Summary
Vi præsenterer her, en protokol for at teste anlægget virulens med plante-patogen Magnaporthe grisea. Denne betænkning vil bidrage til den omfattende screening af kartoffelsorter af svampe isolater og tjene som et fremragende udgangspunkt for at forstå de resistente mekanismer af planter under molekylære avl.
Abstract
Planter have et kraftfuldt system for at forsvare sig mod potentielle trusler af patogene svampe. For landbrugsmæssigt vigtige planter, men aktuelle foranstaltninger til bekæmpelse af disse patogener har vist sig for konservativ, og således ikke tilstrækkeligt effektive, og de kan potentielt udgøre miljørisici. Derfor er det yderst nødvendigt at identificere vært-modstand faktorer at bistå i kontrollerende plantesygdomme naturligt gennem identifikation af resistente kimplasma, isolering og karakterisering af resistensgener og molekylær opdræt af resistente sorter. I denne forbindelse er der behov at etablere en præcis, hurtig og omfattende indpodningsmetode for at avle og udvikle plante resistensgener. Ris blast svampe patogen Magnaporthe grisea forårsager alvorlig sygdomssymptomer og give tab. M. grisea har for nylig dukket op som en model organisme for at studere mekanismerne af plante-svampe patogen interaktioner. Dermed, vi rapport udviklingen af et plant virulens testmetode, der er specifikke for M. grisea. Denne metode giver både spray podning med en conidial suspension og såret podning med mycelium kuber eller dråber af conidial suspension. De vigtigste trin i såret indpodningsmetode for fritliggende ris blade er at gøre sår på planten blade, som undgår forstyrrelser forårsaget af vært indtrængen modstand. Denne spray/såret protokol bidrager til hurtig, præcis og omfattende screening af kartoffelsorter af M. grisea isolater. Denne integrerede og systematisk plante infektion metode vil tjene som et fremragende udgangspunkt for at få et bredt perspektiv af spørgsmål i plantepatologi.
Introduction
Ris blast, forårsaget af M. grisea, er en af de mest alvorlige sygdomme for ris sorter verdensomspændende1,2. Den proces, hvorved M. grisea inficerer værtsplanter omfatter en konidier produktion og overflade udlæg, en konidier spiring og appressorium dannelse, en formation af penetration pind og smitsomme hypha differentiering, og en sygdom spredes 3. alle disse faser er almindelige i mange andre plante patogene svampe, og faktisk en blokade af enhver enkelt fase forebygger infektion af værtsplanter. På grund af dens økonomiske betydning og genetiske sporbarhed fremstod M. grisea som en model organisme for at studere mekanismerne af plante-svampe patogen interaktioner1,4. Derfor, at studere det molekylære grundlag af disse udviklingsstadier i M. grisea vil bidrage til at belyse de molekylære mekanismer bag svampe patogenicitet og identifikation af kandidat target gener for screening og designe roman fungicider5.
De seneste rapporter om M. grisea infektion har fokuseret på de molekylære mekanismer før penetration faser, især conidiation, appressorium-dannelsen, penetration pløkker og smitsomme vækst3, 6. det er derfor vigtigt at udvikle en detaljeret protokol for at teste M. grisea infektion. Heri, præsenterer vi en detaljeret metode til en infektion test, der udnytter spray-medieret infektion assays med en conidial suspension og podning af sår med mycelial stik af M. grisea. I denne betænkning fokuserer protokollen på kultur af stammer, forberedelse af conidiation løsningen for sprøjtning, og den mycelial plug-medieret podning af planter med M. grisea. Disse trin beskrives i detaljer nedenfor, og en skematisk oversigt viser hele arbejdsgangen for metoden og en typisk læsion er vist i figur 1 og 2, henholdsvis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. spray podning med en Suspension af M. grisea konidier
-
Svampe kultur for M.grisea
- Forberede havregryn tomat agar (OTA) kultur medium for svampe stammer.
- Vejer 30-50 g havregryn, Tilføj dette til 800 mL destilleret/deioniseret vand (ddH2O) og kog blandingen i 30 min i den elektriske pot.
- Filtrer kogt havregryn juice i bægerglas igennem et stykke gaze.
- Tilføj 150 mL af tomatsaft og 20 g agar til filtratet i bægerglasset og tilføje ddH2O op til 1000 mL.
