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Biology

बहु रंग स्थानीयकरण एकल झिल्ली प्रोटीन की Organelles लाइव स्तनधारी कोशिकाओं में माइक्रोस्कोपी

Published: June 30, 2018 doi: 10.3791/57690
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1,3
1School of Biology, University of Osnabrück, 2Center of Cellular Nanoanalytics, Integrated Bioimaging Facility, University of Osnabrück, 3Department of Biology, WWU Münster

Summary

यहाँ, हम लाइव कोशिकाओं के organelles में एकल झिल्ली प्रोटीन के बहु रंग स्थानीयकरण के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । fluorophores संलग्न करने के लिए, स्व-लेबलिंग प्रोटीन का उपयोग किया जाता है । प्रोटीन, एक ही organelle के विभिन्न झिल्ली डिब्बों में स्थित है, की एक परिशुद्धता के साथ स्थानीयकृत किया जा सकता ~ 18 एनएम.

Abstract

सेलुलर उपडिब्बों में प्रोटीन के स्थानीयकरण के बारे में ज्ञान उनके विशिष्ट समारोह को समझने के लिए महत्वपूर्ण है । यहां, हम एक सुपर संकल्प तकनीक है कि microcompartments है कि प्रोटीन के लिए स्थानीयकरण पैदा करने और इन प्रोटीन के नक्शे पर नज़र रखने के लिए सुलभ है के निर्धारण के लिए अनुमति देता है उपस्थित । इसके अलावा, बहु रंग स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी द्वारा, स्थानीयकरण और विभिन्न उपडिब्बों में प्रोटीन की ट्रैकिंग प्रोफाइल एक साथ प्राप्त कर रहे हैं । तकनीक जीवित कोशिकाओं के लिए विशिष्ट है और एकल मोबाइल झिल्ली प्रोटीन के दोहराव इमेजिंग पर आधारित है । ब्याज के प्रोटीन आनुवंशिक रूप से विशिष्ट, तथाकथित स्वयं लेबलिंग टैग के साथ जुड़े हुए हैं । इन टैग एंजाइमों कि एक आबंध तरीके से एक सब्सट्रेट के साथ प्रतिक्रिया कर रहे हैं । इन सब्सट्रेट करने के लिए संयुग्मित फ्लोरोसेंट रंजक हैं । एंजाइम की प्रतिक्रिया-प्रोटीन लेबल में सब्सट्रेट परिणाम लेबल प्रतिदीप्ति के साथ- यहां, Tetramethylrhodamine (टीएमआर) और सिलिकॉन Rhodamine (सर) एंजाइमों के सब्सट्रेट से जुड़ी फ्लोरोसेंट रंजक के रूप में उपयोग किया जाता है । प्रधानमंत्री को एनएम रेंज में सब्सट्रेट सांद्रता का उपयोग करके, उप-stoichiometric लेबलिंग कि विशिष्ट संकेतों में परिणाम प्राप्त किया है । इन संकेतों के साथ स्थानीयकृत रहे हैं ~ 15 – 27 एनएम परिशुद्धता. तकनीक बहु के लिए अनुमति देता है एक अणु के रंग इमेजिंग, जिससे रंग की संख्या उपलब्ध झिल्ली-पारगंय रंजक और स्वयं की प्रदर्शनों लेबल एंजाइमों द्वारा सीमित है । हम गुणवत्ता नियंत्रण एंजाइम (Pten)-प्रेरित कळेनासे 1 (PINK1) के स्थानीयकरण का निर्धारण करके तकनीक की व्यवहार्यता दिखाने के अंय झिल्ली प्रोटीन के संबंध में अपनी प्रोसेसिंग के दौरान विभिंन mitochondrial डिब्बों में । एक अणु झल्लाहट या सह-ट्रैकिंग द्वारा अलग लेबल एकल प्रोटीन के बीच सच शारीरिक बातचीत के लिए परीक्षण प्रतिबंधित है, हालांकि, क्योंकि कम लेबलिंग डिग्री दो आसंन एक ही समय में लेबल प्रोटीन होने के लिए संभावना कम । जबकि तकनीक झिल्ली डिब्बों में इमेजिंग प्रोटीन के लिए मजबूत है, ज्यादातर मामलों में यह उचित नहीं है अत्यधिक मोबाइल घुलनशील प्रोटीन के स्थानीयकरण का निर्धारण ।

Introduction

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य स्थानीयकरण और लाइव कोशिकाओं के अंदर एकल झिल्ली प्रोटीन ट्रैक करने के लिए एक इमेजिंग विधि प्रदान करने के लिए है । हम इस विधि पर नज़र रखने और स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (TALM)1,2कहते हैं । जैसे Stochastic ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी (स्टॉर्म)3 और प्रतिदीप्ति Photoactivation स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी ((एफ) पाम)4,5, TALM एक अणु है आधारित प्रतिदीप्ति स्थानीयकरण तकनीक । हालांकि, यह अलग स्थिति में एक ही लेबल अणु के दोहराव इमेजिंग के साथ संयोजन में झिल्ली प्रोटीन की गतिशीलता कि मोबाइल प्रोटीन के लिए सुलभ है कि microcompartment से पता चलता है कि रास्ते में अलग है । दूसरे शब्दों में, प्रोटीन के संभावित स्थानीयकरण organelle की वास्तुकला द्वारा और प्रोटीन की गतिशीलता द्वारा निर्धारित कर रहे हैं1. विधि विभिंन अंय सुपर संकल्प तकनीक6,7,8 के पूरक है क्योंकि यह स्थानीयकरण और इमेजिंग मोबाइल प्रोटीन द्वारा पथ नक्शे से पता चलता है । लेबल आनुवंशिक रूप से इंजीनियर फ्यूजन प्रोटीन है कि एसई प्रति गैर फ्लोरोसेंट का उपयोग कर रहा है पर आधारित है । ये फ्यूजन प्रोटीन स्वयं लेबलिंग एंजाइमों कि एक डाई करने के लिए एक सब्सट्रेट संयुग्मित के साथ covalently प्रतिक्रिया कर रहे हैं. इस प्रक्रिया का लाभ यह है कि लेबलिंग की डिग्री जोड़ा सब्सट्रेट की राशि से नियंत्रित किया जा सकता है. इसके अलावा, यह प्रतिदीप्ति के रंग भिंन है, चुना संयुग्मित डाई पर निर्भर करता है की अनुमति देता है । कई स्वयं लेबलिंग एंजाइम-टैग उपलब्ध9हैं । स्वयं का उपयोग कर का एक और लाभ-लेबलिंग एंजाइम-टैग है, कि संयुग्मित रंजक आमतौर पर अधिक स्थिर और फ्लोरोसेंट प्रोटीन1 और व्यक्तिगत प्रोटीन से उज्जवल है इसलिए अब और अधिक ठीक दर्ज किया जा सकता है जब तक वे ब्लीच कर रहे हैं । यह मोबाइल प्रोटीन की गति और प्रसार की निकासी गुणांक10,11की रिकॉर्डिंग के लिए अनुमति देता है ।

