Summary
여기, 우리는 무대와 초파리 종에서 후 각 조직 개발 해 부 프로토콜을 제시. 있으 나 해 부 조직 immunohistochemistry 또는 제자리에서 같은 비보에 분석 뿐만 아니라 양적 RT-PCR (반전 전사-연쇄 반응) 또는 시퀀싱 (RNAseq), RNA와 같은 분자 분석에 대 한 나중에 사용할 수 있습니다. 교 잡입니다.
Abstract
초파리 의 후 각 시스템 발달 신경 생물학, 시스템 신경 과학으로 신경 생리학, 행동과 행동 진화에 널리 사용 되는 시스템이입니다. 초파리 의 후 각 조직 집 수압 및 온도 감각 신경 이외에 휘발성 화학 신호를 감지 하는 후 각 수용 체 신경 (ORNs). 이 프로토콜에서 우리는 성인 초파리 종의 주변 후 각 조직 개발의 해 부를 설명 합니다. 우리는 처음 무대 초파리 애벌레, 중순에 번데기 단계와 성인에서 안테나의 해 부에 의해 따라 초기 번데기 단계에서 더듬이 디스크의 해 부를 이어서 나이 하는 방법을 설명 합니다. 우리는 또한 어디 준비 qRT-PCR, RNAseq, 또는 immunohistochemistry RNA 추출 등 분자 기법에 활용할 수 있는 방법을 보여줍니다. 이러한 방법은 적용할 수 있습니다 또한 다른 초파리 종 종의 번데기 개발 시간, 결정 하 고 각 단계는 적절 한 노화에 대 한 계산 됩니다.
Introduction
발달 신경 생물학, 시스템 신경 과학으로 신경 생리학, 행동 연구, 그리고 행동 진화1,2,3, 초파리 의 후 각 시스템은 널리 사용 되는 시스템 4. 초파리 의 후 각 조직 집 수압 및 온도 감각 신경1,,56외 휘발성 화학 신호를 감지 하는 후 각 수용 체 신경 (ORNs). 이 원고의 전반적인 목표는 무대 초파리 종의 번데기 및 성인 후 각 조직 개발 해 부 하는 방법을 보여 줍니다. 이 기술에 대 한 근거 또한 vivo에서 조직 기술 라벨 샘플 RNAseq 등 정량적 RT-PCR, 주변 후 각 시스템의 분자 및 발달 분석에 대 한 다른 번데기 단계에서 생성 하는 . 이 기술은 특정 세포 유형에 대 한 모든 유전자 변형 시 약 하지 않은 비-초파리 melanogaster 종 개발 성인 후 각 시스템에 transcriptional 프로필의 역학을 식별 하기 위해 특히 유용할 수 있습니다. 표시 하 고 분석입니다. 이 원고, 더듬이 디스크와 번데기 및 성인 초파리 종에서 안테나를 해 부하는 방법을 보여 줍니다. 첫째, 우리 개발 준비 및 종의 노화에 대 한 puparium 형성 (APF, 흰색 pupae 또는 prepupae)의 0 h 초파리 를 식별 하는 방법을 보여 줍니다. 다음, 우리에 게 보여 더듬이 디스크와 제 3 더듬이 세그먼트; 해 부 특히, 눈 디스크 및 RNAseq 또는 RT PCRs에 필요한 조직 순도 대 한 두 번째 더듬이 세그먼트에서 그들을 분리 하는 방법. 미리 무늬 더듬이 디스크 (prepupae)에 해당 하는 단계 D. melanogaster 약이 프로토콜에서 설명에서 일어나는 더듬이에서 선택 디스크 (8 h APF), ORNs (40 h APF)에 대 한 터미널 차별화의 시작 하 고 성인 안테나입니다. 마지막으로, 우리 성인 안테나 메서드를 사용 하 여 고립에서 그리고 vivo에서 immunohistochemistry 양적 RT-PCR에 대 한 예제는 줄. 이 메서드는 RNA/DNA 분석 및 immunohistochemistry 초파리 종에서 주변 후 각 조직 개발에 대 한 샘플을 생성 하기 위해 사용할 수 있습니다.
