Burada, içinde canlı hücre organelleri tek zar proteinleri çok renkli yerelleştirme için bir iletişim kuralı mevcut. Fluorophores eklemek için kendi kendine etiketleme protein kullanılır. Aynı organel farklı membranlar bölmeleri içinde bulunan proteinler, ~ 18 hassasiyetle lokalize nm.
Proteinlerin hücresel subcompartments lokalizasyonu hakkında bilgi belirli kendi işlevini anlamak çok önemlidir. Burada, yerelleştirme üreten ve haritalar bu proteinlerin izleme proteinler için erişilebilir microcompartments belirlenmesi için izin veren bir süper çözünürlük teknik mevcut. Ayrıca, çok renkli yerelleştirme mikroskobu tarafından yerelleştirme ve profilleri farklı subcompartments proteinlerin izleme aynı anda elde edilir. Teknik canlı hücreler için özgüdür ve tek mobil zar proteinleri tekrarlayan görüntüleme üzerinde temel alır. Proteinler ilgi genetik olarak belirli, sözde Self Etiketleme etiketleri ile erimiş. Bu etiketleri bir substrat ile kovalent bir şekilde tepki enzimlerdir. Bu yüzeyler için Birleşik floresan boyalar vardır. Reaksiyon ile floresan enzim öğesini proteinlerin etiketli yüzeylerde sonuçlar etiketli proteinler. Burada, Tetramethylrhodamine (TMR) ve silikon rodamine (sır) Floresan boyalar enzimler yüzeyler için bağlı olarak kullanılır. Substrat konsantrasyonu nM Aralık pM içinde kullanılarak, alt stokiometrik etiketleme farklı sinyaller de sonuçları elde edilir. Bu sinyaller ~ 15-27 ile yerelleştirilmiştir nm hassas. Sayede renk sayısını sınırlı kullanılabilir membran geçirgen boyalar ve enzimler Self Etiketleme repertuar tek moleküllerin çok renkli görüntüleme için tekniği sağlar. Biz kalite kontrol enzimi (Pten) lokalizasyonu belirlenerek teknik fizibilite göstermek-kinaz 1 (PINK1) ile ilgili olarak diğer membran proteinlerinin işleme sırasında farklı mitokondrial bölmeleri indüklenen. Farklı etiketlenmiş tek protein molekülünü perde veya ortak izleme arasındaki gerçek fiziksel etkileşim için test olsa da, düşük etiketleme derece aynı zamanda etiketli iki bitişik protein sahip olma olasılığını azaltmak için sınırlıdır. Teknik proteinler membran bölmeleri görüntüleme için güçlü olmakla birlikte, çoğu durumda son derece mobil çözünür proteinler lokalizasyonu belirlemek uygun değil.
Bu iletişim kuralının amacı yerelleştirilmesine ve tek zar proteinleri canlı hücreleri içinde izlemek için bir görüntüleme yöntemi sağlamaktır. Bu yöntem1,2izleme ve yerelleştirme mikroskobu (TALM) diyoruz. Stokastik optik imar mikroskobu (fırtına)3 ve floresan Photoactivation yerelleştirme mikroskobu ((F) PALM)4,5gibi TALM bir tek molekül tabanlı floresans yerelleştirme tekniktir. Ancak, zar proteinleri birlikte hareketlilik ile aynı yinelenen görüntüleme için mobil protein erişilemez microcompartment molekül farklı pozisyonlar ortaya çıkarır, etiketli şekilde farklıdır. Başka bir deyişle, protein mümkün yerelleştirmeler organel mimarisini ve protein1hareketliliğini tarafından ayarlanır. Yerelleştirme ve yörünge haritaları görüntüleme mobil proteinler tarafından ortaya çıkarır çünkü çeşitli diğer süper çözünürlük teknikleri6,7,8 ‘ e tamamlayıcı yöntemdir. Etiketleme başına sigara floresan genetiği füzyon protein kullanarak dayanmaktadır. Bu füzyon proteinler kovalent bir boya için Birleşik bir substrat ile reaksiyona enzimler Self Etiketleme. Bu yordam etiketleme derecesi olabilir avantajı vardır ekledi substrat miktarı kontrollü. Ayrıca, floresan, bağlı olarak seçilen konjuge boya rengini değiştirmek için izin verir. Birkaç kendini etiketleme enzim-mevcut9etiketlerdir. Tam olarak onlar ağartılmış kadar enzim-Etiketler Self Etiketleme, konjuge boyalar genellikle daha istikrarlı ve floresan proteinler1 ve bireysel proteinler bu nedenle artık kaydedilebilir daha parlak ve daha fazla kullanmanın bir diğer avantajı. Bu yörüngeleri mobil proteinlerin kaydı ve difüzyon katsayıları10,11çıkarılması için sağlar.
