle | FST | 26000-35 | |
| Incubator | MEMMERT | PYX313 | |
| Inoculation ring | Greiner Bio One | 731175 |
References
- Li, W. T., et al. A natural allele of a transcription factor in rice confers broad-spectrum blast resistance. Cell. 170 (1), 114-126 (2017).
- Chi, M. H., Park, S. Y., Kim, S., Lee, Y. H. A novel pathogenicity gene is required in the rice blast fungus to suppress the basal defenses of the host. PLoS Pathogens. 5 (4), 1000401 (2009).
- Jia, Y., Valent, B., Lee, F. N. Determination of host responses to Magnaporthe grisea.on detached rice leaves using a spot inoculation method. Plant Disease. 87 (2), 129-133 (2003).
- Ebbole, D. J. Magnaporthe as a model for understanding host-pathogen interactions. Annual Review of Phytopathology. 45, 437-456 (2007).
- Hamer, J. E., Talbot, N. J. Infection-related development in the rice blast fungus Magnaporthe grisea. Current Opinion in Microbiology. 1 (6), 693-697 (1998).
- Howard, R. J., Valent, B. Breaking and entering: host penetration by the fungal rice blast pathogen Magnaporthe grisea. Annual Review of Microbiology. 50, 491-512 (1996).
- Chen, X. L., et al. N-Glycosylation of Effector Proteins by an α-1,3- Mannosyltransferase Is Required for the Rice Blast Fungus to Evade Host Innate Immunity. The Plant Cell. 26 (3), 1360-1376 (2014).
- Zhang, Y., et al. M.ARG1, MoARG5,6 and MoARG7 involved in arginine biosynthesis are essential for growth, conidiogenesis, sexual reproduction, and pathogenicity in Magnaporthe oryzae. Microbiological Research. 180, 11-22 (2015).
- Du, Y. X., et al. A serine/threonine-protein phosphatase PP2A catalytic subunit is essential for asexual development and plant infection in Magnaporthe oryzae. Current Genetics. 59 (1-2), 33-41 (2013).
- Yang, J., et al. A novel protein com1 is required for normal conidium morphology and full virulence in Magnaporthe oryzae. Molecular Plant-Microbe Interactions. 23 (1), 112-123 (2010).
- Cao, Z. J., et al. An ash1-like protein MoKMT2H null mutant is delayed for conidium germination and pathogenesis in Magnaporthe oryzae. BioMed Research International. 2016, 1575430 (2016).
- Bryan, G. T., et al. A single amino acid difference distinguishes resistant and susceptible alleles of the rice blast resistance gene Pi-ta. The Plant Cell. 12 (11), 2033-2045 (2000).
- Zhou, J. M. Plant pathology: a life and death struggle in rice blast disease. Current Biology. 26 (18), 843-845 (2016).
- Guo, M., et al. MoGrr1, a novel F-box protein, is involved in conidiogenesis and cell wall integrity and is critical for the full virulence of Magnaporthe oryzae. Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (19), 8075-8088 (2015).
- Talbot, N. J. On the trail of a cereal killer: Exploring the biology of Magnaporthe grisea. Annual Review of Microbiology. 57, 177-202 (2009).
- Wilson, R. A., Talbot, N. J. Under pressure: investigating the biology of plant infection by Magnaporthe oryzae. Nature Reviews Microbiology. 7, 185-195 (2009).
- Jia, Y. L., Lee, F. N., McClung, A. Determination of Resistance Spectra of the Pi-ta and Pi-k Genes to U.S. Races of Magnaporthe oryzae Causing Rice Blast in a Recombinant Inbred Line Population. Plant Disease. 93, 639-644 (2009).
- Peng, Y. L., Shishiyama, J. Temporal sequence of cytological events in rice leaves infected with Pyricularia oryzae. Canadian Journal of Botany. 66 (4), 730-735 (1988).
