蛋白质和蛋白质代谢物相互作用对所有细胞功能都至关重要。在这里, 我们描述了一个协议, 允许并行分析这些交互与蛋白质的选择。我们的协议优化了植物细胞培养, 并结合亲和纯化与质谱为基础的蛋白质和代谢物检测。
细胞过程由蛋白质、代谢物和核酸等生物分子之间的相互作用调节。虽然对蛋白质-蛋白质相互作用 (PPI) 的研究并不新奇, 但旨在表征内源性蛋白质代谢物相互作用 (PMI) 的实验方法构成了一个较近期的发展。在此, 我们提出一个协议, 允许同时描述 PPI 和 PMI 的蛋白质的选择, 称为诱饵。我们的协议优化了拟南芥细胞培养, 并结合亲和纯化 (AP) 与质谱 (MS) 为基础的蛋白质和代谢物检测。总之, 转基因拟南芥系, 表达诱饵蛋白融合到亲和标记, 首先裂解获得一个本地的细胞提取物。抗标记抗体是用来拉下蛋白质和代谢物的伙伴的诱饵蛋白。采用一步法甲基叔丁基醚 (MTBE)/甲醇/水法提取亲和纯化复合物。虽然代谢物分离成极性或疏水相, 蛋白质可以在颗粒中找到。然后用超效液相色谱-质谱 (UPLC-ms 或 UPLC-ms) 分析代谢产物和蛋白质。空矢量 (EV) 控制线用于排除误报。我们的协议的主要优点是, 它能够在近生理条件 (细胞裂解物) 中同时识别目标蛋白的蛋白质和代谢物伙伴。所提出的方法是直接的, 快速的, 可以很容易地适应生物系统以外的植物细胞培养。
此处描述的方法旨在确定在体内细胞裂解条件下选择蛋白质的代谢物和蛋白质伙伴。据推测, 今天有许多比特征的代谢物具有重要的调节功能1。代谢物可以充当生物开关, 改变其受体蛋白2、3、4的活动、功能和/或定位。在过去十年中, 已经制定了一些突破性的方法, 能够在体内或近体条件下鉴定 PMI, 已经发展了5。可用方法可分为两组。第一组包括从已知代谢物诱饵开始的技术, 以诱捕新的蛋白质伙伴。方法包括亲和层析6、药物亲和反应靶-稳定性测定7、化疗蛋白质组学8和热蛋白质分析9。第二组由一个单一的方法, 开始与已知的蛋白质, 以确定小分子配体10,11。
采用 AP 结合 MS 为基础的 lipidomics 分析酵母蛋白脂复合物12.作为出发点, 作者使用酵母菌株表达21种酶参与麦角甾醇生物合成和103激酶融合到串联亲和纯化 (自来水) 标签。70% 的酶和20% 的激酶被发现绑定不同的疏水性配体, 脱落光进入复杂的蛋白质-脂质相互作用网络。
以前, 我们可以证明, 类似于脂质, 极性和半极性化合物也仍然绑定到从细胞裂解物13分离的蛋白质复合物。根据这些发现, 我们决定优化以前发表的10、11植物细胞和亲水性化合物14的 AP 方法。为此, 我们使用了 Van Leene等2010 所描述的抽头矢量, 成功地用于植物 PPI 研究15。为了缩短获得转基因品系所需的时间, 我们决定了拟南芥细胞培养。我们使用一步甲基叔丁基醚, (MTBE)/甲醇/水萃取方法, 允许蛋白质 (颗粒), 脂类 (有机相) 和亲水性代谢物 (水相)16在一个单一的亲和纯化实验。EV 控制线被引入, 以排除误报,例如蛋白质绑定到标签单独。作为概念的证明, 我们标记了三 (五) 核苷二磷酸激酶存在于拟南芥基因组 (NDPK1-NDPK3)。在其他发现中, 我们可以证明 NDPK1 与谷胱甘肽S转移酶和谷胱甘肽相互作用。因此, 我们可以证明 NDPK1 受 glutathionylation14。
综上所述, 所提出的协议是描述蛋白质和蛋白质-小分子相互作用网络的重要工具, 是对现有方法的重大进展。
所提出的协议允许平行识别靶蛋白的 PP 和 PM 复合物。从克隆到最终结果, 实验可以在8-12 周内完成。完整 AP 需要大约4-6 小时的12到24个样本, 使我们的协议适用于中吞吐量分析。
尽管该议定书总体上直截了当, 但仍有一些关键步骤。(i) 足够数量的输入蛋白和亲和珠对于达到动态的代谢产物检测至关重要。因此, 有效的细胞裂解是过程中的关键步骤。不良的蛋白质产量可能是由于材料的粉碎不足或次优裂解-缓冲/物质比的结果。(二) 应注意使用的试剂是 MS 友好的。在干扰 MS 检测时, 应避免使用强力洗涤剂、甘油或过量食盐。(iii) 在洗涤步骤中, 琼脂糖珠不应过度干燥, 当使用真空歧管时, 应用慢速流速, 以免破坏珠子或影响复杂的稳定性是很重要的。
对所提出的协议有一些重要的可能的修改: (i) 我们使用本构 CaMV35S 启动子来最大化诱饵蛋白的数量。过度表达虽然非常有用, 但会对细胞稳态28产生严重影响, 导致生理上无关的相互作用的形成。标记蛋白的表达使用本地启动器, 并在可能的功能损失的背景被认为优于检索真正的生物 interactors。对于通常没有在植物细胞培养中表达的蛋白质, 植物的背景可能证明有必要确定相关的 interactors。(ii) 在使用膜蛋白时, 溶解缓冲液需要辅以 MS 兼容洗涤剂。(iii) 引入第二亲和纯化步骤可提高误报率, 并消除对 EV 控制29的需要。一个新的串联标签与两个独立的蛋白酶解的网站提出了一个有吸引力的替代的大小排除色谱步骤添加的 Maeda等201411, 这既费力又费时。
AP 最严重的缺点是误报率高。原因很多。本构表达已被提及。另一种生理上无关的相互作用的来源, 除非与孤立的细胞器, 是制备全细胞裂解物包含蛋白质和代谢物的不同亚细胞间的混合物。亚细胞定位应用于筛选真正的 interactors。然而, 大多数假阳性是由蛋白质和琼脂糖树脂之间不特异的结合引起的。如上文所述, 引入第二个净化步骤提供了解决问题的最佳方法, 但代价是时间和吞吐量。此外, 随着协议的延长, 较弱的交互可能会丢失。AP 的另一个告诫是, 尽管它提供了关于目标蛋白 interactome 的全面信息, 但在诱饵蛋白的直接和间接目标之间进行区分是不可能的。需要有针对性的分子方法来确认交互。
采用 AP 结合 MS 为基础的新陈代谢用于研究12的酵母蛋白复合物.这项工作, 连同我们早先的观察13 , 类似于脂质, 极性和半极性化合物仍然绑定到从细胞裂解物分离的蛋白质复合物, 为提出的议定书提供了概念基础。我们的协议的特点是三独特的点: (i) 与酵母工作12相比, 它表明, AP 是适合检索不仅疏水性, 而且亲水蛋白配体。(ii) 通过引入一个三入一萃取协议, 单一 AP 可以用来研究蛋白和代谢物 interactors 的诱饵蛋白。(iii) 我们修改了该议定书以种植细胞。
未来的努力将集中在创建一个新的串联标签与两个独立的蛋白酶解的网站。我们还想探讨该议定书对低丰度小分子如植物激素的适用性。
The authors have nothing to disclose.