Burada, biz TALM fizibilite mitokondri zar proteinleri ile göstermek, ama aynı zamanda farklı hücre türleri12,13de dahil olmak üzere diğer içi ve ekstra cellular membran proteinlerinin için uygulanabilir. Biz çok renkli TALM daha da proteinler tamamlayıcı için varolan Süper çözünürlük floresans mikroskobu teknikleri14,15, içinde farklı subcompartments arasında eşzamanlı ayrım sağlar göstermek 16. TALM17Imaging canlı hücre ile uyumludur. Fotoğraf-fizik seçilen rhodamines Tetramethylrhodamine (TMR) ve silikon-Rhodamien (sır), özellikle onların parlaklık ve istikrar, sağlar kayıt tek zar proteinleri için yerelleştirme (ve yörünge) haritalar sağlayan birden çok çerçeve. Ancak, TALM hareket bulanıklığı çok yüksek olduğu ve kare başına toplanan fotonlar uygun yerelleştirme için çok düşük çözünür proteinler yüksek difüzyon katsayıları ile lokalizasyonu için sınırlıdır. Ayrıca, TALM Fototoksik etkileri azaltmak örneğin fırtına veya uyarılmış emisyonu tükenmesi (STED) mikroskopi6,7, daha az uyarma güç gerektirir. Fototoksik stres organellar morfoloji18 ve böylece mobilite analiz19kez etkiler bu yana bu önemlidir. Özetle, biz yerelleştirme mikroskobu yöntemleri fırtına/STED arasında bir boşluk doldurur bir teknik olarak çok renkli TALM canlı hücreler içinde mevcut / (F) PALM ve protein hareketlilik floresans kurtarma gibi photobleaching sonra analiz teknikleri (sıkı bağlamak)20 ,21, floresans korelasyon spektroskopisi (FCS)22ve floresan çapraz korelasyon spektroskopisi (FCCS)11,23.
Burada, mobil zar proteinleri çift renk tek molekül yerelleştirme için bir teknik sunuldu. Aşağıdaki iletişim kuralı, membran proteinlerinin erimiş TMR ve onların anılan sıraya göre yüzeylerde Birleşik efendim rodamine boyalar ile reaksiyona proteinler Self Etiketleme için. Rodamine are parlak ve photostable boya ve böylece yinelenen görüntüleme1için izin verir. Başarılı performans için çeşitli koşullar ve kritik konular akılda tutulması gerek.
<p class="jove_con…The authors have nothing to disclose.
Yazarlar Biyofizik grup ve Jacob Piehler Üniversitesi Osnabrück sürekli desteği, teknik yardım ve malzeme hazırlanması için Wladislaw Kohl ve mikroskoplar kullanmak için sağlamak için CellNanOs yönetim kurulu için teşekkür etmek istiyorum. Proje SFB 944 tarafından finanse edildi.
