Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Flerfärgade lokalisering mikroskopi av enda membranproteiner i organeller av levande däggdjursceller

doi: 10.3791/57690 Published: June 30, 2018

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för flerfärgade lokalisering av enda membranproteiner i organeller av levande celler. Bifoga fluorophores genom används egen märkning proteiner. Proteiner, beläget i olika membran fack i samma organell, kan lokaliseras med en precision av ~ 18 nm.

Abstract

Kunskap om lokaliseringen av proteiner i cellulär subcompartments är avgörande för att förstå deras specifika funktion. Här presenterar vi en super resolution-teknik som möjliggör bestämning av den microcompartments som är tillgängliga för proteiner genom att generera lokalisering och spårning kartor av dessa proteiner. Dessutom av flerfärgade lokalisering mikroskopi erhålls lokaliseringen och spårning profiler av proteiner i olika subcompartments samtidigt. Tekniken är specifik för levande celler och är baserad på den repetitiva avbildning av enda mobila membranproteiner. Proteiner av intresse är genetiskt smält med specifika, så kallade egen märkning taggar. Dessa taggar är enzymer som reagerar med ett substrat i en kovalent sätt. Konjugerat till dessa substrat är fluorescerande färger. Reaktion av enzym-märkta proteiner med fluorescensen märkt substrat resultat i märkta proteiner. Här, används tetrametylrodamin (TMR) och Silicon rodamin (SiR) som fluorescerande färgämnen bifogas substratesna för enzymerna. Genom att använda substrat koncentrationer i pM för nM spektrum, som sub stökiometriska märkning uppnås som resulterar i distinkta signaler. Dessa signaler är lokaliserade med ~ 15 – 27 nm precision. Tekniken möjliggör flerfärgade avbildning av enstaka molekyler, varigenom antalet färger begränsas av de tillgängliga membran-permeable färgämnena och repertoaren av egen märkning enzymer. Vi visar genomförbarheten av tekniken genom att bestämma localizationen av enzymet kvalitetskontroll (PT)-inducerad kinase 1 (PINK1) i olika mitokondriella fack under behandlingen i förhållande till andra membranproteiner. Testet för sann fysisk interaktion mellan olikt märkt enstaka proteiner av enda molekyl bandet eller samtidig spårning är begränsad, men eftersom de låg märkning graderna minska sannolikheten för att ha två intilliggande proteiner märkt samtidigt. Även tekniken är stark för imaging proteiner i membran fack, i de flesta fall är det inte lämpligt att bestämma localizationen av lättrörliga lösliga proteiner.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Målet med detta protokoll är att tillhandahålla en tänkbar metod för att lokalisera och spåra enda membranproteiner inuti levande celler. Vi kallar denna metod spårning och lokalisering mikroskopi (TALM)1,2. Stokastiska optiska återuppbyggnad mikroskopi (STORM)3 och fluorescensmikroskopi ljusaktivering lokalisering ((F) PALM)4,5är TALM en enda molekyl-baserade fluorescens lokalisering teknik. Dock skiljer det på sätt att rörligheten för membranproteiner i kombination med repetitiva avbildning av samma märkt molekyl på olika positioner avslöjar den microcompartment som är tillgänglig för mobila protein. Med andra ord, anges de möjliga lokaliseringar av protein av arkitekturen av organell och rörlighet av protein1. Metoden är ett komplement till olika andra super-upplösning tekniker6,7,8 eftersom det avslöjar lokalisering och bollbana kartor av imaging mobila proteiner. Märkningen är baserad på använda genmanipulerade fusionsproteinerna som är i sig icke-fluorescerande. Dessa fusionsproteinerna egen märkning enzymer som reagerar kovalent med ett substrat som konjugerat med ett färgämne. Detta förfarande har fördelen att märkning graden kan vara styrs av mängden tillsatt substrat. Det går dessutom för att variera färgen på fluorescens, beroende på den valda konjugerade färgämnen. Flera egenföretagare märkning enzym-taggar är tillgänglig9. En annan fördel med att använda egen märkning enzym-taggar, att de konjugerade färgämnena oftast är mer stabil och ljusare än fluorescerande proteiner1 och enskilda proteiner därför kan föras in längre och mer exakt tills de är blekt. Detta möjliggör inspelning av banor av mobila proteiner och utvinning av diffusion koefficienter10,11.

Här vi demonstrera genomförbarheten av TALM med mitokondriell membranproteiner, men den kan också tillämpas för andra intra - och extra - celler membranproteiner, inklusive annan cell typer12,13. Vi visar att flerfärgade TALM ytterligare möjliggör samtidiga skillnaden av proteiner i olika subcompartments i komplettering till befintliga super-resolution fluorescence mikroskopi tekniker14,15, 16. TALM är kompatibel med levande cell imaging17. Foto-fysik av de valda rhodamines tetrametylrodamin (TMR) och Silicon-Rhodamien (SiR), i synnerhet deras ljusstyrka och stabilitet, gör det möjligt att registrera enstaka membranproteiner över flera ramar som tillhandahåller lokalisering (och bana) kartor. TALM är dock begränsad för lokalisering av lösliga proteiner med hög Diffusionskoefficienterna eftersom rörelseoskärpa är för hög och de insamlade fotonerna per ram är för låg för korrekt lokalisering. Dessutom kräver TALM mindre excitation ström än till exempel STORM eller stimulerad Emission utarmning (STED) mikroskopi6,7, minska fototoxiska effekter. Detta är viktigt, eftersom fototoxisk stress påverkar ofta organellar morfologi18 och därmed rörlighet analys19. Sammanfattningsvis vi presentera flerfärgade TALM i levande celler som en teknik som fyller ett tomrum mellan lokalisering mikroskopi metoderna STORM/STED / (F) PALM och tekniker som analysera protein rörlighet såsom fluorescens återhämtning efter fotoblekning (FRAP)20 ,21, fluorescens korrelation spektroskopi (FCS)22och fluorescens cross korrelation spektroskopi (S.K.)11,23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Följande protokoll följer riktlinjerna i den lokala institution forskningsetisk kommittén.

