Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para testar a virulência da planta com o patógeno vegetal Magnaporthe grisea. Este relatório contribuirá para o rastreio em larga escala das raças de isolados de fungos e servir como um excelente ponto de partida para a compreensão dos mecanismos resistentes de plantas durante reprodução molecular.
Abstract
As plantas possuem um sistema poderoso para se defender contra potenciais ameaças por fungos patogênicos. Para plantas agronomicamente importantes, no entanto, medidas atuais para combater tais patógenos revelaram-se demasiado conservadoras e, assim, não é suficientemente eficaz e eles podem potencialmente representar riscos ambientais. Portanto, é extremamente necessário identificar fatores de resistência do hospedeiro para auxiliar no controle de doenças de plantas naturalmente através da identificação de germoplasma resistente, o isolamento e caracterização de genes de resistência e a reprodução molecular de cultivares resistentes. A este respeito, há necessidade de estabelecer um método de inoculação precisa, rápida e em larga escala para criar e desenvolver genes de resistência da planta. O arroz bombardear o patógeno fungo Magnaporthe grisea causas sintomas de doença grave e perdas de rendimento. Recentemente, M. grisea tem emergido como um organismo modelo para estudar os mecanismos de interações planta-fungo patogênico. Daí, nós relatamos o desenvolvimento de um método de teste de virulência de planta que é específico para M. grisea. Este método fornece para inoculação de pulverizador com uma suspensão conidiais e ferindo inoculação com cubos de micélio ou gotículas de suspensão conidiais. A etapa chave do método de inoculação ferindo para folhas de arroz destacado é tornar-se feridas nas folhas da planta, que evita qualquer interferência causada pela resistência à penetração do anfitrião. Este pulverizador/ferir protocolo contribui para o rastreio rápido, preciso e em grande escala das raças de isolados de M. grisea . Este integrado e o método de infecção sistemática vegetal irá servir como um excelente ponto de partida para a obtenção de uma perspectiva ampla de questões em Fitopatologia.
Introduction
Brusone do arroz, causada pelo M. grisea, é uma das doenças mais graves para as variedades de arroz em todo o mundo1,2. O processo pelo qual M. grisea infecta plantas hospedeiras inclui uma produção de conídios e a fixação de superfície, uma germinação de conídios e a formação de apressório, uma formação do peg de penetração e diferenciação de hifa infecciosa, e uma doença se espalhar 3. todas as etapas são comuns em muitos outros fungos patogênicos de plantas, e, de fato, um bloqueio de qualquer único estágio impede a infecção de plantas hospedeiras. Devido à sua importância económica e rastreabilidade genética, M. grisea tem emergido como um organismo modelo para estudar os mecanismos da planta-fungo patógeno interações1,4. Portanto, estudar a base molecular destes estágios do desenvolvimento de M. grisea ajudará a elucidar os mecanismos moleculares subjacentes à patogenicidade de fungosa e a identificação de genes-alvo candidato para triagem e projetando romance fungicidas,5.
Relatórios recentes relativas à infecção de M. grisea centraram-se sobre os mecanismos moleculares das fases pré-penetração, especialmente o conidiation, a formação de apressório, os pinos de penetração e o crescimento infecciosas3, 6. por conseguinte, é essencial para desenvolver um protocolo detalhado para testar infecção M. grisea . Neste documento, apresentamos um método detalhado para testes de infecção que utiliza ensaios de infecção mediada por pulverização com uma suspensão conidiais e a inoculação de feridas com plugues micelial de M. grisea. Neste relatório, o protocolo centra-se na cultura de cepas, a preparação da solução para a pulverização de conidiation e a inoculação do micélio plug-mediada de plantas com M. grisea. Essas etapas são descritas em detalhes abaixo e uma visão esquemática mostrando o fluxo de trabalho inteiro do método e uma lesão típica são mostrados nas figuras 1 e 2, respectivamente.