-
Forberedelse af eksperimentelle materialer
- Sættetid ca. 50 frø af ris (Oryza sativa) kultivar Lijiangxintuan-heigu (LTH) i ddH2O til 3 d eller suge ca. 50 frø af byg (Hordeum vulgare cv Golden lover) i ddH2O til omkring 1 d.
- Wrap frø af ris eller Byg i fugtige gaze og spire dem på fugtigt filtrerpapir i ca. 30 petriskåle med en diameter på 10 cm x 10 cm ved 28 ° C. Ris frø spiring tid er omkring 2-3 d, Byg frø spiring tid er omkring 2 d. Relative luftfugtigheden i drivhuset er ca. 70%.
- Plante planter af ris eller Byg i Potter ved hjælp af autoklaveres pottemuld og vanding og derefter dække dem med et lag af vermiculit.
- Placere planterne i en egnet væksthus eller vækst kabinettet ved 25 ° C for omkring 1 ~ 2 uger.
- Skær 3 lag filterpapir i cirkler med en steril kirurgiske saks (hver cirkel bør have en diameter på 8 cm) og placere dem på 100 mm sterile plast plader.
- Tilføje ddH2O til hver skål at suge filtrerpapir.
- Kontroller filter papiret er helt våd men tilføjer ingen ekstra vand.
- Fjern overskydende vand med en vakuumpumpe.
- Sted 2 sterile tandstikkere i kultur skål til at støtte ris/Byg blade; plads til tandstikkere ~ 2-3 cm fra hinanden.
- Indsamle blade af en ris 2 uger efter såning af frø eller tage bladene fra Byg 7 d efter såning af frø.
- Bruger 4 - 6 blade stiklinger af ris/Byg, skær den nederste del af stænglen på ~ 5 cm fra toppen og indsamle blade.
-
Spray podning protokol
- Kultur de svampe stamme på OTA plader i en termostatisk inkubator (25 ° C) for ~ 4 d.
- Tilføje ~ 2 mL af Hedeselskabet2O ved hjælp af en 0,5 - 5 mL pipette til hver 4 dage gamle plade.
- Med en podning løkken, skrabe mycelia af M. grisea wild-type belastning og de mutant stamme i mycelia snavs.
- Indsamle mycelia snavs og overføre det til en ny OTA plade. Tage mycelia snavs og blæse tør i ren bænken.
- Dække pladen med 3 lag gaze til at sikre den fugtighed, der kræves ved vækst af konidier i et drivhus ved 25 ° C i dag (14 h) og 23 ° C om natten (10 h) i 24-48 timer.
- Der tilsættes 2 mL af Hedeselskabet2O til hvert fad og skrabe Konidierne forsigtigt med steril bomuld svaberprøver efterfulgt af en filtrering gennem 2 lag af linsen papir. Vær omhyggelig med ikke at ridse overfladen af næringssubstratet.
- Overføre konidier suspension ind i en ny 50 mL rør med en 100-1.000 µL pipette.
- Der centrifugeres i 5 min. ved et minimum af 5.000 x g ved 25 ° C.
- Fjern supernatanten og resuspenderes for at give 2 x 104 konidier pr. mL i en 0.025% (v/v) Tween-20 løsning. Tween-20 løsning er normalt omkring 10-20 mL.
- Hæld Sporeopslæmningen i en håndholdt sprøjte.
- Spay ca. 10 mL conidial suspension på ris blade 2-uge-forhenværende risplanter eller Byg blade af 7 dage gamle Byg frøplanter og inkuberes dem ved 25 ° C i et mørkt, fugtigt kammer for ~ 24 h. Spray kontrol planter med 0.025% (v/v) Tween-20 løsning.
- Overføre bladene i en anden fugtig kammer under fluorescerende lys ved 25 ° C til en lysperiode på 12 h.
- Optage sygdomssymptomer på 5 d efter podning. Undersøge de syge ris/Byg knive af ~ 6 cm i længden. Evaluering standard ifølge pointsystem for blast modstand af International Rice Research Institute (IRRI). Detaljer om pointsystemet for blast modstand er vist i tabel 1.
- Fotografere blade til at evaluere infektion af de testede stammer. Infektionen blev vurderet ved antallet af læsioner pr. 3,6 cm2.
2. sårede podning med Mycelium kuber eller dråber af Conidial Suspension af M. grisea
- Ved hjælp af en anatomisk nål, skrabe tre 2-3 cm lange sår i de vigtigste årer af fritliggende ris/Byg blade; passe på ikke at trænge ind i bladene.
