Summary

צבע רב לוקליזציה מיקרוסקופיה של חלבוני ממברנה בודדת ב- Organelles של תאים בתרבית של חיים

Published: June 30, 2018
doi:

Summary

כאן, אנו מציגים עבור צבע רב לוקליזציה של חלבוני ממברנה בודדת פרוטוקול organelles של תאים חיים. כדי לצרף fluorophores, משמשים החלבונים תיוג עצמי. חלבונים, במיקום שונה ממברנות תאי האברון המשמש אותו, יכול להיות מקומי עם דיוק של ~ 18 ננומטר.

Abstract

הידע על הלוקליזציה של חלבונים ב- subcompartments סלולרי חיוני להבין את פעולתן. כאן, אנו מציגים טכניקה סופר רזולוציה המאפשרת מצפני microcompartments שהם נגישים חלבונים על ידי יצירת לוקליזציה ומעקב מפות של חלבונים אלו. יתר על כן, על ידי מיקרוסקופ צבע רב לוקליזציה, הלוקליזציה ומעקב פרופילים של חלבונים ב- subcompartments שונים מתקבלים בעת ובעונה אחת. הטכניקה ספציפית עבור תאים חיים והיא מבוססת על ההדמיה חוזרות של חלבוני ממברנה ניידים יחיד. חלבונים עניין גנטית הם התמזגו עם תגי תיוג עצמי מסוים, כביכול. תגים אלה הם אנזימים להגיב עם מצע באופן קשרי ערכיות. מצומדת כדי סובסטרטים אלה הם צבעי פלורסנט. התגובה של החלבונים האנזים מתויג עם פלורסצנטיות תוויות תוצאות מצעים בשנת חלבונים עם תוויות. כאן, Tetramethylrhodamine (TMR), סיליקון Rhodamine (SiR) משמשים כמו צבעי פלורסנט מחובר על מצעים של האנזימים. באמצעות ריכוז המצע ב רה מ למגוון ננומטר, תיוג תת stoichiometric מושגת שתוצאתו אותות ברורים. אותות אלה מותאמים עם ~ 15-27 דיוק ננומטר. הטכניקה מאפשרת הדמיה צבע רב של מולקולות יחיד, לפיה מספר הצבעים מוגבל על ידי קרום חדיר צבעים זמינים, לרפרטואר של תיוג עצמי של אנזימים. אנו מראים את הכדאיות של הטכניקה על-ידי קביעת ההתאמה של האנזים בקרת איכות (Pten)-induced קינאז 1 (PINK1) בתאים מיטוכונדריאלי שונה במהלך העיבוד שלו ביחס לחלבונים אחרים ממברנה. המבחן האמיתי הפיזי אינטראקציות בין חלבונים יחיד שכותרתו באופן שונה על ידי מולקולה בודדת סריג או מעקב משותף הוא מוגבל, אף, כי מעלות תיוג נמוך להקטין את ההסתברות שיש שני חלבונים סמוכים שכותרתו באותו זמן. בעוד הטכניקה חזקה הדמיה חלבונים בתאים ממברנה, ברוב המקרים זה לא הולם לקבוע הלוקליזציה של חלבונים מסיסים ניידים במיוחד.