(2-(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethanesulfonic acid, 1 M) (HEPES) | Biochrom | #1104E | |
DC1: Dichroid beam splitter | Chroma | 640 dcxr | NC506031 |
DC2: Polychroic Mirror, beamsplitter | Chroma | zt405/488/561/640rpc | discontinued |
Dulbecco´s Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1x (w/o Ca & Mg) | Sigma-Aldrich & Co. | #RNBF8311 | |
Earle´s MEM without phenol red, without L-Glutamine and without NaHCO3 containing 1% FBS, 0.1% HEPES, 0.1% NEAA, 0.1% Alanyl-L-Glutamine and 34.78% sodium hydrogen carbonate (NaHCO3 0.75g/l) | Imaging medium | ||
Earle´s minimum essential medium (MEM) with phenol red, containing 1% Fetal Bovine Serum Superior (FBS), 0.1% HEPES (2-(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethanesulfonic acid, 1 M), and 0.1% non-essential amino acids (NEAA) | Growth medium | ||
EF: Emission filter quadbandpass | AHF analysentechnik | F72-866 | Brightline HC 446 nm/523 nm/600 nm/677 nm |
EMCCD camera | Andor | Andor iXON 897 | EMCCD camera |
Emission filter QuadView filter cubes, orange | AHF analysentechnik | F39-637 | bandpass 582 – 619 nm |
Emission filter QuadView filter cubes, red | Chroma | bandpass 655 – 725 nm (HQ 690/70) | |
FBS (Fetal bovine serum) superior | Biochrom | S0615 | |
Fluorescent beads: TetraSpeck™ Microspheres, 0.1 µm, fluorescent blue/green/orange/dark red | Thermo Fisher Scientific | T7279 | fluorescent microspheres |
Glutamine | Biochrom | #0951C | |
HeLa cells | DSMZ | ACC-57 | Cervical carcinoma cells from patient Henrietta Lacks |
Hela cells CI::paGFP, stable | Muster et al., PLOSOne 2010 | ||
Hela cells CV g::Halo7-Tag, stable | Appelhans et al., NanoLett 2012 | ||
Hela cells Tom20::Halo7-Tag, stable | Appelhans et al., NanoLett 2012 | ||
Image splitter | Photometrics | Dual-View QV2 | image splitter emission |
Imaging processing software | ImageJ2 / Fiji | freeware | |
Immersion Oil – ImmersolTM 518 F (ne = 1.518, ve = 45) | Carl Zeiss Jena GmbH | 444960-0000-000 | |
Inverted epifluorescence microscope | Olympus IX-71/73/83 | ||
Laser 561 nm, 200 mW | CrystaLaser | CL-561-200 | 561 nm emission |
Laser 642 nm, 140 mW | Omicron | Luxx-642-140 | 642 nm emission |
MATLAB | MathWorks | version R2013a | |
MEM with Earle's Balanced Salt Solution 2.2 g/L NaHCO3, stable glutamine w/o PR | Biochrom | FG-0385 | |
MEM with Earle's Balanced Salt Solution with 2.2 g/L NaHCO3, stable glutamine, Phenolred | Biochrom | FG-0325 | |
MitoTracker® Deep Red FM | Thermo Fisher Scientific | M22426 | dye |
MitoTracker® Green FM | Thermo Fisher Scientific | M7514 | dye |
Multi-mode-optical polarization maintaining monomode fiber | Pointsource/Qioptiq | KineFLEX | |
NHS-PEG-MAL, Rapp Polymer | Rapp Polymere GmbH Tübingen | coverslip coating | |
non-essential amino acids (NEAA) | Biochrom | #0802E | |
PEG 800 (Polyethylene glycol) 10 % | Carl Roth GmbH | Art No. 0263.1 | coverslip coating |
Penicillin/Streptomycin | Biochrom | #0122E | |
Plasmid for PINK1-Halo7-Tag expression | Beinlich et al., ACS Chemical Biology 2015 | ||
Poly-L-lysine (1.2 mg/ml) | Sigma-Aldrich & Co. | Cat. No.P9155 | coverslip coating |
RGD Peptide (Ac-CGRGDS-COOH) | Coring System Diagnostix GmbH, Gernsheim | coverslip coating / Intergrin receptor motif | |
Silicon Rhodamine linked to HaloTag®-Ligand (SiRHTL) | personal gift from Kai Johnson | dye | |
Software analysis plugin | self-written C. P. Richter, Biophysik Osnabrück | SLIMFAST 16g | |
Tetramethylrhodamine / SNAP-Cell® TMR-Star linked to SNAP-Ligand (TMRstar) | New England Biolab® | S9105S | dye |
Tetramethylrhodamine linked to HaloTag®-Ligand (TMRHTL) | Promega | G8251 | dye |
TIRF condensor | Olympus | Cell^TIRF MITICO System | TIRF condensor |
TIRF microscope controlling software | Olympus cellSens 1.12 | ||
TIRF objective | Olympus | 150x oil objective (N.A. 1.45; Olympus UAPO) | |
Trypsin/EDTA 10x | Biochrom | #0266 | |
Water H2O 99,5 % Rotipuran® Low organic | Carl Roth GmbH | Art. No. HN57.1 |