1. metoder

  1. Cellkultur
    1. Odla celler, till exempel HeLa cells (mänskliga livmoderhalsen karcinom), i en T25 cell kultur kolv innehållande 5 mL odlingsmedium vid 37 ° C och 5% CO2.
      Obs: För imaging, dela upp cellerna på beredda coverslips (se steg 1.3 och 1.4) och hålla i imaging medium.
  2. Cell transfection
    Obs: Använd cellinjer som stabilt uttrycker de märkta proteinerna möjligt24 att undvika starkt överuttryck. För övergående transfection, anpassa mängden plasmid DNA används för transfection. Till exempel när Ca2 + fosfat transfection25 används, transfect celler (80 – 90% konfluens) i en 3,5 cm cell kultur maträtt med 2,5-5 µg av plasmid DNA. När du utför dubbel transfection, använda 2,5 µg per varje plasmid konstruktion.
    1. För dubbel färg experiment, använda en cell fodrar med stabilt uttryck för en egen märkning protein och övergående transfect med plasmiden kodning andra själv märkning protein17.
      Obs: Här, för dubbel färg experiment, HeLa cells användes som stabilt uttryck själv märkning proteinerna PINK1-Halo-Tag och Tom20-fSNAP-Tag.
  3. Rengöring av coverslips
    1. Placera coverslips i en bägare. Tillsätt 30 mL H2O i den bägare som innehåller coverslips och skaka försiktigt för att ta bort damm från deras yta.
    2. Samla coverslips med pincett och torka dem med en kväveström.
    3. Ta bort organiska föroreningar på ytan av coverslips, t.ex., av plasma rengöring.
      Obs: För att undvika ytterligare förorening av materialet som glas, Använd handskar vid hantering av coverslips.
      Varning: När coverslips städas av plasma rengöring, bara den övre sidan av coverslips städas; Använd denna sida för beläggning med poly-L-lysin-polyetylen glykol-arginin-glycin-aspartat (PLL-PEG-RGD) (avsnitt 1.4) och cell sådd (avsnitt 1.5).
  4. Täckglas beläggning med PLL-PEG-RGD
    Obs: PLL-PEG-RGD är ett poly-L-lysin (PLL) derivat fäst med en polyetylenglykol (3 000 Da) och en cysteine-glycine-arginine-glycine-aspartate-serine (CGRGDS)-peptid. PLL binder till negativt laddade glasytan och bildar en PEG-borste. Detta minskar kraftigt ospecifik bindning av laddade fluorescerande färger. Dessutom RGD motivet härmar signal peptiden av integrin-receptorn och främjar därmed integrin-medierad följsamhet av celler som annars inte enkelt följer.
    1. Förbereda PLL-PEG-RGD som tidigare beskrivits26. Kort sagt, lös PLL-PEG-RGD 0,8 mg i 1 mL PBS. Tillsätt 10 µL av PLL-PEG-RGD lösningen på den övre sidan av en ren täckglas.
    2. Ta ett andra täckglas och placera den med ren yta uppochner på den första täckglas (som har den PLL-PEG-RGD droppe på toppen); Detta resulterar i sandwiching PLL-PEG-RGD lösningen mellan två coverslips.
    3. Noggrant placera den inklämt coverslips i en bägare och inkubera i 1 timme vid rumstemperatur i en dammfri torr miljö.
    4. Efter 1 h, tillsätt 30 mL H2O till bägaren att fullt ut täcka coverslips med vatten.
    5. Skaka försiktigt bägaren tills coverslips loss från varandra.
    6. Använda pincett för att samla coverslips ur vattnet och torka dem under en ström av kvävgas.
      Obs: Den belagda coverslips kan lagras i en torr, steril glas petriskål med lock för ett par dagar.
  5. Beredning av provet för imaging
    1. Överför den enda belagda coverslips till en 35 mm cell kultur maträtt, med PLL-PEG-RGD belagda ytan uppåt och tillsätt 2 mL av imaging medium på toppen.
    2. Lägg till ~ 500 000 trypsinized celler (200 – 500 µL) som uttrycker själv märkning taggarna på respektive membranproteiner till 2 mL imaging medium i cell kultur skålen med det belagda täckglaset. Skaka försiktigt för hand att säkerställa en homogen fördelning av cellerna för att få ett enhetligt cellager.
    3. Inkubera cellerna vid 37 ° C och 5% CO2 tills 80% konfluens nås.
      Obs: Cellprover bör vara seedad 3 dagar innan imaging och 1 dag innan transfection. Celler, som stabilt express proteinet av intresse, kan vara seedad 2 dagar innan imaging. Senare, är endast celler som odlas på täckglaset avbildade.
  6. Märkning av märkta proteiner
    Obs: Mest fluorescerande substrat måste lösas upp i vatten-fri DMSO. Vi rekommenderar för att använda stamlösningar av 1 µM fluorescerande substrat när slutliga märkning koncentration är 0,2 – 30 nM17. För imaging membranproteiner inuti cellerna, använda membran genomsläpplig fluorescerande substrat.
    1. Värm upp imaging medellång till 37 ° C i ett vattenbad.
    2. Pipettera 1 mL före värmde imaging mediet i en 2 mL rör med lock. Tillsätt 0,2 – 30 µL av fluorescerande substrat från 1 µM stamlösningar att förbereda den slutliga märkning lösningen (slutlig koncentration: 0,2 – 30 nM).
    3. Vortex märkning lösningen för 10 s.
    4. Ersätta mediet i 35 mm kultur skålen med celler med ett täckglas (se steg 1,5) av 1 mL beredd märkning lösning.
    5. Inkubera cellerna i märkning lösningen vid 37 ° C och 5% CO2 för 20 – 30 min.
    6. Tvätta cellerna med 2 mL PBS en gång, sedan med 2 mL imaging medium två gånger. Slutligen, pipett 1 mL färsk imaging medium till cell skålen och placera provet i inkubatorn vid 37 ° C och 5% CO2 för minst 1 h. Innan imaging, utbyta imaging medlet en gång till.
      Obs: När du kör experimentet för första gången, bekräfta korrekt inriktning av själv märkt proteiner i organellar membran genom färgning organeller med kommersiellt tillgängliga organell specifika färgämnen27,28. I det här fallet använda 100 – 200 nM substrat för egen märkning enzymerna för att producera starka signaler.
  7. Beredningen av ett fluorescerande pärla prov
    Obs: För att avgöra den optisk drivan och anpassa bilder av de olika kanalerna, flerfärgade fluorescerande pärlor (0.1 µm) används. Med de inspelade bilderna, kommer en affine omformningsmatrisen för två utsläpp kanalerna att genereras.
    1. Späd lösningen av pärlor till 1% med ren H2O.
    2. Placera 5 droppar av den beredda lösningen med fluorescens pärlor på fem olika positioner på ett rengjorda täckglas (se steg 1.3).
    3. Låt provet fluorescerande pärla torka på en ren bänk.
      Obs: Provet kan återanvändas; Därför, täck över provet med aluminiumfolie att undvika kontaminering och hålla det på en 4 ° C.