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Protocol
1. spray inoculação com uma suspensão de conídios de M. grisea
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Cultura de fungosa por M.grisea
- Prepare o meio de cultura de ágar (OTA) de tomate de aveia para estirpes fúngicas.
- Pesar de 30-50 g de farinha de aveia, adicione isto a 800 mL de água destilada/deionizada (ddH2O) e ferver a mistura por 30 min na panela elétrica.
- Filtre o suco aveia cozida para o béquer através de um pedaço de gaze.
- Adicionar 150 mL de suco de tomate e 20 g de ágar-ágar ao filtrado no copo e adicione O ddH2até 1.000 mL.
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Preparação dos materiais experimentais
- Absorver cerca de 50 sementes de cultivares de arroz (Oryza sativa) Lijiangxintuan-heigu (LTH) em ddH2O para 3-d ou absorver cerca de 50 sementes de cevada (Hordeum vulgare cv Golden promessa) em ddH2O para cerca de 1 d.
- Envolva as sementes de arroz ou cevada em gaze úmida e germiná-los em papel de filtro úmido em cerca de 30 caixas de Petri com um diâmetro de 10 cm x 10 cm a 28 ° C. O tempo de germinação de sementes de arroz é de cerca de 2-3 d, o tempo de germinação de sementes de cevada é cerca de 2 d. A umidade relativa na estufa é cerca de 70%.
- Plantar as sementes do arroz ou cevada em uns potenciômetros usando o solo de potting autoclavados e rega e em seguida, cubra-os com uma camada de vermiculita.
- Coloque as plantas em uma estufa apropriada ou crescimento do armário a 25 ° C, durante cerca de 1 ~ 2 semanas.
- Corte 3 camadas de papel de filtro em círculos com estéril tesoura cirúrgica (cada círculo deve ter um diâmetro de 8 cm) e colocá-los em placas de plástico estéril de 100 mm.
- Adicione O ddH2para cada prato para embeber o papel de filtro.
- Certifique-se de que o papel de filtro é completamente molhado, mas adicionar sem água extra.
- Remova qualquer excesso de água com uma bomba de vácuo.
- Coloque 2 palitos estéril para o prato de cultura para apoiar a arroz/cevada folhas; os palitos de espaço ~ 2-3 cm de distância.
- Recolher as folhas do arroz 2 semanas após a semeadura as sementes ou tirar as folhas da cevada 7D após a semeadura as sementes.
- Usando 4 - 6 folhas mudas de arroz/cevada, corte a parte inferior da haste no ~ 5 cm da parte superior e recolher as folhas.
-
Protocolo de inoculação de pulverizador
- Cultura a cepa fúngica em placas OTA em uma incubadora termostática (25 ° C) para d ~ 4.
- Adicione ~ 2 mL de DDQ2O usando um 0.5 - pipeta de 5 mL para cada placa de 4 dias de idade.
- Com um laço do inoculation, raspe os micélios de M. grisea estirpe selvagem-tipo e a estirpe mutante em restos de micélios.
- Recolher os detritos de micélios e transferi-lo para uma nova placa OTA. Pegue os restos de micélios e secagem no banco limpo.
- Cubra o prato com 3 camadas de gaze para garantir a umidade necessária para o crescimento dos conídios em uma estufa a 25 ° C no dia (14 h) e 23 ° C à noite (10 h) por 24-48 h.
- Adicionar 2 mL de DDQ2O para cada prato e raspe os conídios suavemente com cotonetes estéreis, seguidos por filtração através de 2 camadas de papel da lente. Tenha cuidado para não arranhar a superfície do meio de cultura.
- Transferi a suspensão de conídios em um novo tubo de 50 mL com uma pipeta de µ l 100-1.000.
- Centrifugue por 5 min em um mínimo de 5.000 x g a 25 ° C.
