Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Produktionen av Elastin-liknande Protein hydrogeler för inkapsling och immunfärgning av celler i 3D

Published: May 19, 2018 doi: 10.3791/57739
Automatic Translation
*1, *2, 1, 2
1Department of Bioengineering, Stanford University, 2Department of Materials Science and Engineering, Stanford University
* These authors contributed equally

Summary

Rekombinant protein-engineered hydrogeler är fördelaktiga för 3D cellkultur eftersom de tillåter för komplett tunability av polymeren ryggraden och därför den cell mikromiljö. Här beskriver vi processen för rekombinant elastin-liknande protein rening och dess tillämpning i 3D hydrogel cell inkapsling.

Abstract

Tvådimensionell (2D) vävnadsodling tekniker har varit avgörande för vår förståelse av grundläggande cellbiologi. Dock samlas traditionella 2D vävnadsodling system brist en tredimensionell (3D)-matris, vilket resulterar i en betydande klyfta mellan resultat in vitro- och in vivo. För att lösa denna begränsning, har forskare konstruerade 3D hydrogel vävnadsodling plattformar som kan härma den biokemiska och biofysiska egenskaper för den i vivo cell mikromiljö. Denna forskning har motiverat behovet av att utveckla material plattformar som stöder 3D cell inkapsling och nedströms biokemiska analyser. Rekombinant protein engineering erbjuder en unik verktygsuppsättning för 3D hydrogel materialdesign och utveckling genom att tillåta specifik kontroll av proteinsekvens och därmed, i förlängningen, de eventuella mekaniska och biokemiska egenskaperna av resultanten Matrix. Här presenterar vi ett protokoll för uttrycket av recombinantly-derived elastin-liknande protein (ELP), som kan användas till formuläret hydrogels med självständigt avstämbara mekaniska egenskaper och cell-självhäftande ligand koncentration. Vi presenterar ytterligare en metod för cell inkapsling inom ELP hydrogels och efterföljande Immunofluorescerande färgning av inbäddade celler för efterföljande analys och kvantifiering.

Introduction

Under det senaste århundradet, har tvådimensionell (2D) vävnadskultur utvecklats till en integrerad verktygsuppsättning för att studera grundläggande cellbiologi i vitro. Dessutom har relativt låg kostnad och enkel protokollen för 2D cellkultur lett till antagandet i många biologiska och medicinska discipliner. Tidigare forskning har dock visat att traditionella 2D plattformar kan leda till resultat att avvika markant från de insamlade i vivo, orsakar dyrbar tid och medel slösas bort för kliniskt inriktad forskning1,2, 3. Vi och andra hypotes att denna diskrepans kan tillskrivas bristen på inhemska biokemiska och biofysiska ledtrådar till cellerna odlade på 2D ytor, som kan vara nödvändiga för optimal spridning och mognaden av olika celltyper.

För att hantera dessa begränsningar och hjälp överbryggar klyftan mellan 2D har in vitro- och in-vivo studier, forskarna utvecklat tredimensionella (3D) hydrogel plattformar för cell-inkapsling1,4,5 ,6. Hydrogeler är perfekt material att sammanfatta den endogena mikromiljö av extracellulär matrix (ECM) i vivo på grund av deras vävnad-liknande mekaniska egenskaper och vatten-svullna struktur som möjliggör snabb transport av näringsämnen och signalering faktorer7,8. Dessutom kan 3D hydrogels utformas oberoende kontroll över mekaniska och biokemiska egenskaper av ställningen. Både matrix mekanik9,10,11,12 och cell-självhäftande ligander13,14,15 är kända att påverka cell beteende i vitro och invivo. Således, 3D hydrogels med avstämbara boenden erbjuder en plattform för att studera de kausala relationerna mellan celler och deras mikromiljö. Kriterierna för en perfekt 3D hydrogel matris innehålla enkla, icke-cytotoxiska celler-inkapsling samt oberoende tunability av fysiologiskt relevanta mekaniska egenskaper och härmar av infödda cell-självhäftande motiv.

Både syntetiska (t.ex., polyetylenglykol, polymjölksyra, poly (glykolsyra)) och naturligt framställda (t.ex., alginat, kollagen, Matrigel) hydrogeler har fördelar jämfört med 2D i vitro kultur plattformar; de har dock även betydande brister som begränsar deras användbarhet. Första, många syntetiskt och naturligt framställda plattformar kräver hårda crosslinking förhållanden som kan vara potentiellt giftiga för däggdjursceller, vilket leder till minskade cell lönsamhet7. Dessutom många syntetiska plattformar saknar infödda bioaktivitet och behöver vara functionalized sekundära kemiska reaktioner, som kan lägga ökad kostnad och komplexitet16. Slutligen, medan naturligt framställda material innehåller vanligtvis inneboende bio-aktiva domäner, de är ofta plågas av hög sats till sats variabilitet och ofta är begränsade till bildar relativt svag geler7,17.

Rekombinant protein engineering presenterar en unik verktygslåda för materialdesign genom att explicit kontroll över proteinsekvens och, i förlängningen, de eventuella mekaniska och biokemiska egenskaperna hos den slutliga hydrogel schavotten18. Dessutom, genom att utnyttja den välkända biologiska maskinen av Escherichia coli (E. coli) att uttrycka proteiner, kan material produceras kostnadseffektivt och konsekvent med begränsad inter - och intra-batch variabilitet. Proteinet elastin-liknande (ELP) presenteras här har tre bakåtkompilerade domäner: (1) en T7 och His6-tagg som möjliggör märkning fluorescently taggade antikroppar, (2) en 'elastin-liknande' region som ger elastiska mekaniska egenskaper och möjliggör kemiska crosslinking, och (3) en 'bio-aktiva' region som kodar för cell-självhäftande motiv.