- Sætte de skrabede blade på tandstikkere og spray en 0.02% (v/v) Tween-20 løsning på blade til at danne et lag af små dråber.
- Skære en 0,5 cm x 0,5 cm mycelial stik for hver M. grisea stamme (vildtype, mutant, supplement stammer, eller andre test stammer) fra en OTA plade.
- Sætte de mycelial stik eller 25 µL dråber af conidial suspension på de sårede blade og inkuberes blade ved 25 ° C i et fugtigt kammer for 3-8 d.
- Undersøge læsioner på 5-7 d efter podning. Metoden for undersøgelse er det samme som det var for spray indpodningsmetode (Se trin 1.3.13).
- Undersøge de syge ris/Byg knive af ~ 6 cm i længden og fotografere dem for at evaluere infektion af de testede stammer. Infektionen blev vurderet ved antallet af læsioner pr. 3,6 cm2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hele arbejdsgangen for teknikken, der er vist i figur 1. Plante infektion assays blev udført på 14 dage gamle modtagelige risplanter (O. sativa cv CO-39) eller modtagelige 7 dage gamle Byg blade (H. vulgare cv Golden lover)7,8,9. For at teste for en infektion på ris blade, en conidial suspension (1,0 x 105 sporer/mL) af M. grisea wild-type belastning P131 og Com1 sletning mutant stamme blev forberedt og derefter sprøjtet på bladskederne af 14-dages-gamle modtagelige CO-39 kimplanter, som derefter blev holdt i et fugtigt kammer for 5 d10. P131-podes CO-39 efterlader viste de typiske robust læsioner af ris blast, men Com1-podes bladene viste indlysende infektion fejl og kunne ikke fremkalde en fuld infektion (fig. 2A). Wild-type stamme P131 er en stamme, der er fremstillet af du-Liang Peng i 198818. MoKMT2H null mutant (ΔMoKMT2H) blev fremstillet af Cao et al. i vores laboratorium ved hjælp af et target gen udskiftning strategi11. Com1 mutant blev isoleret af Yang et al. i du-Liang Peng lab10.
For at kontrollere, om M. grisea ΔMoKMT2H kunne inficere værtsceller gennem sår, slibes blade af wild-type ris planter blev podet med mycelial propper af ΔMoKMT2H via metoden spray eller sårende metode11. De blade, der var spray-podes med ΔMoKMT2H viste ingen indlysende mangler i ΔMoKMT2H infektion sammenlignet med P131/wild-type belastning; dog blev indlysende fejl observeret for blade podes med ΔMoKMT2H via sår (fig. 2A). Til yderligere teste anlæg infektion med Byg blade, sund eller sårede blade (cv Golden lover) blev podet med conidial dråber eller mycelial stik, henholdsvis Com1, ΔMoKMT2Heller P131. På 5 d efter podning, havde typisk ris blast læsioner fuldt udviklet på bladene podet med enten ΔMoKMT2H eller P131 stamme, der henviser til, at færre og mindre læsioner blev fundet på bladene podet med Com1 mutant (figur 2 B).