2. mikroskopi

  1. Experimentellt ställa in
    Obs: En grundläggande mikroskopi systemet för tvåfärgad enda molekyl imaging bygger på ett inverterat Mikroskop: den är utrustad med två lasrar kopplat via en multi-Counter-mode-optisk polarisering upprätthålla monomode fiber till en enskild Totalreflexion (TIR) kondensator-en oljeimmersionsobjektivet utformad för Frida, en polyband utsläpp filter, en bild-splitter och en mycket känslig kamera (figur 1). En TIR-kylare behövs som möjliggör kontinuerlig trimning av infallande vinkeln växla mellan den epi-, mycket benägen och laminerade optiska ark (starkt lutande tunn belysning (HILO)29), och Frida magnetiseringen läge med optimerad genomträngningsdjupet. Bilder förvärvas med en mycket känslig kyls detektorsystem, t.ex., en back-belysta electron att multiplicera debiteras kopplat enheten (elektrisk) kamera (quantum effektivitet QE > 90%) eller en sCMOS kamera (QE > 80 – 90%).
    1. Bestämma den optiska drivan av imaging fluorescerande pärlor (se steg 2.2) på samma villkor som de som senare kommer att användas för experimentet, t.ex., när 10.000 bilder registreras i experimentet, rekord också 10.000 bilder med pärla provet. För bestämning av den optiska avdrift, jämföra positionen för pärlorna i den första bildrutan och den sista förvärvade bildrutan (figur 1B). Om det behövs senare korrigera bilden serien för optisk drift30 eller använda drivgarn stabila miljöer.
    2. Utrusta filter kuben med lämpliga dikroisk stråldelare, t.ex., för orange och röd fluorescens plus tillräcklig utsläpp filter för orange fluorescens och röd fluorescens. Utrusta image splitter med de lämpliga filter. Kontrollera om möjligt läckan av signaler från den ena kanalen till den andra kanalen genom inspelning enda färgprover i båda kanalerna (figur 1 c).

Figure 1
Figur 1 : Optisk layout för flerfärgade spårning och lokalisering mikroskopi (TALM) med orange och röda utsläppsländerna. (A) inverterad Mikroskop setup med minst två excitation lasrar, en Frida kondensor, en Frida lämpliga mål, en bild-splitter och en känslig kamera. Infällt: för att excitera organeller inuti cellerna, vinkel infallande strålen måste ställas in mindre än den kritiska vinkeln för Frida att uppnå mycket benägen och laminerade optiska ark belysning (HILO). DC1: Dichroic spegel 1; DC2: Dichroic spegel 2. EF: utsläpp filter. (B) Test på optiska drift av imaging positioner av en fluorescerande pärla för 10.000 bilder med samma bildhastighet per följande experimenten (här: 15 Hz). Anslutna positioner av de första 500 ramarna och de sista 500 ramarna visar drivan. En sammanslagen bild med positionen för först och den sista bildrutan i rött och blått visar också, en minimal drift. Drivan är avståndet mellan centrum av signalerna dividerat med den totala inspelningstiden, här 125 pm/s. (C) kontrollera om tydlig avskiljning av signaler, här TMR och SiR. För båda kanaler genererades kumulativ sum bilder från 3.000 ramar (TMR i kanal 1) och SiR i kanal 2. SiRHTL fästes till Tom20-HaloTag och TMRHTL till OxPhos komplex V-HaloTag. Färger är falska färger. Skala barer = 100 nm (B) och 1 µm (C). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