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Protocol
다음 프로토콜은 듀크 대학 연구 윤리 위원회에 의해 설립 된 윤리 지침과 일치.
1. 조직 준비와 초파리 melanogaster 번데기의 개발 준비
- 첫째, 얼마나 많은 파리 해 부 할 것입니다 확인 합니다. RT-PCR 및 RNAseq, prepupal, 8 h APF, 40 h APF, 및 성인 단계에서 필요한는 개인에서 100-200 더듬이 디스크와 안테나를 수집 합니다. Immunohistochemistry, 10-20 개인을 해 부.
- 해 부 패드와 집게, 물티슈를 사용 하 여 70%를 포함 하 여 모든 물자를 청소 EtOH. 해 부 물자는 RNA 추출에 사용할 수, RNase neutralizers와 모든 것을 깨끗이 nuclease 무료 사용 하는 모든 솔루션을 경우 diethyl pyrocarbonate (DEPC) 물 처리.
참고:이 프로토콜은 해에 대 한 유리 대신 실리콘 해 부 패드 사용합니다. 실리콘 패드 초 미세 집게를 친절 하 고 신속 하 고 높은 품질의 해를 홍보. - 0 h APF/prepupal 단계에서 번데기를 수집 합니다.
- 가장 정확한 준비 되도록 30 분 1 시간 간격에서 애벌레를 모니터링 합니다.
참고: 적당히 붐비는 병에서 방황 하 고 세 번째 탈피 애벌레 몇 시간 pupate 가능성이 것입니다. - 일단 애벌레 움직이지 되 고 매우 가벼운 (거의 흰색) 색된 번데기 케이스에 의해 포위 된다는 작은 2-페 트리 접시에 촉촉한 필터 종이 그들을 전송.
- 1-2 h, 때때로 모니터링, 확인, 및 prepupae 전송에 대 한 계속.
참고: 또는 모든 pupae의 병을 취소 하 고 2 시간에 대 한 개발에 애벌레를 허용. 모든 pupae 수집 후 2 h 0-2 h APF 범위 안에 있을 것입니다.
- 가장 정확한 준비 되도록 30 분 1 시간 간격에서 애벌레를 모니터링 합니다.
- 즉시 prepupal 더듬이 디스크 0 h APF 무대에 대 한 해 부 3.1 단계로 이동 합니다. prepupa 세 수 하는 경우, 접시에 그들을 수집, 접시 커버와 건조, 억제 하기 위해 가장자리 주위 파라핀 영화 놓고 25 ° c.에 페 트리 접시를 놓고
참고: 번데기 이제 일수로 하 세 수 있습니다. - 2 h 범위에서 수집 하는 번데기에 대 한 번데기 하지 할 수 있도록 원하는 나이 보다는 더 적은 2 시간에 대 한 prepupae을 나이 없 더군요.
- 아주 작고 연약한 조직으로 초 미세 집게 (Dumont 55)를 사용 합니다.
2. 조직 준비 및 다른 초파리 종에서 번데기의 개발 준비
- 다른 초파리 종의 번데기 개발의 길이 확인 하려면 샘플 최적의 온도에서 prepupae은 관찰 날짜를 기록, 신선한 유리병으로 그들을 정렬 놓고 성인 기에 prepupa에서 일 수를 기록 합니다.
- 시간 번데기 개발에 대 한 비-melanogaster 종 melanogaster의 비율을 기록 합니다. Melanogaster 준비에 대 한 비-melanogaster 종 나이에 시간 수를 사용 하는 시간의 수에 의해 개발 시간의 비율을 곱하면 됩니다.
3. D. melanogaster 번데기 더듬이 디스크의 해 부
참고: 모든 노화 시간 및 해 부 프로토콜 설명에 대 한 초파리 melanogaster. 위에서 설명한 대로 다른 모든 종족에 대 한 종의 발달 시간 포인트에 따라 노화 프로토콜의 필요 있을 것입니다.