- Remover o sobrenadante e ressuspender o precipitado para dar 2 x 104 conídios / mL em um 0.025% (v/v), solução de Tween-20. A solução de Tween-20 é geralmente cerca de 10 a 20 mL.
- Despeje a suspensão de esporos em um pulverizador manual.
- Spay cerca de 10 mL da suspensão conidiais em folhas de plântulas de arroz 2 semanas ou cevada arroz folhas de plântulas de cevada de 7 dias de idade e incube-os a 25 ° C, numa câmara escura, úmida para ~ 24 h.. Spray as plantas de controle com a 0.025% (v/v), solução de Tween-20.
- Transferi as folhas para uma outra câmara úmida sob luz fluorescente, a 25 ° C durante um fotoperíodo de 12 h.
- Grave os sintomas da doença em 5 d após a inoculação. Examine as lâminas de arroz/cevada doentes de ~ 6 cm de comprimento. A padrão de avaliação está de acordo com o sistema de Pontuação para a resistência de explosão de Instituto de pesquisa de arroz internacional (IRRI). Os detalhes do sistema de Pontuação para a resistência de explosão são mostrados na tabela 1.
- Fotografe as folhas para avaliar a infecção das cepas testadas. A infecção foi avaliada pelo número de lesões por 3,6 cm2.
2. ferindo a inoculação com cubos de micélio ou gotículas de suspensão conidiais de M. grisea
- Usando uma agulha anatômica, raspar três feridas de longa 2-3 cm nas veias principais das folhas de arroz/cevada isolada; Tome cuidado para não penetrar as folhas.
- Coloque as folhas raspadas em palitos e pulverizar um 0,02% (v/v), solução de Tween-20 nas folhas para formar uma camada de gotículas.
- Corte um plug micelial de 0,5 x 0,5 cm para cada cepa de M. grisea (estirpes de tipo selvagem, mutante, complemento ou outras estirpes de ensaio) de uma placa OTA.
- Colocar os plugues do micélio ou 25 gotas µ l da suspensão conidiais para os feridos deixa e incubar as folhas a 25 ° C, numa câmara húmida para d 3-8.
- Examine as lesões na pós-inoculação d 5-7. O método de exame é o mesmo que foi para o método de inoculação de pulverizador (consulte a etapa 1.3.13).
- Examinar as lâminas de arroz/cevada doentes de ~ 6 cm de comprimento e fotografá-los para avaliar a infecção das cepas testadas. A infecção foi avaliada pelo número de lesões por 3,6 cm2.
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Representative Results
O fluxo de trabalho inteiro para a técnica é mostrado na Figura 1. Os planta infecção ensaios foram realizados em mudas de arroz suscetíveis de 14 dias de idade (o. sativa cv CO-39) ou folhas de cevada suscetível de 7 dias de idade (H. vulgare cv Golden promessa)7,8,9. Para testar uma infecção sobre as folhas de arroz, uma suspensão conidiais (1.0 x 105 esporos/mL) da estirpe do selvagem-tipo de M. grisea P131 e a estirpe mutante de exclusão Com1 foram elaborados e então pulverizado sobre as bainhas de folhas da 14 dias de idade suscetível CO-39 mudas, que em seguida foram mantidas em uma câmara úmida para 5 d10. O CO-39 P131-inoculados deixa exibido as lesões típicas robustas da brusone do arroz, mas as folhas Com1-inoculadas mostraram defeitos óbvios de infecção e não poderiam provocar uma infecção completa(Figura 2). A estirpe selvagem-tipo P131 é uma cepa obtida por você-Liang Peng em 198818. O mutante nulo MoKMT2H (ΔMoKMT2H) foi obtido por Cao et al . em nosso laboratório usando um de estratégia de substituição de gene alvo11. O mutante de Com1 foi isolado por Yang et al . em você-Liang Peng lab10.