  1. Fysisk anpassning av image splitter genererade bilder
    Obs: För montering av preparatet beredd på ett täckglas, en self-made provhållaren kan vara används (figur 2A). För att undvika damm, etc. faller i provet, placera locket på kultur skålen löst ovanpå kammaren, när den är monterad. Samma prov-innehavare kan användas för att montera täckglas med fluorescerande pärlor eller celler; När cellerna är avbildade, tillsätt 0,5 – 0,8 mL imaging medium. Image splitter delar upp bilden i två eller flera spektralt separerade kanaler och projekt dem sida vid sida på samma kamera. Denna process potentiellt introducerar systematisk snedvridning mellan kanalerna på grund av distinkta optiska vägar korsas och hindrar direkt colocalization analys. Därför först utföra fysisk anpassning och andra, efter korrigering justering med en omformningsmatris. För både anpassningen processer fördelas fluorescerande pärlor likartad i hela synfältet.
    1. Montera det beredda provet med fluorescerande pärlor i in provhållaren mellan polytetrafluoretylen (PTFE)-ring och röd gummiring (figur 2A).
    2. Starta mikroskopet, alla maskinvarukomponenter och all programvara som behövs för mikroskopi.
    3. Ren objektiva och botten av täckglaset med en luddfri vävnad torka fuktad med isopropanol. Sedan torka båda träffar med en färsk luddfri vävnad. Placera en droppe av nedsänkning olja på eleven av objektivet.
    4. Placera provhållaren med pärla provet på Mikroskop scenen så att botten av täckglaset kontakter oljan. Fokusera på pärlor med hjälp av överföring ljus eller en laserlinje.
    5. Justera kraften i två excitation lasrar för att uppnå liknande signalintensitet i två fluorescens-kanalerna. Söka efter ett område med många distinkta fluorescerande signaler.
    6. Generera en sammanslagna vy av fluorescerande kanaler med programmet kamera kontroll. Sedan använda skruvarna på bilden splitter manuellt vrida de inre speglarna av image splitter att uppnå den bästa överlagringen av signalerna från de två fluorescerande kanalerna (figur 2B).
      Obs: uppmärksamhet! Överskrid inte det dynamiska omfånget av kameran.
  2. Justering av spektralt separerade kanaler av programvara utför rumsliga omvandling
    Obs: Följande del visar efter korrigering anpassning och lokalisering förfarandet med vår programvara plugin (tillgänglig på begäran).
    1. Starta mikroskopet Frida Kontrollera programvara och välja att visa enskilda kanaler i levande strömläge. Ta en ögonblicksbild bild spännande fluorescens i alla kanaler (figur 2 c).
    2. Använd denna ögonblicksbild bild för att producera omformningsmatrisen (se figur 2).
      Obs: Omformningsmatrisen används för en rumsliga omvandling, vanligtvis en affine en, som korrigerar för översättning (avvikelse av signaler från en single point källa mellan två kanaler).
    3. Starta programvaran analys plugin (kan fås på begäran från våra lab, se figur 2 c).
    4. Läsa in tidigare inspelade dubbla bilder i färg (se steg 2.2) av fluorescerande pärlor i programvaran. Välj används orientering av fluorescerande kanaler.  Klicka på 'Ja' när bad om 'kalibrera bilder' och välj tidigare tagit ögonblicksbilden.
    5. Öppna ”UNIT MANAGER” för att definiera enheten omräkningsfaktorer (pixelstorlek, bildhastighet, photon konverteringsfaktor).
    6. Öppna ”LOCALIZATION MANAGER”. Bestäm punkten sprida funktion (PSF) först. Tryck på knappen: ”polyesterstapelfibrer radie”. I fönstret ”polyesterstapelfibrer Estimator” som öppnar, definiera den numeriska bländaröppningen och maximala utsläpp. Starta ”uppskattning polyesterstapelfibrer radie” genom att klicka på. Acceptera den erhållna experimentella polyesterstapelfibrer. definiera rutan utvärdering, antalet deflation slingor och hur många kärnor på datorn används för beräkning. Tryck på ”lokalisera” för att starta passande intensitet fördelningen av enstaka partiklar av en 2D symmetriska Gaussisk funktion (figur 2 c).
    7. ”Acceptera” den erhållna experimentella polyesterstapelfibrer. definiera rutan utvärdering, antalet deflation slingor och hur många kärnor på datorn används för beräkning. Tryck på ”lokalisera” för att starta passande intensitet fördelningen av enstaka partiklar av en 2D symmetriska Gaussisk funktion (figur 2 c).
    8. Öppna ”kalibrering MANAGER”. I den renderade sammanslagna bilden av de två kanalerna visas de ursprungliga signalerna och lokaliserade centers. Välja ”affine” läge. Anslut manuellt motsvarande parar av lokaliserade centra i de två kanaler som har sitt ursprung från samma fluorescerande pärla genom att rita en anslutning linje.
    9. Anslut motsvarande signalerna distribueras över hela synfältet. Efter detta trycker du på ”acceptera”. Spara kalibreringen.
      Obs: Den rumsliga omvandlingen är urvalet på varje fluorescerande pärla och interpolerad i mellan. Den extraherade omvandling funktionen representerar en förskjutning fältet Δr(x,y) som används för att därefter korrigera de experimentella tvåfärgad enda molekyl lokaliseringar så att de overlay inom deras lokalisering precision. Rumsliga omformningsmatrisen är vanligtvis en affine som korrigerar för översättning, skalning och rotation mellan kanaler med nanometer precision, och det kan utläsas från denna manuell mappning (figur 2 c).

Figure 2
Figur 2 : Arbetsflöde för dubbla färgjusteringen. (A) täckglaset med fluorescerande pärlor är monterad i en provhållare mellan en PTFE och en gummiring. Sedan den övre och nedre delen av kammaren är skruvas ihop. (B) fysisk anpassning av vyerna kanal som genereras av image splitter. Inspelade fluorescerande signaler från pärlor (0.1 µm) i två kanaler (grön och röd, false färger) slås samman. Motsvarande skruvarna på den optiska bilden splittern vänds manuellt tills den bästa överlagringen av de olika signalerna uppnås (gul färg, nedre panelen). (C) Generation en omformningsmatris för post-processive kanal anpassning. För exakt lokalisering av en partikel är det nödvändigt att fastställa punkten sprida funktion (PSF) i beroende på utsläpp våglängd och den numeriska bländaröppningen målet. I mitten av en polyesterstapelfibrer kan bestämmas av dess intensitet profil analyseras av en symmetrisk tvådimensionell Gaussisk passar. Den resulterande lokaliseringen av signal toppen projiceras sedan på de ursprungliga, suddig signalerna. I en sammanslagen bild, är lokaliserade centrerar av signalerna från de två kanalerna anslutna för att generera en omformningsmatris som används senare för post-processive uppriktning av experimentella data. Skala barer = 1 µm (B, C). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