- 번데기 더듬이 디스크 해에 대 한 50-100 0-2 h 또는 주걱을 사용 하 여 6-8 h 오래 된 번데기를 수집 하 고 해 부 패드에 그들을 배치.
- 무료 1.5 mL microfuge 200 µ L 피 펫을 사용 하 여 튜브와 튜브를 얼음 위에 RNase에 RNA 격리 솔루션의 150 µ L 플라스틱.
- 1 x PBS (인산 염 버퍼 식 염 수, nuclease 무료)의 150-200 µ L에 번데기를 해 부. 해 부 패드에 PBS (방울 당 150-200 µ L)의 여러 방울을 배치 합니다.
- 해 부 패드에서 PBS 방울 x 1 중에서 해 부 수를 0-2 h 또는 세 6-8 h 번데기 (한 번데기 드롭 당)을 놓습니다. 한 손에 집게를 사용 하 여 신체를 안정.
- 0-2 h pupae를 사용 하 여 다른 손에 잡고 집게에는 prepupa의 가장 앞쪽 부분 (입 고리)를 세 고 두뇌와 앞쪽 번데기 케이스에 부착 된 imaginal 디스크를 밖으로 당겨.
- 8 h APF pupae에 대 한 먼저 부드럽게 껍질 번데기, 시체를 둘러싸는 막 자루 내 머리를 노출의 가장 앞쪽 분기에서 번데기 케이스에서.
참고: 몸,이 단계에서 처럼 보인다 악화 애벌레. - 목 관절에서 머리를 제거 합니다.
참고: 이렇게 하면 더듬이 디스크 손실 되지 것입니다이 단계에는 주로 뇌의 시 돌출부에 연결 되어. - 두뇌와 imaginal 디스크 조직을 다른 1x PBS 방울 집게 또는 20 µ L 피 펫을 사용 하 여 전송.
- 광 엽에서 뇌에 연결 된 눈 더듬이 디스크를 식별 합니다. 집게를 사용 하 여, 두뇌와 번데기 케이스에서 눈 더듬이 디스크를 분리 합니다. PBS 방울 집게 또는 20 µ L 피 펫을 사용 하 여 x 새 1에 그것을 전송.
참고: prepupal 눈 더듬이 디스크는 평평한 조직 이다. 그러나, 8 h pupae로 눈 디스크는 회전 컵 더듬이 디스크는 중앙 뇌 앞쪽에 앉아. - 집게를 사용 하 여 눈과 더듬이 디스크 사이의 연결의 사이트에서 조직을 잘라. 20 µ L 피 펫을 사용 하 여 부드럽게 RNA 격리 솔루션 시 약으로 해 부 조직을 전송. 가능한 금액 pipetting으로 전송 하는 액체의 양을 최소화 합니다.
- 모든 pupae 해 부 될 때까지 반복 합니다.
4. D. melanogaster 중반-번데기 및 성인 안테나의 해 부
참고: 40 h APF, 대부분의 변 태 완료 되 면, 그리고 성인 구조, 명백한 되고있다 하지만 여전히 흰색 하 고 표현할 수 있다. 이 개발 시간이 시점에서 성인 안테나는 그것의 마지막 모양 아직 여전히 투명은 고 몇을 제외한 후 각 수용 체의 대부분 식 시작 하지 않았습니다.
- 번데기 더듬이 해에 대 한 1 단계에서 설명한 대로 50-100 prepupae를 수집 하 고 40 h 25 ° c.에 대 한 그들을 나이
- 피펫으로 150 µ L RNase 무료 1.5 mL microcentrifuge에 RNA 격리 솔루션의 200 µ L 피펫으로 사용 하 여 튜브와 튜브를 얼음 위에.
