Summary

مجهرية التعريب متعدد الألوان البروتينات الغشاء واحدة في العضيات الحية خلايا الثدييات

Published: June 30, 2018
doi:

Summary

نقدم هنا، بروتوكولا للترجمة متعدد الألوان من البروتينات الغشاء واحدة في العضيات خلايا الحية. لإرفاق فلوروفوريس، تستخدم البروتينات الذاتية التوسيم. البروتينات، يقع في المقصورات الأغشية المختلفة من عضية نفسه، يمكن أن تكون مترجمة بدقة ~ 18 شمال البحر الأبيض المتوسط.

Abstract

المعرفة بشأن إضفاء الطابع المحلي على البروتينات في سوبكومبارتمينتس الخلوية أمر حاسم لفهم وظيفتها المحددة. نقدم هنا، تقنية فائقة قرار الذي يسمح لتحديد ميكروكومبارتمينتس التي يمكن الوصول إليها للبروتينات بتوليد التعريب وتتبع الخرائط لهذه البروتينات. وعلاوة على ذلك، بالفحص المجهري التعريب متعدد الألوان، التعريب وتتبع ملامح بروتينات في سوبكومبارتمينتس مختلفة يتم الحصول عليها في وقت واحد. التقنية محددة للخلايا الحية ويقوم على تصوير متكررة من البروتينات الغشاء متنقلة واحدة. تنصهر فيها البروتينات التي تهم وراثيا مع علامات التوسيم ذاتية محددة، ما يسمى. هذه العلامات هي الإنزيمات التي تتفاعل مع الركازة بطريقة تساهمي. يضاف إلى هذه ركائز صبغات الفلورسنت. رد فعل البروتينات معلم الإنزيم مع الأسفار المسماة النتائج ركائز في البروتينات المسماة. هنا، تيتراميثيلرهوداميني (ترانسنيستريا) و “السليكون والرودامين” (السير) تستخدم الأصباغ الفلورية يعلق على ركائز للإنزيمات. باستخدام تركيزات الركيزة في الساعة إلى نطاق شمال البحر الأبيض المتوسط، ووسم المقايسة الفرعية يتحقق التي ينتج عنها إشارات مميزة. وقد تمت ترجمة هذه الإشارات مع ~ 15 – 27 دقيقة شمال البحر الأبيض المتوسط. التقنية تسمح للتصوير متعدد الألوان من جزيئات مفردة، حيث يقتصر عدد الألوان الأصباغ نفاذية الأغشية المتاحة ومرجع ذاتي وسم الإنزيمات. نحن إظهار جدوى هذه التقنية بتحديد التعريب إنزيم مراقبة الجودة (فتن)-التي يسببها كيناز 1 (PINK1) في الأقسام المختلفة المتقدرية أثناء معالجة به فيما يتعلق بغيرها من البروتينات الغشاء. اختبار التفاعلات الفيزيائية الحقيقية بين البروتينات واحد مسمى بشكل مختلف من جزيء واحد الحنق أو تتبع المشارك مقيد، رغم ذلك، نظراً لانخفاض درجات التوسيم إنقاص احتمال لوجود اثنين من البروتينات المجاورة المسمى في الوقت نفسه. بينما التقنية قوية للتصوير البروتينات في الغشاء المقصورات، في معظم الحالات من غير المناسب تحديد إضفاء الطابع المحلي على البروتينات القابلة للذوبان كثيري التنقل.

