Summary
Rekombinantes Protein-Engineering Hydrogele sind für 3D Zellkultur von Vorteil, da sie für komplette Einstellbarkeit der Polymer-Rückgrat und sich somit die Zelle Mikroumgebung ermöglichen. Hier beschreiben wir den Prozess der rekombinante Elastin-wie Proteinreinigung und ihre Anwendung in 3D Hydrogel Zelle Kapselung.
Abstract
Zweidimensionale (2D) Gewebekultur Techniken sind wichtig für unser Verständnis der grundlegenden Zelle Biologie gewesen. Jedoch sammelte traditionelle 2D Gewebekultur Systeme fehlen eine dreidimensionale (3D) Matrix, wodurch eine deutliche Trennung zwischen Ergebnisse in Vitro und in Vivo. Um diese Einschränkung zu beheben, haben Forscher 3D Hydrogel Gewebekultur Plattformen entwickelt, die die biochemischen und biophysikalischen Eigenschaften der in Vivo Zelle Mikroumgebung nachahmen kann. Diese Forschung hat die Notwendigkeit, Material Plattformen entwickeln, die 3D Zelle Kapselung und nachgelagerten biochemischen Assays unterstützen motiviert. Rekombinantes Protein-Engineering bietet eine einzigartige Toolset für 3D Hydrogel-Material-Design und Entwicklung, indem Sie für die spezifische Steuerung der Proteinreihenfolge und daher, durch Verlängerung, die möglichen mechanischen und biochemischen Eigenschaften der resultierenden Matrix. Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Expression von rekombinant abgeleitet Elastin-Like Protein (ELP), die Form Hydrogele mit unabhängig einstellbaren mechanischen Eigenschaften und Zelle-Klebstoff-Liganden-Konzentration genutzt werden können. Weiter präsentieren wir eine Methodik für die Zelle Kapselung in ELP Hydrogele und anschließende immunofluorescent Färbung der Zellen für nachgelagerte Analyse und Quantifizierung eingebettet.
Introduction
Im vergangenen Jahrhundert entwickelte zweidimensionale (2D) Gewebekultur zu einer integralen Toolset für die grundlegende Zelle Biologie in-vitro-Untersuchung. Darüber hinaus haben die relativ kostengünstige und einfache Protokolle für 2D Zellkultur zu ihrem Erlass in vielen biologischen und medizinischen Disziplinen geführt. Jedoch hat Forschung gezeigt, dass traditionelle 2D Plattformen zu Ergebnissen führen können, dass deutlich von diesen gesammelten in Vivoabweichen, wodurch wertvolle Zeit und Mittel für klinisch orientierte Forschung1,2verschwendet, 3. Wir und andere stellen die Hypothese auf, dass diese Diskrepanz zugeschrieben werden kann, auf den Mangel an einheimischen biochemischen und biophysikalischen Hinweise bereitgestellt, um die Zellen kultiviert auf 2D Oberflächen, die für optimale Vermehrung und Reifung der verschiedenen Zelltypen erforderlich sein können.
Um diese Einschränkungen und Hilfe Brücke die Lücke zwischen 2D anzugehen haben in Vitro und in Vivo Studien, Forscher entwickelten dreidimensionalen (3D) Hydrogel Plattformen für Zelle-Kapselung1,4,5 ,6. Hydrogele sind ideale Materialien zu rekapitulieren die endogenen Mikroumgebung von der extrazellulären Matrix (ECM) in Vivo aufgrund ihrer Gewebe-ähnliche mechanische Eigenschaften und Wasser geschwollen Struktur, schnellen Transport von Nährstoffen und Signalisierung Faktoren7,8. Darüber hinaus können 3D Hydrogele sollen unabhängige Kontrolle der mechanischen und biochemischen Eigenschaften des Gerüstes zu haben. Matrix Mechanik9,10,11,12 und Zelle-Klebstoff Liganden13,14,15 sind bekannte Zelle beeinflussen Verhalten in Vitro und in-vivo. So bieten 3D Hydrogele mit einstellbaren Eigenschaften eine Plattform, um kausale Zusammenhänge zwischen Zellen und ihrer Mikroumgebung zu studieren. Kriterien für eine ideale 3D hydrogelmatrix sind einfache, nicht-zytotoxische Zelle-Kapselung sowie unabhängige Einstellbarkeit der physiologisch relevanten mechanischen Eigenschaften und Mimik native Zelle-Klebstoff-Motive.
Beide synthetischen (zB., Polyethylenglykol, Polymilchsäure, Poly (glykolische Säure)) und natürlich gewonnen (zB., Alginat, Kollagen, Matrigel) Hydrogele haben Vorteile gegenüber 2D in-vitro- Kultur-Plattformen; Sie haben jedoch auch erhebliche Mängel, die ihre Anwendbarkeit zu begrenzen. Erstens viele synthetische und natürlich gewonnenen Plattformen erfordern harte Vernetzung Bedingungen, die für Säugerzellen potenziell giftig sein können, führt zu verringerte Zelle Lebensfähigkeit7. Darüber hinaus viele synthetische Plattformen fehlt native Bioaktivität und müssen durch chemische Nebenreaktionen funktionalisiert werden die erhöhten Kosten und Komplexität16hinzufügen können. Schließlich, während natürlich gewonnenen Materialien in der Regel innere bioaktive Domänen enthalten, sie sind oft durch hohe Variabilität von Charge zu Charge geplagt und beschränken sich oft auf Bildung relativ schwachen Gele7,17.
Rekombinantes Protein-Engineering präsentiert eine einzigartige Toolset für Materialien Design durch explizite Kontrolle über Proteinreihenfolge und, durch Verlängerung, die möglichen mechanischen und biochemischen Eigenschaften der endgültige Hydrogel Gerüst18. Darüber hinaus können durch die Nutzung der bekannten biologischen Maschinen von Escherichia coli (E. Coli), Proteine zu äußern, Materialien kostengünstig und konsequent mit begrenzten inter - und Intra-Batch Variabilität produziert werden. Das Elastin-wie Protein (ELP) hier vorgestellten hat drei technische Bereiche: (1) ein T7 und His6 Tag, das ermöglicht eine Kennzeichnung über Gewebekulturen Antikörper markiert, (2) ein "Elastin-Like"-Region, das verleiht elastische mechanische Eigenschaften und chemische ermöglicht Vernetzung, und (3) eine "Bio-aktiv"-Region, die für Zelle-Klebstoff Motive kodiert.
Elastin-ähnliche Region basiert auf der kanonischen (Val-Pro-Gly-Xaa-Gly)5 Elastin Sequenz, wo vier 'Xaa' Aminosäure-Websites sind Isoleucin (Ile), aber könnte so konzipiert, dass jede Aminosäure außer Prolin. Diese Sequenz stiftet rekombinante ELPs mit untere kritische Temperatur (LCST) lösungsverhalten, die für einfache Reinigung nach dem Ausdruck über thermische Radfahren19,20ausgenutzt werden können. Diese LCST Eigenschaft kann bei unterschiedlichen Temperaturen durch Ändern der Gast 'Xaa' Rückstand21,22, thermisch Aggregat abgestimmt werden.
Hier wurde mit Amin-präsentierenden Lysin (Lys) Aminosäure, die "Xaa" Position auf einem der fünf Elastin-artigen Wiederholungen ersetzt, die Hydrogel Vernetzung genutzt wird. Unsere bisherige Arbeit hat nicht zytotoxisch und robuste Vernetzung durch Reaktion mit der Amin-reaktive Vernetzer Tetrakis (Hydroxymethyl) Phosphonium-Chlorid (THPC)23gezeigt. Durch unterschiedliche allgemeine Inhalte und Vernetzer Proteinkonzentration können wir Hydrogele zu produzieren, die optimiert werden können, um eine physiologisch relevanten Steifigkeit Palette (~0.5-50 kPa)9,23,24zu überspannen. Neben der Optimierung der mechanischer Eigenschaften, Zelle Adhäsion innerhalb der Hydrogel-Ergebnisse aus der Integration der kanonischen Zelle-Klebstoff-Domänen innerhalb das Rückgrat des ELP-Proteins. Beispielsweise ermöglicht die Einbeziehung der erweiterten Fibronektin abgeleitet "RGDS" Aminosäure-Sequenz Zelladhäsion und Konformationsänderungen Flexibilität, während das Rührei, unverbindliche "RDGS" Variante schränkt Zellmatrix Haftung24. Durch die Modulation des Verhältnis der Zelle-Klebstoff nichtklebenden Proteine sowie die Gesamt-Protein-Konzentration, können wir effektiv Hydrogele zu produzieren, die eine Vielzahl von Liganden-Konzentration zu überspannen. Resultantly, entwickelten wir eine Hydrogel-Plattform mit entkoppelten biochemischen und biophysikalischen Eigenschaften, die unabhängig für optimale 3D Culture von verschiedenen Zelltypen abgestimmt werden können.