- 해 부 패드에서 PBS 방울 x 1의 하나로 해 부에 번데기를 놓습니다. 한 손에 집게를 사용 하 여 신체를 안정. 번데기는 시체를 둘러싸는 막 자루 내 머리를 노출의 가장 앞쪽 분기에서 번데기 케이스 벗기다 집게를 사용 하 여 다른 손에서 부드럽게.
- 집게를 사용 하 여, 조심 스럽게 잘라 번데기 시체의 나머지 부분에서 머리 집게의 1 세트를 가진 시체를 벗는 머리 목에 집게의 또 다른 세트와 함께 공동 하 여. 부드럽게 PBS 방울 집게를 사용 하 여 다른 1x로 머리를 전송 합니다. 머리 (뇌, 등)를 분명 막 개발 초파리 머리를 포위 하는 데 사용의 내용을 밖으로 청소를 위아래로 플라스틱.
참고: 40-50 h APF, 안테나 막의 앞쪽 대부분 섹션에 연결 됩니다. 그들은 머리의 내용을 pipetting으로 지워집니다 때 해 부에 대 한 명백한 될 것입니다. - 집게를 사용 하 여 막에서 번데기 안테나를 분리 합니다. 3에서 안테나의 2nd 세그먼트를 분리rd 3rd 세그먼트만 후 각 수용 체 신경 세포를 들어설 예정으로 단편 관절에서 슬라이스를 집게를 사용 하 여.
- 20 µ L 피 펫을 사용 하 여 부드럽게 RNA 격리 솔루션 시 약으로 해 부 조직을 전송. 가능한 금액 pipetting으로 전송 하는 액체의 양을 최소화 합니다. 모든 pupae 해 부 될 때까지 반복 합니다.
- 성인 더듬이 해 약 50 성인 수집 및 주 후 일수로 대 한 그들을 나이.
참고: 후 각 수용 체 유전자의 표현과 다른 유전자 일수로 후 주 피크. 어른은 생물학으로 관련 유전자 검출 임계값 이상 상승 낮은 풍부 증명서를 위해 1 주일에 대 한 세. - RNA 추출에 대 한 그들은 CO2 패드에 아직도 살아 있는 동안 파리의 해 부. RNase 억제제와 CO2 패드를 취급 합니다. Confocal 영상에 대 한 해 부 해 부 패드 PBS 또는 PBS + 0.2% x 1에서에 파리 트리톤.
- 첫째, 성인 절 개 범위에서 CO2 역 패드에 잘 넣어. 신체를 안정 시키기 위해 한 손에 집게를 사용 하 여 CO2 역 패드, 다른 한편에서 포 셉을 사용 하 여 두 번째에서 세 번째 더듬이 세그먼트 밖으로 부드럽게 당겨/핀치에.
- 집게를 사용 하 여 액체에 직접 안테나를 배치 하는 RNA 격리 솔루션에 안테나를 전송 합니다. 모든 성인 해 부 될 때까지 반복 합니다.
주: 안테나 RNA 격리 솔루션에 잠긴 것을 확인 하십시오. 안테나는 튜브의 측면에 갇혀 될 수 있습니다. 이 RNA 품질 및 수량 감소는 RNA의 증가 저하가 될 수 있습니다. - 직접 RNA 추출을 진행 하거나 장기 저장을 위한-80 ° C에서 튜브를 놓습니다.
5. RNA 격리 해 부 조직에서
- -80 ° C 저장소에서 모든 샘플을 제거 하 고 얼음에 녹여.
- 짧게 스핀 (5-6 s, ~ 6000 x g) 튜브의 하단에 있는 자료를 수집 하는 각 샘플.
- 10는 압력가 플라스틱 유 봉과 전기 모터를 사용 하 여 각 샘플을 갈아 얼음에 s.
- 5.2와 5.3 4 단계를 반복 합니다.
- RNA 추출 상용 키트를 사용 하 고 최적의 생산량에 대 한 제조 업체의 프로토콜을 다음을 수행 합니다.
- QRT-PCR 상용 시 약 및 제조 업체의 프로토콜에 따라 관심의 유전자에 대 한 특정 뇌관을 사용 하 여 수행 합니다.
- 다음과 같은 조건을 사용 하 여 모든 PCR 반응을 수행: 10 분 동안 95 ° C 변성 뒤 15 95 ° C의 40 주기 s, 55 ° C 30에 대 한 s, 그리고 60 ° C 30에 대 한 s.
참고: 딥 및 dpr 유전자를 위해 뇌관 쌍 표 1에 나열 된 및 Hueston CE 외 에 후 각 수용 체 유전자를 위한 뇌관 나열 8.
- 다음과 같은 조건을 사용 하 여 모든 PCR 반응을 수행: 10 분 동안 95 ° C 변성 뒤 15 95 ° C의 40 주기 s, 55 ° C 30에 대 한 s, 그리고 60 ° C 30에 대 한 s.
6. 번데기 더듬이 디스크와 Immunohistochemistry에 대 한 안테나의 고정
참고: 시간이 같은 금액에 대 한 조직 고정 되도록 10-20 개인 배치 조직 수정 했다. 샘플 조직의 무결성을 최대화 하기 위해 정착 액에 그들을 전송 하기 전에 PBT (세제 PBS)에 체류 하는 시간을 최소화 합니다.
- 수집 해 부 더듬이 디스크 또는 0.2%의 200 µ L을 포함 하는 200 µ L PCR 튜브에 번데기 안테나 조직의 무결성을 유지 하 고 200 µ L PCR의 벽에 튀어나와에서 샘플을 피하기 위해 얼음에 PBT 튜브는 불완전 한 고정으로 이어질 것입니다 합니다.
참고: 번데기 안테나 및 더듬이 디스크 어려울 수 있습니다 그들은 꽤 반투명으로 보고입니다. 그것은 조직의 모든 손실을 방지 하기 위해 모든 세척 단계에 대 한 절 개 범위를 사용 하는 것이 좋습니다. 또는, 96-잘 Terasaki 플레이트 고정에 대 한 사용 하 고 최고의 조직을 추적 얼룩 있을 수 있습니다. - 4%의 약 200 µ L에 번데기에서 수정 해 부 더듬이 디스크와 더듬이 샘플 PFA (Paraformaldehyde) 실 온에서 30 분. 이 고 후속 단계를 제대로 믹스 솔루션에서 샘플을 nutator에 샘플 튜브를 유지. 6.7 단계로 진행입니다.
- 성인 안테나에 대 한 전체 머리를 처음 해 부하 고 4%의 약 200 µ L에서 수정 PFA (paraformaldehyde) 실 온에서 1 h.
- 씻어 0.2%의 200 µ L 3 x PBT 10 분. 인큐베이션 기간 동안에 nutator 샘플을 유지.
- 고정 헤드에서 두 번째 더듬이 세그먼트의 미세한 절 개에 대 한 해 부 현미경을 다시 이동 합니다. 집게를 사용 하 여 머리를 안정, 두 번째에서 세 번째 더듬이 세그먼트 밖으로 부드럽게 당겨/핀치.
- 4%의 약 200 µ L로 해 부 제 3 더듬이 세그먼트를 전송 PFA (paraformaldehyde) 실 온에서 30 분 동안 그들을 수정 하 고.
- 씻어 0.2%의 200 µ L 3 x PBT 10 분. 인큐베이션 기간 동안에 nutator 샘플을 유지.
- 4 ° C에서 샘플을 저장 하거나 전체 마운트 immunohistochemistry 직접 계속.
참고: 얼룩의 효율성 항 체 사용 되 고 변경할 수 있습니다. 이 메서드는 풍부한 단백질 태그 덜 적합 또는 약한 항 체 이어야 한다. 그러나, 때때로, 그것은 프로토콜 (정체성 또는 정착 액의 금액 또는 고정 시간)의 최적화가 필요할 수 있습니다.
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Representative Results
해 부 개발 후 각 조직의 RNA 추출 뒤에 RT-PCR 유전자 발현을 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. 또는 immunohistochemistry 프로토콜을 통해 식이 패턴, 그리고 하위 세포질 유전자의 지역화를 확인 하기 위해 취할 수 있습니다. 관심입니다. 이 섹션에서 우리는 어느 프로토콜에서 대표적인 결과 제시. 그림 1 은 대표적인 양적 RT-PCR 야생-타입 성인 안테나에 세포 표면 수용 체와 후 각 수용 체 유전자의 전사를 보여주는. 그림 2 는 6-8 h 고 Rn EGFP 유전자 변형에 12 h APF 더듬이 디스크 stainings를 사용 하 여 안티-GFP (1:1000)와 안티 lamin 항 체 (1: 100) (그림 2A 와 2B). Rn EGFP 초기 번데기 단계 동안 더듬이 디스크 내의 특정 영역을 라벨. 우리는 또한 40 h APF 번데기 더듬이 안티-GFP 항 체 얼룩이 UAS-CD8GFP Or67d-GAL4 유전자 변형 파리, 그리고 성인 더듬이 안티-elav (1: 100) ORNs (그림 2)의 얼룩이 지는 항 체를 보여줍니다. 다른 예제는 또한 문학7,8,,910에서 찾을 수 있습니다.
그림 1 . 야생-타입 성인 더듬이 RNA의 샘플에서 다른 유전자에 대 한 양적 RT-PCR. 이 패널 (A)에 대 한 양적 RT-PCR 결과 보기 딥-알파, 딥-eta, dpr5, dpr8, 국선, beatIIIb (뇌관 쌍 참조 표 1), 그리고 (B) 후 각 및 ionotropic 수용 체 (또는 / Ir) 성인에서 유전자 더듬이 RNA 샘플. 오차 막대 표시 표준 오차 (SEM)의. 또는 / Ir 유전자는 낮은 풍부 RNAs qRT-PCR에 의해 아직도 검출 될 수 있는. 각 유전자의 표현 3 중에서 분석 했다. Ct 값은 각 유전자에 대 한 만든 표준 곡선에 따라 각 유전자에 대 한 희석 요소를 계산 하기 위해 사용 되었다. 희석 요인 측정8전에 설명한 대로 모든 유전자의 평균 식에 각 유전자에 대 한 다음 정규화 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 . 다른 항 체를 사용 하 여 개발 후 각 조직에 Immunohistochemistry. 이러한 패널 표시 안티-GFP (녹색)와 안티 lamin (레드) (A) 6 h APF 번데기 더듬이 디스크와 (B항 체 stainings) 12 h APF 번데기 더듬이 디스크. (C)이이 패널 안테나 Or67d GAL4 UAS-CD8GFP 제 닉에서 토끼와 안티-GFP (녹색) 항 체 얼룩이 40 h APF 보여줍니다. (D)이이 패널 어떤 라벨 Or47b-c d 2를 긍정적인 ORNs (마젠타) 안티-c d 2 항 체로 얼룩진 성인 안테나를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 앞으로 뇌관 | 반전 뇌관 | 길이 |
| CGGAGAGGAGGTTATGAGCA | GGAAGTGCACAACTAGCGTT | 143 |
| CGCGAATCGTTGTGTCAGTA | TGTCGATAGCGTGAACCTGA | 129 |
| AGGAGTGGACGTTGAGTTACA | CAATCATGTCCTCGTGACCG | 146 |
| TAGAGTCCGAGCAGCAGATG | GTCAGAATTCGAGTTGTCCGC | 104 |
| GGCGCTAAGTAGCAGGACG | GGCCAAGTCTGTTTGTGAGG | 215 |
| TAAGACCCTAGCGCCCTCTT | AGGGAGATGCGCTTTGAGAC | 129 |
표 1입니다. QRT-PCR에 사용 되는 PCR 뇌관의 목록입니다.
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Discussion
이 프로토콜은 실험실 초파리 에 걸쳐이 프로그램의 비교 분석으로 초파리 의 후 각 조직 개발에서 유전과 transcriptional 프로그램을 식별 하는 데 관심이 대 한 유용한 리소스 종입니다. 다른 발달 단계에서 시스템 수준 transcriptional 프로필 미래 연구를 위한 뇌관으로 필요한 경우 특히 유용 합니다. 여기에 설명 된 프로토콜 단계 및 개발에 사용 될 터미널 차별화를 모방 하는 사전에서 후 각 시스템 개발의 4 가지 핵심 단계에서 샘플을 얻기 위해 초파리 에서 후 각 조직 분리 하는 방법을 보여 줍니다. 분자 및 면역 조직학 연구입니다. 초파리 해 부 더듬이 디스크와 다른 번데기 단계에서 안테나 양적 RT-PCR에 의해 RNA-seq 하 여 시스템 수준에서 또는 개별 유전자의 수준에 후 각 시스템 개발 중 유전자 식 프로필을 식별 하기 위해 사용할 수 있습니다. 샘플 조직-특정 유전자 발현의 vivo에서 패턴을 식별 하 immunohistochemistry와 제자리에서 교 잡에 대 한 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜의 추가적인 이점은 표준 방법을 사용 하 여 천연 및 포워드 액티브 셀 형식 관련 분자 분석, 순화 된 세포 인구 (또는 단일 셀)를 같이 얻을 정렬 해 부 샘플에 추가 수은 정량 RT-PCR 또는 RNAseq입니다.
프로토콜 더듬이 디스크와 (0 h/prepupa에서 8 h 40 h APF) 번데기에서 안테나 및 성인 단계 해 보여, 비록 다른 번데기 시간 포인트를 적용할 수 있습니다. 그것은 또한이 해를 학습 시간과 연습이 필요 언급 가치입니다. 전문가 한 시간 50 샘플을 해 부를 수 있어야 합니다. 그건 중요 하지 넘는 번데기. 따라서, 해 부, 시작 하기 전에 한 시간 더 pupae 원하는 시대 보다 오래 된 인지 확인 합니다. 그래서 각 단계에 대 한 연습 기간은 실험을 시작 하기 전에 요구 해, 배우는 시간을 걸릴 수 있습니다. ╂ 형태학 변화 9-12 h APF에서에서 어렵게 될. 연령별 pupae 정렬 수 (체 색, 오래 되 고 어두운 색상)에 의해 prepupae를 수집 하는 때. 처음 prepupae를 정렬 overaging를 방지 하기 위해 나이의 순서 대로 해 부에 대 한 수 있습니다.
위에서 설명한 프로토콜 다른 초파리 종에 적용할 수 있습니다. 다른 종의 번데기 해에 대 한 타이밍 근거 할 수 있다 D. melanogaster 에 25 ° C에서 주어진 종의 번데기 개발의 비율에 및 안테나/더듬이 디스크 형태학의 비교 관찰에 모두 해, 시와 가능한 동일한 것으로 형태학 고려 주어진 우선 순위입니다. 초파리 melanogaster, 번데기 단계 약 4 일 소요. D. sechellia 와 D. erecta 번데기 발달 준비 D. melanogaster; 와 비슷합니다. 그러나, 디 virilis 번데기 개발 더 이상11,12x 1.3 이다. 다른 종 절 개에 대 한 준비가 때 가장 높은 우선 순위가 되 고 형태학 적 유사성과 준비 번데기 기간 타이밍 및 무대 관련 안테나/더듬이 디스크 형태학의 비교 관찰에 근거 한다. 첫째, 최적 온도에 관심이 있다면 종족에 대 한 처리를 식별 합니다. 많은 종 25 ° C에서 잘 성장 하지만 UC 샌디에고 초파리 종 재고 센터에서 유지 관리 조건에 대 한 자세한 정보를 얻을 수 있습니다.