Para verificar se o ΔMoKMT2H de M. grisea poderia infectar as células hospedeiras através de feridas, desgastada folhas de arroz selvagem-tipo plantas foram inoculadas com plugues micelial de ΔMoKMT2H através do método de pulverização ou ferindo método11. As folhas que foram pulverizador-inoculados com ΔMoKMT2H revelaram sem defeitos óbvios na infecção ΔMoKMT2H em comparação com a cepa P131/selvagem-tipo; no entanto, observaram-se defeitos óbvios para folhas inoculadas com ΔMoKMT2H através de feridas(Figura 2). Para testar a infecção da planta com folhas de cevada, saudáveis ou folhas feridas (cv Golden promessa) foram inoculadas com gotículas conidiais ou plugues micelial, respectivamente, de Com1, ΔMoKMT2Hou P131. A pós-inoculação 5D, lesões de explosão de arroz típico tinham totalmente desenvolvido nas folhas inoculadas com o ΔMoKMT2H ou P131 estirpe, Considerando que lesões menores e menos foram encontradas nas folhas inoculadas com o mutante Com1 (Figura 2 B).
Figura 1 : Um esquema ilustrando a planta infecção. Planta as sementes foram germinadas em solo em potes de plástico (50mm2 x 50 mm de profundidade, com um furo de drenagem), duas sementes por vaso e as mudas foram cultivadas em uma estufa. A cultura e inoculação do fungo explosão M. grisea foram cultivadas em placas OTA. Para os conídios método de inoculação de pulverização, a suspensão de conídios foi suspenso em um 0,02% (v/v), solução de Tween-20 e pulverizada sobre as plantas de arroz/cevada. Para o método de inoculação arranhado, as folhas de plantas raspadas arroz/cevada foram colocadas em placas plásticas e em seguida inoculadas por um plug micelial ou a suspensão de conídios. E então, todas as folhas da planta tratada escuro-cultivadas por 24 h e luz-cultivadas por 12 h. Finalmente, foi registado o número de colônias nas unidades de 3,6 cm2 . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Com1 e MoKMT2H são necessárias para uma formação de Conídio e patogenicidade em folhas de arroz. (A) este painel mostra a inoculação do arroz deixa através de conídios spray (à esquerda) ou ficha micelial (à direita) com conídios do P131 do selvagem-tipo de M. grisea , mutante Com1ou ΔMoKMT2H. Folhas típicas foram observadas 7D após a inoculação do micélio plug-mediada, que foi realizada em folhas de arroz desgastados. Lesões típicas foram observadas 5 d após a inoculação do micélio plug-mediada. Cevada (B) folhas foram inoculados através de conídios pulverizador (à esquerda) ou micelial plug (à direita). Como um controle de tratamento simulado, o mesmo volume de um 0.025% (v/v), solução de Tween-20 foi pulverizado. Para a inoculação de ferida, a figura do P131 foi modificada de Cao et al 11. a MoKMT2H de fungos ascomicetes é um homólogo funcional de Ash1, que está implicado na metilação de H3K4 e H3K3611. O bar = 1 cm. Os mutantes Δcom1 reduziram-se significativamente na virulência no arroz e cevada mudas10. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Escala | Descrição |
| 1 | Pequenas manchas marrons de pin-point de tamanho |
| 2 | Pequenas manchas cinza arredondadas ligeiramente alongada, necrótico, cerca de 1-2 mm de diâmetro, com uma margem distinta de marrom. As lesões são encontradas principalmente nas folhas superiores |
| 3 | Tipo de lesão é o mesmo que 2, mas um número significativo de lesão são em folhas de Upper |
| 4 | Lesões típicas explosão suscetíveis, 3 mm ou mais, infectando menor que 4% da área de theleaf |
| 5 | Lesões típicas explosão suscetíveis, 3mm ou menos infectante, mais de 4-10% da área da folha |
| 6 | Lesões típicas explosão suscetíveis, 3mm ou menos infectante, mais de 11 a 25% da área da folha |
| 7 | Lesões típicas explosão suscetíveis, 3mm ou menos infectante, mais de 26-50% da área da folha |
| 8 | Lesões típicas explosão suscetíveis, 3mm ou menos infectante, mais de 51-75% da superfície da folha, muitos mortos de folhas |
| 9 | Lesões típicas explosão suscetíveis, 3 mm ou mais, infectando mais de 75% da superfície da folha |
Tabela 1: um sistema de Pontuação para resistência explosão. A tabela é citada do Instituto Internacional de pesquisa arroz (IRRI).
