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Biology

살아있는 포유류 세포의 세포에서 단일 막 단백질의 다 색 지역화 현미경

doi: 10.3791/57690 Published: June 30, 2018

Summary

여기, 우리 살아있는 세포의 세포에 단일 막 단백질의 다 색 지역화에 대 한 프로토콜을 제시. Fluorophores 연결할 자체 라벨 단백질 사용 됩니다. 단백질, 세포 기관이 동일한의 다른 막 구획에 있는 ~ 18의 정밀도로 지역화할 수 nm.

Abstract

Subcompartments 세포에 있는 단백질의 지역화에 대 한 지식을 그들의 특정 한 기능을 이해 하는 것이 결정적 이다. 여기, 우리는 지역화를 생성 하 고이 단백질의 지도 추적 하 여 단백질을 위해 액세스할 수 있는 microcompartments의 결정에 대 한 수 있도록 슈퍼 해상도 기법 제시. 또한, 멀티 컬러 지역화 현미경으로 지역화 및 추적 프로필 다른 subcompartments에 있는 단백질의 얻을 수 있습니다 동시에. 기술은 살아있는 세포에 대 한 특정 이며 단일 모바일 막 단백질의 반복적인 이미지에 기반. 관심사의 단백질 유전자 특정, 소위 자체 라벨 태그와 융합 된다. 이 태그는 기판 공유 방식으로 반응 하는 효소. 이러한 기판에 활용 된 형광 염료입니다. 형광과 효소 태그 단백질의 반응 레이블이 단백질에 기판 결과 표시. 여기, Tetramethylrhodamine (TMR)와 실리콘 Rhodamine (선생님)는 효소의 기질에 부착 된 형광 염료로 사용 됩니다. NM 범위에 오후에 기질 농도 사용 하 여 하위 화학 량 론 라벨 이루어집니다 뚜렷한 신호 귀착되는. 이러한 신호 ~ 15-27와 지역화는 nm 정밀도. 기술을은 사용할 수 막 투과성 염료와 효소 레이블이 자체적으로 지정 하는 것이 레 퍼 토리에 의해 색상 수는 제한 하는 의하여 단일 분자의 멀티 컬러 이미징 할 수 있습니다. 우리 품질 관리 효소 (Pten)의 지역화를 결정 하 여 기술의 타당성을 보여줍니다-다른 막 단백질에 관하여 처리 하는 동안 다른 미토 콘 드 리아 구획에 니 1 (PINK1)을 유발. 단일 분자 무서 워 또는 공동 추적에 의해 다르게 레이블이 단일 단백질 간의 진정한 실제 상호 작용에 대 한 테스트는 제한 하지만, 낮은 라벨도 두 개의 인접 한 단백질을 동시에 표시 하는 데에 대 한 확률 감소 때문입니다. 기술은 단백질 막 구획에 이미징에 대 한 강한 동안, 대부분의 경우 높은 모바일 수용 성 단백질의 지역화가 결정 적합 하지 않다.

Introduction

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이 프로토콜의 목표는 지역화 하 고 단일 막 단백질 라이브 셀 내부를 추적 하는 이미징 방법 제공. 추적 및 지 방화 현미경 검사 법 (TALM)1,2이 메서드를 호출 하 고. 확률적 광학 재건 현미경 (폭풍)3 와 같이 형광 Photoactivation 지역화 현미경 검사 법 ((F) 팜)4,5, TALM 단일 분자 기반 형광 지역화 기술 이다. 그러나, 그것은 동일의 반복적인 이미지와 함께 조합에 있는 막 단백질의 이동성 표시 계시 한다 다른 위치에 분자 microcompartment 모바일 단백질에 대 한 액세스할 수 있는 방식으로 구분 됩니다. 즉, 단백질의 가능한 국부 세포 기관이의 건축 및 단백질1의 이동성에 의해 설정 됩니다. 메서드는 지역화 및 탄도 이미징 모바일 단백질에 의해 지도 계시 한다 때문에 다양 한 다른 슈퍼 해상도 기법6,,78 보완. 라벨은 se 당 비 형광은 유전자 조작된 융해 단백질을 사용 하 여 기반으로 합니다. 이 융해 단백질은 자체 효소 반응 covalently 염료에 활용 된 기판 레이블이 지정 됩니다. 이 절차는 라벨도 될 수 있는 이점이 있다 추가 된 기판의 크기에 의해 제어. 또한, 그것은 선택한 활용된 염료에 따라 형광의 색상을 다양 하 게 있습니다. 여러 자체 라벨 효소-태그는 사용할 수9. 또 다른 장점은, 사용 하는 자체 효소 태그 라벨 활용된 염료를 일반적으로 더 안정적이 고 밝은 형광 단백질1 와 개별 단백질 따라서 기록 될 수 있습니다 더 이상 보다는 더 정확 하 게 때까지 그들은 표백. 모바일 단백질의 궤적의 녹음 및 확산 계수10,11의 추출에 대 한 수 있습니다.

여기, 우리는 미토 콘 드 리아 멤브레인 단백질, TALM의 타당성 입증 하지만 그것은 또한 다른 세포 유형12,13를 포함 하 여 다른 내부 및 여분 cellular 막 단백질에 적용할 수 있습니다. 우리 다 색 TALM 추가 기존 슈퍼 해상도 형광 현미경 검사 법 기술14,15, 보완성에 다른 subcompartments에 있는 단백질의 동시 구별에 대 한 허용 표시 16. TALM 라이브 셀 이미징17와 호환 됩니다. 사진-물리학 선택한 rhodamines Tetramethylrhodamine (TMR)와 실리콘-Rhodamien (선생님)의 특히 그들의 밝기와 안정성, 수 있게 기록 단일 막 단백질 지역화 (및 궤적) 지도 제공 하는 여러 프레임에 걸쳐. 그러나 모션 블러는 너무 높은 때문에 프레임 마다 수집 된 광자는 적절 한 지역화를 위해 너무 낮은, TALM 높은 확산 계수와 수용 성 단백질의 지역화에 대 한 제한 됩니다. 게다가, TALM phototoxic 효과 감소 예 폭풍 또는 자극 방출 소모 (호텔 위치) 현미경6,7, 보다 전원을 적게 필요 합니다. 이것은 phototoxic 스트레스는 종종 organellar 형태학18 및 따라서 이동성 분석19영향을 때문에 중요 한. 합계에서는, 선물이 살아있는 세포에 다 색 TALM 지역화 현미경 방법 폭풍/호텔 위치 사이의 간격을 채우는 기술 (F) 팜 및 photobleaching 후 단백질 이동성 형광 복구 등을 분석 하는 기법 (졸라)20 / ,21, 형광 상관 분광학 (FCS)22, 그리고 형광 상관 분광학 (FCCS)11,23크로스.