Neben Matrix Steifigkeit und Klebstoff Liganden Einstellbarkeit bieten rekombinante Hydrogele die Möglichkeit, bestimmte Materialabbau designprofile, die notwendig ist für die Zelle verbreiten, Proliferation und Migration innerhalb einer 3D Rahmen4 , 9. dieser Abbau wird durch Zelle Sekretion von Proteasen, die gezielt die erweiterte "RGDS"9 oder Elastin-Sequenz25gewährt. ELP Hydrogele haben auch gezeigt, dass die nachfolgenden biochemischen Assays zu unterstützen, die notwendig sind für das Studium Zellviabilität und Immunocytochemistry, sowie DNA/RNA/Proteingewinnung für quantitative Reverse-Funktion Transkription-Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR) und Western blot9. ELP-Varianten wurden auch in einer Reihe von in Vivo Modellen verwendet und sind dafür bekannt, die vom Immunsystem26gut vertragen werden.
Zusammengenommen, ELP als eine wesentliche Plattform für Zelle-Kapselung Studien verfügt über eine Vielzahl von Vorteilen im Vergleich zu synthetischen oder natürlich gewonnenen Material Plattformen, die oft nicht über den gleichen Grad an biochemischen und biophysikalischen Einstellbarkeit und Reproduzierbarkeit. Darüber hinaus ELP einfach und nicht zytotoxischen Einsatz mit einer Vielzahl von Zelltypen (zB., Küken Dorsal Root Ganglien14,24, murine neuronalen Vorläuferzellen Zellen9, menschlichen mesenchymalen Stammzellen27, bovine neonatale Chondrozyten28, Human endothelial Zellen29,30) ermöglicht eine mehr physiologisch relevanten Modell des endogenen 3D ECM im Vergleich zu 2D Zellkultur. Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für den Ausdruck von rekombinant abgeleitet, ELPs für den Einsatz als Durchstimmbare Hydrogel Plattform für 3D Handy Kapselung. Weiter stellen wir die Methodik für die Downstream-fluoreszierende Kennzeichnung und konfokalen Mikroskopie von verkapselten Zellen.
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Protocol
(1) ELP Ausdruck Protokoll
- 1. Tag: Wachsen die Starter-Kolonie
- Bereiten Sie Ampicillin und Chloramphenicol Agarplatten durch Autoklavieren 25 g von Luria, Brühe und 15 g Agar pro 1 L von Reinstwasser. Sobald die Lösung auf ~ 60 ° C abgekühlt ist, fügen Sie 1 mL Ampicillin Lager (100 mg/mL Reinstwasser) und 1 mL Chloramphenicol Lager (34 mg/mL in 70 % igem Ethanol) bis 1 L Agar-Lösung für die endgültige Konzentrationen von 100 µg/mL und 34 µg/mL , beziehungsweise. Übertragen Sie 20 mL Endlösung auf 10 cm Petrischalen mit einer serologischen Pipette und ermöglichen Sie das Agar zu festigen. Wickeln Sie die Petrischalen mit Parafilm und Store bei 4 ° C.
Hinweis: Petrischalen kann bei 4 ° C bis zu zwei Wochen aufbewahrt werden. - Streifen eine kleine Probe des BL21 (DE3) pLysS E. Coli aus einem vorgefertigten bakterielle bestand, enthält einen pET15b-Vektor Codierung der ELP Verzinsung einer nährbodenplatte Ampicillin und Chloramphenicol.
Hinweis: Die Ampicillin und Chloramphenicol für Bakterien, enthält die pET15b und pLysS Vektoren bzw. auswählen. - Platzieren Sie die gestreift Platte auf dem Kopf stehend in einem Inkubator bei 37 ° C. Lassen Sie die Bakterienkolonien über Nacht wachsen.
Hinweis: Inkubieren Sie die Platten länger als 16 h nicht, wie Ampicillin abgebaut wird und die Kolonien, die Ampicillin-Resistenz nicht tragen können.
- Bereiten Sie Ampicillin und Chloramphenicol Agarplatten durch Autoklavieren 25 g von Luria, Brühe und 15 g Agar pro 1 L von Reinstwasser. Sobald die Lösung auf ~ 60 ° C abgekühlt ist, fügen Sie 1 mL Ampicillin Lager (100 mg/mL Reinstwasser) und 1 mL Chloramphenicol Lager (34 mg/mL in 70 % igem Ethanol) bis 1 L Agar-Lösung für die endgültige Konzentrationen von 100 µg/mL und 34 µg/mL , beziehungsweise. Übertragen Sie 20 mL Endlösung auf 10 cm Petrischalen mit einer serologischen Pipette und ermöglichen Sie das Agar zu festigen. Wickeln Sie die Petrischalen mit Parafilm und Store bei 4 ° C.
- Tag 2: Vorbereitung der Vorspeise Kultur und Ausdruck Medien
- Entfernen Sie die E. Coli -Kultur aus dem Inkubator. Parafilm Platte und Speicher für bis zu 4 Tage bei 4 ° C.
- Bereiten Sie ein Starter-Kultur-Flasche (250 mL) und Ausdruck Kulturflaschen (12 x 1 L) und Autoklaven. Für 1 L von Expression Media 1 L von Reinstwasser in einem 2 L ratlos Kultur Kolben 47,6 g tolle Brühe und 4 mL Glycerin hinzu, und mit Alufolie verschließen.
Hinweis: Typische Erträge sind 60-100 mg/L Protein Expression Media. - Laden Sie den autoklaviert Starter in vorgewärmten, 37 ° C schütteln Inkubator und inkubieren Sie ohne Hetze.
- Die Starterkultur für eine Endkonzentration von 100 µg/mL 250 µL steril filtriert (0,22 µm Filter) Ampicillin Lager (100 mg/mL Reinstwasser) hinzufügen. Sofort beginnen Sie die Starterkultur bei 250 u/min rühren.
Hinweis: Chloramphenicol dient ausschließlich zur Kolonie Auswahl auf Agarplatten und ist nicht für flüssige Kulturen enthalten. - Impfen Sie die Starterkultur durch Hinzufügen einer einzigen ELP Plasmid-haltigen E. Coli Kolonie von der gestreiften Platte zu und lassen Sie die Starterkultur zu schütteln bei 37 ° C für 16 h.
- Legen Sie den Ausdruck Kulturmedien, die Flaschen in, 37 ° C schütteln Inkubatoren vorgewärmt und inkubieren über Nacht ohne Erregung, so dass die Flaschen am nächsten Morgen impfen bereit sind.
- 3. Tag: Induzierende Protein-Expression in E. coli
- Frische, steril filtriert Ampicillin Lager (100 mg/mL Reinstwasser) zu machen. Fügen Sie 1 mL Ampicillin Lager zu jedem Kolben von Expression Media für eine Endkonzentration von 100 µg/mL.
- Beginnen Sie die Ausdruck Medien bei 250 u/min rühren.
- Nehmen Sie eine 2 mL Probe der Medien aus jedem Ausdruck Flasche und Hinzufügen einer Küvette als Rohling für eine optische Dichte lesen bei 600 nm (OD600).
- Impfen Sie nach der Fertigstellung der 16 h Starter Kultur Inkubation jedem Ausdruck Kolben von 20 mL der Starterkultur auf jedem Ausdruck Kolben über eine serologische Pipette übertragen.
- Messen Sie nach der Fertigstellung der 1 h-Agitation die OD600 eines der Ausdruck Fläschchen. Messen Sie nach diesem Schritt OD600 alle 20 min, überprüft ein anderes Fläschchen jedes Mal.
- Reduzieren Sie bei einer OD600 von 0,6 die Temperatur der Shaker, enthält der Ausdruck Fläschchen bis 32 ° C.
- Überprüfen Sie die OD600 alle 10 Minuten. Induzieren Sie bei einer OD600 von 0,8 die Expression durch Zugabe von 1 mL 1 M, steril filtriert β-Isopropyl Thiogalactoside (IPTG) in Reinstwasser zu jedem Ausdruck Kolben.
- E. Coli im Ausdruck Kolben 7 h zum Ausdruck bringen können.
- 20 Minuten vor dem Ende des Ausdrucks, Vorkühlen eine große Boden-Zentrifuge bis 4 ° C.
- Sammeln Sie alle 12 L von Expression Media in einzelne Zentrifuge Behälter und Gleichgewicht.
- Zentrifugieren Sie Expression Media bei > 12.000 x g für 15 min bei 4 ° C mit einer Boden-Zentrifuge.
- Der Überstand von jeder Zentrifuge Behälter abgießen. Mit einem Spatel, die Zelle Pellets in ein vorgewogene Zip-Lock Beutel sammeln.