我们谨向 Willmitzer 博士表示感谢, 感谢他参与了该项目, 进行了富有成效的讨论, 并进行了重大监督。我们感谢丹尼尔 Veyel 博士对蛋白质组 MS 测量的帮助。我们感谢Änne 米氏夫人, 他为我们提供了宝贵的技术帮助与 LC MS 测量。此外, 我们还要感谢莫妮卡 Kosmacz 博士和 Ewelina 博士 Sokołowska 对原手稿工作的帮助和参与, 并向维罗尼卡 Jasińska 提供技术支持。
Murashige and Skoog Basal Salts with minimal organics | Sigma-Aldrich | M6899 | |
1-Naphthylacetic acid | Sigma-Aldrich | N1641 | |
Kinetin solution | Sigma-Aldrich | K3253 | |
Tris base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
MgCl2 | Carl Roth | 2189.1 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | 3609 | |
NaF | Sigma-Aldrich | S6776 | |
DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
E-64 protease inhibitor | Sigma-Aldrich | E3132 | |
Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P9599 | |
Na3VO4 | Sigma-Aldrich | S6508 | |
AcTEV Protease | Thermo Fischer Scientific | 12575015 | |
Rotiphorese Gel 30 (37,5:1) | Carl Roth | 3029.2 | |
TEMED | Carl Roth | 2367.3 | |
PageRuler Prestained Protein Ladder | Thermo Fischer Scientific | 26616 | |
SBP Tag Antibody (SB19-C4) | Santa Cruz Biotechnology | sc-101595 | |
Goat anti-mouse IgG-HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | |
Bradford Reagent | Sigma-Aldrich | B6916 | |
Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade | Promega | V5071 | |
Urea | Sigma-Aldrich | U5128 | |
Thiourea | Sigma-Aldrich | T8656 | |
Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I1149 | |
MTBE | Biosolve | 138906 | |
Methanol | Biosolve | 136806 | |
Water | Biosolve | 232106 | |
Acetonitrile | Biosolve | 12006 | |
Trifluoroacetic acid | Biosolve | 202341 | |
Formic acid | Biosolve | 69141 | |
Unimax 2010 Platform Shaker | Heidolph | 5421002000 | |
Nylon Mesh (Wire diameter 34 µM, thickness 55 µM, open area 14%) | Prosepa | Custom order | |
Glass Funnel, 47 mm, 300 ml | Restek | KT953751-0000 | |
Filter Bottle Top 500 mL 0,2 µM Pes St | VWR International GmbH | 514-0340 | |
Mixer Mill MM 400 | Retsch GmbH | 207450001 | |
IgG Sepharose 6 Fast Flow | GE Healthcare Life Sciences | 17-0969-02 | |
Mobicol ""Classic"" with 2 different screw caps without filters | MoBiTec GmbH | M1002 | |
Filter (small) 35 µM pore size, for Mobicol M 1002, M1003, M1050 & M1053 | MoBiTec GmbH | M513515 | |
Variable Speed Tube Rotator SB 3 | Carl Roth | Y550.1 | |
Rotary dishes for rotators SB 3 | Carl Roth | Y555.1 | |
Resprep 24-Port SPE Manifolds | Restek | 26080 | |
Finisterre C18/17% SPE Columns 100mg / 1ml | Teknokroma | TR-F034000 | |
Autosampler Vials | Klaus Trott Chromatographie-Zubehör | 40 11 01 740 | |
Acclaim PepMap 100 C18 LC Column | Thermo Fischer Scientific | 164534 | |
EASY-nLC 1000 Liquid Chromatograph | Thermo Fischer Scientific | LC120 | |
Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer | Thermo Fischer Scientific | IQLAAEGAAPFALGMBDK | |
Acquity UPLC system | Waters | Custom order | |
ACQUITY UPLC HSS C18 Column, 100A, 1.8 µM, 2.1 mM X 100 mM, 1/pkg | Waters | 186003533 | |
High-power ultrasonic cleaning baths for aqueous cleaning solutions | Bandelin | RK 31 | |
Genedata Expressionist | Genedata | NaN | |
Xcalibur Software | Thermo Fischer Scientific | NaN | |
MaxQuant | NaN | NaN |