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Protocol

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다음 프로토콜 로컬 기관 연구 윤리 위원회의 지침을 따릅니다.

1입니다. 방법

  1. 세포 배양
    1. 배양 세포, 예를 들면 HeLa 세포 (인간의 자 궁 경부 암), T25 셀 문화 플라스 크 포함 하는 37 ° C, 5% CO2성장 매체의 5 mL에.
      참고: 이미지에 대 한 준비 coverslips (1.3과 1.4 단계 참조)에 셀을 분할 하 고 영상 매체에 유지.
  2. 세포 transfection
    참고: 사용 가능한 태그 단백질을 안정적으로 나타내는 셀 라인을 피하기 위해 강력한 overexpression24 . 일시적인 transfection에 대 한 플라스 미드 DNA transfection에 대 한 사용 금액을 적응. 예를 들어 Ca2 + 인산 transfection25 를 사용 하는 경우에 셀 (80-90 %confluency) 플라스 미드 DNA의 2.5-5 µ g으로 3.5 cm 세포 문화 접시에 transfect. 더블 transfection를 수행할 때 각 플라스 미드 구조 당 2.5 µ g를 사용 합니다.
    1. 듀얼 컬러 실험에 대 한 하나의 자체 라벨 단백질의 안정적인 식이 셀 라인을 사용 하 고 뚜렷이 다른 자체 라벨 단백질17인코딩 플라스 미드와 transfect.
      참고: 여기, 듀얼 컬러 실험, HeLa 세포 사용 되었다 안정적 PINK1-헤일로-태그와 Tom20-fSNAP 셀프 라벨링 단백질을 표현.
  3. Coverslips의 청소
    1. 장소는 비 커에 coverslips입니다. coverslips를 포함 하는 비 커에 H2O의 30 mL를 추가 하 고 부드럽게 흔들어 그들의 표면에서 먼지를 제거 하.
    2. 핀셋으로는 coverslips를 수집 하 고 질소의 흐름과 함께 그들을 건조.
    3. 플라즈마 청소, 예를 들어, coverslips의 표면에 유기 오염을 제거 합니다.
      참고: 추가 유리 재료의 오염을 피하기 위해, 처리는 coverslips의 중 장갑을 착용 합니다.
      주의: coverslips 플라즈마 청소 여 청소를 하는 경우는 coverslips의 위 측에만 청소; 폴 리-L-리-폴 리 에틸렌 글리콜-아르기닌-글리신-aspartate (PLL-말뚝-RGD) (섹션 1.4)로 코팅 한 셀 시드 (섹션 1.5)이이 측면을 사용 합니다.
  4. PLL-말뚝-RGD와 Coverslip 코팅
    참고: PLL-말뚝-RGD는 폴 리 에틸렌 글리콜 (3000 다)와 cysteine-glycine-arginine-glycine-aspartate-serine (CGRGDS) 펩 티 드 연결 된 폴 리-L-리 신 (PLL) 파생. PLL 부정 청구 유리 표면에 고 못 브러시를 형성 한다. 충전된 형광 염료의 불특정 바인딩 대폭 줄어듭니다. 또한, RGD 모티브 integrin 수용 체의 신호 펩 티 드를 모방 하 고 그로 인하여 그렇지 않으면 쉽게 고착 하지 않는 셀의 integrin 중재 준수를 촉진.
    1. 앞에서 설명한26으로 PLL-말뚝-RGD를 준비 합니다. 즉, 1 mL의 PBS에 PLL-말뚝-RGD의 0.8 mg 분해. 깨끗 한 coverslip의 상부에 PLL-말뚝-RGD 솔루션의 10 µ L를 추가 합니다.
    2. 두 번째 coverslip 고 (위에 있는 PLL-말뚝-RGD 드롭)는 첫 번째 coverslip;에 거꾸로 그것의 깨끗 한 표면 배치 이 두 개의 coverslips 사이 PLL-말뚝-RGD 솔루션 사이에 발생 합니다.
    3. 신중 하 게 비 커에 샌드위치 coverslips를 배치 하 고 먼지가 없는 건조 한 환경에서 실 온에서 1 h에 품 어.
    4. 1 시간 후 물으로 coverslips를 완전히 커버 하는 비이 커에 H2O의 30 mL를 추가 합니다.
    5. Coverslips는 서로에서 분리 될 때까지 부드럽게 비 커를 흔들.
    6. 핀셋을 사용 하 여 물에서 coverslips를 수집 하 고 질소 가스의 흐름에 따라 그들을 건조.
      참고: 코팅된 coverslips 저장할 수 있습니다 건조, 살 균 유리 뚜껑이 있는 페 트리 접시에에서 며칠에 대 한.
  5. 이미징에 대 한 시료의 준비
    1. PLL-말뚝-RGD 코팅 표면 위 35 mm 셀 문화 접시에 단일 코팅된 coverslips 전송 및 영상 위에 매체의 2 개 mL를 추가.
    2. 영상 매체와 코팅된 coverslip 셀 문화 접시에 2 mL에 각 막 단백질에 자체 라벨 태그를 표현 하는 ~ 500000 trypsinized 셀 (200-500 µ L)를 추가 합니다. 얻기 위해 셀의 균일 분배를 보장 하기 위해 손으로 부드럽게 악수를 균일 하 게 셀 레이어.
    3. 80 %confluency이 때까지 셀에서 37 ° C, 5% CO2 를 품 어.
      참고: 셀 샘플 영상 전과 transfection 전에 1 한 일 시드 되어야 합니다. 안정적으로 표현 하는 관심사의 단백질, 세포 이미징 하기 전에 2 일 시드할 수 있습니다. 나중에, 성장 하는 coverslip에 셀만 몇 군데.
  6. 태그 단백질의 라벨
    참고: 형광 기판 물 무료 DMSO에 해체 해야 한다. 1 µ M 형광 기판의 재고 솔루션을 사용 하 여 최종 레이블 농도 0.2-30 nM17때 좋습니다. 세포 내부 막 단백질 이미징, 막 투과성 형광 기판 사용 합니다.
    1. 따뜻한 물 욕조에 37 ° C에 영상 매체를.
    2. 뚜껑 2 mL 튜브에 미리 데워 진된 영상 매체의 1 mL를 플라스틱. 1 µ M 재고 솔루션 최종 라벨 솔루션을 준비 하에서 형광 기판의 0.2-30 µ L를 추가 (최종 농도: 0.2-30 nM).
    3. 소용돌이 10 라벨 솔루션 s.
    4. 대체는 coverslip에 셀으로 35mm 문화 접시에 있는 매체 (단계 1.5 참조) 준비의 1 mL에 의해 라벨링 솔루션.
    5. 20-30 분 동안 37 ° C, 5% CO2 라벨 솔루션에서 셀을 품 어.
    6. 셀 2 mL PBS의 한 번, 다음 두 번 매체 이미지의 2 mL 씻으십시오. 마지막으로, 셀 요리에 신선한 영상 매체의 1 mL를 플라스틱 하 고 적어도 1 시간에 대 한 37 ° C, 5% CO2 배양 기에 다시 샘플을 넣어. 이미징, 전에 영상 매체를 한 번 더 교환 합니다.
      참고: 처음으로 실험을 실행 하는 경우 상용 세포 기관이 특정 염료27,28와 세포 얼룩 자체 레이블된 organellar 막 단백질의 올바른 대상으로 확인 합니다. 이 경우에, 자체 라벨 효소에 대 한 기판의 100-200 nM을 사용 하 여 강한 신호를 생성 하도.
  7. 형광 구슬 샘플의 준비
    참고: 광 유를 결정 하 고 다른 채널의 이미지 정렬, 다 색 형광 구슬 (0.1 µ m) 사용 됩니다. 기록 된 이미지와 함께 두 개의 방출 채널에 대 한 관계 변환 매트릭스를 생성 됩니다.
    1. 구슬 순수한 H2o. 1%의 솔루션을 희석
    2. 장소 5 방울 청소 coverslip에 5 개의 다른 위치에서 형광 구슬 준비 솔루션 (단계 1.3 참조).
    3. 건조 한 깨끗 한 벤치에 형광 구슬 샘플을 보자.
      참고: 샘플 다시 사용할 수 있습니다; 따라서, 오염 방지 4 ° c.에 그것을 유지 하는 알루미늄 호 일로 샘플을 커버