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Discussion
Genes de resistência de doença de planta desempenham um papel essencial na prevenção de infecções por patógenos, incluindo patógenos fúngicos1,12. Brusone do arroz tem sido usado como um modelo para entender a natureza das estruturas de população do patógeno e a identificação de genes de resistência de planta4. Portanto, é necessário examinar o genótipo de resistência de doença e de genótipos de avirulence das principais variedades de plantas agrícolas em grande escala para identificar plantas resistentes a doenças que podem ser cultivadas continuamente. Além disso, as vantagens de genótipos de avirulence de patógenos de campo determinam a distribuição racional dos diferentes genótipos resistentes de anfitrião variedades12,13. No entanto, métodos atuais de inoculação comumente interferem com a seleção para resistência e patógeno identificação14,15,16,17.
Aqui, apresentamos um método rápido e preciso para testar a infecção da planta. Este método de inoculação é adequado para a identificação de plantas resistentes durante os ensaios de reprodução e do fenótipo de uma população de descendência durante a clonagem de genes de resistência. Aqui, nós estabelecemos um método para inocular planta ferida deixa com M. grisea. Porque a resistência do hospedeiro desempenha um papel importante na prevenção da disseminação de um patógeno, esse método em vitro , que produziu as feridas sobre o arroz testado deixa e inoculado a brusone do arroz na ferida, é conveniente para a criação de uma infecção diretamente no as folhas sem ter que penetrar na epiderme da folha e parede celular epidérmica. Além disso, este método de inoculação é apropriado para as idades diferentes da folha. Os resultados de inoculação são estáveis e precisos. O método de inoculação de ferimento pode ser usado para inoculação com micélios para identificar a patogenicidade de cepas de fungosas que produzem somente pequenas quantidades de conídios.
Este protocolo contribuirá ainda mais para a nossa compreensão dos mecanismos patogénicos que são conservadas em fungos, bem como os fatores do patógeno específico que permitem um fungo para resistir e suprimir a imunidade inata de seu anfitrião13. No entanto, a inoculação de ferida não é aplicável ao tentar determinar a taxa de uma invasão conidiais e expansão de micélios. Mas no seu estado natural, o método de inoculação de pulverização pode refletir melhor a patogenicidade de um agente patogénico. O método de inoculação de pulverizador é fácil de operar e ajuda a melhorar a eficiência do trabalho. Tomados em conjunto, estes resultados indicando um método de inoculação exato e estável são necessárias para a seleção planta de genes de resistência e determinação de patogenicidade.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo especial projeto de pesquisa científica da Universidade de agricultura de Beijing (YQ201603) e o projeto científico do Comitê educacional de Beijing (KM201610020005).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Filter paper | GE Healthcare brand(Sweden) | 10311387 | |
| 50-mL tube | CORNING(Amercia) | 430290 | |
| Centrifuge | Eppendorf(Amercia) | 5804R | |
| Culture dish | Thermofisher(Amercia) | 150326 | |
| 0.5-5 mL pipette | Eppendorf | 4920000105 | |
| 100-1000uL pipette | Eppendorf | 4920000083 | |
| Vacuum pump | Leybold | D25B | |
| Dissection needle | FST | 26000-35 | |
| Incubator | MEMMERT | PYX313 | |
| Inoculation ring | Greiner Bio One | 731175 |
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