यहाँ, हम mitochondrial झिल्ली प्रोटीन के साथ TALM की व्यवहार्यता का प्रदर्शन, लेकिन यह भी अन्य अंतर और अतिरिक्त सेलुलर झिल्ली प्रोटीन के लिए लागू किया जा सकता, विभिन्न कोशिका प्रकार12,13सहित. हम बताते है कि बहु रंग TALM आगे के लिए पूरक में विभिंन उपडिब्बों में प्रोटीन के एक साथ अंतर के लिए अनुमति देता है मौजूदा सुपर संकल्प प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी तकनीक14,15, 16. TALM लाइव सेल इमेजिंग17के साथ संगत है । फोटो-चुना rhodamines Tetramethylrhodamine (टीएमआर) और सिलिकॉन के भौतिकी-Rhodamien (सर), विशेष रूप से उनकी चमक और स्थिरता में, स्थानीयकरण (और पथ) नक्शे प्रदान करने के लिए कई फ्रेम पर एकल झिल्ली प्रोटीन रिकॉर्ड करने के लिए अनुमति देता है । हालांकि, TALM उच्च प्रसार गुणांक के साथ घुलनशील प्रोटीन के स्थानीयकरण के लिए सीमित है क्योंकि प्रस्ताव धुंधला बहुत अधिक है और प्रति फ्रेम एकत्र फोटॉनों उचित स्थानीयकरण के लिए बहुत कम हैं । इसके अलावा, TALM उदाहरण के तूफान या उत्तेजित उत्सर्जन कम करने (STED) माइक्रोस्कोपी6,7, phototoxic प्रभाव को कम करने के लिए की तुलना में उत्तेजना शक्ति की आवश्यकता है । यह महत्वपूर्ण है, क्योंकि phototoxic तनाव अक्सर organellar आकृति विज्ञान18 को प्रभावित करता है और इस प्रकार गतिशीलता विश्लेषण19. संक्षेप में, हम वर्तमान बहु-रंग TALM एक तकनीक है कि स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी तरीकों तूफान के बीच एक अंतर भरता है के रूप में रहने वाले कोशिकाओं में STED/(च) पाम और तकनीक है कि प्रोटीन गतिशीलता का विश्लेषण जैसे प्रतिदीप्ति वसूली के बाद photobleaching (frap है)20 ,२१, प्रतिदीप्ति सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (FCS)२२, तथा प्रतिदीप्ति परस्पर सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (FCCS)११,२३.

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Protocol

निंनलिखित प्रोटोकॉल स्थानीय संस्था अनुसंधान नैतिकता समिति के दिशानिर्देशों का पालन करता है ।

1. विधियाँ

  1. सेल संस्कृति
    1. खेती कोशिकाओं, उदाहरण के लिए हेला कोशिकाओं (मानव ग्रीवा कार्सिनोमा), एक T25 सेल संस्कृति कुप्पी में ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह2पर विकास माध्यम के 5 मिलीलीटर युक्त ।
      नोट: इमेजिंग के लिए, तैयार coverslips पर कक्षों को विभाजित करें (चरण १.३ और १.४ देखें) और इमेजिंग माध्यम में रखें ।
  2. सेल अभिकर्मक
    नोट: सेल लाइनों का उपयोग करें कि छुरा टैग प्रोटीन व्यक्त जब भी संभव24 मजबूत व्यक्त से बचने के लिए । क्षणिक अभिकर्मक के लिए, अभिकर्मक के लिए इस्तेमाल प्लाज्मिड डीएनए की मात्रा में अनुकूलन । उदाहरण के लिए, जब Ca2 + फास्फेट अभिकर्मक25 का उपयोग किया जाता है, transfect कोशिकाओं (80 – 90% प्रवाह) में एक ३.५ सेमी सेल कल्चर डिश के साथ 2.5 – 5 µ g of प्लाज्मिड DNA. डबल अभिकर्मक करते समय, २.५ µ g प्रति प्रत्येक प्लाज्मिड निर्माण का उपयोग करें ।
    1. दोहरे रंग प्रयोगों के लिए, एक स्वयं के स्थिर अभिव्यक्ति लेबलिंग प्रोटीन और अंय स्व-लेबलिंग प्रोटीन17एंकोडिंग प्लाज्मिड के साथ क्षणिक transfect के साथ एक सेल लाइन का उपयोग करें ।
      नोट: यहां, दोहरी रंग प्रयोगों के लिए, हेला कोशिकाओं का इस्तेमाल किया गया है कि छुरा आत्म लेबलिंग प्रोटीन PINK1-हेलो-टैग और Tom20-fSNAP-टैग व्यक्त की ।
  3. coverslips की सफाई
    1. coverslips को एक यूरिन में लगाएं । coverslips युक्त चोंच में एच2ओ के 30 मिलीलीटर जोड़ें और धीरे से अपनी सतह से धूल हटाने के लिए हिला ।
    2. चिमटी के साथ coverslips इकट्ठा और उंहें नाइट्रोजन की एक धारा के साथ सूखी ।
    3. coverslips की सतह पर किसी भी कार्बनिक संदूषण निकालें, उदाहरणके लिए, प्लाज्मा सफाई से ।
      नोट: कांच सामग्री के आगे संदूषण से बचने के लिए, coverslips से निपटने के दौरान दस्ताने पहनते हैं ।
      चेतावनी: जब coverslips प्लाज्मा सफाई द्वारा साफ कर रहे हैं, केवल coverslips के ऊपरी पक्ष साफ है; पाली-एल-Lysine-पॉलीथीन ग्लाइकोल-arginine-glycine-aspartate (पीएलएल-खूंटी-RGD) (धारा १.४) और सेल सीडिंग (धारा १.५) के साथ कोटिंग के लिए इस पक्ष का उपयोग करें ।
  4. पीएलएल के साथ Coverslip कोटिंग-खूंटी-RGD
    नोट: पीएलएल-खूंटी-RGD एक पाली-एल-Lysine (पीएलएल) एक पॉलीथीन ग्लाइकोल के साथ व्युत्पंन संलग्न (३,००० दा) और एक cysteine-glycine-arginine-glycine-aspartate-serine (CGRGDS) पेप्टाइड । पीएलएल नकारात्मक चार्ज कांच की सतह को बांधता है और एक खूंटी ब्रश रूपों । यह काफी चार्ज फ्लोरोसेंट रंजक के विशिष्ट बंधन को कम कर देता है । इसके अलावा, RGD आकृति integrin रिसेप्टर के संकेत पेप्टाइड की नकल करती है और इस तरह कोशिकाओं है कि अंयथा आसानी से पालन नहीं की integrin मध्यस्थता पालन को बढ़ावा देता है ।
    1. तैयार पीएलएल-खूंटी-RGD पहले26वर्णित के रूप में । में कम, भंग ०.८ पीएलएल के एमजी-खूंटी-पंजाब के 1 मिलीलीटर में RGD । एक साफ coverslip के ऊपरी ओर पीएलएल-पेग-RGD सॉल्यूशन के 10 µ l को डालें ।
    2. एक दूसरे coverslip ले लो और यह अपनी साफ सतह के साथ पहले coverslip पर उल्टा जगह (है कि पीएलएल-खूंटी शीर्ष पर RGD ड्रॉप है); यह दो coverslips के बीच पीएलएल-खूंटी-RGD समाधान सैंडविच में परिणाम है ।
    3. सावधानी से एक चोंच में सैंडविच coverslips जगह और एक धूल से मुक्त शुष्क वातावरण में कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए मशीन ।
    4. 1 ज के बाद, coverslips को पूरी तरह पानी से ढक कर यूरिन के लिए एच2ओ के 30 मिलीलीटर डालें ।
    5. धीरे से चोंच हिलाना जब तक एक दूसरे से coverslips अलग ।
    6. coverslips को पानी से बाहर इकट्ठा करने और उन्हें नाइट्रोजन गैस की एक धारा के नीचे सूखने के लिए चिमटी का प्रयोग करें ।
      नोट: लेपित coverslips दिन के एक जोड़े के लिए ढक्कन के साथ एक सूखी, बाँझ गिलास पेट्री डिश में संग्रहीत किया जा सकता है ।
  5. इमेजिंग के लिए नमूना तैयार करना
    1. एक ३५ मिमी कोशिका संस्कृति पकवान में एक लेपित coverslips स्थानांतरण, पीएलएल-खूंटी RGD लेपित सतह ऊपर की ओर का सामना करना पड़ के साथ और शीर्ष पर इमेजिंग मध्यम के 2 मिलीलीटर जोड़ें ।
    2. जोड़ें ~ ५००,००० trypsinized कोशिकाओं (200-500 µ एल) है कि स्व-लेबलिंग टैग संबंधित झिल्ली प्रोटीन पर 2 मिलीलीटर इमेजिंग माध्यम के लिए सेल संस्कृति डिश में लेपित coverslip के साथ व्यक्त करते हैं । एक समान रूप से सेल परत प्राप्त करने के लिए कोशिकाओं के एक समरूप वितरण सुनिश्चित करने के लिए हाथ से धीरे से हिला ।
    3. ३७ ° c और 5% सह2 पर कोशिकाओं की मशीन ८०% तक प्रवाह तक पहुंच जाता है ।
      नोट: सेल नमूनों इमेजिंग से पहले 3 दिन और 1 दिन अभिकर्मक से पहले वरीयता प्राप्त किया जाना चाहिए । कोशिकाओं है, जो छुरा ब्याज के प्रोटीन व्यक्त, इमेजिंग से पहले 2 दिन वरीयता प्राप्त किया जा सकता है । बाद में, केवल coverslip पर उगाए गए कक्षों की छवि होती है.
  6. टैग की गईं प्रोटीन का लेबल
    नोट: सबसे फ्लोरोसेंट सब्सट्रेट पानी मुक्त DMSO में भंग किया जाना है । हम 1 µ एम फ्लोरोसेंट सब्सट्रेट के शेयर समाधान का उपयोग करने की सलाह जब अंतिम लेबलिंग एकाग्रता 0.2-30 एनएम17है । कोशिकाओं के अंदर इमेजिंग झिल्ली प्रोटीन के लिए, उपयोग झिल्ली पारगंय फ्लोरोसेंट सब्सट्रेट ।
    1. एक जल स्नान में ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए इमेजिंग मध्यम गर्म ।
    2. पिपेट 1 मिलीलीटर पूर्व गर्म इमेजिंग मध्यम के ढक्कन के साथ एक 2 मिलीलीटर ट्यूब में । 1 µ एम स्टॉक समाधान से फ्लोरोसेंट सब्सट्रेट के 0.2-30 µ एल जोड़ें अंतिम लेबलिंग समाधान (अंतिम एकाग्रता: 0.2-30 एनएम) तैयार करने के लिए ।
    3. भंवर 10 एस के लिए लेबलिंग समाधान ।
    4. एक coverslip पर कोशिकाओं के साथ ३५ mm संस्कृति डिश में मध्यम स्थानापन्न (१.५ कदम देखें) तैयार लेबलिंग समाधान के 1 मिलीलीटर से ।
    5. ३७ ° c और 5% सह2 पर लेबलिंग समाधान में कोशिकाओं की मशीन 20 के लिए-30 मिनट ।
    6. 2 मिलीलीटर की 2 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को एक बार धो लें, फिर इमेजिंग मध्यम से दो बार । अंत में, सेल डिश के लिए ताजा इमेजिंग मध्यम के 1 मिलीलीटर पिपेट और नमूना डाल वापस ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह2 पर मशीन में कम से 1 एच के लिए । इमेजिंग से पहले, इमेजिंग मीडियम को एक बार और एक्सचेंज करें ।
      नोट: जब पहली बार प्रयोग चल रहा है, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध organelle विशिष्ट रंजक27,28के साथ organelles दाग द्वारा organellar झिल्ली के लिए स्व-लेबल प्रोटीन के सही लक्ष्यीकरण की पुष्टि करें । इस मामले में, भी 100 का उपयोग करें-200 एनएम के लिए स्वयं लेबल एंजाइमों के लिए मजबूत संकेतों का उत्पादन ।
  7. एक फ्लोरोसेंट मनका नमूना की तैयारी
    नोट: आदेश में ऑप्टिकल बहाव का निर्धारण करने के लिए और विभिन्न चैनलों की छवियों को संरेखित करने के लिए, बहु रंग फ्लोरोसेंट मोती (०.१ µm) का उपयोग किया जाता है । दर्ज छवियों के साथ, दो उत्सर्जन चैनलों के लिए एक affine परिवर्तन मैट्रिक्स उत्पंन किया जाएगा ।
    1. शुद्ध एच2ओ के साथ 1% करने के लिए मोतियों का समाधान पतला
    2. एक साफ coverslip पर पांच विभिंन पदों पर प्रतिदीप्ति मोतियों के साथ तैयार समाधान के 5 बूंदें प्लेस (१.३ कदम देखें) ।
    3. एक साफ बेंच पर फ्लोरोसेंट मनका नमूना सूखी चलो ।
      नोट: नमूना फिर से इस्तेमाल किया जा सकता है; इसलिए, संक्रमण से बचने और एक 4 डिग्री सेल्सियस पर रखने के लिए एल्यूमीनियम पंनी के साथ नमूना कवर ।