2입니다. 현미경

  1. 실험적인 체제
    참고: 듀얼 컬러 단일 분자 이미징에 대 한 기본적인 현미경 시스템은 거꾸로 현미경에 기반: 그것은 다중 mode 광학 편광 단일 총 내부 반사 (사격)으로 monomode 섬유를 유지를 통해 결합 하는 두 개의 레이저 장비 콘덴서, TIRF, polyband 방출 필터, 이미지 스플리터와 매우 민감한 카메라 (그림 1)를 위한 석유 집중 목표. 사격 콘덴서는 입사 각도의 지속적인 튜닝는 피-, 높은 경사를 전환할 필요 고 적 층된 광학 시트 (매우 경사 얇은 조명 (힐로)29)와 함께 TIRF 흥분 모드 최적화 침투 깊이입니다. 이미지는 매우 민감한 냉각된 검출기 시스템 획득, 예를 들어, 백업 조명 전자 멀티 충전 결합 된 장치 (EMCCD) 카메라 (양자 효율 QE > 90%) 또는 sCMOS 카메라 (QE > 80-90%).
    1. 그 나중 실험, 예를 들어, 10000 프레임 실험에 기록 하는 경우, 비드 샘플 또한 10000 프레임을 기록으로 동일한 조건 하에서 형광 구슬 (단계 2.2 참조) 이미징 하 여 광학 드리프트를 결정 합니다. 광학 드리프트의 결정에 대 한 첫 번째 프레임과 마지막 인수 프레임 (그림 1B)에 구슬의 위치를 비교 합니다. 필요한 경우 나중에 광학 드리프트30 이미지 시리즈를 수정 및/또는 드리프트 안정적인 환경을 사용.
    2. 주황색과 빨간색 형광 플러스 오렌지 형광 및 빨간 형광에 대 한 적절 한 방출 필터에 대 한 적절 한 색 성 빔 스플리터, 예를 들어, 필터 큐브를 장비. 적당 한 필터 이미지 스플리터를 장비. 두 채널 (그림 1C)에 단일 색상 샘플을 기록 하 여 다른 채널에 신호를 한 채널에서의 가능한 누수를 확인 합니다.

Figure 1
그림 1 : 광학 레이아웃입니다 다 색 추적 및 지역화 (TALM) 오렌지와 빨간색 미터. (A) 두 개 이상 여기 레이저, TIRF 콘덴서, TIRF 적당 한 목표, 이미지 스플리터와 민감한 카메라 거꾸로 현미경 설치. 삽입: 셀 안에 세포를 자극, 입사 빔 각도 설정 되어야 합니다 매우 달성 하기 TIRF에 대 한 중요 한 각도 경사와 광학 시트 조명 (힐로)을 적 층 하는 보다 작은. D c 1: Dichroic 거울 1; D c 2: Dichroic 거울 2입니다. EF: 방출 필터입니다. 다음 실험으로 동일한 프레임 속도 10000 프레임에 대 한 형광 구슬의 위치를 이미징 하 여 광학 드리프트에 (B) 테스트 (여기: 15 Hz). 처음 500 프레임 및 마지막 500 프레임의 연결 된 위치는 드리프트를 보여줍니다. 또한, 빨간색과 파란색에서 첫 번째 및 마지막 프레임의 위치와 병합 된 이미지를 최소한의 드리프트를 보여줍니다. 드리프트 신호의 중심 사이의 거리 시간으로 나눈 총 녹음, 여기 125 오후/미 신호, 여기 TMR 및 선생님의 명확한 구분에 (C) 검사입니다. 두 채널 (채널 1에 TMR)과 채널 2에서 경 3, 000 프레임에서 누적 합계 이미지 생성 되었다. 선생님HTL Tom20 HaloTag와 TMRHTL OxPhos 복잡 한 V-HaloTag에에 붙어 있었다. 색상은 거짓 색상입니다. 바 규모 = 100 nm (B) 및 1 개의 µ m (C). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