  1. Enda molekyl avbildning av mitokondriell membranproteiner
    Obs: Alla experimenten utförs i rumstemperatur. T-celler eller icke-anhängare celler måste immobiliseras i agaros innan imaging31.
    1. Montera preparatet med vidhäftande celler på täckglas mellan gummi och PTFE-ringarna (figur 3A). Fyll i kammaren med 0,5 – 0,8 mL imaging medium.
    2. Upprepa steg 2.2.2–2.2.5.
    3. Justera mikroskopet belysning vinkel Frida kontroll av programvara för att skapa en incident vinkel som är mindre än den kritiska vinkeln för TIR-läget att excitera regionen specifika intresse via en HILO ark32 (HILO läge, figur 1A).
      Undvik direkt ögonkontakt med laserstrålen!
    4. Ställa in förstärkning av EM och välja en exponeringstid som är lämplig för experiment som samlar tillräckligt fotoner per bildruta.
    5. Ange laser makt att uppnå en hög signal till brus (S/N)-förhållande (figur 3B), eftersom den lokalisering precisionen direkt motsvarar S/N33 (figur 3 c).
    6. Hitta ett område i cell periferin med icke-överlappande, avlånga mitokondrier och enda molekyl signaler (figur 3D; Kompletterande Video 1). Om ingen enda molekyl signaler är synliga, vänta tills blekning resulterar i uppkomsten av enda molekyl signaler (figur 3E).
    7. Spela in tills antalet signaler är för låg för rimliga fortsättning (vanligtvis 1000 – 10 000 ramar beroende på blekning beteendet hos den fluorescerande färgen, figur 3F).
    8. Starta av imaging bearbetning programvara och kontrollera om mitokondriell strukturer genom att generera en kumulativ återgivna summan bild av minst 1 000 inspelade bildrutor (figur 3 g).
      Obs: Den snabbaste möjliga hastigheten styrs av området avläsning. Synfältet för en kanal minskas med en tvåfärgad image splitter (512 x 512 pixlar) till 256 x 512 pixlar, och för en Quad-färg till 256 x 256 pixlar. Således, för att använda en bild-splitter för två färger, detta är 30 Hz. Set frame överföringsläget att uppnå lägsta möjliga utläsning tiden.
    9. Starta programvaran analys plugin och belastning rådata. Välj kanal orientering och ladda bilderna. Använd omformningsmatrisen från steg 2.3.9 när bad om ”kalibrera bilder”. Kanaler visas separat.
    10. Öppna ”UNIT MANAGER” som tidigare för att definiera enheten konverteringsfaktorer för varje kanal. Öppna ”LOCALIZATION MANAGER” för varje kanal. Definiera rutan utvärdering, antalet deflation slingor, Lägg sedan till den teoretiska polyesterstapelfibrer för de villkor som används och ange hur många kärnor på datorn används för beräkning. Slutligen, tryck på ”lokalisera” för att få lokaliserade enstaka partiklar (figur 3 H; Kompletterande Video 2).
    11. Observera att programmet äntligen kommer att generera en kumulativ superresolution bild visar lokaliserade alla partiklar (figur 3I).
    12. Utför analysen, t.ex., av programvara med öppen källkod eller vår programvara finns på begäran.
    13. Spåra de enstaka molekylerna i båda lokaliserade kanaler, t.ex., med flera mål tracer10
      Obs: Steg 2.4.13 måste preliminära (experimentell) kunskap om diffusibility av proteinerna av intresse för den gräns villkoren korrekt inställda. Vanligtvis, att hitta den rätta gräns villkoren är en iterativ process.

Figure 3
Figur 3 : Steg under enda molekyl lokalisering mikroskopi. (A) A täckglas med preparatet är monterad mellan den övre och nedre delen (grå) av hemmagjord provhållaren (designad av J. Bereiter-Hahn). En gummiring (röd) och ett PTFE-ring (vit) täta systemet från ovan och nedan täckglaset, när provhållaren delarna är bolt tillsammans. (B) Signal-brusförhållandet för TMR signalen. (C) beräknas lokalisering precision histogram för alla lokaliserade partiklar. (D) val av en rimlig region för imaging, här, cell periferin med klart avskild mitokondrier. (E) inspelning och bildbehandling: en enda bildruta med distinkta enda molekyl signaler visas (här, enstaka molekyler av CV-HaloTag/TMRHTL spelades in). (F) intensitet av TMR över inspelningstiden. (G) kumulativa summan bild av 3.000 ramar, obearbetade. (H) partiklar av CV-HaloTag/TMRHTL lokaliserade med 2D Gaussisk funktion från en enda bildruta. (jag) ackumulerat, återges summan bilden visar alla lokaliserade CV-HaloTag/TMRHTL partiklar från 3.000 ramar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Flerfärgade imaging och colocalization analys kan hjälpa för att fastställa den sub-organellar lokaliseringen av proteiner. Vi visat detta tidigare med cytosoliska fosfatas och Tenzin homologt, PINK1, som har olika sub-mitokondriell platser på grund av dess bearbetning av mitokondriell proteaser17. PINK1 är en viktig faktor som garanterar mitokondriella funktioner34,35. Att bestämma localizationen av PINK1 i olika mitokondriella fack under behandlingen (figur 4A), flerfärgade super-resolution mikroskopi med levande celler utfördes. PINK1 var därför genetiskt smält till en egen märkning tagg (HaloTag). För att avgöra dess lokalisering i förhållande till andra proteiner i funktionella och dysfunktionella mitokondrier, var Tom20, som en del av translocase av den yttre mitokondriella membran (TOM)36, märkta med en annan egen märkning tagg (SNAPIN-tagg). Tidsserier med minst 1000 bilder (96 bildrutor per s) registrerades. Den samlade bilden av alla signaler över tid från en kanal visade att PINK1 var lokaliserade i cytosolen och i mitokondrierna (figur 4B, vänstra panelen) under normala förhållanden, medan det var kvar på det yttre membranet av Aricebo mitokondrier ( behandling med 10 µM av den uncoupler karbonyl cyanid m-klorfenyl hydrazin, CCCP, för 20 min). Motsvarande bana kartorna visar också skillnaden i plats och tid organisationen. Eftersom de summerade bilderna av lokaliserade partiklar avslöja, PINK1 distribueras främst inuti polariserade mitokondrier (figur 4 c, vänster övre panelen), medan Tom20 är lokaliserad i det yttre mitokondriella membranet (OM) (figur 4 c, vänster nedre panelen). Detta blir ännu mer tydligt i den sammanslagna bilden lokaliserad Tom20 och PINK1 partiklar, där fördelningen av den yttre membranprotein Tom20 är mycket bredare (figur 4 c, högra panelen).

Figure 4
Figur 4 : Dubbel färg super-resolution mikroskopi visar subcompartmental lokalisering av PINK1 i mitokondrierna. (A) hypotetiska PINK1 skytteltrafik och bearbetning i mitokondrierna. (B) lokalisering och bollbana kartor över PINK1 under normala förhållanden och i Aricebo mitokondrier. (C) tvåfärgad super-resolution lokalisering mikroskopi att avslöja mitokondriell lokalisering av PINK1 i förhållande till Tom20. Bild serie 1000 bildrutor spelades in med en bildhastighet av 96 bildrutor per s. vänstra övre panelen: lokalisering karta över PINK1 (märkt via HaloTag med TMRHTL). Vänster nedre panelen: lokalisering karta över Tom20 (märkt via SNAPIN-Tag med SiRBG). Högra panelen: sammanfoga kumulativa summan bilden av PINK1-TMR (röd) och Tom20-SiR (blå) lokaliseringar. (D) samma data plus lokaliseringar av respiratoriska komplex I (CI, grön) i det inre mitokondriella membranet. CI var smält till paGFP (CI-paGFP). Höger: Menar tvärsnitt profil Tom20 (blå), PINK1 (röd) och CI (grön) fluorescens i regionen markerade i den sammanslagna bilden. De genomsnittliga tvärsnitt profilerna erhölls genom genomsnitt upp till 30 parallellt orienterade linjer (intervallet 40 nm). Anpassad version återges med tillstånd från Beinlich o.a. 16, upphovsrätt (2015) ACS kemisk biologi. Alla färger är falska färger. Skala barer = 1 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