Introduction

המטרה של פרוטוקול זה נועד לספק שיטת הדמיה כדי להתאים לשפה ולעקוב אחר חלבוני ממברנה בודדת בתוך תאים חיים. אנחנו קוראים בשיטה זו, מעקב ו לוקליזציה מיקרוסקופ (TALM)1,2. כמו סטוכסטי אופטי שחזור מיקרוסקופ (סערה)3 ו-4,זריחה Photoactivation לוקליזציה מיקרוסקופ ((נ) דקל)5, TALM היא טכניקה לוקליזציה פלורסצנטיות מבוסס-מולקולה בודדת. עם זאת, ברורים בדרך כי הניידות של חלבוני ממברנה בשילוב עם הדמיה חוזרות של אותו הנקרא מולקולה-מגלה עמדות שונות microcompartment הנגיש עבור החלבון ניידים. במילים אחרות, הגרסא המקומית אפשרי של החלבון נקבעים על ידי הארכיטקטורה של אברון ועל ידי את הניידות של חלבון1. השיטה זו משלימים שונים אחרים סופר רזולוציה טכניקות6,7,8 כי הוא מגלה לוקליזציה, מסלול מפות על ידי הדמיה חלבונים ניידים. תיוג מבוסס על שימוש חלבונים פיוז’ן מהונדס גנטית כי הם כשלעצמם שאינם פלורסנט. חלבונים אלה פיוז’ן הם תיוג עצמי אנזימים להגיב covalently עם מצע מצומדת כדי צבע. הליך זה יש יתרון כי מידת תיוג יכול להיות נשלט על ידי כמות המצע שנוספו. יתר על כן, היא מאפשרת לשנות את הצבע של זריחה, בהתאם לצבוע מצומדת שבחרת. מספר תיוג עצמי אנזים-תגיות הן זמינות9. יתרון נוסף של השימוש תיוג עצמי תגי אנזים זה, כי צבעים מצומדת הם בדרך כלל יותר יציב ובהיר יותר מאשר חלבונים פלורסנט1 , חלבונים בודדים ולכן ניתן להקליט עוד ועוד בדיוק עד שהם נמצאים מולבן. דבר זה מאפשר ההקלטה של מסלולים של חלבונים ניידים, החילוץ של דיפוזיה המקדמים10,11.

. הנה, נדגים את הכדאיות של TALM עם ממברנה מיטוכונדריאלי חלבונים, אך זה ניתן להחיל גם חלבונים ממברנה אינטרה – ו תוספת – cellular אחרים, כולל תאים שונים סוגי12,13. אנחנו מראים כי צבע רב TALM נוסף מאפשר ההבחנה סימולטני של חלבונים ב- subcompartments שונה ב קומפלמנטציה קיימת סופר-רזולוציה קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ טכניקות14,15, 16-TALM התואמת לתא חי הדמיה17. צילום-הפיזיקה של rhodamines שבחרת Tetramethylrhodamine (TMR) וסיליקון-Rhodamien (אדון), בפרט שלהם בהירות ויציבות, מאפשרת ממברנה אחת רשומה חלבונים מסגרות מרובות ומספקת מפות לוקליזציה (ואת המסלול). TALM זאת, מוגבלת עבור ההתאמה של חלבונים מסיסים עם המקדמים של פעפוע מאז טשטוש תנועה גבוהים מדי, והפוטונים שנאספו לכל מסגרת נמוכים מדי בלוקאליזציה נאותה. חוץ מזה, TALM דורש פחות אנרגיה עירור מאשר לדוגמה סערה או דלדול פליטה מגורה (STED) מיקרוסקופיה6,7, הפחתת תופעות פוטוטוקסי. זה חשוב, מכיוון פוטוטוקסי לחץ משפיע לעיתים קרובות על מורפולוגיה אבחון18 ובכך ניידות ניתוח19. לסיכום, אנו מציגים צבע רב TALM בתאים חיים כמו טכניקה ממלאת פער בין השיטות מיקרוסקופ לוקליזציה הסערה/STED/דקל (נ) וטכניקות לנתח חלבון ניידות כגון קרינה פלואורסצנטית התאוששות לאחר photobleaching (FRAP)20 ,21קרינה פלואורסצנטית המתאם ספקטרוסקופיה (FCS)22, קרינה פלואורסצנטית לחצות המתאם ספקטרוסקופיה (FCCS)11,23.

Protocol

להלן כללי התנהגות עוקב אחר הקווים המנחים של ועדת האתיקה של המחקר למוסד מקומי. 1. שיטות תרבית תאים לטפח תאים, לדוגמה הלה תאים (צוואר הרחם האנושי קרצינומה), בבקבוקון T25 תא תרבות המכיל 5 מ של מדיום הגידול-CO 37 ° C ו-5%2.הערה: עבור הדמיה, לפצל את התאים על coversli…

Representative Results

הדמיית צבע רב וניתוח colocalization יכול לעזור לקבוע לוקליזציה תת-אבחון של חלבונים. להדגים זאת מוקדם יותר עם cytosolic פוספטאז, homologue tensin, PINK1, הכולל סאב-מיטוכונדריאלי במקומות שונים בשל העיבוד שלו על-ידי פרוטאזות מיטוכונדריאלי17. PINK1 הוא גורם חשוב המבטיח פונקציונליות מיט?…