Introduction

والهدف من هذا البروتوكول توفير طريقة تصوير لتوطين وتعقب غشاء واحد البروتينات داخل الخلايا الحية. ونحن ندعو هذا الأسلوب تتبع والتعريب مجهرية (تألم)1،2. مثل العشوائية بصري التعمير مجهرية (العاصفة)3 و4،Fluorescence فوتواكتيفيشن التعريب مجهرية ((و) النخيل)5، تألم وأسلوب تعريب fluorescence المستندة إلى جزيء واحد. ومع ذلك، أنها متميزة في الطريق أن تنقل بروتينات الغشاء في تركيبة مع التصوير المتكرر لنفس المسمى جزيء في المواقف المختلفة يكشف عن ميكروكومبارتمينت التي يمكن الوصول إليها للبروتين المتنقلة. وبعبارة أخرى، يتم تعيين تعريب ممكن من البروتين بنية عضية، والتنقل من البروتين1. الأسلوب مكمل لشتى أخرى القرار فائقة تقنيات6،7،8 نظراً لأنها تكشف عن التعريب ومسار الخرائط بالبروتينات النقالة التصوير. العلامات يستند إلى استخدام البروتينات الانصهار المهندسة وراثيا التي في حد ذاتها غير الفلورية. يتم وسم هذه البروتينات الانصهار الذاتي الإنزيمات التي تتفاعل تساهمي مع الركازة مترافق بصبغة. ويمتاز هذا الإجراء يمكن أن درجة وصفها يسيطر عليها كمية الركازة المضافة. وعلاوة على ذلك، يتيح تختلف لون الأسفار، اعتماداً على صبغ مترافق المختار. إنزيم التوسيم الذاتي عدة-العلامات هي المتوفرة9. ميزة أخرى لاستخدام الذاتي وسم العلامات الإنزيم، أن الأصباغ مترافق عادة ما تكون أكثر استقرارا وأكثر إشراقا من البروتينات الفلورية1 والبروتينات الفردية ولذلك يمكن تسجيل أطول وأكثر تحديداً حتى أنها المبيضة. وهذا يسمح لتسجيل مسارات للبروتينات المتنقلة واستخراج نشر معاملات10،11.

هنا، نحن إثبات جدوى تألم مع بروتينات الغشاء الميتوكوندريا، ولكن يمكن أيضا تطبيقها للبروتينات الغشاء داخل وخارج الخلايا الأخرى، بما في ذلك أنواع مختلفة من الخلية12،13. نظهر أن تألم متعدد الألوان كما يسمح للتفريق المتزامن للبروتينات في سوبكومبارتمينتس مختلفة في التكامل القائمة القرار فائقة fluorescence المجهري تقنيات14،15، 16. تألم متوافق مع الخلايا الحية التصوير17. الصور–الفيزياء من رهودامينيس الذي تم اختياره تيتراميثيلرهوداميني (ترانسنيستريا) والسليكون-رهودامين (السير)، لا سيما السطوع، والاستقرار، ويسمح للبروتينات الغشاء واحد سجل على إطارات متعددة توفير خرائط التعريب (ومساره). ومع ذلك، تألم يقتصر لإضفاء الطابع المحلي على البروتينات القابلة للذوبان مع معاملات نشر عالية منذ الضبابية مرتفع جداً والفوتونات التي جمعت كل إطار منخفضة جداً للتعريب السليم. وعلاوة على ذلك، يتطلب تألم طاقة الإثارة أقل على سبيل المثال العاصفة أو نضوب الانبعاثات وحفز (STED) مجهرية6،7، تقليل آثار سمي ضيائي. هذا أمر مهم، إذ غالباً ما يؤثر الإجهاد سمي ضيائي مورفولوجيا أورجانيلار18 ومن ثم تنقل التحليل19. وباختصار، نحن نقدم تألم متعدد الألوان في الخلايا الحية كأسلوب ليملأ فجوة بين أساليب الفحص المجهري التعريب العاصفة/STED/النخيل (F) وتقنيات تحليل التنقل البروتين مثل الأسفار الانتعاش بعد فوتوبليتشينج (اربط)20 ،21والأسفار ارتباط مطيافية (FCS)22، والأسفار عبر ارتباط التحليل الطيفي (فككس)11،23.

Protocol

البروتوكول التالي يتبع المبادئ التوجيهية للجنة أخلاقيات البحوث مؤسسة محلية. 1-الأساليب خلية ثقافة زراعة الخلايا، على سبيل المثال هيلا الخلايا (سرطان عنق الرحم البشرية)، في T25 قارورة ثقافة خلية التي تحتوي على 5 مل متوسط النمو في 37 درجة مئوية و 5% CO2….

Representative Results

يمكن أن يساعد تحليل التصوير وكولوكاليزيشن متعدد الألوان تحديد الترجمة sub-أورجانيلار للبروتينات. أظهرنا ذلك في وقت سابق مع الفوسفاتيز سيتوسوليك وتنزين المناظرة، PINK1، يحتوي على مواقع فرعية المتقدرية مختلفة نظراً للتجهيز البروتياز المتقدرية17. PINK1 عاملاً هاما…

Discussion

هنا، قدم تقنية للتعريب جزيء واحد لون مزدوج من البروتينات الغشاء المتنقلة. بعد البروتوكول، وبروتينات الغشاء تنصهر فيها لذاتي وسم البروتينات التي تتفاعل مع الأصبغة والرودامين جمهورية ترانسنيستريا المولدوفية وسيدي مترافق لركائز كل منها على. والرودامين الأصباغ هي مشرق وفوتوستابل، وتسمح ب?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

المؤلف يود أن يشكر مجموعة الفيزياء الحيوية وبلير جاكوب في جامعة أوسنابروك للدعم المستمر وولاديسلاو كول للمساعدة التقنية، وإعداد المواد ومجلس سيلنانوس لتقديم مجاهر للاستخدام. وقد مولت المشروع SFB 944.

Materials

(2-(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethanesulfonic acid, 1 M) (HEPES) Biochrom #1104E
DC1: Dichroid beam splitter  Chroma 640 dcxr NC506031
DC2: Polychroic Mirror, beamsplitter Chroma zt405/488/561/640rpc discontinued
Dulbecco´s Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1x (w/o Ca & Mg) Sigma-Aldrich & Co. #RNBF8311
Earle´s MEM without phenol red, without L-Glutamine and without NaHCO3 containing 1% FBS, 0.1% HEPES, 0.1% NEAA, 0.1% Alanyl-L-Glutamine and 34.78% sodium hydrogen carbonate (NaHCO3 0.75g/l) Imaging medium
Earle´s minimum essential medium (MEM) with phenol red, containing 1% Fetal Bovine Serum Superior (FBS), 0.1% HEPES (2-(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethanesulfonic acid, 1 M), and 0.1% non-essential amino acids (NEAA) Growth medium
EF: Emission filter quadbandpass AHF analysentechnik F72-866 Brightline HC 446 nm/523 nm/600 nm/677 nm
EMCCD camera Andor Andor iXON 897 EMCCD camera
Emission filter QuadView filter cubes, orange AHF analysentechnik F39-637 bandpass 582 – 619 nm
Emission filter QuadView filter cubes, red Chroma bandpass 655 – 725 nm (HQ 690/70)
FBS (Fetal bovine serum) superior Biochrom S0615
Fluorescent beads: TetraSpeck™ Microspheres, 0.1 µm, fluorescent blue/green/orange/dark red Thermo Fisher Scientific T7279 fluorescent microspheres
Glutamine Biochrom #0951C
HeLa cells  DSMZ ACC-57 Cervical carcinoma cells from patient Henrietta Lacks
Hela cells CI::paGFP, stable Muster et al., PLOSOne 2010
Hela cells CV g::Halo7-Tag, stable Appelhans et al., NanoLett 2012
Hela cells Tom20::Halo7-Tag, stable Appelhans et al., NanoLett 2012
Image splitter Photometrics Dual-View QV2 image splitter emission
Imaging processing software  ImageJ2 / Fiji freeware
Immersion Oil – ImmersolTM 518 F (ne = 1.518, ve = 45) Carl Zeiss Jena GmbH 444960-0000-000
Inverted epifluorescence microscope Olympus IX-71/73/83
Laser 561 nm, 200 mW CrystaLaser CL-561-200 561 nm emission
Laser 642 nm, 140 mW Omicron Luxx-642-140 642 nm emission
MATLAB MathWorks version R2013a
MEM with Earle's Balanced Salt Solution 2.2 g/L NaHCO3, stable glutamine w/o PR Biochrom FG-0385
MEM with Earle's Balanced Salt Solution with 2.2 g/L NaHCO3, stable glutamine, Phenolred Biochrom FG-0325
MitoTracker® Deep Red FM Thermo Fisher Scientific M22426 dye
MitoTracker® Green FM Thermo Fisher Scientific M7514 dye
Multi-mode-optical polarization maintaining monomode fiber Pointsource/Qioptiq KineFLEX
NHS-PEG-MAL, Rapp Polymer  Rapp Polymere GmbH Tübingen coverslip coating
non-essential amino acids (NEAA) Biochrom #0802E
PEG 800 (Polyethylene glycol) 10 % Carl Roth GmbH Art No. 0263.1 coverslip coating
Penicillin/Streptomycin Biochrom #0122E
Plasmid for PINK1-Halo7-Tag expression Beinlich et al., ACS Chemical Biology 2015
Poly-L-lysine (1.2 mg/ml) Sigma-Aldrich & Co. Cat. No.P9155 coverslip coating
RGD Peptide (Ac-CGRGDS-COOH) Coring System Diagnostix GmbH, Gernsheim coverslip coating / Intergrin receptor motif
Silicon Rhodamine linked to HaloTag®-Ligand (SiRHTL)  personal gift from Kai Johnson dye
Software analysis plugin self-written C. P. Richter, Biophysik Osnabrück SLIMFAST 16g
Tetramethylrhodamine / SNAP-Cell® TMR-Star linked to SNAP-Ligand (TMRstar)  New England Biolab® S9105S dye
Tetramethylrhodamine linked to HaloTag®-Ligand (TMRHTL)  Promega G8251 dye
TIRF condensor Olympus Cell^TIRF MITICO System TIRF condensor
TIRF microscope controlling software Olympus cellSens 1.12
TIRF objective Olympus 150x oil objective (N.A. 1.45; Olympus UAPO)
Trypsin/EDTA 10x Biochrom #0266
Water H2O 99,5 % Rotipuran® Low organic  Carl Roth GmbH Art. No. HN57.1