För att verifiera localizationen av PINK1 inuti mitokondrierna, en tredje fotograferades också protein lokaliserade i det inre mitokondriella membranet. Därför den 30 kDa subuniten av respiratoriska komplex jag (CI) var smält till photoactivable GFP (paGFP) och inspelad av FPALM4. Den kumulativa trippel färgbild och tvärsnitt fördelningen visar överdra av CI (grön) och PINK1 (röd) (figur 4 d), bekräftar import av fullängds PINK1. PINK1 har en N-terminal mitokondriell inriktning sekvens och således etiketten sattes på C-terminus i Kinas. Samtidig lokalisering med CI visar att fulla längd PINK1 hade importerats. Fluorescens fördelning längs ett tvärsnitt visar att en kvot av PINK1 partiklar tydligen också colocalized med Tom20 i det yttre mitokondriella membranet. Troligen är detta PINK1 som är associerad med Tom20, vilket är den import-receptorn. Som dessa data visar, upptas flera mitokondriella mikro-fack av subpopulationer av PINK1. För att lösa denna fråga av sub-mitokondriell lokalisering av biokemiska metoder skulle vara mycket svårare, eftersom det skulle kräva stränga sub fraktionering av olika membran och en tydlig separation mellan lösliga komponenter att utesluta korskontaminering.

Kompletterande Video 1: Footage av enda molekyl inspelning, 100 ramar, CV-HaloTag/TMR HTL. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Kompletterande Video 2: lokaliserade data. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Här, presenterades en teknik för dubbel färg enda molekyl lokalisering av mobil membranproteiner. Efter de protokoll, membranproteiner är smält till egen märkning proteiner som reagerar med de rodamin färgämnena TMR och SiR konjugerat till deras respektive substrat. Rodamin färgämnen är ljusa och fotostabilt och därmed tillåta för repetitiva imaging1. För framgångsrika resultat måste flera villkor och kritiska ämnen hållas i åtanke.

Först, är det viktigt att välja lämpliga filter och splitters för att separera signalerna från TMR och SiR tydligt. För att minska bakgrunden från utanför cellen, var en förrengöring och beläggning av täckglaset med PLL-PEG-RGD hjälpsam. Dye-substratet slutliga koncentration skall provas genom att beakta frändskapet av enzymet egen märkning för dess substrat och tillgängligheten av enzymet inuti cellen. Nano-picomolar koncentrationer var tillräckliga för mitokondrie proteiner17 och stress granulat13. Koncentrationerna som krävs måste testas för andra organeller. Om färgningen är för stark i början av inspelningen och ingen enstaka molekyler är urskiljbara, är det bäst att vänta tills blekning har minskat mängden fluorescerande färgämnen så att enstaka partiklar (SP) kan urskiljas. Vi har funnit att halterna av färgämnen högre än 30 nM för BG-substrat och 1 nM för HTL substrat under förfarandet för färgning, eller längre färgning gånger för att öka antalet märkta molekyler, inte är genomförbara. För varje experiment, intensiteten av magnetiseringen lasern måste anpassas, eftersom färgen subcellulär placering påverkar dess fluorescens beteende (quantum avkastning, blekning, blinkande)5 på grund av olika miljöförhållanden som pH och Redox staten3. Vidare måste det nämnas att bakgrunden är högre i tvåfärgad experiment jämfört med enfärgad imaging. Detta påverkar precisionen för lokalisering. Därför är det avgörande att optimera laser befogenhet att uppnå bra signal för buller (S/N) nyckeltal men låg fotoblekning priser. Typisk laser driva tätheter i HILO mikroskopi är i spänna av 25 ± 8 kW/cm2. För finjustering av magnetiseringen makt, kan olika uppsättningar av neutral density filter användas om laserdioder är inte direkt moduleras och inte moduleras via en acousto-optisk modulator. Det rekommenderas att använda speciella 2 mm tjocka speglar för Frida för att minska beam snedvridningar. Särskilt om TIR- och HILO villkor behövs mycket effektiv blockering av magnetiseringen ljus. För enda molekyl imaging och lokalisering med sub-pixel noggrannhet krävs en ordentlig rumsliga samplingsfrekvens (Nyquist-Shannons samplingsteorem). Detta bör vara dubbelt så hög som den högsta spatial frekvens definieras av resolution gränsen av imaging system37. Med en oljeimmersionsobjektivet med en hög numeriska bländaröppningen (NA > 1,4), vilken upplösning, d = λ / (2 × NA), är typiskt vid 200-250 nm för orange till mån färgämnen. Således, med tanke på de fysiska pixelstorlek av detektorn, förstoring av imaging optiken bör resultera i en pixel bildstorlek cirka 100 nm. För en elektrisk kamera med pixelstorleken 16 x 16 µm2 i kombination med en 150 X-objektiv, pixelstorlek är 106,7 nm och sålunda på ett adekvat.

Generellt, det föreslås att använda stabil transfekterade celler eftersom detta har fördelen att en stadig mängd taggade proteiner uttrycks i de flesta av de celler24. Men för tvåfärgad lokalisering och spåra experiment, skulle detta kräva en dubbel transfection och dubbel urval med olika antibiotika. Därför är det ofta mer genomförbart att övergående transfect en redan stabila cellinje med en andra plasmid kodning de extra taggade protein av intresse.