  1. 이미지 분할의 물리적 맞춤 이미지 생성
    참고: 장착 하는 coverslip에 준비 된 표본에 대 한 성가 샘플 홀더 수 사용 (그림 2A). 먼지, 샘플에 빠지지 않으려면 장소 문화 접시의 뚜껑 느슨하게 챔버, 위에 설치 하는 경우. 동일한 샘플 홀더 형광 구슬 또는 셀; coverslip 마운트를 사용할 수 있습니다. 세포는 군데 추가 0.5-0.8 mL 영상 매체의. 이미지 분할 2로 이미지를 분할 또는 더 괴기 하 게 채널을 분리 하 고 동일한 카메라에 그들 측면-의해-측면을 프로젝트. 이 프로세스는 잠재적으로 통과 뚜렷한 광학 경로 때문 채널 사이의 체계적인 왜곡을 소개 하 고 직접 colocalization 분석을 방해. 따라서, 실제 정렬 및 두 번째, 수행 후 보정 변환 매트릭스를 정렬. 두 정렬 프로세스에 대 한 형광 구슬 homogenously 보기의 필드에 걸쳐 배포 될 한다.
    1. 소계 (PTFE) 사이 샘플 홀더에 형광 구슬 가진 준비 된 샘플을 마운트-링과 빨간 고무 링 (그림 2A).
    2. 현미경, 모든 하드웨어 구성 요소, 그리고 현미경 검사 법에 필요한 모든 소프트웨어를 시작 합니다.
    3. 소 프로 파 놀과 접촉 보풀 조직 지우기와 목적과 coverslip 아래쪽을 청소. 다음 두 항목 모두 신선한 보풀 조직으로 건조. 대물 렌즈의 눈동자에 침수 기름 작은 물방울을 놓습니다.
    4. 하는 coverslip 하단의 연락처 기름 현미경 스테이지에 비드 샘플 샘플 홀더를 배치 합니다. 전송 빛 또는 레이저를 사용 하 여 구슬에 초점.
    5. 두 개의 형광 채널에서 비슷한 신호 강도 달성 하기 위해 두 여기 레이저의 파워를 조정 합니다. 많은 독특한 형광 신호 영역에 대 한 검색.
    6. 카메라 제어 소프트웨어를 사용 하 여 형광 채널의 병합 된 보기를 생성 합니다. 다음 수동으로 기울기 두 형광 채널 (그림 2B)에서 신호의 최고의 오버레이 달성 하기 위해 이미지 스플리터의 내부 거울 이미지 분배기에 나사를 사용 합니다.
      참고: 주의! 카메라의 동적 범위를 초과 하지 마십시오.
  2. 맞춤 소프트웨어 공간 변환을 수행 하 여 괴기 하 게 분리 된 채널을
    참고: 다음 부분 후 교정 맞춤 및 우리의 소프트웨어 플러그인 (요청 시 사용 가능)와 지역화 절차를 보여 줍니다.
    1. TIRF 현미경 제어 소프트웨어를 시작 하 고 라이브 스트림 모드에서 개별 채널을 표시 하려면 선택 합니다. 모든 채널 (그림 2C)에 스냅숏 이미지 흥미로운 형광을 가져가 라.
    2. 이 스냅숏 이미지를 사용 하 여 변환 매트릭스를 생성 ( 그림 2참조).
      참고: 변환 매트릭스 공간 변환, 일반적으로 유사 하나, 번역 (단일 포인트 소스 두 채널 사이에서 신호 발산)에 대 한 해결을 위해 사용 됩니다.
    3. 소프트웨어 분석 플러그인을 시작 ( 그림 2C참조 하십시오 우리의 실험실에서 요청 시 얻어질 수 있다).
    4. 소프트웨어에 형광 구슬 (단계 2.2 참조) 이전에 기록 된 듀얼 컬러 이미지를 로드 합니다. 형광 채널의 사용된 방향을 선택 합니다.  '예' '이미지 보정'에 대 한 질문 받을 때 클릭 하 고 이전 찍은 스냅샷 선택 합니다.
    5. 단위 변환 요인 (픽셀 크기, 프레임 속도, 광자 변환 인수)를 정의 하려면 "장치 관리자"를 엽니다.
    6. "지역화 관리자"를 엽니다. 지점 확산 기능 (PSF)를 먼저 확인 합니다. 단추: "PSF 반경". "PSF 견적" 창이 열리면 정의 숫자 조리개와 최대 방출. 시작 "견적 PSF 반경"를 클릭 하 여. 평가 상자를 얻은 실험 PSF. 정의 수락, 디플레이션 루프의 수 및 얼마나 많은 코어 컴퓨터의 계산을 위해 사용 된다. "지역화" 2D 대칭 가우스 함수 (그림 2C) 단일 입자의 강도 분포를 피팅 시작을 누릅니다.
    7. "수락" 얻은 실험 PSF. 정의 평가 상자, 디플레이션 루프의 수 및 얼마나 많은 코어 컴퓨터의 계산을 위해 사용 된다. "지역화" 2D 대칭 가우스 함수 (그림 2C) 단일 입자의 강도 분포를 피팅 시작을 누릅니다.
    8. "교정 관리자"를 엽니다. 두 채널의 렌더링된 병합 된 이미지에서 원래 신호 및 지역화 된 센터 표시 됩니다. "" 모드를 선택 합니다. 수동으로 연결 선을 그려 같은 형광 구슬에서 유래 하는 두 개의 채널에 지역화 된 센터의 해당 쌍을 연결 합니다.
    9. 보기의 필드를 통해 모든 배포 해당 신호를 연결 합니다. 이 후, "동의"를 누릅니다. 보정을 저장 합니다.
      참고: 공간 변환 각 형광 구슬에서 샘플 이며 사이 보간됩니다. 추출 된 변환 함수 이후에 그들은 그들의 지역화 정밀도 내에서 중첩 되도록 실험 듀얼 컬러 단일 분자 지 방화를 수정 하는 데 사용 되는 변위 필드 Δr(x,y)를 나타냅니다. 공간 변환 매트릭스는 일반적으로 번역, 스케일링, 및 회전 나노미터의 정확도와 채널 간의 해결 관계 한 고이 수동 일대일 매핑 (그림 2C)에서 추정 될 수 있다.