2. माइक्रोस्कोपी

  1. प्रायोगिक सेटअप
    नोट: दोहरे रंग एकल अणु इमेजिंग के लिए एक बुनियादी माइक्रोस्कोपी प्रणाली एक औंधा माइक्रोस्कोप पर आधारित है: यह एक एकल कुल आंतरिक प्रतिबिंब में monomode फाइबर को बनाए रखने के एक बहु-मोड-ऑप्टिकल ध्रुवीकरण के माध्यम से युग्मित दो पराबैंगनीकिरण के साथ सुसज्जित है (तिर) संघनित्र, एक तेल विसर्जन उद्देश्य TIRF, एक polyband उत्सर्जन फिल्टर, एक छवि अलगानेवाला, और एक उच्च संवेदनशील कैमरा (चित्रा 1) के लिए बनाया गया है । एक तिर संघनित्र की जरूरत है कि घटना के कोण की सतत ट्यूनिंग के लिए अनुमति देता है महामारी के बीच स्विच करने के लिए, अत्यधिक झुका और फाड़ा ऑप्टिकल शीट (अत्यधिक इच्छुक पतली रोशनी (हिलो)29), और अनुकूलित के साथ TIRF उत्तेजना मोड पैठ गहराई । छवियां एक अति-संवेदनशील कूल्ड डिटेक्टर सिस्टम के साथ प्राप्त कर रहे हैं, उदाहरण के लिए, एक वापस प्रबुद्ध इलेक्ट्रॉन गुणा आरोपित डिवाइस (EMCCD) कैमरा (क्वांटम दक्षता QE > 90%) या एक sCMOS कैमरा (QE > 80-90%) ।
    1. इमेजिंग फ्लोरोसेंट मोतियों से ऑप्टिकल बहाव का निर्धारण (चरण २.२ देखें) उन है कि बाद में प्रयोग के लिए इस्तेमाल किया जाएगा के रूप में एक ही स्थिति के तहत, उदाहरणके लिए, जब १०,००० फ्रेम प्रयोग में दर्ज कर रहे हैं, रिकार्ड भी मनका नमूना के साथ १०,००० फ्रेम । ऑप्टिकल बहाव के निर्धारण के लिए, पहले फ्रेम में मोतियों की स्थिति और पिछले अधिग्रहीत फ्रेम (आंकड़ा 1b) की तुलना करें । यदि आवश्यक हो, बाद में ऑप्टिकल बहाव के लिए छवि श्रृंखला को सही30 और/
    2. ऑरेंज और रेड प्रतिदीप्ति प्लस ऑरेंज प्रतिदीप्ति और रेड प्रतिदीप्ति के लिए पर्याप्त उत्सर्जन फिल्टर के लिए, उदाहरणके लिए, उपयुक्त dichroic बीम अलगानेवाला के साथ फिल्टर घन लैस । उपयुक्त फिल्टर के साथ छवि अलगानेवाला लैस । दोनों चैनलों में एकल रंग नमूने रिकॉर्डिंग द्वारा अन्य चैनल में एक चैनल से संकेतों की संभावित रिसाव के लिए जाँच करें (चित्रा 1C).

Figure 1
चित्रा 1 : नारंगी और लाल उत्सर्जक के साथ बहु रंग ट्रैकिंग और स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (TALM) के लिए ऑप्टिकल लेआउट । (a) उल्टे माइक्रोस्कोप सेटअप के साथ कम से दो उत्तेजना पराबैंगनीकिरण, एक TIRF संघनित्र, एक TIRF उपयुक्त उद्देश्य, एक छवि अलगानेवाला, और एक संवेदनशील कैमरा. इनसेट: कोशिकाओं के अंदर organelles उत्तेजित करने के लिए, घटना बीम के कोण TIRF के लिए महत्वपूर्ण कोण की तुलना में छोटे सेट करने के लिए अत्यधिक झुका और फाड़ा ऑप्टिकल शीट रोशनी (हिलो) प्राप्त करना चाहिए । DC1: Dichroic मिरर 1; DC2: Dichroic दर्पण 2. EF: उत्सर्जन फ़िल्टर । (ख) निंनलिखित प्रयोगों के रूप में एक ही फ्रेम दर के साथ १०,००० फ्रेम के लिए एक फ्लोरोसेंट मनका के इमेजिंग पदों द्वारा ऑप्टिकल बहाव पर परीक्षण (यहां: 15 हर्ट्ज) । पहले ५०० फ्रेम और पिछले ५०० फ्रेम के जुड़े पदों बहाव दिखा । इसके अलावा, लाल और नीले रंग में पहली और अंतिम फ्रेम की स्थिति के साथ एक विलय छवि एक न्यूनतम बहाव दिखा । बहाव कुल रिकॉर्डिंग समय से विभाजित संकेतों के केंद्र के बीच की दूरी है, यहाँ १२५ बजे/एस. (ग) संकेतों की स्पष्ट जुदाई पर जाँच, यहाँ टीएमआर और सर. दोनों चैनलों के लिए, संचयी योग छवियाँ से ३,००० फ़्रेम (टीएमआर चैनल में 1 और सर में चैनल 2) उत्पन्न किए गए थे । सरHTL को Tom20-HaloTag और टीएमआरHTL को OxPhos कॉम्प्लेक्स वी-HaloTag से अटैच किया गया था. रंग झूठे रंग हैं । स्केल बार्स = १०० एनएम (बी) और 1 µm (सी) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

  1. छवि अलगानेवाला जनित छवियों के शारीरिक संरेखण
    नोट: एक coverslip पर तैयार नमूना बढ़ते के लिए, एक आत्म निर्मित नमूना धारक इस्तेमाल किया जा सकता है (चित्रा 2a). धूल से बचने के लिए, आदि के नमूने में गिर रही है , चैंबर के शीर्ष पर ढीला संस्कृति डिश के ढक्कन जगह है, जब घुड़सवार । एक ही नमूना धारक फ्लोरोसेंट मोतियों या कोशिकाओं के साथ coverslip माउंट करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है; जब कोशिकाओं imaged रहे हैं, इमेजिंग मध्यम के 0.5-0.8 मिलीलीटर जोड़ें । छवि अलगानेवाला दो या अधिक वर्णक्रम अलग चैनलों में छवि विभाजन और उन परियोजनाओं के साथ-साथ एक ही कैमरे पर । इस प्रक्रिया के संभावित अलग ऑप्टिकल रास्तों के कारण चैनलों के बीच व्यवस्थित विकृतियों का परिचय और नुकसान पहुंचा प्रत्यक्ष colocalization विश्लेषण । इसलिए, पहले भौतिक संरेखण और दूसरा, बाद सुधार संरेखण एक परिवर्तन मैट्रिक्स के साथ प्रदर्शन । दोनों संरेखण प्रक्रियाओं के लिए, फ्लोरोसेंट मोतियों को देखने के क्षेत्र भर में वितरित homogenously किया जाना चाहिए ।
    1. polytetrafluoroethylene (PTFE)-अंगूठी और लाल रबर की अंगूठी (चित्रा 2a) के बीच नमूना धारक में फ्लोरोसेंट मोतियों की माला के साथ तैयार नमूना माउंट ।
    2. माइक्रोस्कोप शुरू, सभी हार्डवेयर घटकों, और सभी सॉफ्टवेयर माइक्रोस्कोपी के लिए आवश्यक.
    3. साफ उद्देश्य और एक एक प्रकार का वृक्ष-मुक्त ऊतक isopropanol के साथ गीला पोंछ के साथ coverslip के नीचे । फिर एक ताजा एक प्रकार का वृक्ष-मुक्त ऊतक के साथ दोनों मदों सूखी । उद्देश्य लेंस की पुतली पर विसर्जन तेल की एक छोटी बूंद प्लेस ।
    4. coverslip संपर्क तेल के नीचे इतना है कि माइक्रोस्कोप मंच पर मनका नमूना के साथ नमूना धारक प्लेस । संचरण प्रकाश या एक लेज़र लाइन का उपयोग करके मोतियों पर ध्यान केंद्रित ।
    5. दो प्रतिदीप्ति चैनलों में समान संकेत तीव्रता को प्राप्त करने के लिए दो उत्तेजना पराबैंगनीकिरण की शक्ति को समायोजित करें । कई अलग फ्लोरोसेंट संकेतों के साथ एक क्षेत्र के लिए खोजें ।
    6. कैमरा नियंत्रण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके फ्लोरोसेंट चैनलों के एक विलय दृश्य उत्पंन करते हैं । फिर छवि अलगानेवाला पर शिकंजा का उपयोग करने के लिए मैंयुअल रूप से आंतरिक छवि अलगानेवाला के दर्पण झुकाव दो फ्लोरोसेंट चैनल (चित्रा बी) से संकेतों का सबसे अच्छा ओवरले को प्राप्त करने के लिए ।
      नोट: ध्यान दें! कैमरा के गतिशील रेंज से अधिक नहीं है ।
  2. स्थानिक परिवर्तन प्रदर्शन सॉफ्टवेयर द्वारा वर्णक्रम से अलग चैनलों के संरेखण
    नोट: निंनलिखित भाग के बाद सुधार संरेखण और हमारे सॉफ्टवेयर प्लगइन के साथ स्थानीयकरण प्रक्रिया दिखाता है (अनुरोध पर उपलब्ध है) ।
    1. सॉफ्टवेयर को नियंत्रित करने TIRF माइक्रोस्कोप शुरू करने और लाइव स्ट्रीम मोड में व्यक्तिगत चैनलों को प्रदर्शित करने के लिए चुनते हैं । सभी चैनलों में एक स्नैपशॉट छवि रोमांचक प्रतिदीप्ति ले लो (चित्रा 2c) ।
    2. इस स्नैपशॉट छवि का उपयोग रूपांतरण मैट्रिक्स बनाने के लिए करें ( चित्र 2देखें) ।
      नोट: परिवर्तन मैट्रिक्स एक स्थानिक परिवर्तन के लिए प्रयोग किया जाता है, आम तौर पर एक affine एक, कि अनुवाद के लिए सही (दो चैनलों के बीच एक बिंदु स्रोत से संकेतों के विचलन) ।
    3. सॉफ़्टवेयर विश्लेषण प्लगइन प्रारंभ करें (हमारी प्रयोगशाला से अनुरोध पर प्राप्त किया जा सकता है, चित्र 2cदेखें).
    4. पहले दर्ज दोहरी रंग छवियों लोड सॉफ्टवेयर में फ्लोरोसेंट मोतियों की (२.२ कदम देखें) । फ्लोरोसेंट चैनलों का इस्तेमाल किया अभिविंयास चुनें ।  फिर ' पर क्लिक करें ' हां जब ' जांचना छवियां ' और पहले लिया स्नैपशॉट का चयन करने के लिए कहा ।
    5. इकाई रूपांतरण कारकों (पिक्सेल आकार, फ़्रेम दर, फोटॉन रूपांतरण कारक) को परिभाषित करने के लिए "इकाई प्रबंधक" खोलें ।
    6. "स्थानीयकरण प्रबंधक" खोलें । पहले पॉइंट स्प्रेड फंक्शन (पीएसएफ) निर्धारित करें । प्रेस बटन: "पीएसएफ त्रिज्या" । "पीएसएफ अनुमानक" खिड़की है कि खोलता है में, संख्यात्मक एपर्चर और उत्सर्जन अधिकतम परिभाषित । क्लिक करके "अनुमान पीएसएफ त्रिज्या" प्रारंभ करें । प्राप्त प्रयोगात्मक पीएसएफ स्वीकार करें । मूल्यांकन बॉक्स, संकुचन की संख्या को परिभाषित करें, और कंप्यूटर के कितने कोर परिकलन के लिए उपयोग किए जाते हैं । एक 2d सममित गाऊसी समारोह (चित्रा 2c) द्वारा एकल कणों की तीव्रता वितरण फिटिंग शुरू करने के लिए "स्थानीयकरण" दबाएँ.
    7. "स्वीकार" प्राप्त प्रयोगात्मक पीएसएफ. मूल्यांकन बॉक्स, संकुचन की संख्या को परिभाषित करें, और कंप्यूटर के कितने कोर गणना के लिए उपयोग किया जाता है । एक 2d सममित गाऊसी समारोह (चित्रा 2c) द्वारा एकल कणों की तीव्रता वितरण फिटिंग शुरू करने के लिए "स्थानीयकरण" दबाएँ.
    8. "अंशांकन प्रबंधक" खोलें । दो चैनलों की रेंडर की गई मर्ज की गई छवि में, मूल सिग्नल और स्थानीयकृत केंद्र दिखाए गए हैं. "affine" मोड चुनें । मैन्युअल रूप से एक कनेक्शन लाइन ड्राइंग द्वारा एक ही फ्लोरोसेंट मनका से उत्पन्न हुआ है कि दो चैनलों में स्थानीयकृत केंद्रों के इसी जोड़े कनेक्ट.
    9. सभी वितरित संगत संकेतों को दृश्य के फ़ील्ड से कनेक्ट करें । इस के बाद, प्रेस "स्वीकार" । अंशांकन सहेजें ।
      नोट: स्थानिक परिवर्तन के बीच में प्रत्येक फ्लोरोसेंट मनका और दुओं में नमूना है । निकाले परिवर्तन समारोह एक विस्थापन क्षेत्र Δr (एक्स, वाई) का प्रतिनिधित्व करता है कि बाद में प्रयोगात्मक दोहरे रंग एकल अणु स्थानीयकरण तो सही है कि वे अपने स्थानीयकरण परिशुद्धता के भीतर ओवरले के लिए प्रयोग किया जाता है । स्थानिक रूपांतरण मैट्रिक्स आम तौर पर एक affine एक है कि अनुवाद, स्केलिंग, और नैनोमीटर सटीकता के साथ चैनलों के बीच रोटेशन के लिए सही है, और यह इस मैनुअल एक-से-एक मानचित्रण (चित्रा 2c) से आस्थगित किया जा सकता है ।

Figure 2
चित्रा 2 : दोहरी रंग संरेखण के लिए कार्यप्रवाह । (क) फ्लोरोसेंट मोतियों के साथ coverslip एक PTFE और एक रबर की अंगूठी के बीच एक नमूना धारक में बढ़ रहा है । इसके बाद चैंबर के ऊपरी और निचले हिस्से को एक साथ बोल्ट कर रहे हैं । (ख) छवि अलगानेवाला द्वारा उत्पंन कर रहे है कि चैनल विचारों का भौतिक संरेखण । मोतियों से दर्ज फ्लोरोसेंट संकेतों (०.१ µm) दो चैनलों में (हरे और लाल, झूठे रंग) विलय कर रहे हैं । ऑप्टिकल छवि अलगानेवाला पर इसी शिकंजा मैंयुअल रूप से विभिंन संकेतों का सबसे अच्छा ओवरले (पीला रंग, कम पैनल) हासिल की है जब तक कर रहे हैं । (ग) के बाद प्रक्रिया चैनल संरेखण के लिए एक परिवर्तन मैट्रिक्स की पीढ़ी । एक कण की सटीक स्थानीयकरण के लिए, यह उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य और उद्देश्य के संख्यात्मक एपर्चर पर निर्भरता में बिंदु प्रसार समारोह (पीएसएफ) का निर्धारण करने के लिए आवश्यक है । एक पीएसएफ के केंद्र अपनी तीव्रता प्रोफ़ाइल द्वारा निर्धारित किया जा सकता है एक सममित दो आयामी गाऊसी फिट द्वारा विश्लेषण । संकेत चोटी के परिणामस्वरूप स्थानीयकरण तो मूल, धुंधला संकेतों पर पेश है । मर्ज किए गए छवि में, दो चैनलों से संकेतों का स्थानीयकृत केंद्र बाद में प्रायोगिक डेटा के बाद प्रक्रिया संरेखण के लिए उपयोग किया जाता है जो एक परिवर्तन मैट्रिक्स जनरेट करने के लिए कनेक्टेड हैं । स्केल पट्टियां = 1 µm (B, C) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

  1. mitochondrial झिल्ली प्रोटीन की एकल अणु इमेजिंग
    नोट: सभी प्रयोग कमरे के तापमान पर किए जाते हैं । टी-सेल या नॉन-अनुयाई कक्ष इमेजिंग31से पहले agarose में मैटीरियल होना चाहिए ।
    1. रबर और PTFE के छल्ले (3 ए आंकड़ा) के बीच coverslip पर अनुयाई कोशिकाओं के साथ नमूना माउंट । 0.5-0.8 मिलीलीटर इमेजिंग माध्यम के साथ चैंबर भरें ।
    2. दोहराएँ चरण -8 – 2.2.5.
    3. एक हिलो शीट३२ (हिलो मोड, चित्रा 1a) के माध्यम से ब्याज की विशिष्ट क्षेत्र को उत्तेजित करने के लिए तिर मोड के लिए महत्वपूर्ण कोण से छोटा है कि एक घटना कोण बनाने के लिए दीप्ति कोण TIRF माइक्रोस्कोप को नियंत्रित करने के सॉफ्टवेयर को समायोजित करें ।
      चेतावनी: लेजर बीम के साथ प्रत्यक्ष आंख से संपर्क से बचें!
    4. उंहें लाभ सेट करें और एक जोखिम समय प्रयोग है कि फ्रेम प्रति पर्याप्त फोटॉनों एकत्र के लिए उपयुक्त चुनें ।
    5. लेजर शक्ति सेट शोर करने के लिए एक उच्च संकेत प्राप्त करने के लिए (s/n) अनुपात (चित्र3बी), स्थानीयकरण परिशुद्धता के बाद से सीधे संगत S/
    6. गैर अतिव्यापी, लंबी mitochondria और एकल अणु संकेतों के साथ सेल परिधि में एक क्षेत्र का पता लगाएं (चित्रा 3 डी; अनुपूरक वीडियो 1) । यदि कोई एक अणु संकेत दिखाई दे तो एकल अणु संकेतों (फिगर 3E) की शक्ल में ब्लीचिंग परिणाम आने तक प्रतीक्षा करें.
    7. रिकॉर्ड संकेतों की संख्या तक उचित निरंतरता के लिए बहुत कम है (आमतौर पर 1000-10000 फ्रेम फ्लोरोसेंट डाई, चित्रा 3Fके ब्लीचिंग व्यवहार पर निर्भर करता है) ।
    8. इमेजिंग संसाधन सॉफ़्टवेयर प्रारंभ करें और कम से १,००० रिकॉर्ड किए गए फ़्रेम्स (चित्र 3g) का संचई रेंडर किया गया योग छवि जनरेट कर mitochondrial संरचनाओं के लिए जांचें ।
      नोट: सबसे तेजी से संभव फ्रेम दर readout क्षेत्र द्वारा तय की है । एक चैनल के लिए दृश्य के क्षेत्र में एक दोहरे रंग छवि अलगानेवाला (५१२ x ५१२ पिक्सल) से २५६ x ५१२ पिक्सल के लिए, और एक Quad-रंग के लिए २५६ x २५६ पिक्सल के लिए कम है । इस प्रकार, दो रंगों के लिए एक छवि अलगानेवाला का उपयोग करने के लिए, यह 30 हर्ट्ज है. सबसे कम संभव readout समय प्राप्त करने के लिए फ़्रेम स्थानांतरण मोड सेट करें ।
    9. सॉफ्टवेयर विश्लेषण प्लगइन शुरू करें और रॉ डेटा लोड । चैनल ओरिएंटेशन और लोड छवियों का चयन करें । कदम 2.3.9 से परिवर्तन मैट्रिक्स का प्रयोग करें जब "जांचना छवियां" के लिए कहा । चैनल अलग से प्रदर्शित किया जाएगा ।
    10. प्रत्येक चैनल के लिए इकाई रूपांतरण कारकों को परिभाषित करने से पहले के रूप में "इकाई प्रबंधक" खोलें । प्रत्येक चैनल के लिए "स्थानीयकरण प्रबंधक" खोलें. उसके बाद मूल्यांकन बॉक्स, संकुचन की संख्या छोरों को परिभाषित, उपयोग की गई शर्तों के लिए सैद्धांतिक पीएसएफ जोड़ें और सेट कंप्यूटर के कितने कोर गणना के लिए उपयोग किया जाता है । अंत में, स्थानीयकृत एकल कणों प्राप्त करने के लिए "स्थानीयकरण" दबाएँ (चित्रा 3H; अनुपूरक वीडियो 2) ।
    11. ध्यान दें कि कार्यक्रम अंततः एक संचई superresolution सभी स्थानीयकृत (चित्रा 3I) कणों दिखा छवि उत्पंन करेगा ।
    12. विश्लेषण करें, उदाहरणके लिए, ओपन सोर्स सॉफ़्टवेयर या हमारे सॉफ्टवेयर के अनुरोध पर उपलब्ध है ।
    13. दोनों स्थानीयकृत चैनल में एकल अणुओं को ट्रैक, उदाहरणके लिए, एकाधिक-लक्ष्य अनुरेखक10 के साथ
      नोट: कदम 2.4.13 ब्याज की प्रोटीन की diffusibility के बारे में प्रारंभिक (प्रयोगात्मक) ज्ञान की जरूरत है सीमा की स्थिति सही ढंग से सेट । आमतौर पर, सही सीमा की स्थिति ढूंढना एक चलने प्रक्रिया है ।

Figure 3
चित्रा 3 : एकल अणु स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी के दौरान कदम । (क) नमूना के साथ एक coverslip घर का नमूना धारक के ऊपर और नीचे भाग (ग्रे) के बीच बढ़ रहा है (जे Bereiter द्वारा डिजाइन-हैन). एक रबर की अंगूठी (लाल) और एक PTFE अंगूठी (सफेद) ऊपर और coverslip, जब नमूना धारक भागों एक साथ बोल्ट है नीचे से प्रणाली सील । (ख) टीएमआर संकेत के शोर अनुपात के लिए संकेत । (C) सभी स्थानीयकृत कणों के लिए परिकलित स्थानीयकरण सटीक हिस्टोग्राम. (घ) इमेजिंग के लिए एक उचित क्षेत्र का विकल्प, यहां, स्पष्ट रूप से अलग mitochondria के साथ सेल परिधि । (ङ) रिकॉर्डिंग और छवि प्रसंस्करण: अलग एकल अणु संकेतों के साथ एक एकल फ्रेम (यहां, CV के एक अणुओं-HaloTag/टीएमआरHTL दर्ज किए गए) दिखाया गया है । (च) रिकॉर्डिंग समय पर टीएमआर की तीव्रता । (G) ३,००० फ़्रेम्स की संचई योग छवि, अनप्रोसेस्ड । (ज) CV के कण-HaloTag/टीएमआरHTL एक एकल फ्रेम से एक 2d गाऊसी समारोह के साथ स्थानीयकृत । (I) संचयी, प्रदान की गई राशि सभी स्थानीयकृत CV-HaloTag/टीएमआरHTL कणों ३,००० फ्रेम से दिखा छवि । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Representative Results

बहु रंग इमेजिंग और colocalization विश्लेषण प्रोटीन के उप organellar स्थानीयकरण का निर्धारण करने में मदद कर सकते हैं । हम cytosolic फॉस्फेट और tensin homologue, PINK1, कि विभिंन उप mitochondrial mitochondrial द्वारा अपने प्रसंस्करण के कारण स्थानों है के साथ इस पहले प्रदर्शन किया17। PINK1 एक महत्वपूर्ण mitochondrial कार्यशीलता३४,३५गारंटी कारक है । अपने प्रसंस्करण (चित्रा 4a) के पाठ्यक्रम में विभिन्न mitochondrial डिब्बों में PINK1 के स्थानीयकरण का निर्धारण करने के लिए, लाइव कोशिकाओं के साथ बहु रंग सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी किया गया था । इसलिए, PINK1 आनुवंशिक रूप से एक स्व-लेबलिंग टैग (HaloTag) से जुड़े हुए थे । कार्यात्मक और बेकार mitochondria में अंय प्रोटीन के सापेक्ष अपने स्थानीयकरण का निर्धारण करने के लिए, Tom20, बाहरी mitochondrial झिल्ली (टॉम)३६के translocase के भाग के रूप में, एक और आत्म लेबलिंग टैग (स्नैप-टैग) के साथ टैग किया गया था । न्यूनतम १,००० फ़्रेम (९६ फ़्रेम प्रति s) के साथ समय श्रृंखला रिकॉर्ड की गई । एक चैनल से समय पर सभी संकेतों की संचयी छवि से पता चला कि PINK1 cytosol में और सामान्य परिस्थितियों के तहत mitochondria (चित्रा 4B, बाएँ पैनल) में स्थानीयकृत किया गया था, जबकि यह विध्रुवीकरण mitochondria की बाहरी झिल्ली पर बनाए रखा गया था ( 10 µ के साथ उपचार carbonyl साइनाइड एम-chlorophenyl hydrazine, CCCP, 20 मिनट के लिए) । इसी पथ नक्शे भी spatio-लौकिक संगठन में इस अंतर को दिखाते हैं । स्थानीयकृत कणों की अभिव्यक्त छवियों के रूप में प्रकट होता है, PINK1 मुख्य रूप से अंदर ध्रुवीकरण mitochondria (आंकड़ा 4c, बाएँ ऊपरी पैनल) वितरित किया जाता है, जबकि Tom20 बाहरी mitochondrial झिल्ली (ओम) (चित्र 4c, बाएँ निचले पैनल) में स्थानीयकृत है. यह स्थानीयकृत Tom20 और PINK1 कणों की मर्ज की गई छवि में और भी अधिक स्पष्ट हो जाता है, जहां बाहरी झिल्ली के प्रोटीन Tom20 का वितरण बहुत व्यापक है (आंकड़ा 4c, दायां फलक) ।

Figure 4
चित्र 4 : दोहरी रंग सुपर संकल्प mitochondria में PINK1 के उपकंपार्टमेंट स्थानीयकरण दिखा माइक्रोस्कोपी । (क) mitochondria में परिकल्पना PINK1 गढ़शंकर और प्रोसेसिंग । (ख) स्थानीयकरण और सामान्य स्थितियों के अंतर्गत PINK1 का पथ मानचित्र और ध्रुवीकरण mitochondria में. (ग) Tom20 के संबंध में PINK1 के mitochondrial स्थानीयकरण प्रकट करने के लिए दोहरे रंग सुपर संकल्प स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी. १,००० फ्रेम की छवि श्रृंखला एस प्रति ९६ फ्रेम की एक फ्रेम दर के साथ दर्ज की गई ऊपरी पैनल: PINK1 के स्थानीयकरण नक्शा (टीएमआरHTLके साथ HaloTag के माध्यम से लेबल) । बाएं निचले पैनल: Tom20 के स्थानीयकरण नक्शा (स्नैप के माध्यम से लेबल-सरबीजीके साथ टैग) । दायां फलक: PINK1-टीएमआर (लाल) और Tom20-सर (नीला) स्थानीयकरण की संचई योग छवि मर्ज करें । (घ) भीतरी mitochondrial झिल्ली में श्वसन परिसर मैं (CI, हरे) के एक ही डेटा प्लस स्थानीयकरण । ci paGFP से जुड़े हुए थे (ci-paGFP) । सही: Tom20 के पार अनुभाग प्रोफ़ाइल का मतलब (नीला), PINK1 (लाल), और CI (हरी) विलय छवि के चिह्नित क्षेत्र में प्रतिदीप्ति । मतलब पार अनुभाग प्रोफाइल अप करने के लिए औसत द्वारा प्राप्त किए गए थे 30 समानांतर उंमुख पार लाइनों (अंतराल ४० एनएम) । अनुकूलित संस्करण Beinlich एट अल से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित । 16, कॉपीराइट (२०१५) ACS रासायनिक जीव विज्ञान । सभी रंग झूठे रंग हैं । स्केल पट्टियां = 1 µm. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

mitochondria अंदर PINK1 के स्थानीयकरण सत्यापित करने के लिए, एक तिहाई भीतरी mitochondrial झिल्ली में स्थानीयकृत प्रोटीन भी imaged था । इसलिए, 30 केडीए उपइकाई श्वसन परिसर मैं (CI) photoactivable GFP (paGFP) से जुड़े हुए थे और4FPALM द्वारा दर्ज की गई । संचई ट्रिपल रंग छवि और क्रॉस-खंड वितरण CI (हरा) और PINK1 (लाल) (चित्रा 4d) के ओवरले दिखाने के लिए, पूर्ण लंबाई PINK1 के आयात की पुष्टि । PINK1 एक एन टर्मिनल mitochondrial लक्ष्यीकरण अनुक्रम है और इस तरह लेबल सी पर रखा गया था कळेनासे के टर्मिनस । CI के साथ सह-स्थानीयकरण प्रदर्शित करता है कि पूर्ण लंबाई PINK1 आयात किया गया था । एक पार अनुभाग के साथ प्रतिदीप्ति वितरण से पता चलता है कि PINK1 कणों का एक कोटा जाहिरा तौर पर भी बाहरी mitochondrial झिल्ली में Tom20 के साथ colocalized । शायद, इस PINK1 Tom20, जो आयात रिसेप्टर है के साथ जुड़ा हुआ है । जैसा कि इन आंकड़ों का प्रदर्शन, कई mitochondrial माइक्रो डिब्बों PINK1 की उपआबादी के कब्जे में हैं । जैव रासायनिक तरीकों से उप mitochondrial स्थानीयकरण के इस सवाल का पता करने के लिए और अधिक कठिन होगा, क्योंकि यह अलग झिल्ली के कड़े उप-भिन्नीकरण और घुलनशील घटकों का एक स्पष्ट जुदाई बाहर करने के लिए की आवश्यकता होगी पार संदूषण ।

अनुपूरक वीडियो 1: एकल अणु रिकॉर्डिंग के फुटेज, १०० फ्रेंस, CV-HaloTag/टीएमआर HTL। कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए ।

अनुपूरक वीडियो 2: स्थानीयकृत डेटा । कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए ।

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Discussion

यहां, मोबाइल झिल्ली प्रोटीन के दोहरे रंग एकल अणु स्थानीयकरण के लिए एक तकनीक प्रस्तुत किया गया था । प्रोटोकॉल के बाद, झिल्ली प्रोटीन rhodamine रंजक टीएमआर और उनके संबंधित सब्सट्रेट करने के लिए सर संयुग्मित के साथ प्रतिक्रिया है कि स्वयं लेबल प्रोटीन के लिए जुड़े हुए हैं. Rhodamine रंजक चमकीले और photostable होते हैं और इस प्रकार दोहराव इमेजिंग1के लिए अनुमति देते हैं । सफल प्रदर्शन के लिए कई शर्तें और अहम विषयों को ध्यान में रखना होगा ।

सबसे पहले, यह उचित फिल्टर और टीएमआर और सर से स्पष्ट रूप से संकेतों को अलग करने के लिए विभाजन का चयन करने के लिए महत्वपूर्ण है । कक्ष के बाहर से पृष्ठभूमि को कम करने के लिए, पीएलएल-खूंटी-RGD के साथ coverslip की एक सफाई और कोटिंग मददगार था । डाई-सब्सट्रेट के अंतिम एकाग्रता अपने सब्सट्रेट और सेल के अंदर एंजाइम की पहुँच के लिए स्वयं लेबलिंग एंजाइम के संबध पर विचार करके परीक्षण किया जाना चाहिए. नैनो-picomolar सांद्रता mitochondrial प्रोटीन17 और तनाव granules13के लिए पर्याप्त थे । अन्य organelles के लिए, आवश्यक सांद्रता परीक्षण करने की आवश्यकता है । यदि दाग रिकॉर्डिंग की शुरुआत में भी मजबूत है और कोई एक अणु भेद कर रहे हैं, यह सबसे अच्छा है जब तक ब्लीचिंग फ्लोरोसेंट रंजक की मात्रा कम हो गया है, ताकि एक कण (सपा) समझदार किया जा सकता है इंतज़ार करना । हमने पाया है कि रंग की सांद्रता अधिक से अधिक 30 समुद्री मील की तुलना में BG-सब्सट्रेट और 1 एनएम के लिए HTL सब्सट्रेट्स के दौरान धुंधला प्रक्रिया, या अब धुंधला बार आदेश में लेबल अणुओं की संख्या बढ़ाने के लिए, संभव नहीं हैं । प्रत्येक प्रयोग के लिए, उत्तेजना लेजर की तीव्रता अनुकूलित किया जा करने के लिए है, डाई के सेलुलर स्थान के बाद से अपने प्रतिदीप्ति व्यवहार को प्रभावित करता है (क्वांटम उपज, ब्लीचिंग, निमिष)5 ऐसे पीएच के रूप में विभिंन पर्यावरणीय स्थितियों के कारण और redox स्थिति3. यह आगे कि पृष्ठभूमि दोहरे रंग प्रयोगों में उच्च है जब एकल रंग इमेजिंग की तुलना में उल्लेख किया जाना चाहिए । यह स्थानीयकरण की शुद्धता को प्रभावित करता है । इसलिए, यह शोर करने के लिए अच्छा संकेत प्राप्त करने के लिए लेजर शक्ति का अनुकूलन करने के लिए महत्वपूर्ण है (S/N) अनुपात लेकिन कम photobleaching दरों. ठेठ लेजर शक्ति घनत्व हिलो माइक्रोस्कोपी में 25 ± 8 किलोवाट की सीमा में है/ उत्तेजना शक्ति की ठीक ट्यूनिंग के लिए, तटस्थ घनत्व फिल्टर के विभिन्न सेट अगर लेजर डायोड सीधे संग्राहक नहीं कर रहे हैं और एक acousto-ऑप्टिकल मॉडुलन के माध्यम से संग्राहक नहीं हैं इस्तेमाल किया जा सकता है । यह बीम विकृतियों को कम करने के लिए TIRF के लिए विशेष 2 मिमी मोटी दर्पण का उपयोग करने की सिफारिश की है । विशेष रूप से तिर और हिलो स्थितियों के तहत, उत्तेजना प्रकाश के बहुत कुशल अवरुद्ध की जरूरत है । उप पिक्सेल सटीकता के साथ एकल अणु इमेजिंग और स्थानीयकरण के लिए, एक उचित स्थानिक नमूना आवृत्ति (Nyquist-शैनन नमूना प्रमेय) की आवश्यकता है । यह इमेजिंग सिस्टम३७की रिज़ॉल्यूशन सीमा द्वारा निर्धारित अधिकतम स्थानिक आवृत्ति के रूप में उच्च के रूप में दो बार होना चाहिए । एक उच्च संख्यात्मक एपर्चर के साथ एक तेल विसर्जन उद्देश्य का प्रयोग (na > 1.4), संकल्प, डी = λ/(2 × ना), आमतौर पर नारंगी के लिए 200-250 एनएम में है दूर लाल रंगों के लिए । इस प्रकार, डिटेक्टर के शारीरिक पिक्सेल आकार पर विचार, इमेजिंग प्रकाशिकी का इज़ाफ़ा लगभग १०० एनएम के एक छवि पिक्सेल आकार में परिणाम चाहिए । एक 150X उद्देश्य के साथ संयोजन में 16 x 16 µm2 के एक पिक्सेल आकार के साथ एक EMCCD कैमरा के लिए, पिक्सेल आकार १०६.७ एनएम और इस तरह पर्याप्त है ।