För mitokondrier är rörelse och fragmentering en kritisk fråga. Fragmenterad eller flytta organeller bör inte registreras eller analyseras. Rörelse kan kontrolleras genom överliggande renderade bilder av lokaliserade molekyler från början och slutet av experimentet, med två olika (false) färger. En homogen fördelning av signalerna från organeller i överlägget visar att organeller inte har flyttat. Allmänhet, rumstemperatur minskar rörligheten för cellulär föreningar och strukturer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Författarna vill tacka biofysik koncernen och Jacob Piehler vid universitetet i Osnabrück för kontinuerligt stöd, Wladislaw Kohl för tekniskt bistånd och beredning av material och CellNanOs styrelsen för att tillhandahålla Mikroskop för användning. Projektet finansierades av SFB 944.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(2-(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethanesulfonic acid, 1 M) (HEPES) Biochrom #1104E
DC1: Dichroid beam splitter  Chroma 640 dcxr NC506031
DC2: Polychroic Mirror, beamsplitter Chroma zt405/488/561/640rpc discontinued
Dulbecco´s Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1x (w/o Ca & Mg) Sigma-Aldrich & Co. #RNBF8311
Earle´s MEM without phenol red, without L-Glutamine and without NaHCO3 containing 1% FBS, 0.1% HEPES, 0.1% NEAA, 0.1% Alanyl-L-Glutamine and 34.78% sodium hydrogen carbonate (NaHCO3 0.75g/l) Imaging medium
Earle´s minimum essential medium (MEM) with phenol red, containing 1% Fetal Bovine Serum Superior (FBS), 0.1% HEPES (2-(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethanesulfonic acid, 1 M), and 0.1% non-essential amino acids (NEAA) Growth medium
EF: Emission filter quadbandpass AHF analysentechnik F72-866 Brightline HC 446 nm/523 nm/600 nm/677 nm
EMCCD camera Andor Andor iXON 897 EMCCD camera
Emission filter QuadView filter cubes, orange AHF analysentechnik F39-637 bandpass 582 - 619 nm
Emission filter QuadView filter cubes, red Chroma bandpass 655 - 725 nm (HQ 690/70)
FBS (Fetal bovine serum) superior Biochrom S0615
Fluorescent beads: TetraSpeck™ Microspheres, 0.1 µm, fluorescent blue/green/orange/dark red Thermo Fisher Scientific T7279 fluorescent microspheres
Glutamine Biochrom #0951C
HeLa cells  DSMZ ACC-57 Cervical carcinoma cells from patient Henrietta Lacks
Hela cells CI::paGFP, stable Muster et al., PLOSOne 2010
Hela cells CV g::Halo7-Tag, stable Appelhans et al., NanoLett 2012
Hela cells Tom20::Halo7-Tag, stable Appelhans et al., NanoLett 2012
Image splitter Photometrics Dual-View QV2 image splitter emission
Imaging processing software  ImageJ2 / Fiji freeware
Immersion Oil - ImmersolTM 518 F (ne = 1.518, ve = 45) Carl Zeiss Jena GmbH 444960-0000-000
Inverted epifluorescence microscope Olympus IX-71/73/83
Laser 561 nm, 200 mW CrystaLaser CL-561-200 561 nm emission
Laser 642 nm, 140 mW Omicron Luxx-642-140 642 nm emission
MATLAB MathWorks version R2013a
MEM with Earle's Balanced Salt Solution 2.2 g/L NaHCO3, stable glutamine w/o PR Biochrom FG-0385
MEM with Earle's Balanced Salt Solution with 2.2 g/L NaHCO3, stable glutamine, Phenolred Biochrom FG-0325
MitoTracker® Deep Red FM Thermo Fisher Scientific M22426 dye
MitoTracker® Green FM Thermo Fisher Scientific M7514 dye
Multi-mode-optical polarization maintaining monomode fiber Pointsource/Qioptiq KineFLEX
NHS-PEG-MAL, Rapp Polymer  Rapp Polymere GmbH Tübingen coverslip coating
non-essential amino acids (NEAA) Biochrom #0802E
PEG 800 (Polyethylene glycol) 10 % Carl Roth GmbH Art No. 0263.1 coverslip coating
Penicillin/Streptomycin Biochrom #0122E
Plasmid for PINK1-Halo7-Tag expression Beinlich et al., ACS Chemical Biology 2015
Poly-L-lysine (1.2 mg/ml) Sigma-Aldrich & Co. Cat. No.P9155 coverslip coating
RGD Peptide (Ac-CGRGDS-COOH) Coring System Diagnostix GmbH, Gernsheim coverslip coating / Intergrin receptor motif
Silicon Rhodamine linked to HaloTag®-Ligand (SiRHTL)  personal gift from Kai Johnson dye
Software analysis plugin self-written C. P. Richter, Biophysik Osnabrück SLIMFAST 16g
Tetramethylrhodamine / SNAP-Cell® TMR-Star linked to SNAP-Ligand (TMRstar)  New England Biolab® S9105S dye
Tetramethylrhodamine linked to HaloTag®-Ligand (TMRHTL)  Promega G8251 dye
TIRF condensor Olympus Cell^TIRF MITICO System TIRF condensor
TIRF microscope controlling software Olympus cellSens 1.12
TIRF objective Olympus 150x oil objective (N.A. 1.45; Olympus UAPO)
Trypsin/EDTA 10x Biochrom #0266
Water H2O 99,5 % Rotipuran® Low organic  Carl Roth GmbH Art. No. HN57.1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Appelhans, T., Richter, C., Wilkens, V., Hess, S., Piehler, J., Busch, K. Nanoscale organization of mitochondrial microcompartments revealed by combining tracking and localization microscopy. Nano Letters. 12, (2), 610-616 (2012).
  2. Appelhans, T., Busch, K. Single Molecule Tracking and Localization of Mitochondrial Protein Complexes in Live Cells. Methods Mol Biol. 1567, 273-291 (2017).
  3. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3, (10), 793-795 (2006).
  4. Gould, T. J., Verkhusha, V. V., Hess, S. T. Imaging biological structures with fluorescence photoactivation localization microscopy. Nat Protoc. 4, (3), 291-308 (2009).
  5. Pennacchietti, F., Gould, T. J., Hess, S. T. The Role of Probe Photophysics in Localization-Based Superresolution Microscopy. Biophys J. 113, (9), 2037-2054 (2017).
  6. Wegel, E., Göhler, A., Lagerholm, B. C., Wainman, A. Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison. Scientific reports. Available from: https://www.nature.com/articles/srep27290?WT.feed_name=subjects_physical-sciences (2016).
  7. Pellett, P., et al. Two-color STED microscopy in living cells. Biomedical Optics Express. 2, (8), (2011).