References

  1. Appelhans, T., Richter, C., Wilkens, V., Hess, S., Piehler, J., Busch, K. Nanoscale organization of mitochondrial microcompartments revealed by combining tracking and localization microscopy. Nano Letters. 12 (2), 610-616 (2012).
  2. Appelhans, T., Busch, K. Single Molecule Tracking and Localization of Mitochondrial Protein Complexes in Live Cells. Methods Mol Biol. 1567, 273-291 (2017).
  3. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
  4. Gould, T. J., Verkhusha, V. V., Hess, S. T. Imaging biological structures with fluorescence photoactivation localization microscopy. Nat Protoc. 4 (3), 291-308 (2009).
  5. Pennacchietti, F., Gould, T. J., Hess, S. T. The Role of Probe Photophysics in Localization-Based Superresolution Microscopy. Biophys J. 113 (9), 2037-2054 (2017).
  6. Wegel, E., Göhler, A., Lagerholm, B. C., Wainman, A. Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison. Scientific reports. , (2016).
  7. Pellett, P., et al. Two-color STED microscopy in living cells. Biomedical Optics Express. 2 (8), (2011).
  8. Ishigaki, M., et al. STED super-resolution imaging of mitochondria labeled with TMRM in living cells. Mitochondrion. 28, 79 (2016).
  9. Liss, V., Barlag, B., Nietschke, M., Hensel, M. Self-labelling enzymes as universal tags for fluorescence microscopy, super-resolution microscopy and electron microscopy. Scientific Reports. 5, 17740 (2015).
  10. Sergé, A., Bertaux, N., Rigneault, H., Marguet, D. Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotemporal cartography of cell membranes. Nat Methods. 5 (8), (2008).
  11. Appelhans, T., Busch, K. B. Dynamic imaging of mitochondrial membrane proteins in specific sub-organelle membrane locations. Biophysical reviews. 9 (4), 345-352 (2017).
  12. Wilmes, S., et al. Triple-color super-resolution imaging of live cells: resolving submicroscopic receptor organization in the plasma membrane. Angewandte Chemie. 51 (20), 4868-4871 (2012).
  13. Niewidok, B., et al. Single-molecule imaging reveals dynamic biphasic partition of RNA-binding proteins in stress granules. J Cell Biol. , (2018).
  14. Wurm, C. A., Jakobs, S. Differential protein distributions define two sub-compartments of the mitochondrial inner membrane in yeast. FEBS Lett. 580 (24), 5628-5634 (2006).
  15. Schmidt, R., Wurm, C. A., Punge, A., Egner, A., Jakobs, S., Hell, S. W. Mitochondrial cristae revealed with focused light. Nano Lett. 9 (6), 2508-2510 (2009).
  16. Kukat, C., Wurm, C. A., Spahr, H., Falkenberg, M., Larsson, N. G., Jakobs, S. Super-resolution microscopy reveals that mammalian mitochondrial nucleoids have a uniform size and frequently contain a single copy of mtDNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (33), 13534-13539 (2011).
  17. Beinlich, F., Drees, C., Piehler, J., Busch, K. Shuttling of PINK1 between Mitochondrial Microcompartments Resolved by Triple-Color Superresolution Microscopy. ACS chemical biology. 10 (9), 1970-1976 (2015).
  18. Shim, S., et al. Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (35), 13978-13983 (2012).
  19. Sbalzarini, I., Mezzacasa, A., Helenius, A., Koumoutsakos, P. Effects of Organelle Shape on Fluorescence Recovery after Photobleaching. Biophysical Journal. 89 (3), 1482-1492 (2005).
  20. Reits, E., Neefjes, J. From fixed to FRAP: measuring protein mobility and activity in living cells. Nature Cell Biology. 3 (6), E145-E147 (2001).
  21. Goehring, N., Chowdhury, D., Hyman, A., Grill, S. FRAP Analysis of Membrane-Associated Proteins: Lateral Diffusion and Membrane-Cytoplasmic Exchange. Biophysical Journal. 99 (8), 2443-2452 (2010).
  22. Bacia, K., Haustein, E., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy: principles and applications. Cold Spring Harbor protocols. 2014 (7), 709-725 (2014).
  23. Sukhorukov, V., Dikov, D., Busch, K., Strecker, V., Wittig, I., Bereiter-Hahn, J. Determination of protein mobility in mitochondrial membranes of living cells. Biochimica et biophysica acta. 1798 (11), 2022-2032 (2010).
  24. Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Anal Bioanal Chem. 397 (8), 3173-3178 (2010).
  25. Graham, F. L., van der Eb, A. J. A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA. Virology. 52 (2), 456-467 (1973).
  26. Wedeking, T., et al. Spatiotemporally Controlled Reorganization of Signaling Complexes in the Plasma Membrane of Living Cells. Small. 11 (44), 5912-5918 (2015).
  27. Mironov, S. L., Ivannikov, M. V., Johansson, M. [Ca2+]i signaling between mitochondria and endoplasmic reticulum in neurons is regulated by microtubules. From mitochondrial permeability transition pore to Ca2+-induced Ca2+ release. J Biol Chem. 280 (1), 715-721 (2005).
  28. Poot, M., et al. Analysis of mitochondrial morphology and function with novel fixable fluorescent stains. J Histochem Cytochem. 44 (12), 1363-1372 (1996).
  29. Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells (vol 5, pg 159). Nature Methods. 5 (5), 455 (2008).
  30. Elmokadem, A., Yu, J. Optimal Drift Correction for Superresolution Localization Microscopy with Bayesian Inference. Biophys J. 109 (9), 1772-1780 (2015).
  31. Barlag, B., et al. Single molecule super-resolution imaging of proteins in living Salmonella enterica using self-labelling enzymes. Sci Rep. 6, 31601 (2016).
  32. Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells. Nature Methods. 5 (2), 159-161 (2008).
  33. Mortensen, K. I., Churchman, L. S., Spudich, J. A., Flyvbjerg, H. Optimized localization analysis for single-molecule tracking and super-resolution microscopy. Nat Methods. 7 (5), 377-381 (2010).
  34. Jin, S., Youle, R. J. PINK1- and Parkin-Mediated Mitophagy at a Glance. Journal of Cell Science. 125, 795-799 (2013).
  35. Yamano, K., Youle, R. J. PINK1 is degraded through the N-end rule pathway. Autophagy. 9 (11), 1758-1758 (2013).
  36. Wiedemann, N., et al. Machinery for protein sorting and assembly in the mitochondrial outer membrane. Nature. 424 (6948), 565-571 (2003).
  37. Thompson, R., Larson, D., Webb, W. Precise Nanometer Localization Analysis for Individual Fluorescent Probes. Biophysical Journal. 82 (5), 2775-2783 (2002).

Play Video

Cite This Article
Appelhans, T., Beinlich, F. R., Richter, C. P., Kurre, R., Busch, K. B. Multi-color Localization Microscopy of Single Membrane Proteins in Organelles of Live Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (136), e57690, doi:10.3791/57690 (2018).

View Video