- Re das Pellet in steril filtriert zehn Puffer (100 mL Puffer pro 25 g Pellets) und entfernen Sie überschüssigen Luftblasen durch das Massieren der Pellet. Fügen Sie für 1 L von zehn Puffer 5,8 g Natriumchlorid, 1,21 g Tris-base und 0,37 g Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA) binatrium Salz Dihydrat 900 mL Reinstwasser hinzu. Stellen Sie den pH-Wert auf 8.0 und bringen Sie bis 1 L. Für diesen Schritt sind pH-Streifen ausreichend.
- Legen Sie den Zip-Lock Beutel mit neu suspendierten Zelle Pellet in einen zweiten Behälter und bei-80 ° C über Nacht einfrieren.
- Tag 4-6: Ruptur der bakterienzellwand über Frost-Tau-wechseln
- Entfernen Sie die gefrorene Kugel aus dem Gefrierschrank und lassen Sie es zu tauen langsam bei 4 ° C mit sanften Agitation mit einem Orbitalschüttler.
- Lassen Sie die Pellets zu tauen bis etwas Flüssigkeit vorhanden ist. Hinzufügen von ~ 30-40 mg des Deoxyribonuclease ich (DNase), aufgetaut lysate. Darüber hinaus fügen Sie 1 mL 100 mM Phenylmethylsulphonyl Fluorid (PMSF; eine Protease-Hemmer) in Isopropanol pro 100 mL der Zelle lysate. Ermöglichen Sie die lysate, über Nacht zu schütteln.
Hinweis: Hinzufügen der DNase und PMSF ist nur nötig für den ersten Frost-Tau-Zyklus.
Achtung: PMSF ist giftig beim Einatmen. Eine Gesichtsmaske sollte beim Umgang mit PMSF Pulver verwendet werden. - Sobald die Zelle lysate vollständig aufgetaut ist, frieren Sie die lysate bei-80 ° C über Nacht oder bis vollständig gefroren.
- Wiederholen Sie Frost-Tausalz-Vorgang für eine Gesamtmenge von drei Zyklen. Verlassen der lysate bei 4 ° C nach dem letzten Frost-Tausalz-aufgetaut. 100 µL der rohen lysate für Natrium Dodecyl Sulfat-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (SDS-PAGE) Analyse nach Abschluss der Reinigung zu speichern.
- Stellen Sie nach dem letzten Tauwetter den pH-Wert der aufgetauten lysate auf 9,0 mit 1 M NaOH. Für diesen Schritt sind pH-Streifen ausreichend. Bei 4 ° C für mindestens 1 h Inkubation (über Nacht ist geeignet) auf einem Orbitalschüttler.
- Tag 7-9: ELP Reinigung über kalte und warme Spin Temperaturzyklen
- Cool die Stock-Zentrifuge bis 4 ° C 20 min. vor der Zentrifugation.
- Aliquoten und Balance der aufgetauten lysate in die Zentrifuge Container.
- Zentrifugieren Sie die Proben an > 15.000 x g für 1 h bei 4 ° C. Speichern Sie 100 µL des Überstands für SDS-PAGE-Analyse nach Abschluss der Reinigung.
Hinweis: Nach dem Zentrifugieren, sollte das ELP-Protein im überstand aufgrund seiner hohen Löslichkeit in Wasser bei Temperaturen unter seiner LCST bleiben (< 32 ° C). - Den überstand auf neue Zentrifuge Container übertragen und entsprechend auszugleichen.
- Eine Endkonzentration von 1 M (5,84 g NaCl pro 100 ml des Überstands) Natriumchlorid (NaCl) in drei Teile hinzufügen. Gewährleistet, dass NaCl in drei Teilen, um ausreichende Auflösung zu ermöglichen.
- 3 h bei 37 ° C bei 250 u/min in einem Inkubator schütteln schütteln.
- 1 h vor dem Ende der Agitation, Vorwärmen eine Stock-Zentrifuge auf 37 ° C.
- Zentrifugieren bei > 15.000 x g für 1 h bei 37 ° C. Speichern Sie 100 µL des Überstands für SDS-PAGE-Analyse nach Abschluss der Reinigung und verwerfen Sie den verbleibenden überstand.
Hinweis: Nach dem Zentrifugieren, ELP-Protein sollte sein oelletiert durch seine geringe Löslichkeit in Wasser bei Temperaturen oberhalb seiner LCST (> 32 ° C). - Wieder aussetzen der Pellets durch Zugabe von 10 mL autoklaviert, hochreines Wasser pro 1 g Pellets. Mit einem Spatel aus Metall, die Pellets bei der Auflösung des Proteins Maische.
- Stellen Sie den pH-Wert der aufgetauten lysate auf 9,0 mit 1 M NaOH. Für diesen Schritt sind pH-Streifen ausreichend.
- Über Nacht bei 4 ° C auf einem Orbitalschüttler agitieren.
- Wiederholen Sie kalte und warme Spin thermischen Radfahren für eine Gesamtmenge von drei Zyklen (i.e., wiederholen Sie die Schritte 1.5.1 durch 1.5.11 für insgesamt drei Zyklen).
- Tag 10-15: ELP Dialyse und Gefriertrocknung
- Zentrifugieren Sie das neu suspendierten Pellet in einer vorgekühlt Zentrifuge bei > 15.000 x g für 1 h bei 4 ° C. Speichern Sie 100 µL des Überstands für SDS-PAGE-Analyse nach Abschluss der Reinigung.
- Entsalzen Sie die Proteinlösung durch dialyzing des restlichen Überstands in ein 3,5 kDa Dialysemembran gegen 4 L vorgekühlt ultrareinem Wasser bei 4 ° C. Ändern Sie die Dialyse Wasser zweimal täglich für insgesamt 6-mal mehr als 3 Tage.
Hinweis: Typische überstand Bände sind zwischen 5 und 30 mL. - Zentrifugieren der dialysierten Lösung in eine vorgekühlte Zentrifuge bei > 15.000 x g für 1 h bei 4 ° C. 100 µL des Überstands für SDS-PAGE-Analyse am Ende der Reinigung zu speichern.
- Frieren Sie die resultierende Überstand bei-80 ° C in vorgewogene konischen Rohren.
- Lyophilize Sie die gefrorenen Lösung für 3 Tage und Masse das Endprodukt, die Protein-Rendite bestimmen.
- Parafilm der Röhrchen mit dem Finale lyophilisiert ELP Produkt und Shop bei 4 ° C.
- Führen Sie die SDS-PAGE um die Reinheit des Proteins zu bestimmen.
Hinweis: Protokolle für die SDS-PAGE variiert je nach spezifischen Agarose-Gel-Bedingungen. Für unsere Experimente war letzte lyophilisierte Protein zu einer Konzentration von 0,5 mg/mL in entionisiertem Wasser aufgelöst und bei 140 V für 70-100 min in einen 12 % (w/V) Acrylamid Gel unter denaturierenden Bedingungen laufen.
(2) Zelle Kapselung in 3D Protein Elastin-wie Hydrogele
- Vorbereitung von Silikon-Formen
- Verwenden Sie einen Biopsie-Punch mit dem gewünschten Durchmesser Löcher in einem 0,5 mm dicken Silikon-Blatt erstellen und schneiden Sie ein Quadrat um jedes Loch. Wiederholen Sie für die Anzahl der Formen gewünscht.
Hinweis: Der Durchmesser und die Dicke der Formen für die jeweilige Anwendung und Zelle Kulturbedingungen einstellbar. In der Praxis für Zellkulturen von 50 106 Zellen/mL, 0,5 mm dicken Formen mit 4 mm und 5 mm Durchmesser empfohlen für ausreichend DNA/RNA und Protein-Extraktion, beziehungsweise. Ein 2 mm-Biopsie-Punch ist für Immunostaining lässt sich stattdessen drei benachbarte Löcher pro quadratischen Form erstellen, so dass drei Wiederholungen pro Bohrloch gebeizt werden können. - Entfernen Sie die Plastikfolie auf jeder Seite der individuellen Form mit einer Pinzette.
Hinweis: Vermeiden Sie den Kontakt mit der exponierten Silikon-Oberfläche als Verunreinigung zukünftige Plasma Verklebung Effizienz verringern kann. - Mit einer Pinzette, die gleiche Anzahl von nackten Silikon Formen und Glasdeckgläser (Nr. 1, 12 mm Durchmesser) in abwechselnden Reihen auf dem umgekehrten Deckel einer 48-Well-Platte anordnen. Abschluss, decken Sie den Deckel von der 48-Well-Platte zur Vermeidung von Kontaminationen.
- Sauerstoffplasma behandeln die gesamte 48-Well-Platte Deckel (i.e., Schimmelpilze und Glas-Objektträger). Sofort nach verwenden Sie Zange die Silikonform auf die angrenzenden Glas Deckglas zu invertieren. Drücken Sie fest auf dem Schimmel um die Verklebung zu gewährleisten. Lassen Sie die Formen auf 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.
Hinweis: Die Dauer der Sauerstoff Plasmabehandlung variieren je nach das Instrument benutzt. Typische Bedingungen für unser Instrument sind Gas Druck einem Arbeitsfenster zwischen 0,3-4 Mbar, Sauerstoff Gasfluss bei 20 cm3/min und Probe Exposition gegenüber Plasma für 10-20 s. - Sterilisieren Sie die Formen durch Autoklavieren. Speichern Sie die Formen bei Raumtemperatur in einer sterilen Umgebung bis zur Verwendung.
Hinweis: Die Formen können in diesem Stadium auf unbestimmte Zeit gespeichert werden.
- Verwenden Sie einen Biopsie-Punch mit dem gewünschten Durchmesser Löcher in einem 0,5 mm dicken Silikon-Blatt erstellen und schneiden Sie ein Quadrat um jedes Loch. Wiederholen Sie für die Anzahl der Formen gewünscht.
- Vorbereitung der Elastin-wie Protein-Stammlösung
- Entfernen Sie lyophilisierter ELP aus 4 ° C Speicher. Wärmen Sie das Protein auf Raumtemperatur vor dem Öffnen der Röhre um sicherzustellen, dass keine Kondensation auf dem Protein über Mehrfachverwendung baut.
- ELP in Dulbeccos Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (DPBS) bei 4 ° C mit ständiger Bewegung auflösen (i.e., Spinnerei) über Nacht.
Hinweis: ELP-Stammlösung Konzentration wird mit dem Zusatz von Vernetzer Lösung in einem benutzerdefinierten Volumetrisches Verhältnis weiter verdünnt werden. Zum Beispiel für eine 3 % (w/V) ELP Endkonzentration, bereiten Sie eine 3,75 % (w/V) ELP-Stammlösung, die im Verhältnis 4:1 Volumetrische ELP Lösung: Vernetzer Lösung verdünnt wird. Die Konzentration als notwendig für die gewünschte Anwendung anpassen. - Sterilfilter ELP-Stammlösung mit einem 0,22 µm-Spritze-Filter. ELP auf Eis bei Nichtgebrauch zu speichern.
- Übertragen Sie in der Biosicherheit Kabinett die sterilen Formen sterilen Pinzette mit einer 24-Well-Zellkultur-Platte.
- Vorbereitung der THPC-Stammlösung
- Verdünnen Sie THPC in DPBS kurz vor zu verwenden. Passen Sie die Konzentration der THPC Lösung entsprechend der Endkonzentration ELP und gewünschte Vernetzung Verhältnis.
Hinweis: Für das Protokoll, eine Endkonzentration von ELP von 3 % (w/V) erfolgt durch das Mischen der ELP-Stammlösung mit der THPC-Lösung in einem Volumenverhältnis von 4:1. Passen Sie bei Bedarf. - 997.4 µL des DPBS 2,6 µL THPC Lösung (80 % in Wasser) hinzufügen.
Hinweis: Diese Konzentration des THPC entspricht einer stöchiometrischen Verhältnis von 1:1-hydroxy-Methylgruppen auf THPC und primäre Amine auf dem ELP-Protein beim Mischen von Lösungen auf die beschriebenen Volumetrische Verhältnis 4:1 für eine endgültige 3 % (w/V) ELP Hydrogel. Die THPC Lösung ist zähflüssig und Tropfen der Lösung können auf die Seite der Pipettenspitze kleben. Für genaue Konzentrationen zu vermeiden solche Tropfen, wenn in DPBS verdünnen. Löschen der THPC Lager Containers mit Stickstoffgas, Oxidation von der Phosphin und Inaktivierung von der Vernetzer zu verhindern. - Vortex Lösung zu mischen und zu halten auf dem Eis.
- Sterilfilter die THPC Lager Lösung mithilfe eines Filters 0,22 µm Spritze. Verdünnen Sie die THPC-Stammlösung weiter mit sterilen DPBS niedrigeren stöchiometrischen Vernetzung Verhältnisse zu erreichen (zB., 0.5:1 oder 0.75:1).
Hinweis: THPC ist sauerstoffempfindlich, und die verdünnte Lösung sollte innerhalb von ein paar Stunden nach der Zubereitung verwendet werden.
- Verdünnen Sie THPC in DPBS kurz vor zu verwenden. Passen Sie die Konzentration der THPC Lösung entsprechend der Endkonzentration ELP und gewünschte Vernetzung Verhältnis.
- Die Zellen durch Inkubation mit Trypsin-EDTA in eine einzelne Zelle Aussetzung zu distanzieren, pellet-Zellen und zählen die Zellen wieder in Medium mit einem Hemocytometer ausgesetzt.
Hinweis: Genaue Protokolle für diesen Schritt hängt stark von gewünschten Zelltyp und Anwendung. Für die neurale Vorläuferzellen in dieses Protokoll verwendet wurde eine 0,025 % Trypsin-EDTA Inkubation bei Raumtemperatur für 1,5 min durchgeführt. Die Zellen wurden bei 200 X g für 2 min oelletiert. Für erhöhte Zellviabilität sollte Zellen im normalen mittlere Bedingungen ausgesetzt werden. Typische Zelldichten für Kapselung Zellbereich von 1-50 106 Zellen/mL des endgültigen Hydrogel Volumen verwendet. Passen Sie bei Bedarf. - Die gewünschte Anzahl von Zellen in einem sterilen 1,5 mL Zentrifugenröhrchen aliquoten.
- Zentrifugieren Sie sorgfältig die Zellen bei ~ 200 X g für 3 min., Aspirieren Sie überstand und halten Sie die Zelle Pellet auf Eis.
Hinweis: Es ist entscheidend für die völlig Aspirieren des Überstands um die weitere Verdünnung der ELP und THPC Vernetzer zu mildern. Spezielle Zentrifugation Geschwindigkeiten variieren Zelltyp. - Wieder aussetzen der Zelle Pellet in der ELP-Stammlösung derart, dass das Volumen 80 % des letzten Bandes (vorausgesetzt, ein 4:1 Verhältnis von ELP-Lösung: THPC-Lösung). Pipette Mix 20 - 25 Mal um eine homogene Mischung der Zellen und ELP zu produzieren.
Hinweis: Vermeiden Sie greifen den Boden des Röhrchens, Temperaturerhöhung und anschließende Phasenübergang von ELP zu mildern. Jeweils 2 mm Form mit drei Wiederholungen erfordert 7,5 µL Endvolumen (i.e., 6 µL Stammlösung ELP und 1,5 µL der Stammlösung THPC) aufgeteilt in die 3 Löcher (i.e., 2,5 µL Endvolumen pro Loch). Für die 4- und 5-mm-Formen ist ein Endvolumen von 7,5 µL und 15,5 µL bzw. erforderlich. - Die Zelle/ELP-Aussetzung für die verbleibenden 20 % Endvolumen THPC Stammlösung hinzufügen. Pipette Mix 20 - 25 Mal um eine homogene Mischung zu produzieren.
- Sofort die entsprechenden letzten Bände der Zelle/ESP/THPC Mischung pipette in jeder Form durch eine Kreisbewegung. Wiederholen Sie für alle Formen.
- Inkubieren Sie die Proben bei Raumtemperatur für 15 min, gefolgt von einer zusätzlichen Inkubation bei 37 ° C für 15 min.
Hinweis: Die erste Inkubationszeit hilft erste Vernetzung von Hydrogel vor Erhöhung der Temperatur zu, die über das ESP LCST und induzieren die thermische Phase Trennung zu erleichtern. - Geben Sie langsam 750 µL warm Zellkulturmedium in jeder der 24-Well-Platte, die Gele zu stören zu vermeiden.
- 7 Tage inkubieren Sie die Hydrogele bei 37 ° C.
Hinweis: Vollständige Medium, die Änderungen alle 1-2 Tage je nach Zelltyp empfohlen werden. Um den Druck auf das Gel zu beschränken, verwenden Sie ein Glas Pasteurpipette angebracht mit einem 200 µL PIPETTENSPITZE beim Absaugen von Medium aus dem Brunnen.
(3) Immunocytochemistry der Zellen in 3D ELP Hydrogele
- Bereiten Sie die Fixierung-Lösung durch das Mischen von 10 mL 16 % (w/V) Paraformaldehyd (PFA) in 30 ml DPBS. Die Lösung auf 37 ° c warm
- Aspirieren Sie das Medium aus dem 24-Well-Platte und vorsichtig waschen mit 1 mL des DPBS.
- Jedes gut 750 µL der Fixierung-Lösung hinzu und bei 37 ° C für 30 min inkubieren. Verwenden Sie nicht die Gewebekultur Inkubator zur Vermeidung von Kontaminationen anderer Kulturen mit PFA Dampf.
- Aspirieren Sie sorgfältig die Fixierung Lösung aus jedem Brunnen, verwerfen die PFA in einen entsprechenden Sondermüll-Behälter.
Achtung: Kontakt mit PFA kann Haut- und Augenreizungen verursachen. Handschuhe/Schutzbrille tragen und arbeiten in einem chemischen Abzug. - Jede Probe 1 mL des DPBS hinzufügen. Sofort Aspirieren Sie des DPBS und in PFA Abfallbehälter entsorgen.
- Waschen Sie die Proben zweimal mit 1 mL des DPBS für 10 Minuten.
Hinweis: Proben können in DPBS bei 4 ° C bis zu einer Woche nach der Versiegelung der Platte mit Parafilm gelagert werden. - Permeabilize jede Probe mit 750 µL Permeabilisierung Lösung (100 mL des DPBS und 0,25 mL Triton x-100; PBST) für 1 h bei Raumtemperatur auf einem Rocker bei 15 u/min.
- Aspirieren Sie das PBST und fügen Sie 750 µL Lösung (95 mL PBS, 5 g Rinderserumalbumin (BSA), 5 mL Serum und 0,5 mL der Triton x-100) zu jeder Probe zu blockieren. Bei Raumtemperatur für 3 h auf einer Wippe bei 15 u/min inkubieren.
Hinweis: Die Sperre Lösung sollte enthalten Serum aus der Wirtsarten, unter denen die sekundäre Antikörper ausgelöst wurden (zB., Ziege, Esel) und steril gefiltert durch einen 0,22 µm filter vor der Verwendung. - Bereiten Sie die Antikörperlösung Verdünnung (97 mL des DPBS, 2,5 g der BSA, 2,5 mL Serum (aus gleichen Wirtsarten wie in Schritt 3,8) und 0,5 mL der Triton x-100). Den primären Antikörper mit der Antikörperlösung Verdünnung verdünnen und 500 µL der Lösung zu jeder Probe hinzufügen. Die Dichtplatte mit Parafilm und Inkubation über Nacht bei 4 ° C auf einer Wippe.
Hinweis: Nestin und Sox2 Primärantikörper wurden verdünnt 1: 400 in Verdünnung Antikörperlösung von den Herstellern ursprünglichen Konzentration. - Aspirieren Sie die Antikörperlösung von jeder Probe und waschen Sie die Proben mit PBST 60 min bei Raumtemperatur auf einem Rocker bei 15 u/min. Wiederholen Sie der Waschschritt 3 Mal.
- Den sekundäre Antikörper und 5 mg/mL bestand DAPI (1:2, 000) mit der Antikörperlösung Verdünnung verdünnen und 500 µL der Lösung zu jeder Probe hinzufügen. Die 24-Well-Platte mit Alu-Folie abdecken und Inkubation über Nacht bei 4 ° C auf einer Wippe.
Hinweis: Da der Sekundärantikörper lichtempfindlich sind, müssen die Proben vor Immunofluoreszenz für alle weiteren Schritte geschützt werden. Ziege Anti-Maus und Ziege Anti-Kaninchen Sekundärantikörper wurden verdünnt 1: 500 in Verdünnung Antikörperlösung von den Herstellern ursprünglichen Konzentration. - Aspirieren Sie die Antikörperlösung von jeder Probe und waschen Sie die Proben mit PBST 30 min bei Raumtemperatur auf der Wippe. Wiederholen Sie der Waschschritt 3 Mal.
- Positionieren Sie einen Tropfen hart eingestellt Eindeckmedium auf die Oberfläche des einen Objektträger. Mit Pinzette entfernen Sie überschüssige Lösung aus der Form von leicht den Rand der Form auf einem Papiertuch abtupfen. Vorsichtig legen Sie die Form umgedreht auf das Eindeckmittel und vermeiden Sie Einführung von Luftblasen zu.
- Lassen Sie das Eindeckmittel 48 h bei Raumtemperatur Aushärten. Speichern Sie die Proben bei Raumtemperatur oder 4 ° C. Ermöglichen Sie das Eindeckmittel voll für 48 h vor dem imaging wie Brechungsindex des Mediums sich im Laufe der Verhärtung ändert festgelegt. Versiegeln Sie die Proben auf Abdeckung Objektträger mit klaren Nagellack, Kontamination oder Probe Bewegung zu mildern.
- Die Proben mit einem konfokalen Mikroskop das Bild.
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Representative Results
Die in diesem Protokoll verwendeten ELPs bestehen aus fünf Regionen: ein T7-Tag, His6 Tag spaltstelle Enterokinase (EK), einer Bio-aktiven Region und ein Elastin-ähnliche Region (Abbildung 1). Die T7 und His6 Tags ermöglichen einfache Identifizierung durch standard-Western-Blot-Techniken. Einführung der EK-spaltstelle ermöglicht für den enzymatischen Abbau des Rayons Tag bei Bedarf. Die Bio-aktiven Region kodiert für die erweiterte, Fibronektin-abgeleitete Zelle-Kleber ("RGDS") oder nicht klebend ("RDGS") Sequenzen. Zu guter Letzt enthält die zentralen Wiederholung der Elastin-ähnliche Region eine Lysin-Gruppe am Gast Rückstände Standort Vernetzung über THPC ermöglicht, während die flankierenden Wiederholungen Isoleucin enthalten um eine LCST ~ 32 ° C31zu erreichen.
Post-Ausdruck, SDS-PAGE oder Western-Blot lässt sich das Molekulargewicht zu visualisieren und bestätigen die Identität von ELP, die Antikörper-Tags wie T7 (MASMTGGQQMG) oder His6 (HHHHHH) (Abbildung 2) enthalten. Erfolgreiche Expression unter kontrollierten Bedingungen ergibt ein sehr homogenes Produkt, vertreten durch die Anwesenheit einer einzigen dunklen Band an das ungefähre Molekulargewicht (~ 37 kDa) dieser Proteine mit beiden SDS-PAGE (Abbildung 2A) und Western-blot) Abbildung 2 b).
In unkontrollierten Bedingungen schlägt das Vorhandensein der unteren Molekulargewicht Bands auf ein Western-Blot, dass ein Teil der Proteine war nicht komplett übersetzt und/oder wurden nach dem Ausdruck (Abbildung 2) degradiert. Insbesondere sind hier die Massen von ~ 9 kDa gleichmäßig entspricht etwa dem Gewicht von einem Bio-aktiven Region und drei Elastin-Regionen (eine "Wiederholung") oder etwa ein Viertel des Zielproteins. Diese kleineren PROTEINFRAGMENTE sind in der Regel vor, wenn der Ausdruck bei einer höheren Temperatur durchgeführt wird (> 32 ° C) wie in Abbildung 2. Das Vorhandensein dieser geringere Molekulargewicht Proteine führen zu unvorhersehbaren mechanischen Eigenschaften. Daher ist regelmäßige screening Post Ausdruck empfohlen, um eine hohe Qualität des Endprodukts zu gewährleisten.
Die mechanische Steifigkeit der ELP-basierte Hydrogele kann geändert werden, durch Manipulation der Konzentration von ELP oder das Verhältnis von THPC reaktive Gruppen: ELP primäre Amine. Gleichzeitig kann die Konzentration der Zelle-Klebstoff-Liganden durch die Änderung des Verhältnis von ELP-Varianten mit der Zelle-Kleber (RGDS) abgestimmt werden, nicht klebend (RDGS) Sequenzen innerhalb jedes Steifigkeit Regime. Durch die Manipulation dieser beiden Variablen, produzieren wir Gele, die ein Spektrum an mechanischen Eigenschaften und Liganden Konzentrationen (Abbildung 3).
Um Zellen in 3D ELP Hydrogele zu kapseln, die gewünschte Anzahl von Zellen in das Medium suspendiert und zentrifugiert, um eine Zelle Pellet (Abb. 4A) zu produzieren. Das Medium wird aus dem Röhrchen abgesaugt, und die Zellen sind einheitlich in der ELP-Lösung der gewünschten Konzentration wieder ausgesetzt. Als nächstes ist THPC Lösung hinzugefügt, um die Zelle/ELP-Aussetzung und pipettieren gründlich um eine homogene Mischung zu bilden. Diese Lösung ist schnell zu sterilen Silikon Formen innerhalb einer 24-Well-Platte mit einer Pipette übertragen und durfte Crosslink bei Raumtemperatur und 37 ° C für 15 min jeden (Abbildung 4 b). Schließlich ist das Medium well-Platte hinzugefügt und bei 37 ° C im Experiment inkubiert.
Lebenden/Toten Färbung lässt sich die Zellviabilität und erfolgreiche Zelle Kapselung in ELP Hydrogele zu bewerten. Wie in Abbildung 5dargestellt, zeigen Erwachsenen murinen neurale Vorläuferzellen (NPCs) hohe Zellviabilität innerhalb von 7 Tagen innerhalb einer 3 % (w/V) ELP Hydrogel.
3D ELP Hydrogele haben bisher gezeigt, dass NPC Stamm Wartung gemessen durch den Ausdruck der kanonischen NPC Protein Marker SRY (Geschlecht-Bestimmung von Region Y) unterstützen-Box 2 (Sox2) und nestin9. NPCs in 3 % (w/V) gekapselt ELP Hydrogele mit niedrigen THPC Vernetzung zeigen hohe Expression von nuklearen lokalisiert Sox2 und zytoplasmatischen nestin Filamente über Immunostaining und confocal Imaging (Abbildung 6).
Abbildung 1 : Eine schematische Darstellung der ELP und entsprechenden Aminosäuresequenzen. Das ESP in dieser Studie verwendeten enthält einen T7 und His6 Tag für Antikörper-basierten Imaging, einer bioaktiven Region für Einführung der Zelle-Klebstoff Domains und eine Elastin-wie Region, die verleiht elastische mechanische Eigenschaften und chemische Vernetzung ermöglicht. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Ziel-Protein-Expression mit SDS-PAGE und Western-Blot bestätigen das Molekulargewicht und die Identität des lyophilisierten Produktes überprüft werden kann. Reine Full-Length ELP läuft mit einem Molekulargewicht von 37 kDa wie berichtet von SDS-PAGE (A) und Western-Blot mit dem T7 (MASMTGGQQMG) oder Histidin 6 (HHHHHH) Tag (B). (C). unreine Chargen von ELP aufgrund der Abweichungen in der ELP-Ausdruck-Protokoll können auf die Nennung der ELPs mit niedrigeren Molmassen führen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: RGDS Liganden Inhalte kann unabhängig von mechanischen Eigenschaften innerhalb von ELP Hydrogele abgestimmt werden. 5 % (w/V) und 3 % (w/V) ELP Hydrogele haben Scherung Moduli ~ 800 Pa und ~ 400 Pa, beziehungsweise. Hydrogele mit einem 1:1 Verhältnis von THPC reaktive Gruppen: ELP primäre Amine waren vernetzt bei Raumtemperatur für 15 min auf 37 ° C erhitzt und für 5 Minuten vor der Messung equilibrate durfte. Daten sind Mittelwert ± s.d., *p < 0,001. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Der Zelle Kapselung in ELP Hydrogele schematische. (A). Zellen werden zunächst in eine einzelne Zelle Suspension Mittel-und gebeizte mithilfe einer Zentrifuge getrennt. Das Medium wird aus dem Röhrchen abgesaugt, und die Zellen sind neu im ELP-Lösung auf die gewünschte Konzentration ausgesetzt und gut gemischt. Schließlich ist die THPC Vernetzung Lösung hinzugefügt und gut gemischt. (B). unmittelbar nach der Zugabe von THPC, ist die Lösung in eine Silikonform mit einer Pipette geworfen. Die Lösung darf Crosslink bei Raumtemperatur 15 Minuten, gefolgt von einer zweiten 15 min Inkubation bei 37 ° C. Das Medium wird dann die Kultur auch für die Dauer des Experiments hinzugefügt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: Neurale Vorläuferzellen Erhaltung hohe Lebensfähigkeit in ELP Hydrogele. Repräsentatives Bild der neurale Vorläuferzellen in 3 % (w/V) ELP gekapselt Hydrogele mit 1:1 Vernetzung (THPC reaktive Gruppen: ELP primäre Amine) nach 7 Tagen in der Kultur. Grün: Leben Färbung (Calcein-AM); Rot: tot Färbung (Interkalation Homodimer). Maßstabsleiste = 100 µm.
Abbildung 6 : 3D ELP Hydrogele unterstützen neuronalen Vorläuferzellen Zelle Stamm Maker Ausdruck. Immunfluoreszenz-Bild der neurale Vorläuferzellen Ausdrücken Sox2 und nestin Proteine nach 7 Tagen der Kultur in ELP Hydrogele. Bilder zeigen Zellen in 3 % (w/V) ELP Gele mit 0.5:1 Vernetzung (THPC reaktive Gruppen: ELP primäre Amine) gekapselt. Blau: DAPI (Kerne); Rot: Sox2; Grün: nestin. Maßstabsleiste = 25 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Rekombinante Proteinexpression und Reinigung ist ein leistungsfähiges Werkzeug, Biomaterialien mit hoher Reproduzierbarkeit zu synthetisieren. Aufgrund weitgehend das Aufkommen der kommerzialisierten molekularen Klonen, können benutzerdefinierte rekombinante Plasmide von mehreren Lieferanten gekauft werden die reduziert die Zeit zum Arbeiten mit Materialien wie ELPs. In ähnlicher Weise können Plasmide direkt aus dem ursprünglichen Labor angefordert werden, wenn das ursprüngliche Werk durch einen Bundesvertrag unterstützt wurde und die künftige Arbeit wird für Non-Profit-Einsatz. Die vollständige ELP-Aminosäure-Sequenz wurde zuvor für mehrere ELP Varianten31veröffentlicht. Der Prozess vom Ausdruck auf eventuelle Reinigung von rekombinanten Proteinen beinhaltet jedoch eine Reihe von kritischen Schritte, die häufig zu Ertragseinbußen oder eine niedrigere Qualitätsprodukt führen kann. Einige der am häufigsten auftretenden Probleme für ELP Zubereitung entstehen in eines der folgenden: (1) Qualität der gespeicherten bakterielle Aktien, (2) der erste Frost-Tau-Zyklus um die bakterienmembran und (3) Proteinreinigung durch Temperaturwechsel stören.
Ein Hauptunterschied zwischen Proteinexpression und anderen nicht-biologischen Materialien zu produzieren ist, wir die biologische Maschinen von rekombinanten Hosts nutzen, die Polymere zu synthetisieren. Anschließend diese Technik verfügt über eine eindeutige Einschränkung: Zelltod oder Schäden. Zelltod manifestiert sich am häufigsten als eine reduzierte Anzahl der Bakterienkolonien nach Schlieren einen Teller oder ungewöhnlich kleine Kolonien, die relativ langsam wachsen. Bakterielle Aktien können wenn sorgfältig gepflegt seit Jahren stabil; jedoch können aufeinanderfolgende Frost-Tau-Zyklen wegen wiederholter Gebrauch oder Gefrierschrank Zellviabilität reduzieren oder zu DNA-Schäden führen. Typische BL21 Bakterien Aktien verwenden zwischen 10 % und 40 % Glycerin nach Volumen gemischt mit suspendierten Zellen. Das Glycerin dient zur Membran Schadensreduzierung von Nukleierungsmittel Eiskristalle beim Gefrieren. Daher ist die Verwendung niedriger Konzentration (< 10 %) führen zu einer kompromittierten Membran, während höhere Konzentrationen (> 40 %) können unterdrücken den Gefrierpunkt ausreichend, wo die Aktie nie führt zum Zelltod führt friert. Aber auch innerhalb optimale Glycerin Ebenen, bakterielle Aktien zu voll darf nicht Tauwetter Lager Lebensfähigkeit und DNA-Schäden als eine Kombination von Membranschäden aus wieder einfrieren und zytotoxische Wirkung von Glycerin zu führen kann reduziert. Wenn es festgestellt wird, dass eine bakterielle Aktie ergibt sich eine geringe Kolonie zählen oder die Zellen mit einer konstant niedrigen Übertragungsrate (manifestiert als OD600 Rampe Langsamkeit beim Ausdruck) dividiert werden, deshalb erneut transformieren das Plasmid und eine neue Aktie zu machen eine einfache erster Ansatz, um dieses Problem zu beheben. In diesem Sinne empfiehlt es zur Gewährleistung der langfristigen Erhaltung der bakterielle Aktien und Integrität der DNA, die Kopien von Ihrem Plasmid als gereinigte DNA eingefroren im Wasser und nicht in den Zellen zu speichern. Speicherung von DNA auf diese Weise wird sichergestellt, dass bei unvorhergesehenen Ereignissen wie einer gescheiterten Lager oder Gefrierschrank, eine zuverlässige Quelle für die ursprüngliche DNA für die Transformation verwendet werden kann.
Ein weiterer entscheidender Schritt im ELP-Fertigung ist die Reinigung des Zielproteins vom Ausdruck Host. Proteingewinnung aus E. Coli wird erreicht durch das Brechen der Zellwand mit nukleierenden Eiskristalle, die bilden in der hängenden Zelle lysate auf Einfrieren, die mit aufeinanderfolgenden Gefrier-tau-Zyklen noch verstärkt wird. Alternative Methoden zur Brechung der Zellwand können z. B. Ultraschall oder eine Presse genutzt werden. In Folge Einfrieren Auftauen von der lysate ist insbesondere vorteilhaft, da bedarf es nur ein Gefrierschrank und keine andere Spezialausrüstung. Dieses Verfahren löst jedoch nonspecifically DNA, RNA und Protein Verunreinigungen, neben Proteasen, die das Potenzial haben, das Zielprotein verschlechtern. Daher, um Kontamination zu vermeiden und Ertrag, Deoxyribonuclease ich (DNase) und Phenylmethanesulfonyl Fluorid (PMSF) werden hinzugefügt, um die Zelle lysate zu erniedrigen die DNA und hemmen Proteasen, bzw. reduziert. Das Vorhandensein von DNA vor der Zugabe von DNase kann visuell als einen "sehnig" Auftritt im gesamten Re hängenden Zelle lysate, nach dem ersten Tauwetter beobachtet werden. DNase aktiv verschlechtert diese DNA und so verringert die Viskosität der Zelle lysate erleichtert das Reinigen durch Zentrifugation. Optimalen Abbau von DNA kann visuell bestätigt werden, indem sichergestellt wird, dass die Zelle lysate scheint ganz flüssig sein und strähnige Aussehen nicht mehr sichtbar ist. Wir haben in der Praxis beobachtet, dass die Zugabe von ~0.1 mg pro mL Zelle lysate DNase ausreichen, um die notwendigen Abbau zu erreichen. Allerdings wird das Vorhandensein von DNA noch eingehalten, kann weitere DNase gefolgt durch weitere zwei bis drei Stunden Agitation hinzugefügt werden. Ein ähnliches Problem kann auch auftreten, wenn DNase vorzeitig hinzugefügt wird, bevor eines der lysate hat das Potenzial, ausreichend Auftauen. In diesem Fall können die kälteren Temperaturen die Effizienz von DNA-Abbau aufgrund der vorzeitigen Inaktivierung von DNase begrenzen. Um dieses Problem zu vermeiden, empfiehlt es oft neu suspendierten Pellet Auftauen für ca. 8 Stunden vor der Behandlung mit DNase zu ermöglichen. Darüber hinaus möglicherweise wenn eiweißarme Erträge gemeldet und der Abbau von DNA hat ausgereicht, die Zugabe von mehr PMSF zur Verringerung der weitere potenzielle Proteinabbau aus Proteasen erforderlich.
Weitere Überlegungen zur Gewährleistung optimaler Ausdruck der ELPs gehören eine sorgfältige Verständnis für die Vorteile und Grenzen des gewählten Antibiotikums. Hier wurden pET15b Vektoren mit einem Ampicillin-Resistenz-Gen für Protein-Expression verwendet. Funktional, ermöglichen das Haustier Vector Serie bedeutende Proteinexpression mit weniger als 50 % der Proteinexpression ein Bakterium das Zielprotein nach einer erfolgreichen Induktion32,33gewidmet. Als Auswahl Antibiotikum Ampicillin kommt jedoch mit einigen Einschränkungen, die optimalen Ausdruck stören können. Abbau von Ampicillin in Anwesenheit von E. Coli kann erstens schnell durch die Freisetzung von Beta-Lactamase auftreten. Wenn eine ausreichende Menge an die Ampicillin abgebaut wird, kann die Ampicillin-Codierung Plasmid (d. h. die ELP-Codierung Plasmid) vollständig verloren gehen. Infolgedessen wenn ELPs für längere Laufzeiten mit dem Ausdruck, werden Ausdruck proteingehalte überwacht zu aufeinander folgenden Zeitpunkten um sicherzustellen, dass ausreichender Menge des Gens ELP-Codierung bleibt um wünschenswerte Ausdruck zu ermöglichen. Mögliche Methoden zur Problembehandlung des Aufbau von Beta-Lactamases gehören Spinnen sich die Starterkultur und erneut Aussetzung der Zellen in antibiotikafreien Medium vor dem impfen die Ausdruck-Medium. Dieser Prozess effektiv begrenzt die Übertragung von Antibiotika-abbauenden Enzymen und sorgt für einen größeren Teil der Zellen enthalten die Ziel-Protein-encoding-Vektor. Darüber hinaus hat Ampicillin eine begrenzte Haltbarkeit von etwa zwei bis drei Wochen. Daher sollten Kultur Platten für Protein-Expression bei 4 ° C für maximal zwei Wochen vor dem Gebrauch gespeichert werden. Schließlich, um die Wirksamkeit von Ampicillin innerhalb der Starter und Expression Media, Ampicillin-Stammlösung zu gewährleisten sollte werden produziert frische sofort vor verwenden, Langzeitspeicher zu einem weniger wirksames Antibiotikum führen.
Das Vorhandensein einer LCST ermöglicht die einfache Reinigung der ELPs durch Temperaturwechsel. Insbesondere verursachen bei höheren Temperaturen und in Anwesenheit von Salzen entropische Kräfte ELPs werden weniger wasserlöslich und bilden anschließend eine Polymer-reichen coacervate Phase. Auf der anderen Seite, bei niedrigeren Temperaturen, ELPs bleiben löslich und lösen sich leicht in die Lösung. Radfahren zwischen diesen zwei Temperaturregime gepaart mit Zentrifugation Schritte, sammeln und entsorgen Sie die nicht-ELP-haltigen Phase nacheinander konzentriert sich das Protein und reduziert gleichzeitig die Existenz von nicht-ELP Verunreinigungen.
Allerdings gibt es eine Reihe von Stadien, wo ELPs in diesem Reinigungsprozess verloren gehen können. Erstens ist vor jedem kalten Spin, die Protein-haltigen Lösung zu einem pH-Wert von 9,0 alkalisiert. Diese höheren pH-Wert dient zum Deprotonate bestimmte Aminosäuren auf das Protein Rückgrat, so dass sie effektiv in geladenem Zustand und die weitere Verbesserung ihrer Löslichkeit. Infolgedessen kann Verzicht auf diesen Schritt oder nicht genügend Zeit für die Protein-Auflösung zu einem Rückgang der Rendite führen, wie Proteine nicht solubilisiert werden bei der Zentrifugation oelletiert und verworfen.
Ebenso können Zielproteine während des heißen Spin-Verfahrens verloren sein, wenn das ESP pelleted ist. Zunächst wird der eiweißreichen überstand die Löslichkeit der ELP reduzieren NaCl hinzugefügt. Die Salze Arbeiten zur Abschirmung von elektrostatischer Wechselwirkungen zwischen den Proteinen und Wasser Molekülen, verursacht das Protein aus der wässrigen Phase zu trennen. Dieser Effekt wird noch verstärkt durch Erhitzen der Lösung, die aufgrund der entropische Effekte weiter bricht die wasserhaltigen "Käfig" rund um ELPs und zwingt die Aggregation der Proteine. Bei niedrigeren proteinkonzentrationen (i.e., der ersten thermischen Zyklus), Zugabe von Salzen allein ist oft nicht ausreichend, um diese Phasentrennung führen. Allerdings erhöht sich die Konzentration des Proteins (i.e., später thermischen Zyklen), und es gibt weniger sekundäre Verunreinigungen zur Interaktion mit den Salzen, das ESP wird leichter Niederschlag. Infolgedessen wenn Salze zu schnell hinzugefügt werden, können sie physisch eingeklemmt werden durch Aggregation der Proteine, die effektiv reduziert den Salzgehalt der Lösung und weitere Proteinfällung begrenzt. So sollte das Salz hinzugefügt werden, in drei kleinen Chargen um sicherzustellen, dass sie genügend Zeit, um durch die Lösung homogen verteilen. Als abschließende Bemerkung Variationen mit dem ELP-Backbone, entweder durch weitere Änderungen in der Gast-Rückstand der Elastin-ähnliche Region oder Änderungen an der Bio-aktiven Region können das LCST Verhalten erheblich beeinträchtigen. Folglich um optimale Protein Erträge über Protein-Varianten zu gewährleisten, ist es entscheidend zur Optimierung der pH-Wert, Salzgehalt und Salz Typ (zB., monovalenten oder zweiwertige) für die kalt- und Spins.
SDS-PAGE nach Protokoll Abschluss ausgeführt wird empfohlen, da es lässt sich leicht feststellen, ob signifikanter ELP Verlust tritt auf, während der die Reinigungsschritte. Kurz, wenn im Anschluss an einer heiße Runde überstand ELP erkannt wird, wird dann das Protein nicht effektiv ausgefällt werden. Ebenso wenn ELPs in einer Stichprobe von solubilisiert Pellet nach einem kalten Spin gekennzeichnet sind, ist dann das Protein nicht effektiv aufgelöst wird.
ELP Hydrogele bieten viele Vorteile gegenüber synthetischen oder natürlich gewonnenen Materialien. Insbesondere bietet die Verwendung von Amin-reaktive Vernetzer THPC einen kostengünstige, einfachen und einstellbaren Mechanismus der Protein-Vernetzung. Es gibt jedoch verschiedene Einschränkungen innerhalb der Vernetzung-Protokolls, die beachtet werden sollten. THPC Sauerstoff empfindlich, und wenn unter falschen Bedingungen gelagert, kann es schnell Reaktion Effizienz verschlechtern. Darüber hinaus kann aufgrund seiner Reaktivität mit primären Aminen, THPC mit den umliegenden Proteine in Medien oder diejenigen auf der Zelloberfläche, die reich an Aminen reagieren. Daher, wenn ELP Hydrogele bilden, empfiehlt es sich, Medien Kontamination mit der Pellet-Zelle möglich exogene Protein Kreuzreaktivität und somit eine Reduzierung in vernetzungseffizienz zu reduzieren. Zu guter Letzt dieser Vernetzung Mechanismus schließt die Bio-aktiven Region-Sequenz, die diejenigen, die keine Rückstände von Lysin enthalten und somit begrenzt möglichen Integration von einigen Zelle-Klebstoff-Motive (zB., IKVAV34). Diese Einschränkungen, Änderungen an dem ELP-Backbone mit Natriumazid und Bicyclononyne (BCN) ermöglicht Reaktionspartner für Bio-orthogonal Vernetzung, wie zuvor beschrieben27.
Es sei darauf hingewiesen, dass das ELP LCST Verhalten eine wichtige Rolle im diktieren Hydrogel Mikrostruktur spielt. Im Temperaturregime oberhalb der LCST Niederschlag ELPs aus der Lösung führt zur Bildung von Protein-reiche und Protein-defizienten Phasen, die Matrix Porosität beeinflussen können und vernetzungseffizienz der Matrix9. Da die meisten Zelle Kultur Experimente bei physiologisch relevanten Temperaturen (~ 37 ° C) über das ELP LCST durchgeführt werden, diese Effekte zu berücksichtigen. Für die Hydrogele effektiv vernetzen und Form muss ein Netzwerk von miteinander verbundenen Protein, das primäre Amin aus Lysin physisch THPC Vernetzer zugänglich. Tritt die ELP-Aggregation vor erreichen ausreichende Vernetzung, möglicherweise ELPs gefangen innerhalb der Protein-reiche Phase nicht zugänglich und somit nicht zur Teilnahme an Vernetzung. Um diese Einschränkung zu beheben, erfordert unser Protokoll eine erste 15 min Vernetzung bei Raumtemperatur, die für die vorläufige Vernetzung von Hydrogel ermöglicht, bevor das ESP die thermische Phasenübergang durchläuft. Diese Raumtemperatur Inkubation folgt eine weitere 15 min Inkubation bei 37 ° C, Hydrogel Vernetzung abzuschließen. Dieses Verfahren ist für ausreichende Vernetzung und robust, reproduzierbare Gelierung des ELP Materials entscheidend.
Abschließend bieten rekombinanten Proteins Hydrogele hergestellt mit ELP außergewöhnliche Einstellbarkeit der Proteinreihenfolge und damit die 3D Zelle Mikroumgebung. ELP Polymere wurden in einer Vielzahl von in Vitro und in Vivo -Systemen gezeigten ausdrückbare in hohe Erträge, aufgrund ihres Verhaltens LCST leicht gereinigt werden und biokompatibel. Die Verwendung von E. Coli als rekombinante Host bietet eine einfache und kostengünstige Verfahren, die perfekte Kontrolle des Polymers Molekulargewicht und Funktionalität in der Nähe von entstehen. In Verbindung erlaubt diese Technik für robuste Einstellbarkeit und Reproduzierbarkeit der Hydrogel-Plattform für die Kultur einer Vielzahl von Zelltypen in 3D ermöglichen. Schließlich ist diese ELP-Hydrogel-Plattform offen für viele nachgeschaltete biochemische Tests einschließlich qRT-PCR, Western-Blot, DNA-Extraktion und Zelle Immunostaining9.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Die Autoren danken T. Palmer und H. Babu (Stanford Neurochirurgie) für die Bereitstellung von murinen NPCs. Vektorgrafiken in Abbildung 4 wurde eingesetzt und angepasst von Servier Medical Art unter Creative Commons Attribution 3.0 Unported Lizenz (https://creativecommons.org/ licenses/by/3.0/legalcode). Teil dieser Arbeit wurde an der Stanford Nano geteilt Einrichtungen (SNF), unterstützt von der National Science Foundation unter Award ECCS-1542152 durchgeführt. N.A.S erkennt Unterstützung aus dem National Institute of General Medical Sciences von den National Institutes of Health (32GM 008412). C.M.M. würdigt Unterstützung durch ein NIH NRSA Pre Promotionsstipendium (F31 EB020502) und Siebel Scholars Program. S.C.H. räumt Unterstützung von den National Institutes of Health (U19-AI116484 und R21 EB018407), National Science Foundation (DMR-1508006) und am California Institute for Regenerative Medicine (RT3-07948). Diese Forschung finanziell unterstützt von der Allianz für Regenerative Rehabilitation Research & Training (AR3T), die von Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health und menschlichen Entwicklung (NICHD), National Institute of unterstützt wird Neurologische Erkrankungen und Schlaganfall (NINDS) und National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering (NIBIB) von den National Institutes of Health unter Nummer P2CHD086843 Award. Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht notwendigerweise die Ansichten von den National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Elastin-Like Protein Expression and Purification | |||
| 10 cm Petri Dishes | Thermo Fisher Scientific | FB0875713 | |
| 70% Ethanol | RICCA Chemical | 2546.70-1 | |
| Ammonium Sulfate | Sigma-Aldrich | A3920-500G | |
| Ampicillin | Thermo Fisher Scientific | BP1760-25G | |
| Bacto Agar | Thermo Fisher Scientific | 9002-18-0 | |
| BL21(DE3)pLysS Competent Cells | Invitrogen | C606003 | |
| Chloramphenicol | Amresco | 0230-100G | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| EDTA disodium salt, dihydrate | Thermo Fisher Scientific | O2793-500 | |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | BP229-4 | |
| Isopropanol | Thermo Fisher Scientific | A451-4 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Thermo Fisher Scientific | BP1755-10G | |
| Luria Broth | EMD Millipore | 1.10285.5007 | |
| Parafilm | VWR | 52858-000 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | MP Biomedicals | 195381 | |
| Sodium Chloride | Thermo Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S 8045-1KG | |
| Syringe Filter Unit (0.22 μm) | Millipore | SLGP033RB | |
| Terrific Broth | Millipore | 71754-4 | |
| Tris Base | Thermo Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Cell Encapsulation in 3D ELP Hydrogels | |||
| 0.22 μm syringe filters | Millipore | SLGV004SL | |
| 0.5 mm thick silicone sheet | Electron Microscopy Science | 70338-05 | |
| 24-well tissue culture plates | Corning | 353047 | |
| Disposable Biopsy Punch (2 mm) | Integra Miltex | 33-31 | |
| Disposable Biopsy Punch (4 mm) | Integra Miltex | 33-34 | |
| Disposable Biopsy Punch (5 mm) | Integra Miltex | 33-35 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) | Corning | 21-031-CM | |
| No. 1 12 mm glass coverslips | Thermo Fisher Scientific | 12-545-80 | |
| Tetrakis(hydroxymethyl)phosphonium chloride (THPC) | Sigma-Aldrich | 404861-100ML | |
| 0.5% Tryspin/EDTA | Thermo Fisher | 15400054 | |
| Immunocytochemistry of Cells in 3D ELP Hydrogels | |||
| 16% (w/v) Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15701 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Roche | 3116956001 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Molecular Probes | D1306 | |
| Donkey Serum | Lampire Biological Labs | 7332100 | |
| Goat anti-mouse Secondary Antibody (AF488) | Molecular Probes | A-11017 | |
| Goat anti-rabbit Secondary Antibody (AF546) | Molecular Probes | A-11071 | |
| Goat Serum | Gibco | 16210-072 | |
| Mouse Nestin Primary Antibody | BD Pharmingen | 556309 | |
| Mouse Sox2 Primary Antibody | Cell Signaling Technology | 23064S | |
| Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Vectashield Hardset Mounting Medium | Vector Labs | H-1400 |
References
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