  8. Ishigaki, M., et al. STED super-resolution imaging of mitochondria labeled with TMRM in living cells. Mitochondrion. 28, 79 (2016).
  9. Liss, V., Barlag, B., Nietschke, M., Hensel, M. Self-labelling enzymes as universal tags for fluorescence microscopy, super-resolution microscopy and electron microscopy. Scientific Reports. 5, 17740 (2015).
  10. Sergé, A., Bertaux, N., Rigneault, H., Marguet, D. Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotemporal cartography of cell membranes. Nat Methods. 5, (8), (2008).
  11. Appelhans, T., Busch, K. B. Dynamic imaging of mitochondrial membrane proteins in specific sub-organelle membrane locations. Biophysical reviews. 9, (4), 345-352 (2017).
  12. Wilmes, S., et al. Triple-color super-resolution imaging of live cells: resolving submicroscopic receptor organization in the plasma membrane. Angewandte Chemie. 51, (20), 4868-4871 (2012).
  13. Niewidok, B., et al. Single-molecule imaging reveals dynamic biphasic partition of RNA-binding proteins in stress granules. J Cell Biol. (2018).
  14. Wurm, C. A., Jakobs, S. Differential protein distributions define two sub-compartments of the mitochondrial inner membrane in yeast. FEBS Lett. 580, (24), 5628-5634 (2006).
  15. Schmidt, R., Wurm, C. A., Punge, A., Egner, A., Jakobs, S., Hell, S. W. Mitochondrial cristae revealed with focused light. Nano Lett. 9, (6), 2508-2510 (2009).
  16. Kukat, C., Wurm, C. A., Spahr, H., Falkenberg, M., Larsson, N. G., Jakobs, S. Super-resolution microscopy reveals that mammalian mitochondrial nucleoids have a uniform size and frequently contain a single copy of mtDNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, (33), 13534-13539 (2011).
  17. Beinlich, F., Drees, C., Piehler, J., Busch, K. Shuttling of PINK1 between Mitochondrial Microcompartments Resolved by Triple-Color Superresolution Microscopy. ACS chemical biology. 10, (9), 1970-1976 (2015).
  18. Shim, S., et al. Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, (35), 13978-13983 (2012).
  19. Sbalzarini, I., Mezzacasa, A., Helenius, A., Koumoutsakos, P. Effects of Organelle Shape on Fluorescence Recovery after Photobleaching. Biophysical Journal. 89, (3), 1482-1492 (2005).
  20. Reits, E., Neefjes, J. From fixed to FRAP: measuring protein mobility and activity in living cells. Nature Cell Biology. 3, (6), E145-E147 (2001).
  21. Goehring, N., Chowdhury, D., Hyman, A., Grill, S. FRAP Analysis of Membrane-Associated Proteins: Lateral Diffusion and Membrane-Cytoplasmic Exchange. Biophysical Journal. 99, (8), 2443-2452 (2010).
  22. Bacia, K., Haustein, E., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy: principles and applications. Cold Spring Harbor protocols. 2014, (7), 709-725 (2014).
  23. Sukhorukov, V., Dikov, D., Busch, K., Strecker, V., Wittig, I., Bereiter-Hahn, J. Determination of protein mobility in mitochondrial membranes of living cells. Biochimica et biophysica acta. 1798, (11), 2022-2032 (2010).
  24. Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Anal Bioanal Chem. 397, (8), 3173-3178 (2010).
  25. Graham, F. L., van der Eb, A. J. A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA. Virology. 52, (2), 456-467 (1973).
  26. Wedeking, T., et al. Spatiotemporally Controlled Reorganization of Signaling Complexes in the Plasma Membrane of Living Cells. Small. 11, (44), 5912-5918 (2015).
  27. Mironov, S. L., Ivannikov, M. V., Johansson, M. [Ca2+]i signaling between mitochondria and endoplasmic reticulum in neurons is regulated by microtubules. From mitochondrial permeability transition pore to Ca2+-induced Ca2+ release. J Biol Chem. 280, (1), 715-721 (2005).
  28. Poot, M., et al. Analysis of mitochondrial morphology and function with novel fixable fluorescent stains. J Histochem Cytochem. 44, (12), 1363-1372 (1996).
  29. Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells (vol 5, pg 159). Nature Methods. 5, (5), 455 (2008).
  30. Elmokadem, A., Yu, J. Optimal Drift Correction for Superresolution Localization Microscopy with Bayesian Inference. Biophys J. 109, (9), 1772-1780 (2015).
  31. Barlag, B., et al. Single molecule super-resolution imaging of proteins in living Salmonella enterica using self-labelling enzymes. Sci Rep. 6, 31601 (2016).
  32. Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells. Nature Methods. 5, (2), 159-161 (2008).
  33. Mortensen, K. I., Churchman, L. S., Spudich, J. A., Flyvbjerg, H. Optimized localization analysis for single-molecule tracking and super-resolution microscopy. Nat Methods. 7, (5), 377-381 (2010).
  34. Jin, S., Youle, R. J. PINK1- and Parkin-Mediated Mitophagy at a Glance. Journal of Cell Science. 125, 795-799 (2013).
  35. Yamano, K., Youle, R. J. PINK1 is degraded through the N-end rule pathway. Autophagy. 9, (11), 1758-1758 (2013).
  36. Wiedemann, N., et al. Machinery for protein sorting and assembly in the mitochondrial outer membrane. Nature. 424, (6948), 565-571 (2003).
  37. Thompson, R., Larson, D., Webb, W. Precise Nanometer Localization Analysis for Individual Fluorescent Probes. Biophysical Journal. 82, (5), 2775-2783 (2002).
Flerfärgade lokalisering mikroskopi av enda membranproteiner i organeller av levande däggdjursceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Appelhans, T., Beinlich, F. R. M., Richter, C. P., Kurre, R., Busch, K. B. Multi-color Localization Microscopy of Single Membrane Proteins in Organelles of Live Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (136), e57690, doi:10.3791/57690 (2018).More

Appelhans, T., Beinlich, F. R. M., Richter, C. P., Kurre, R., Busch, K. B. Multi-color Localization Microscopy of Single Membrane Proteins in Organelles of Live Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (136), e57690, doi:10.3791/57690 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter