כאן, אנו מציגים עבור צבע רב לוקליזציה של חלבוני ממברנה בודדת פרוטוקול organelles של תאים חיים. כדי לצרף fluorophores, משמשים החלבונים תיוג עצמי. חלבונים, במיקום שונה ממברנות תאי האברון המשמש אותו, יכול להיות מקומי עם דיוק של ~ 18 ננומטר.
הידע על הלוקליזציה של חלבונים ב- subcompartments סלולרי חיוני להבין את פעולתן. כאן, אנו מציגים טכניקה סופר רזולוציה המאפשרת מצפני microcompartments שהם נגישים חלבונים על ידי יצירת לוקליזציה ומעקב מפות של חלבונים אלו. יתר על כן, על ידי מיקרוסקופ צבע רב לוקליזציה, הלוקליזציה ומעקב פרופילים של חלבונים ב- subcompartments שונים מתקבלים בעת ובעונה אחת. הטכניקה ספציפית עבור תאים חיים והיא מבוססת על ההדמיה חוזרות של חלבוני ממברנה ניידים יחיד. חלבונים עניין גנטית הם התמזגו עם תגי תיוג עצמי מסוים, כביכול. תגים אלה הם אנזימים להגיב עם מצע באופן קשרי ערכיות. מצומדת כדי סובסטרטים אלה הם צבעי פלורסנט. התגובה של החלבונים האנזים מתויג עם פלורסצנטיות תוויות תוצאות מצעים בשנת חלבונים עם תוויות. כאן, Tetramethylrhodamine (TMR), סיליקון Rhodamine (SiR) משמשים כמו צבעי פלורסנט מחובר על מצעים של האנזימים. באמצעות ריכוז המצע ב רה מ למגוון ננומטר, תיוג תת stoichiometric מושגת שתוצאתו אותות ברורים. אותות אלה מותאמים עם ~ 15-27 דיוק ננומטר. הטכניקה מאפשרת הדמיה צבע רב של מולקולות יחיד, לפיה מספר הצבעים מוגבל על ידי קרום חדיר צבעים זמינים, לרפרטואר של תיוג עצמי של אנזימים. אנו מראים את הכדאיות של הטכניקה על-ידי קביעת ההתאמה של האנזים בקרת איכות (Pten)-induced קינאז 1 (PINK1) בתאים מיטוכונדריאלי שונה במהלך העיבוד שלו ביחס לחלבונים אחרים ממברנה. המבחן האמיתי הפיזי אינטראקציות בין חלבונים יחיד שכותרתו באופן שונה על ידי מולקולה בודדת סריג או מעקב משותף הוא מוגבל, אף, כי מעלות תיוג נמוך להקטין את ההסתברות שיש שני חלבונים סמוכים שכותרתו באותו זמן. בעוד הטכניקה חזקה הדמיה חלבונים בתאים ממברנה, ברוב המקרים זה לא הולם לקבוע הלוקליזציה של חלבונים מסיסים ניידים במיוחד.
המטרה של פרוטוקול זה נועד לספק שיטת הדמיה כדי להתאים לשפה ולעקוב אחר חלבוני ממברנה בודדת בתוך תאים חיים. אנחנו קוראים בשיטה זו, מעקב ו לוקליזציה מיקרוסקופ (TALM)1,2. כמו סטוכסטי אופטי שחזור מיקרוסקופ (סערה)3 ו-4,זריחה Photoactivation לוקליזציה מיקרוסקופ ((נ) דקל)5, TALM היא טכניקה לוקליזציה פלורסצנטיות מבוסס-מולקולה בודדת. עם זאת, ברורים בדרך כי הניידות של חלבוני ממברנה בשילוב עם הדמיה חוזרות של אותו הנקרא מולקולה-מגלה עמדות שונות microcompartment הנגיש עבור החלבון ניידים. במילים אחרות, הגרסא המקומית אפשרי של החלבון נקבעים על ידי הארכיטקטורה של אברון ועל ידי את הניידות של חלבון1. השיטה זו משלימים שונים אחרים סופר רזולוציה טכניקות6,7,8 כי הוא מגלה לוקליזציה, מסלול מפות על ידי הדמיה חלבונים ניידים. תיוג מבוסס על שימוש חלבונים פיוז’ן מהונדס גנטית כי הם כשלעצמם שאינם פלורסנט. חלבונים אלה פיוז’ן הם תיוג עצמי אנזימים להגיב covalently עם מצע מצומדת כדי צבע. הליך זה יש יתרון כי מידת תיוג יכול להיות נשלט על ידי כמות המצע שנוספו. יתר על כן, היא מאפשרת לשנות את הצבע של זריחה, בהתאם לצבוע מצומדת שבחרת. מספר תיוג עצמי אנזים-תגיות הן זמינות9. יתרון נוסף של השימוש תיוג עצמי תגי אנזים זה, כי צבעים מצומדת הם בדרך כלל יותר יציב ובהיר יותר מאשר חלבונים פלורסנט1 , חלבונים בודדים ולכן ניתן להקליט עוד ועוד בדיוק עד שהם נמצאים מולבן. דבר זה מאפשר ההקלטה של מסלולים של חלבונים ניידים, החילוץ של דיפוזיה המקדמים10,11.
. הנה, נדגים את הכדאיות של TALM עם ממברנה מיטוכונדריאלי חלבונים, אך זה ניתן להחיל גם חלבונים ממברנה אינטרה – ו תוספת – cellular אחרים, כולל תאים שונים סוגי12,13. אנחנו מראים כי צבע רב TALM נוסף מאפשר ההבחנה סימולטני של חלבונים ב- subcompartments שונה ב קומפלמנטציה קיימת סופר-רזולוציה קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ טכניקות14,15, 16-TALM התואמת לתא חי הדמיה17. צילום-הפיזיקה של rhodamines שבחרת Tetramethylrhodamine (TMR) וסיליקון-Rhodamien (אדון), בפרט שלהם בהירות ויציבות, מאפשרת ממברנה אחת רשומה חלבונים מסגרות מרובות ומספקת מפות לוקליזציה (ואת המסלול). TALM זאת, מוגבלת עבור ההתאמה של חלבונים מסיסים עם המקדמים של פעפוע מאז טשטוש תנועה גבוהים מדי, והפוטונים שנאספו לכל מסגרת נמוכים מדי בלוקאליזציה נאותה. חוץ מזה, TALM דורש פחות אנרגיה עירור מאשר לדוגמה סערה או דלדול פליטה מגורה (STED) מיקרוסקופיה6,7, הפחתת תופעות פוטוטוקסי. זה חשוב, מכיוון פוטוטוקסי לחץ משפיע לעיתים קרובות על מורפולוגיה אבחון18 ובכך ניידות ניתוח19. לסיכום, אנו מציגים צבע רב TALM בתאים חיים כמו טכניקה ממלאת פער בין השיטות מיקרוסקופ לוקליזציה הסערה/STED/דקל (נ) וטכניקות לנתח חלבון ניידות כגון קרינה פלואורסצנטית התאוששות לאחר photobleaching (FRAP)20 ,21קרינה פלואורסצנטית המתאם ספקטרוסקופיה (FCS)22, קרינה פלואורסצנטית לחצות המתאם ספקטרוסקופיה (FCCS)11,23.
. הנה, הוצגה טכניקה עבור צבע כפול לוקליזציה מולקולה בודדת של חלבוני ממברנה ניידים. בעקבות את הפרוטוקול, קרום חלבונים הם התמזגו כדי תיוג עצמי חלבונים כי מגיבים עם צבעים rhodamine TMR ואדוני מצומדת כדי מצעים המתאימים שלהם. Rhodamine צבעים בהירים, photostable, ובכך לאפשר הדמיה חוזרות1. לביצועים מ?…
The authors have nothing to disclose.
המחברים רוצה להודות ביופיזיקה קבוצה של יעקב Piehler ב אוניברסיטה של אוסנברוק תמיכה שוטפת, ולדיסלאו קוהל לקבלת סיוע טכני והכנת חומר של הלוח CellNanOs למתן מיקרוסקופים לשימוש. הפרויקט מומן על ידי 944 SFB.
(2-(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethanesulfonic acid, 1 M) (HEPES) | Biochrom | #1104E | |
DC1: Dichroid beam splitter | Chroma | 640 dcxr | NC506031 |
DC2: Polychroic Mirror, beamsplitter | Chroma | zt405/488/561/640rpc | discontinued |
Dulbecco´s Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1x (w/o Ca & Mg) | Sigma-Aldrich & Co. | #RNBF8311 | |
Earle´s MEM without phenol red, without L-Glutamine and without NaHCO3 containing 1% FBS, 0.1% HEPES, 0.1% NEAA, 0.1% Alanyl-L-Glutamine and 34.78% sodium hydrogen carbonate (NaHCO3 0.75g/l) | Imaging medium | ||
Earle´s minimum essential medium (MEM) with phenol red, containing 1% Fetal Bovine Serum Superior (FBS), 0.1% HEPES (2-(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethanesulfonic acid, 1 M), and 0.1% non-essential amino acids (NEAA) | Growth medium | ||
EF: Emission filter quadbandpass | AHF analysentechnik | F72-866 | Brightline HC 446 nm/523 nm/600 nm/677 nm |
EMCCD camera | Andor | Andor iXON 897 | EMCCD camera |
Emission filter QuadView filter cubes, orange | AHF analysentechnik | F39-637 | bandpass 582 – 619 nm |
Emission filter QuadView filter cubes, red | Chroma | bandpass 655 – 725 nm (HQ 690/70) | |
FBS (Fetal bovine serum) superior | Biochrom | S0615 | |
Fluorescent beads: TetraSpeck™ Microspheres, 0.1 µm, fluorescent blue/green/orange/dark red | Thermo Fisher Scientific | T7279 | fluorescent microspheres |
Glutamine | Biochrom | #0951C | |
HeLa cells | DSMZ | ACC-57 | Cervical carcinoma cells from patient Henrietta Lacks |
Hela cells CI::paGFP, stable | Muster et al., PLOSOne 2010 | ||
Hela cells CV g::Halo7-Tag, stable | Appelhans et al., NanoLett 2012 | ||
Hela cells Tom20::Halo7-Tag, stable | Appelhans et al., NanoLett 2012 | ||
Image splitter | Photometrics | Dual-View QV2 | image splitter emission |
Imaging processing software | ImageJ2 / Fiji | freeware | |
Immersion Oil – ImmersolTM 518 F (ne = 1.518, ve = 45) | Carl Zeiss Jena GmbH | 444960-0000-000 | |
Inverted epifluorescence microscope | Olympus IX-71/73/83 | ||
Laser 561 nm, 200 mW | CrystaLaser | CL-561-200 | 561 nm emission |
Laser 642 nm, 140 mW | Omicron | Luxx-642-140 | 642 nm emission |
MATLAB | MathWorks | version R2013a | |
MEM with Earle's Balanced Salt Solution 2.2 g/L NaHCO3, stable glutamine w/o PR | Biochrom | FG-0385 | |
MEM with Earle's Balanced Salt Solution with 2.2 g/L NaHCO3, stable glutamine, Phenolred | Biochrom | FG-0325 | |
MitoTracker® Deep Red FM | Thermo Fisher Scientific | M22426 | dye |
MitoTracker® Green FM | Thermo Fisher Scientific | M7514 | dye |
Multi-mode-optical polarization maintaining monomode fiber | Pointsource/Qioptiq | KineFLEX | |
NHS-PEG-MAL, Rapp Polymer | Rapp Polymere GmbH Tübingen | coverslip coating | |
non-essential amino acids (NEAA) | Biochrom | #0802E | |
PEG 800 (Polyethylene glycol) 10 % | Carl Roth GmbH | Art No. 0263.1 | coverslip coating |
Penicillin/Streptomycin | Biochrom | #0122E | |
Plasmid for PINK1-Halo7-Tag expression | Beinlich et al., ACS Chemical Biology 2015 | ||
Poly-L-lysine (1.2 mg/ml) | Sigma-Aldrich & Co. | Cat. No.P9155 | coverslip coating |
RGD Peptide (Ac-CGRGDS-COOH) | Coring System Diagnostix GmbH, Gernsheim | coverslip coating / Intergrin receptor motif | |
Silicon Rhodamine linked to HaloTag®-Ligand (SiRHTL) | personal gift from Kai Johnson | dye | |
Software analysis plugin | self-written C. P. Richter, Biophysik Osnabrück | SLIMFAST 16g | |
Tetramethylrhodamine / SNAP-Cell® TMR-Star linked to SNAP-Ligand (TMRstar) | New England Biolab® | S9105S | dye |
Tetramethylrhodamine linked to HaloTag®-Ligand (TMRHTL) | Promega | G8251 | dye |
TIRF condensor | Olympus | Cell^TIRF MITICO System | TIRF condensor |
TIRF microscope controlling software | Olympus cellSens 1.12 | ||
TIRF objective | Olympus | 150x oil objective (N.A. 1.45; Olympus UAPO) | |
Trypsin/EDTA 10x | Biochrom | #0266 | |
Water H2O 99,5 % Rotipuran® Low organic | Carl Roth GmbH | Art. No. HN57.1 |