Figur 1 : En illustrerer plante infektion ordningen. Plante frøene var spiret i jord i plastic Potter (50 mm2 x 50 mm dyb, med et drænhul), to frø pr. pot, og planter blev dyrket i et drivhus. Kultur og vaccinationer af blast svampen M. grisea var vokset på OTA plader. Konidierne sprøjtning indpodningsmetode, var konidier suspension suspenderet i en 0.02% (v/v) Tween-20 løsning og sprøjtet på ris/Byg planter. Metoden ridset podning var skrabet ris/Byg plante blade sat på plast plader og derefter podes en mycelial plug eller konidier suspension. Og så, alle behandlede plante blade var mørke-kulturperler i 24 timer og lys-kulturperler i 12 timer. Endelig, antallet af kolonier i enheder af 3,6 cm2 blev indspillet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Com1 og MoKMT2H er nødvendige for en conidium dannelse og patogenicitet på ris blade. (A) dette panel viser podning af ris efterlader via konidier spray (til venstre) eller mycelial stik (til højre) med konidier fra M. grisea wild-type P131, mutant Com1eller ΔMoKMT2H. Typiske blade blev observeret 7 d efter den mycelial plug-medieret podning, som blev gennemført på slidt ris blade. Typiske læsioner blev observeret 5 d efter den mycelial plug-medieret podning. (B) Byg blade blev podet via konidier spray (til venstre) eller mycelial stik (til højre). Som en mock behandling kontrol, blev den samme mængde af en 0.025% (v/v) Tween-20 løsning sprøjtet. Til sår-podning, er figur af P131 blevet ændret fra Cao et al. 11. MoKMT2H i ascomycete svampe er en funktionel homolog af Ash1, som er impliceret i H3K4 og H3K36 methylering11. Baren = 1 cm. Δcom1 mutanter blev markant reduceret i virulens på ris og Byg frøplanter10. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Skala | Beskrivelse |
| 1 | Små brune pletter af pin-point størrelse |
| 2 | Lille rund til lidt aflange, nekrotisk grå steder, omkring 1-2 mm i diameter, med en tydelig brun margen. Læsioner findes mest på de øverste blade |
| 3 | Læsion type er den samme som 2, men betydeligt antal læsion er på theupper blade |
| 4 | Typiske modtagelige blast læsioner, 3 mm eller længere, inficerer mindre end 4% af theleaf område |
| 5 | Typiske modtagelige blast læsioner, 3 mm eller længere, inficerer mindre end 4-10% af området blad |
| 6 | Typiske modtagelige blast læsioner, 3 mm eller længere, inficerer mindre end 11-25% af området blad |
| 7 | Typiske modtagelige blast læsioner, 3 mm eller længere, inficerer mindre end 26-50% af området blad |
| 8 | Typiske modtagelige blast læsioner, 3 mm eller længere, inficerer mindre end 51-75% af området blade mange blade døde |
| 9 | Typiske modtagelige blast læsioner, 3 mm eller længere, inficerer mere end 75% af området blad |
Tabel 1: et pointsystem for blast modstand. Tabellen er citeret fra International Rice Research Institute (IRRI).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Plante sygdom resistensgener spiller en vigtig rolle i forebyggelsen af infektioner af patogener, herunder svampe patogener1,12. Ris blast er blevet brugt som en model til at forstå arten af patogenet befolkning strukturer og identificere plante resistens gener4. Det er derfor nødvendigt at undersøge sygdommen modstand genotype og avirulence genotyper af de vigtigste sorter af landbruget planter i stor skala at identificere sygdomsresistente planter, der kan dyrkes kontinuerligt. Desuden nødvendiggør fordelene ved avirulence genotyper af feltet patogener den rationelle fordeling af de forskellige resistente genotyper af vært sorter12,13. Dog interferere aktuelle podning metoder almindeligvis med screening for modstand og patogen identifikation14,15,16,17.
Vi præsenterer her, en hurtig og præcis metode til at teste for anlægget infektion. Denne indpodningsmetode er egnet til identifikation af resistente planter under avl forsøg og af Fænotypen af en afkom befolkning under kloning af resistensgener. Her, etableret vi en metode til at vaccinere sårede plante blade med M. grisea. Fordi vært modstanden spiller en større rolle i forebyggelsen af spredning af et patogen, in vitro- metoden, som producerede sår på den testede ris blade og podes ris blast på såret, er praktisk til at oprette en infektion direkte ind i blade uden at skulle trænge blad epidermis og den epidermale cellevæg. Desuden, denne indpodningsmetode er velegnet til forskellige blad aldre. Podning resultater er stabil og nøjagtig. Metoden for sårede podning kan bruges til podning med mycelia til at identificere sygdomsfremkaldende svampe stammer, der producerer kun små mængder af konidier.
Denne protokol vil yderligere bidrage til vores forståelse af de patogene mekanismer, der er bevaret i svampe, samt de patogen-specifikke faktorer, der tillader en svamp til at modstå og undertrykke af sin vært13medfødt immunitet. Sår-podning er imidlertid ikke gælder, når du forsøger at bestemme hastigheden af en conidial invasion og mycelia ekspansion. Men i den naturlige tilstand, spray indpodningsmetode kan bedre afspejler den sygdomsfremkaldende evne af et patogen. Indpodningsmetode spray er nem at betjene og hjælper med at forbedre arbejdseffektivitet. Taget sammen, plant disse resultater, hvilket indikerer en nøjagtig og stabil indpodningsmetode er nødvendige for screening resistensgener og bestemmelse af sygdomsfremkaldende evne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af den særlige videnskabelige forskningsprojekt af Beijing landbrug Universitet (YQ201603) og den videnskabelige projekt af Beijing pædagogiske udvalg (KM201610020005).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Filter paper | GE Healthcare brand(Sweden) | 10311387 | |
| 50-mL tube | CORNING(Amercia) | 430290 | |
| Centrifuge | Eppendorf(Amercia) | 5804R | |
| Culture dish | Thermofisher(Amercia) | 150326 | |
| 0.5-5 mL pipette | Eppendorf | 4920000105 | |
| 100-1000uL pipette | Eppendorf | 4920000083 | |
| Vacuum pump | Leybold | D25B | |
| Dissection needle | FST | 26000-35 | |
| Incubator | MEMMERT | PYX313 | |
| Inoculation ring | Greiner Bio One | 731175 |
References
- Li, W. T., et al. A natural allele of a transcription factor in rice confers broad-spectrum blast resistance. Cell. 170 (1), 114-126 (2017).
- Chi, M. H., Park, S. Y., Kim, S., Lee, Y. H. A novel pathogenicity gene is required in the rice blast fungus to suppress the basal defenses of the host. PLoS Pathogens. 5 (4), 1000401 (2009).
- Jia, Y., Valent, B., Lee, F. N. Determination of host responses to Magnaporthe grisea.on detached rice leaves using a spot inoculation method. Plant Disease. 87 (2), 129-133 (2003).
- Ebbole, D. J. Magnaporthe as a model for understanding host-pathogen interactions. Annual Review of Phytopathology. 45, 437-456 (2007).
- Hamer, J. E., Talbot, N. J. Infection-related development in the rice blast fungus Magnaporthe grisea. Current Opinion in Microbiology. 1 (6), 693-697 (1998).
- Howard, R. J., Valent, B. Breaking and entering: host penetration by the fungal rice blast pathogen Magnaporthe grisea. Annual Review of Microbiology. 50, 491-512 (1996).
- Chen, X. L., et al. N-Glycosylation of Effector Proteins by an α-1,3- Mannosyltransferase Is Required for the Rice Blast Fungus to Evade Host Innate Immunity. The Plant Cell. 26 (3), 1360-1376 (2014).
- Zhang, Y., et al. M.ARG1, MoARG5,6 and MoARG7 involved in arginine biosynthesis are essential for growth, conidiogenesis, sexual reproduction, and pathogenicity in Magnaporthe oryzae. Microbiological Research. 180, 11-22 (2015).
- Du, Y. X., et al. A serine/threonine-protein phosphatase PP2A catalytic subunit is essential for asexual development and plant infection in Magnaporthe oryzae. Current Genetics. 59 (1-2), 33-41 (2013).
- Yang, J., et al. A novel protein com1 is required for normal conidium morphology and full virulence in Magnaporthe oryzae. Molecular Plant-Microbe Interactions. 23 (1), 112-123 (2010).
- Cao, Z. J., et al. An ash1-like protein MoKMT2H null mutant is delayed for conidium germination and pathogenesis in Magnaporthe oryzae. BioMed Research International. 2016, 1575430 (2016).
- Bryan, G. T., et al. A single amino acid difference distinguishes resistant and susceptible alleles of the rice blast resistance gene Pi-ta. The Plant Cell. 12 (11), 2033-2045 (2000).
- Zhou, J. M. Plant pathology: a life and death struggle in rice blast disease. Current Biology. 26 (18), 843-845 (2016).
- Guo, M., et al. MoGrr1, a novel F-box protein, is involved in conidiogenesis and cell wall integrity and is critical for the full virulence of Magnaporthe oryzae. Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (19), 8075-8088 (2015).
- Talbot, N. J. On the trail of a cereal killer: Exploring the biology of Magnaporthe grisea. Annual Review of Microbiology. 57, 177-202 (2009).
- Wilson, R. A., Talbot, N. J. Under pressure: investigating the biology of plant infection by Magnaporthe oryzae. Nature Reviews Microbiology. 7, 185-195 (2009).
- Jia, Y. L., Lee, F. N., McClung, A. Determination of Resistance Spectra of the Pi-ta and Pi-k Genes to U.S. Races of Magnaporthe oryzae Causing Rice Blast in a Recombinant Inbred Line Population. Plant Disease. 93, 639-644 (2009).
- Peng, Y. L., Shishiyama, J. Temporal sequence of cytological events in rice leaves infected with Pyricularia oryzae. Canadian Journal of Botany. 66 (4), 730-735 (1988).