Discussion

. הנה, הוצגה טכניקה עבור צבע כפול לוקליזציה מולקולה בודדת של חלבוני ממברנה ניידים. בעקבות את הפרוטוקול, קרום חלבונים הם התמזגו כדי תיוג עצמי חלבונים כי מגיבים עם צבעים rhodamine TMR ואדוני מצומדת כדי מצעים המתאימים שלהם. Rhodamine צבעים בהירים, photostable, ובכך לאפשר הדמיה חוזרות1. לביצועים מ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים רוצה להודות ביופיזיקה קבוצה של יעקב Piehler ב אוניברסיטה של אוסנברוק תמיכה שוטפת, ולדיסלאו קוהל לקבלת סיוע טכני והכנת חומר של הלוח CellNanOs למתן מיקרוסקופים לשימוש. הפרויקט מומן על ידי 944 SFB.

Materials

(2-(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethanesulfonic acid, 1 M) (HEPES) Biochrom #1104E
DC1: Dichroid beam splitter  Chroma 640 dcxr NC506031
DC2: Polychroic Mirror, beamsplitter Chroma zt405/488/561/640rpc discontinued
Dulbecco´s Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1x (w/o Ca & Mg) Sigma-Aldrich & Co. #RNBF8311
Earle´s MEM without phenol red, without L-Glutamine and without NaHCO3 containing 1% FBS, 0.1% HEPES, 0.1% NEAA, 0.1% Alanyl-L-Glutamine and 34.78% sodium hydrogen carbonate (NaHCO3 0.75g/l) Imaging medium
Earle´s minimum essential medium (MEM) with phenol red, containing 1% Fetal Bovine Serum Superior (FBS), 0.1% HEPES (2-(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethanesulfonic acid, 1 M), and 0.1% non-essential amino acids (NEAA) Growth medium
EF: Emission filter quadbandpass AHF analysentechnik F72-866 Brightline HC 446 nm/523 nm/600 nm/677 nm
EMCCD camera Andor Andor iXON 897 EMCCD camera
Emission filter QuadView filter cubes, orange AHF analysentechnik F39-637 bandpass 582 – 619 nm
Emission filter QuadView filter cubes, red Chroma bandpass 655 – 725 nm (HQ 690/70)
FBS (Fetal bovine serum) superior Biochrom S0615
Fluorescent beads: TetraSpeck™ Microspheres, 0.1 µm, fluorescent blue/green/orange/dark red Thermo Fisher Scientific T7279 fluorescent microspheres
Glutamine Biochrom #0951C
HeLa cells  DSMZ ACC-57 Cervical carcinoma cells from patient Henrietta Lacks
Hela cells CI::paGFP, stable Muster et al., PLOSOne 2010
Hela cells CV g::Halo7-Tag, stable Appelhans et al., NanoLett 2012
Hela cells Tom20::Halo7-Tag, stable Appelhans et al., NanoLett 2012
Image splitter Photometrics Dual-View QV2 image splitter emission
Imaging processing software  ImageJ2 / Fiji freeware
Immersion Oil – ImmersolTM 518 F (ne = 1.518, ve = 45) Carl Zeiss Jena GmbH 444960-0000-000
Inverted epifluorescence microscope Olympus IX-71/73/83
Laser 561 nm, 200 mW CrystaLaser CL-561-200 561 nm emission
Laser 642 nm, 140 mW Omicron Luxx-642-140 642 nm emission
MATLAB MathWorks version R2013a
MEM with Earle's Balanced Salt Solution 2.2 g/L NaHCO3, stable glutamine w/o PR Biochrom FG-0385
MEM with Earle's Balanced Salt Solution with 2.2 g/L NaHCO3, stable glutamine, Phenolred Biochrom FG-0325
MitoTracker® Deep Red FM Thermo Fisher Scientific M22426 dye
MitoTracker® Green FM Thermo Fisher Scientific M7514 dye
Multi-mode-optical polarization maintaining monomode fiber Pointsource/Qioptiq KineFLEX
NHS-PEG-MAL, Rapp Polymer  Rapp Polymere GmbH Tübingen coverslip coating
non-essential amino acids (NEAA) Biochrom #0802E
PEG 800 (Polyethylene glycol) 10 % Carl Roth GmbH Art No. 0263.1 coverslip coating
Penicillin/Streptomycin Biochrom #0122E
Plasmid for PINK1-Halo7-Tag expression Beinlich et al., ACS Chemical Biology 2015
Poly-L-lysine (1.2 mg/ml) Sigma-Aldrich & Co. Cat. No.P9155 coverslip coating
RGD Peptide (Ac-CGRGDS-COOH) Coring System Diagnostix GmbH, Gernsheim coverslip coating / Intergrin receptor motif
Silicon Rhodamine linked to HaloTag®-Ligand (SiRHTL)  personal gift from Kai Johnson dye
Software analysis plugin self-written C. P. Richter, Biophysik Osnabrück SLIMFAST 16g
Tetramethylrhodamine / SNAP-Cell® TMR-Star linked to SNAP-Ligand (TMRstar)  New England Biolab® S9105S dye
Tetramethylrhodamine linked to HaloTag®-Ligand (TMRHTL)  Promega G8251 dye
TIRF condensor Olympus Cell^TIRF MITICO System TIRF condensor
TIRF microscope controlling software Olympus cellSens 1.12
TIRF objective Olympus 150x oil objective (N.A. 1.45; Olympus UAPO)
Trypsin/EDTA 10x Biochrom #0266
Water H2O 99,5 % Rotipuran® Low organic  Carl Roth GmbH Art. No. HN57.1

References

  1. Appelhans, T., Richter, C., Wilkens, V., Hess, S., Piehler, J., Busch, K. Nanoscale organization of mitochondrial microcompartments revealed by combining tracking and localization microscopy. Nano Letters. 12 (2), 610-616 (2012).
  2. Appelhans, T., Busch, K. Single Molecule Tracking and Localization of Mitochondrial Protein Complexes in Live Cells. Methods Mol Biol. 1567, 273-291 (2017).
  3. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
  4. Gould, T. J., Verkhusha, V. V., Hess, S. T. Imaging biological structures with fluorescence photoactivation localization microscopy. Nat Protoc. 4 (3), 291-308 (2009).
  5. Pennacchietti, F., Gould, T. J., Hess, S. T. The Role of Probe Photophysics in Localization-Based Superresolution Microscopy. Biophys J. 113 (9), 2037-2054 (2017).
  6. Wegel, E., Göhler, A., Lagerholm, B. C., Wainman, A. Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison. Scientific reports. , (2016).
  7. Pellett, P., et al. Two-color STED microscopy in living cells. Biomedical Optics Express. 2 (8), (2011).
  8. Ishigaki, M., et al. STED super-resolution imaging of mitochondria labeled with TMRM in living cells. Mitochondrion. 28, 79 (2016).
  9. Liss, V., Barlag, B., Nietschke, M., Hensel, M. Self-labelling enzymes as universal tags for fluorescence microscopy, super-resolution microscopy and electron microscopy. Scientific Reports. 5, 17740 (2015).
  10. Sergé, A., Bertaux, N., Rigneault, H., Marguet, D. Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotemporal cartography of cell membranes. Nat Methods. 5 (8), (2008).
  11. Appelhans, T., Busch, K. B. Dynamic imaging of mitochondrial membrane proteins in specific sub-organelle membrane locations. Biophysical reviews. 9 (4), 345-352 (2017).
  12. Wilmes, S., et al. Triple-color super-resolution imaging of live cells: resolving submicroscopic receptor organization in the plasma membrane. Angewandte Chemie. 51 (20), 4868-4871 (2012).
  13. Niewidok, B., et al. Single-molecule imaging reveals dynamic biphasic partition of RNA-binding proteins in stress granules. J Cell Biol. , (2018).
  14. Wurm, C. A., Jakobs, S. Differential protein distributions define two sub-compartments of the mitochondrial inner membrane in yeast. FEBS Lett. 580 (24), 5628-5634 (2006).
  15. Schmidt, R., Wurm, C. A., Punge, A., Egner, A., Jakobs, S., Hell, S. W. Mitochondrial cristae revealed with focused light. Nano Lett. 9 (6), 2508-2510 (2009).
  16. Kukat, C., Wurm, C. A., Spahr, H., Falkenberg, M., Larsson, N. G., Jakobs, S. Super-resolution microscopy reveals that mammalian mitochondrial nucleoids have a uniform size and frequently contain a single copy of mtDNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (33), 13534-13539 (2011).
  17. Beinlich, F., Drees, C., Piehler, J., Busch, K. Shuttling of PINK1 between Mitochondrial Microcompartments Resolved by Triple-Color Superresolution Microscopy. ACS chemical biology. 10 (9), 1970-1976 (2015).
  18. Shim, S., et al. Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (35), 13978-13983 (2012).
  19. Sbalzarini, I., Mezzacasa, A., Helenius, A., Koumoutsakos, P. Effects of Organelle Shape on Fluorescence Recovery after Photobleaching. Biophysical Journal. 89 (3), 1482-1492 (2005).
  20. Reits, E., Neefjes, J. From fixed to FRAP: measuring protein mobility and activity in living cells. Nature Cell Biology. 3 (6), E145-E147 (2001).
  21. Goehring, N., Chowdhury, D., Hyman, A., Grill, S. FRAP Analysis of Membrane-Associated Proteins: Lateral Diffusion and Membrane-Cytoplasmic Exchange. Biophysical Journal. 99 (8), 2443-2452 (2010).
  22. Bacia, K., Haustein, E., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy: principles and applications. Cold Spring Harbor protocols. 2014 (7), 709-725 (2014).
  23. Sukhorukov, V., Dikov, D., Busch, K., Strecker, V., Wittig, I., Bereiter-Hahn, J. Determination of protein mobility in mitochondrial membranes of living cells. Biochimica et biophysica acta. 1798 (11), 2022-2032 (2010).
  24. Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Anal Bioanal Chem. 397 (8), 3173-3178 (2010).
  25. Graham, F. L., van der Eb, A. J. A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA. Virology. 52 (2), 456-467 (1973).
  26. Wedeking, T., et al. Spatiotemporally Controlled Reorganization of Signaling Complexes in the Plasma Membrane of Living Cells. Small. 11 (44), 5912-5918 (2015).
  27. Mironov, S. L., Ivannikov, M. V., Johansson, M. [Ca2+]i signaling between mitochondria and endoplasmic reticulum in neurons is regulated by microtubules. From mitochondrial permeability transition pore to Ca2+-induced Ca2+ release. J Biol Chem. 280 (1), 715-721 (2005).
  28. Poot, M., et al. Analysis of mitochondrial morphology and function with novel fixable fluorescent stains. J Histochem Cytochem. 44 (12), 1363-1372 (1996).
  29. Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells (vol 5, pg 159). Nature Methods. 5 (5), 455 (2008).
  30. Elmokadem, A., Yu, J. Optimal Drift Correction for Superresolution Localization Microscopy with Bayesian Inference. Biophys J. 109 (9), 1772-1780 (2015).
  31. Barlag, B., et al. Single molecule super-resolution imaging of proteins in living Salmonella enterica using self-labelling enzymes. Sci Rep. 6, 31601 (2016).
  32. Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells. Nature Methods. 5 (2), 159-161 (2008).
  33. Mortensen, K. I., Churchman, L. S., Spudich, J. A., Flyvbjerg, H. Optimized localization analysis for single-molecule tracking and super-resolution microscopy. Nat Methods. 7 (5), 377-381 (2010).
  34. Jin, S., Youle, R. J. PINK1- and Parkin-Mediated Mitophagy at a Glance. Journal of Cell Science. 125, 795-799 (2013).
  35. Yamano, K., Youle, R. J. PINK1 is degraded through the N-end rule pathway. Autophagy. 9 (11), 1758-1758 (2013).
  36. Wiedemann, N., et al. Machinery for protein sorting and assembly in the mitochondrial outer membrane. Nature. 424 (6948), 565-571 (2003).
  37. Thompson, R., Larson, D., Webb, W. Precise Nanometer Localization Analysis for Individual Fluorescent Probes. Biophysical Journal. 82 (5), 2775-2783 (2002).

Play Video

Cite This Article
Appelhans, T., Beinlich, F. R., Richter, C. P., Kurre, R., Busch, K. B. Multi-color Localization Microscopy of Single Membrane Proteins in Organelles of Live Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (136), e57690, doi:10.3791/57690 (2018).

View Video