프로토콜의 가장 중요 한 단계는 올바른 준비 및 다른 종에서 적절 한 숫자에 관심의 조직의 적절 한 해 부. 이 자리에는, 일단 프로토콜 같은 분석에 대 한 조직의 컬렉션의 효율적인 방법을 제공 한다 고 어떤 초파리 종의 번데기 단계 동안 실질적으로 어떤 개발 imaginal 디스크 조직에 적용할 수 있습니다.
이 프로토콜의 한계가 셀 형식 관련 샘플을 제공 하지 않는다는 것 이다. 세포질 기능 및 형태에 대 한 자세한 이해 셀을 형식별 immunohistochemistry 양적 RT-PCR 등 분자 표준 절차 뿐 아니라 시스템 수준에서 전사의 프로 파일링이 필요 합니다. 셀 형식 관련 프로 파일링 어려운 되었습니다, 특히 비-melanogaster 종에서 셀 형식 관련 기자 제 닉의 부족을 부여. 셀룰러 프로 파일링은 현재 발전, 제 닉, 그리고 CRISPR Cas9 중재 게놈 비-melanogaster 종에서 편집, 라벨 전사13프로 파일링에 대 한 관심의 단일 세포 밖으로 정렬 하는 지금.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 연구는 즐겼다 C. 볼 칸 (뎁-1457690)에 국립 과학 재단에서 교부 금에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X Phosphate-buffered Saline | Gibco | 70011-044 | Dilute to 1X in RNase free water |
| CO2 tank | Air Gas | CD R200 | |
| Two sharp forceps (Dumont #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-026 | RNA isolation solutions |
| Dissecting Microscope | |||
| Small bucket with ice | |||
| P20 and P200 micropipettes and tips | |||
| 1.7 mL Microfuge tubes | Purchase nuclease free for best results | ||
| 0.2 mL PCR tubes | |||
| Paraformaldehyde powder | Polysciences | 380 | |
| 10% Triton X-100 | Teknova | T1105 | Dilute to 0.2% v/v in 1X PBS |
| 2" petri dishes | |||
| 55mm filter paper | Whatman | 1001-055 | Wet with water and place in a petri dish to keep pupae moist |
| 25 C incubator | |||
| deionized H2O | Purchase nuclease free or treat with DEPC | ||
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | to be used for making dissection pads from Terizaki plate covers. | |
| MicroWell Mini Trays with lids | Nunc | 438733 | Lids can be used to make silicone dissection pads |
| Rabbit anti-GFP antibody | MBL international corpor | PM005 | primary antibody |
| Mouse anti RAT CD2 | AbD seroTec | MCA154RHDL | primary antibody |
| ADL195 (anti lamin, mouse) | Dev studies hydoma ban | ADL195-s | primary antibody |
| Alexa Fluor® 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | invitrogen | A11008 | Secondary antibody |
| Cy3 Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-166-003 | Secondary antibody |
| Triton X-100, Protein Grade Detergent, 10% Solution, Sterile-Filtered | CALBIOCHEM | 648463 | detergent |
| Lab Rotator | Thermo scientific | Rotator | |
| Nuclease Free Water | Growcells.com | NUPW-0125 | Water |
| Light-Duty Tissue Wipers | VWR | 82003-822 | For cleaning dissection supplies |
| Superscript II | invitrogen | 18064014 | Reverse Transcriptase |
| QIAshredder (50) | RNA extraction | QIAGEN | 79654 |
| Oligo(dT)12-18 Primer | RT | life technologies | 18418012 |
| RNeasy MinElute Cleanup Kit (50) | RNA extraction | QIAGEN | 74204 |
| FASTSTART UNIV SG MASTER (5 ML)(500 RXN) | qPCR | Roche | 04913850001 |
| FASTSTART ESSENTIAL GREEN DNA MASTER | qPCR | Roche | 06402712001 |
| LIGHTCYCLER 480 - MULTIWELL PLATE 96 | qPCR | Roche | 04729692001 |
| NEBNext High-Fidelity 2X PCR Master Mix | qPCR | NEB | M0541S |
References
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