Figure 2
그림 2 : 듀얼 컬러 정렬에 대 한 워크플로. (A) 형광 구슬 coverslip 샘플 홀더는 PTFE와 고무 링 사이 마운트되어. 다음 챔버의 상단 및 하단 부분 함께 나올입니다. 이미지 분할에 의해 생성 되는 채널 조회의 (B) 실제 맞춤입니다. 두 개의 채널에 구슬 (0.1 µ m)에서 형광 신호를 기록 (녹색 및 빨강, 거짓 색) 병합 됩니다. 다른 신호의 최고의 오버레이 달성 될 때까지 광학 이미지 분배기에 해당 나사는 수동으로 설정 되어 (노란색, 하단 패널). (C) post-processive 채널 정렬에 대 한 변환 매트릭스의 세대. 입자의 정확한 지역화, 지점 확산 기능 (PSF) 방출 파장 및 목표의 숫자 조리개에 대 한 의존에 확인할 필요가 있다. 센터는 PSF의 맞는 대칭 2 차원 가우스에 의해 분석 된 강도 프로 파일에 의해 결정 수 있습니다. 신호 피크의 결과 지역화 다음 원래, 흐리게 신호에 예상 된다. 병합된 이미지에 두 개의 채널에서 신호의 지역화 된 센터 나중 실험 데이터의 post-processive 정렬에 사용 되는 변환 매트릭스를 생성에 연결 됩니다. 스케일 바 = 1 개의 µ m (B, C). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

  1. 미토 콘 드 리아 멤브레인 단백질의 단일 분자 이미징
    참고: 모든 실험 상 온에서 수행 됩니다. T-세포 또는 비 부착 한 세포 해야 될 움직일 수 agarose에서31이미징 하기 전에.
    1. 고무 및 PTFE 반지 (그림 3A) 사이 coverslip에 부착 세포 견본을 탑재 합니다. 0.5-0.8와 챔버를 입력 매체를 이미징 하는 mL.
    2. 2.2.2–2.2.5 단계를 반복 합니다.
    3. 조명 각도 TIRF 현미경 힐로 시트32 (힐로 모드, 그림 1A)을 통해 관심의 특정 영역을 흥분 시키기 위해 사격 모드에 대 한 중요 한 각도 보다 작은 입사 각도 만드는 소프트웨어 제어를 조정 합니다.
      주의: 레이저 빔으로 직접적인 눈 접촉을 피하십시오!
    4. EM 이득을 설정 하 고 프레임 마다 충분 한 광자를 수집 하는 실험에 대 한 적당 한 노출 시간을 선택 합니다.
    5. 레이저 파워 달성 이후 지역화 정밀 직접 S/N33 (그림 3C)에 해당 (S/N) 비율 (그림 3B), 소음에 높은 신호를 설정 합니다.
    6. 겹치지 않는, 길쭉한 미토 콘 드리 아와 단일 분자 신호 (3D 그림; 세포 주변에 있는 영역을 찾기 보조 비디오 1)입니다. 없는 단일 분자 신호 표시 되는 경우 단일 분자 신호 (그림 3E)의 외관에 결과 표백까지 기다립니다.
    7. 신호 수까지 기록 합리적인 계속 (보통 형광 염료, 그림 3 층의 표백 동작에 따라 1000-10000 프레임) 너무 낮습니다.
    8. 영상 처리 소프트웨어 및 미토 콘 드리 아 구조 확인 적어도 1000 기록 된 프레임 (그림 3)의 이미지를 렌더링된 누적 합계를 생성 하 여 시작 합니다.
      참고: 가장 빠른 가능한 프레임 속도 판독 영역에 의해 결정 됩니다. 1 개 채널 보기의 필드 256 x 512 픽셀, 그리고 쿼드-색상 256 x 256 픽셀을 위해 듀얼 컬러 이미지 분배기 (512 x 512 픽셀)으로 감소 된다. 따라서, 두 가지 색상에 대 한 이미지 분배기를 사용 하 여, 이것이 30 Hz. 설정 프레임 전송 모드는 가장 낮은 가능한 판독 시간을 달성 하기.
    9. 소프트웨어 분석 플러그인 및 부하 원시 데이터를 시작 합니다. 채널 방향 및 로드 이미지를 선택 합니다. 단계의 2.3.9 때 "보정 이미지"에 대 한 변환 매트릭스를 사용 합니다. 채널 별도로 표시 됩니다.
    10. 각 채널에 대 한 단위 변환 요소를 정의 하기 전에 "장치 관리자"를 엽니다. 각 채널에 대 한 "지역화 관리자"를 엽니다. 다음 계산에 사용 되는 컴퓨터의 얼마나 많은 코어 설정 및 사용 조건에 대 한 이론적인 PSF 추가 평가 상자, 디플레이션 루프의 수를 정의 합니다. 마지막으로, 지역화 된 단일 입자 (그림 3 H;를 "지역화"를 누릅니다 보조 비디오 2)입니다.
    11. 참고 프로그램 마지막으로 보여주는 누적 해상도 이미지를 생성 합니다 모든 입자 (그림 3I) 지역화.
    12. 예를 들어, 오픈 소스 소프트웨어 또는 요청 시 사용할 수 있는 소프트웨어에 의해 분석을 수행 합니다.
    13. 예를 들어, 다중 표적 추적10 모두 지역화 된 채널에 단일 분자를 추적
      참고: 단계 2.4.13 경계 조건을 올바르게 설정 하는 관심사의 단백질의 diffusibility에 대 한 예비 (실험) 지식이 필요 합니다. 일반적으로, 올바른 경계 조건을 찾는 반복 프로세스입니다.