आम तौर पर, यह स्थिर transfected कोशिकाओं का उपयोग करने का सुझाव दिया है क्योंकि यह लाभ है कि टैग प्रोटीन की एक स्थिर राशि24कोशिकाओं के अधिकांश में व्यक्त की है । हालांकि, दोहरे रंग स्थानीयकरण और ट्रैकिंग प्रयोगों के लिए, यह एक डबल अभिकर्मक और अलग एंटीबायोटिक दवाओं के साथ डबल चयन की आवश्यकता होगी । इसलिए, यह अक्सर एक दूसरे के साथ पहले से ही स्थिर सेल लाइन transfect करने के लिए अधिक संभव है ब्याज की अतिरिक्त टैग प्रोटीन एंकोडिंग प्लाज्मिड ।

mitochondria के लिए, आंदोलन और विखंडन एक महत्वपूर्ण मुद्दा है । खंडित या चलायमान organelles को रिकॉर्ड या विश्लेषित नहीं किया जाना चाहिए । आंदोलन की शुरुआत और प्रयोग के अंत से स्थानीयकृत अणुओं की गाया छवियों ओवरले द्वारा जांच की जा सकती है, दो अलग (झूठी) रंग के साथ । ओवरले में organelles से संकेतों का एक सजातीय वितरण इंगित करता है कि organelles नहीं ले जाया गया है । आम तौर पर, कमरे के तापमान सेलुलर यौगिकों और संरचनाओं की आवाजाही कम कर देता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक के लिए सतत समर्थन, तकनीकी सहायता और सामग्री की तैयारी के लिए Wladislaw कोल के लिए Osnabrück विश्वविद्यालय में, और उपयोग के लिए सूक्ष्मदर्शी प्रदान करने के लिए CellNanOs बोर्ड के लिए भौतिकी समूह और याकूब Piehler शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । परियोजना SFB ९४४ द्वारा वित्त पोषित किया गया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(2-(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethanesulfonic acid, 1 M) (HEPES) Biochrom #1104E
DC1: Dichroid beam splitter  Chroma 640 dcxr NC506031
DC2: Polychroic Mirror, beamsplitter Chroma zt405/488/561/640rpc discontinued
Dulbecco´s Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1x (w/o Ca & Mg) Sigma-Aldrich & Co. #RNBF8311
Earle´s MEM without phenol red, without L-Glutamine and without NaHCO3 containing 1% FBS, 0.1% HEPES, 0.1% NEAA, 0.1% Alanyl-L-Glutamine and 34.78% sodium hydrogen carbonate (NaHCO3 0.75g/l) Imaging medium
Earle´s minimum essential medium (MEM) with phenol red, containing 1% Fetal Bovine Serum Superior (FBS), 0.1% HEPES (2-(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethanesulfonic acid, 1 M), and 0.1% non-essential amino acids (NEAA) Growth medium
EF: Emission filter quadbandpass AHF analysentechnik F72-866 Brightline HC 446 nm/523 nm/600 nm/677 nm
EMCCD camera Andor Andor iXON 897 EMCCD camera
Emission filter QuadView filter cubes, orange AHF analysentechnik F39-637 bandpass 582 - 619 nm
Emission filter QuadView filter cubes, red Chroma bandpass 655 - 725 nm (HQ 690/70)
FBS (Fetal bovine serum) superior Biochrom S0615
Fluorescent beads: TetraSpeck™ Microspheres, 0.1 µm, fluorescent blue/green/orange/dark red Thermo Fisher Scientific T7279 fluorescent microspheres
Glutamine Biochrom #0951C
HeLa cells  DSMZ ACC-57 Cervical carcinoma cells from patient Henrietta Lacks
Hela cells CI::paGFP, stable Muster et al., PLOSOne 2010
Hela cells CV g::Halo7-Tag, stable Appelhans et al., NanoLett 2012
Hela cells Tom20::Halo7-Tag, stable Appelhans et al., NanoLett 2012
Image splitter Photometrics Dual-View QV2 image splitter emission
Imaging processing software  ImageJ2 / Fiji freeware
Immersion Oil - ImmersolTM 518 F (ne = 1.518, ve = 45) Carl Zeiss Jena GmbH 444960-0000-000
Inverted epifluorescence microscope Olympus IX-71/73/83
Laser 561 nm, 200 mW CrystaLaser CL-561-200 561 nm emission
Laser 642 nm, 140 mW Omicron Luxx-642-140 642 nm emission
MATLAB MathWorks version R2013a
MEM with Earle's Balanced Salt Solution 2.2 g/L NaHCO3, stable glutamine w/o PR Biochrom FG-0385
MEM with Earle's Balanced Salt Solution with 2.2 g/L NaHCO3, stable glutamine, Phenolred Biochrom FG-0325
MitoTracker® Deep Red FM Thermo Fisher Scientific M22426 dye
MitoTracker® Green FM Thermo Fisher Scientific M7514 dye
Multi-mode-optical polarization maintaining monomode fiber Pointsource/Qioptiq KineFLEX
NHS-PEG-MAL, Rapp Polymer  Rapp Polymere GmbH Tübingen coverslip coating
non-essential amino acids (NEAA) Biochrom #0802E
PEG 800 (Polyethylene glycol) 10 % Carl Roth GmbH Art No. 0263.1 coverslip coating
Penicillin/Streptomycin Biochrom #0122E
Plasmid for PINK1-Halo7-Tag expression Beinlich et al., ACS Chemical Biology 2015
Poly-L-lysine (1.2 mg/ml) Sigma-Aldrich & Co. Cat. No.P9155 coverslip coating
RGD Peptide (Ac-CGRGDS-COOH) Coring System Diagnostix GmbH, Gernsheim coverslip coating / Intergrin receptor motif
Silicon Rhodamine linked to HaloTag®-Ligand (SiRHTL)  personal gift from Kai Johnson dye
Software analysis plugin self-written C. P. Richter, Biophysik Osnabrück SLIMFAST 16g
Tetramethylrhodamine / SNAP-Cell® TMR-Star linked to SNAP-Ligand (TMRstar)  New England Biolab® S9105S dye
Tetramethylrhodamine linked to HaloTag®-Ligand (TMRHTL)  Promega G8251 dye
TIRF condensor Olympus Cell^TIRF MITICO System TIRF condensor
TIRF microscope controlling software Olympus cellSens 1.12
TIRF objective Olympus 150x oil objective (N.A. 1.45; Olympus UAPO)
Trypsin/EDTA 10x Biochrom #0266
Water H2O 99,5 % Rotipuran® Low organic  Carl Roth GmbH Art. No. HN57.1

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References

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जीव विज्ञान अंक १३६ एकल अणु ट्रैकिंग दोहरे रंग सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी एकल अणु स्थानीयकरण rhodamine रंजक mitochondria झिल्ली प्रोटीन की गतिशीलता लाइव सेल इमेजिंग
बहु रंग स्थानीयकरण एकल झिल्ली प्रोटीन की Organelles लाइव स्तनधारी कोशिकाओं में माइक्रोस्कोपी
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Appelhans, T., Beinlich, F. R. M., Richter, C. P., Kurre, R., Busch, K. B. Multi-color Localization Microscopy of Single Membrane Proteins in Organelles of Live Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (136), e57690, doi:10.3791/57690 (2018).

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