Figure 3
그림 3 : 단일 분자 지 방화 현미경 검사 법 중 단계. (A) A coverslip 표본으로 만든 샘플 홀더 (J. Bereiter에 의해 한 설계)의 상단 및 하단 부분 (회색) 사이 탑재. (적색) 고무 링 및 PTFE 반지 (화이트) 인감 시스템에서 위와 아래는 coverslip 때 샘플 홀더 부품 볼트 함께. TMR 신호 잡음 비율 (B) 신호. (C) 모든 지역화 된 입자에 대 한 지역화 정밀 히스토그램을 계산. (D) 이미징, 여기, 명확 하 게 분리 된 미토 콘 드리 아와 세포 주변에 대 한 합리적인 영역의 선택. (E) 녹화 및 이미지 처리: 고유한 단일 분자 신호와 단일 프레임 표시 됩니다 (여기서, CV-HaloTag/TMRHTL 의 단일 분자 기록 했다). (F) 강도의 TMR 녹화 시간 동안. (G) 3000 프레임, 처리 되지 않은 이미지를 누적 합계. (H) 입자의 이력서-HaloTag/TMRHTL 단일 프레임에서 2D 가우스 기능 지역화. () 누적, 합계 이미지 3000 프레임에서 모든 지역화 된 CV-HaloTag/TMRHTL 입자를 렌더링. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Representative Results

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멀티 컬러 이미징 및 colocalization 분석은 단백질의 하위 organellar 지역화가 결정을 도울 수 있다. 우리가 시연이 이전 cytosolic 인산 가수분해 효소와 tensin homologue, PINK1, 미토 콘 드 리아 프로 테아 제17에 의해 그것의 처리로 인해 다른 하위-미토 콘 드리 아 위치는. PINK1 미토 콘 드 리아 기능34,35보장 하는 중요 한 요소 이다. 처리 (그림 4A), 라이브 셀과 멀티 컬러 슈퍼 해상도 현미경 동안 다른 미토 콘 드 리아 구획에 PINK1 지역화 수행한 결정 합니다. 따라서, PINK1 유전자 자체 라벨 태그 (HaloTag)에 융합 했다. 확인 하려면 그 지역화 기능 및 역 기능 mitochondria에서 다른 단백질을 기준으로, Tom20, 외부 미토 콘 드 리아 멤브레인 (톰)36, translocase의 일환으로 적었습니다 다른 자체 라벨 태그 (스냅-태그). 적어도 1, 000 프레임 (s 96 프레임) 시계열 기록 되었다. 모든 신호를 한 채널에서 시간이 지남에 따라 누적 이미지가 보였다는 cytosol와 미토 콘 드리 아 (그림 4B, 왼쪽된 패널) PINK1 지역화는 정상적인 조건 하에서 depolarized 미토 콘 드리 아 (의 외부 막에 유지 했다 10 µ M와의 치료는 uncoupler 생성 시안 m chlorophenyl 히드라 진, CCCP, 20 분). 해당 궤적 지도 또한 spatio 시간적 조직에서이 차이 보여줍니다. 지역화 된 입자의 총계 이미지 공개로 PINK1 편광된 미토 콘 드리 아 (그림 4C, 왼쪽 상단 패널), 안으로 주로 배포 됩니다 Tom20 외부 미토 콘 드리 아 막 (OM) (그림 4C, 왼쪽 하단 패널)에서 지역화 하는 동안. 이 지역화 된 Tom20 및 PINK1 입자, 어디 외부 막 단백질 Tom20의 분포는 훨씬 광범위 한 (그림 4C, 오른쪽 패널)의 병합 된 이미지에서 더욱 분명해 진다.

Figure 4
그림 4 : 미토 콘 드리 아에서 PINK1 subcompartmental 지역화를 보여주는 듀얼 컬러 슈퍼 해상도 현미경. (A) 가설 PINK1 였죠 및 미토 콘 드리 아에서 처리. (B) 지역화와 궤적의 지도 PINK1 정상적인 조건 하에서 그리고 depolarized 미토 콘 드리 아에. (C) Tom20에 관하여 PINK1의 미토 콘 드리 아 지역화 공개 듀얼 컬러 슈퍼 해상도 지역화 현미경. 이미지 1000 프레임 s. 왼쪽된 상단 패널 당 96 프레임의 프레임 속도와 기록의 시리즈: PINK1 (TMRHTL와 HaloTag을 통해 표시 됨)의 지역화 지도. 왼쪽된 하단 패널: Tom20 (각BG와 스냅-태그를 통해 표시 됨)의 지역화 지도. 오른쪽 패널: 병합 누적 합계의 이미지 PINK1 TMR (레드)와 Tom20-선생님 (파란색) 있어. 복잡 한 호흡의 (D) 같은 데이터 플러스 있어 난 (CI, 녹색) 내부 미토 콘 드리 아 막에. CI는 paGFP (CI-paGFP)로 융합 했다. 오른쪽: Tom20 (블루), PINK1 (빨간색), 그리고 병합 된 이미지의 표시 영역에 CI (녹색) 형광의 횡단면 프로필을 의미 합니다. 평균 단면 프로 파일 평균 30 병렬 라인 (간격 40 nm) 크로스 지향 하 여 얻은 했다. Beinlich 그 외 여러분 에서 허가로 증 쇄 하는 적응된 버전 16, 저작권 (2015) ACS 화학 생물학. 모든 색깔이 틀린 색상입니다. 스케일 바 = 1 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

확인 미토 콘 드리 아, 내부 PINK1 지역화 제 3 안 미토 콘 드리 아 막에 단백질은 또한 몇 군데. 따라서,는 30 kDa 소 단위 (CI) photoactivable GFP (paGFP)에 융합 되었고 FPALM4에 의해 기록 된 호흡 단지. 누적 트리플 컬러 이미지와 횡단면 분포 오버레이 CI (녹색) 및 PINK1 (적색) (그림 4D), 전체 길이 PINK1의 수입을 확인 표시 합니다. PINK1 N 맨끝 미토 콘 드 리아 대상 시퀀스 있으며 따라서 라벨은 키의 C-말단에 지시 했다. CI와 공동 지역화 전체 길이 PINK1 했다 가져온 보여 줍니다. 횡단면 따라 형광 분포 PINK1 입자 분명히 또한 외부 미토 콘 드리 아 막에 Tom20와 colocalized의 할당량을 보여줍니다. 아마, 이건 PINK1 가져오기 수용 체는 Tom20와 관련 된. 이러한 데이터 설명으로 몇 가지 미토 콘 드리 아 마이크로-구획 PINK1의 부분 모집단에 의해 점유 된다. 생 화 확 적인 방법으로 하위-미토 콘 드 리아 지역화의이 문제를 해결 하기 위해 훨씬 더 어려운 것, 때문에 다른 세포 막의 엄격한 하위 분류 및 수용 성 구성 요소 제외의 명확한 분리를 요구 크로스-오염입니다.

보충 비디오 1: 영상 녹화, 100 프레임, CV-HaloTag/TMR 단일 분자의 HTL. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 비디오 2: 데이터 지역화. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

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여기, 듀얼 컬러 단일 분자 지역화 모바일 막 단백질의 기술을 제시 했다. 다음 프로토콜, 막 단백질 자체 라벨 TMR 및 그들의 각각 기판에 활용 된 선생님 rhodamine 염료와 반응 하는 단백질에 융합 된다. Rhodamine 밝은 photostable 염색 하 고 반복적인 이미징1따라서 허용 합니다. 성공적인 성능에 대 한 여러 조건 및 중요 한 주제 마음에 보관 해야 합니다.

첫째, 그것은 적절 한 필터와 스플리터 TMR 및 각 신호를 명확 하 게 구분을 선택 하는 것이 중요입니다. 배경에서 셀 외부를 줄이기 위해, precleaning 및 PLL-말뚝-RGD와 coverslip의 코팅은 도움이 되었다. 염료-기판의 최종 농도 기판에 대 한 자체 라벨 효소의 선호도 셀 내부 효소의 접근성을 고려 하 여 테스트 되어야 한다. 나노-picomolar 농도에 미토 콘 드리 아 단백질17 및 스트레스과 립13에 대 한 충분 한 했다. 다른 세포에 대 한 필요한 농도 테스트할 필요가 있다. 녹음의 시작 부분에 너무 강하다 고 얼룩 없는 단일 분자를 구별할 수 있습니다 경우 단일 입자 (SP)를 분별 수 있도록 형광 염료 양의 감소는 표백 될 때까지 최상 이다. 우리는 발견의 농도 30 보다 높은 염료 BG 기판 및 1 nM nM HTL 기판 착 과정 이상에 대 한 실현은 레이블이 분자의 수를 늘리기 위해 배를 얼룩. 각 실험에 대 한 여기 레이저의 강도 때문에 염료의 subcellular 위치 영향의 형광 동작 (양자 수율, 표백, 점멸)5 pH 등 다른 환경 조건에 따라 적응 하는 고 산화 환 원 상태3. 그것은 추가 해야 합니다 언급 배경 듀얼 컬러 실험 단색 이미지에 비해 높다. 이 지역화의 정밀도 좌우 한다. 따라서, 그것은 좋은 신호 잡음 비율 (S/N) 하지만 낮은 photobleaching 속도를 달성 하기 위해 레이저 파워를 최적화 하기 위해 중요 한. 힐로 현미경에서 일반적인 레이저 전원 밀도 25 ± 8 kW/c m2의 범위에 있습니다. 전원을의 미세 조정에 대 한 레이저 다이오드의 직접 변조는 acousto 광학 변조기를 통해 변조 하지 경우 중립 밀도 필터의 다른 세트를 사용할 수 있습니다. TIRF에 대 한 특별 한 2 m m 두꺼운 거울 빔 왜곡을 줄이기 위해 사용 하는 것이 좋습니다. 사격 하 고 힐로 조건 특히 여기 빛의 차단 하는 매우 효율적인이 필요 합니다. 단일 분자 이미징 및 서브 픽셀 정확도와 지역화, 적절 한 공간 샘플링 주파수 (Nyquist 섀 넌 샘플링 정리)이 필요 합니다. 이 해야한다 두번 높은 이미징 시스템37의 해상도 한계에 의해 정의 된 최대 공간 주파수. 높은 수 가늠 구멍으로 기름 침수 목표를 사용 하 여 (없음 > 1.4), 해상도, d = λ / (2 × 없음), 일반적으로 오렌지 빨강 염료에 대 한 200-250 nm. 따라서, 검출기의 실제 픽셀 크기를 고려 이미징 광학 확대 초래 한다는 이미지 픽셀 크기가 약 100 nm. EMCCD 카메라 픽셀 크기가 16 x 16 µ m2 150 X 목표와 함께에서, 픽셀 크기는 106.7 nm 및 따라서 적절 한.

일반적으로, 그것은 권장 사용 안정적인 transfected 세포에이 있기 때문에 꾸준한 양의 단백질 태그가 장점은 셀24의 대부분에 표시 됩니다. 그러나, 듀얼 컬러 지역화 및 실험을 추적,이 이중 transfection 그리고 다른 항생제로 이중 선택을 요구할 것입니다. 따라서, 그것은 종종 더 뚜렷이 두 번째 플라스 미드와 이미 안정적인 셀 라인 transfect 가능한 관심사의 단백질 태그 추가 인코딩.

미토 콘 드리 아, 운동 및 조각화는 중요 한 문제입니다. 조각화 또는 세포를 이동 하거나 해서는 안됩니다 수 기록 분석. 운동 시작과 다른 (false) 색상 실험의 끝에서 지역화 된 분자의 이미지를 렌더링 overlaying에 의해 확인할 수 있습니다. 오버레이에 세포에서 신호의 균질 배급 세포 이동 하지 않았습니다 나타냅니다. 일반적으로, 실내 온도 구조와 세포의 움직임을 줄일 수 있습니다.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

저자 생물 물리학 그룹 및 Jacob Piehler Wladislaw 콜 기술 지원 및 자료의 준비에 대 한 지속적인 지원과 사용 하기 위해 현미경을 제공 하기 위한 CellNanOs 보드 나 브루 크의 대학에 감사 하 고 싶습니다. 프로젝트는 SFB 944에 의해 투자 되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(2-(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethanesulfonic acid, 1 M) (HEPES) Biochrom #1104E
DC1: Dichroid beam splitter  Chroma 640 dcxr NC506031
DC2: Polychroic Mirror, beamsplitter Chroma zt405/488/561/640rpc discontinued
Dulbecco´s Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1x (w/o Ca & Mg) Sigma-Aldrich & Co. #RNBF8311
Earle´s MEM without phenol red, without L-Glutamine and without NaHCO3 containing 1% FBS, 0.1% HEPES, 0.1% NEAA, 0.1% Alanyl-L-Glutamine and 34.78% sodium hydrogen carbonate (NaHCO3 0.75g/l) Imaging medium
Earle´s minimum essential medium (MEM) with phenol red, containing 1% Fetal Bovine Serum Superior (FBS), 0.1% HEPES (2-(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethanesulfonic acid, 1 M), and 0.1% non-essential amino acids (NEAA) Growth medium
EF: Emission filter quadbandpass AHF analysentechnik F72-866 Brightline HC 446 nm/523 nm/600 nm/677 nm
EMCCD camera Andor Andor iXON 897 EMCCD camera
Emission filter QuadView filter cubes, orange AHF analysentechnik F39-637 bandpass 582 - 619 nm
Emission filter QuadView filter cubes, red Chroma bandpass 655 - 725 nm (HQ 690/70)
FBS (Fetal bovine serum) superior Biochrom S0615
Fluorescent beads: TetraSpeck™ Microspheres, 0.1 µm, fluorescent blue/green/orange/dark red Thermo Fisher Scientific T7279 fluorescent microspheres
Glutamine Biochrom #0951C
HeLa cells  DSMZ ACC-57 Cervical carcinoma cells from patient Henrietta Lacks
Hela cells CI::paGFP, stable Muster et al., PLOSOne 2010
Hela cells CV g::Halo7-Tag, stable Appelhans et al., NanoLett 2012
Hela cells Tom20::Halo7-Tag, stable Appelhans et al., NanoLett 2012
Image splitter Photometrics Dual-View QV2 image splitter emission
Imaging processing software  ImageJ2 / Fiji freeware
Immersion Oil - ImmersolTM 518 F (ne = 1.518, ve = 45) Carl Zeiss Jena GmbH 444960-0000-000
Inverted epifluorescence microscope Olympus IX-71/73/83
Laser 561 nm, 200 mW CrystaLaser CL-561-200 561 nm emission
Laser 642 nm, 140 mW Omicron Luxx-642-140 642 nm emission
MATLAB MathWorks version R2013a
MEM with Earle's Balanced Salt Solution 2.2 g/L NaHCO3, stable glutamine w/o PR Biochrom FG-0385
MEM with Earle's Balanced Salt Solution with 2.2 g/L NaHCO3, stable glutamine, Phenolred Biochrom FG-0325
MitoTracker® Deep Red FM Thermo Fisher Scientific M22426 dye
MitoTracker® Green FM Thermo Fisher Scientific M7514 dye
Multi-mode-optical polarization maintaining monomode fiber Pointsource/Qioptiq KineFLEX
NHS-PEG-MAL, Rapp Polymer  Rapp Polymere GmbH Tübingen coverslip coating
non-essential amino acids (NEAA) Biochrom #0802E
PEG 800 (Polyethylene glycol) 10 % Carl Roth GmbH Art No. 0263.1 coverslip coating
Penicillin/Streptomycin Biochrom #0122E
Plasmid for PINK1-Halo7-Tag expression Beinlich et al., ACS Chemical Biology 2015
Poly-L-lysine (1.2 mg/ml) Sigma-Aldrich & Co. Cat. No.P9155 coverslip coating
RGD Peptide (Ac-CGRGDS-COOH) Coring System Diagnostix GmbH, Gernsheim coverslip coating / Intergrin receptor motif
Silicon Rhodamine linked to HaloTag®-Ligand (SiRHTL)  personal gift from Kai Johnson dye
Software analysis plugin self-written C. P. Richter, Biophysik Osnabrück SLIMFAST 16g
Tetramethylrhodamine / SNAP-Cell® TMR-Star linked to SNAP-Ligand (TMRstar)  New England Biolab® S9105S dye
Tetramethylrhodamine linked to HaloTag®-Ligand (TMRHTL)  Promega G8251 dye
TIRF condensor Olympus Cell^TIRF MITICO System TIRF condensor
TIRF microscope controlling software Olympus cellSens 1.12
TIRF objective Olympus 150x oil objective (N.A. 1.45; Olympus UAPO)
Trypsin/EDTA 10x Biochrom #0266
Water H2O 99,5 % Rotipuran® Low organic  Carl Roth GmbH Art. No. HN57.1

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References

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살아있는 포유류 세포의 세포에서 단일 막 단백질의 다 색 지역화 현미경
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Appelhans, T., Beinlich, F. R. M., Richter, C. P., Kurre, R., Busch, K. B. Multi-color Localization Microscopy of Single Membrane Proteins in Organelles of Live Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (136), e57690, doi:10.3791/57690 (2018).More

Appelhans, T., Beinlich, F. R. M., Richter, C. P., Kurre, R., Busch, K. B. Multi-color Localization Microscopy of Single Membrane Proteins in Organelles of Live Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (136), e57690, doi:10.3791/57690 (2018).

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