Vår elastin-liknande region är baserad på den kanoniska (Val-Pro-Gly-Xaa-Gly)5 elastin sekvens där fyra av de 'Xaa' aminosyra platser är isoleucin (Ile), men kan vara utformade för att vara någon aminosyra utom prolin. Denna sekvens begåvar rekombinant ELPs med lägre kritisk lösning temperatur (LCST) beteende som kan utnyttjas för enkel rening efter uttryck via termisk cykling19,20. Detta LCST boende kan stämmas till termiskt samlade vid olika temperaturer genom att ändra den gäst 'Xaa' rester21,22.

Här, har den 'Xaa' positionen på en av de fem elastin-liknande repetitioner ersatts med amine-presenterande lysin (Lys) aminosyran, som utnyttjas för hydrogel crosslinking. Vårt tidigare arbete har visat icke-cytotoxiska och robust crosslinking via reaktion med amine-reaktivt crosslinker tetrakis (hydroximetyl) phosphonium klorid (THPC)23. Av varierande övergripande innehåll och crosslinker proteinkoncentration kan vi producera hydrogels som kan ställas in för att spänna över ett fysiologiskt relevanta stelhet utbud (~0.5-50 kPa)9,23,24. Utöver tuning mekaniska egenskaper, cell adhesion inom hydrogel resultaten från integrationen av kanoniska cell-självhäftande domäner inom ryggraden av proteinet ELP. Till exempel införlivandet av den utökade Fibronektin-härledda 'RGDS' aminosyrasekvensen möjliggör celladhesion och konfirmerande flexibilitet, medan den kodade, icke-bindande 'RDGS' variant begränsar cell-matrix vidhäftning24. Genom att modulera förhållandet mellan cell-lim till icke-häftande proteiner samt totalprotein koncentrationen, kan vi effektivt producera hydrogels som spänner över ett brett spektrum av liganden koncentration. Resultantly, har vi utvecklat en hydrogel plattform med frikopplat biokemiska och biofysiska egenskaper, som självständigt kan stämmas för optimal 3D kultur av olika celltyper.

Utöver matrix stelhet och självhäftande ligand tunability erbjuder rekombinant hydrogels möjlighet att design specifika materiella nedbrytning profiler, vilket är nödvändigt för cell spridning, spridning och migration inom en 3D sammanhang4 , 9. denna nedbrytning ges av cell utsöndring av proteaser som specifikt inriktar utökade 'RGDS'9 - eller elastin-liknande sekvens25. ELP hydrogeler har också visat sig stödja de efterföljande biokemiska analyser som är nödvändiga för att studera cellernas viabilitet och funktion inklusive immuncytokemi samt DNA/RNA/protein utvinning för kvantitativa omvänd transkription-polymeras-kedjereaktion (qRT-PCR) och Western blot9. ELP varianter har också använts i ett antal i vivo modeller och är kända för att vara tolereras väl av immunsystemet26.

Sammantaget ELP som en materiell plattform för cell-inkapsling studier ståtar med en mängd fördelar jämfört med syntetiskt eller naturligt framställda material plattformar, som ofta saknar samma grad av biokemiska och biofysiska tunability och reproducerbarhet. Dessutom ELPS enkla och icke-cytotoxiska användning med en mängd olika celltyper (t.ex., chick dorsalrotsganglier ganglier14,24, murina neurala stamceller celler9, mänsklig mesenkymala stamceller27, nötkreatur neonatal kondrocyter28, mänskliga endothelial celler29,30) möjliggör en mer fysiologiskt relevanta modell av endogena 3D ECM jämfört med 2D cellkultur. Häri, presenterar vi ett protokoll för uttrycket av recombinantly-derived, ELPs för användning som en avstämbara hydrogel plattform för 3D cell inkapsling. Vi presenterar ytterligare metoder för nedströms fluorescerande märkning och konfokalmikroskopi inkapslade celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ELP uttryck protokoll

  1. Dag 1: Växande starter kolonin
    1. Förbereda ampicillin och kloramfenikol agarplattor genom autoklavering 25 g Luria buljong och 15 g agar per 1 L ultrarent vatten. När lösningen har svalnat till ~ 60 ° C, tillsätt 1 mL av ampicillin materiel (100 mg/mL i ultrarent vatten) och 1 mL av kloramfenikol lager (34 mg/mL i 70% etanol) till 1 L agar lösning för slutliga koncentrationer av 100 µg/mL och 34 µg/mL , respektive. Överför 20 mL av slutliga lösningen till 10 cm petriskålar med serologiska pipett och tillåta agar stelnar. Linda Petriskålarna med parafilm och förvaras vid 4 ° C.
      Obs: petriskålar kan lagras vid 4 ° C i upp till två veckor.
    2. Strimma ett litet urval av BL21 (DE3) pLysS E. coli från en pre-gjord bakteriell lager som innehåller en pET15b vektor kodning en ELP sevärdheter på en ampicillin och kloramfenikol agarplatta.
      Obs: De ampicillin och kloramfenikol Välj för bakterier som innehåller både pET15b och pLysS vektorer, respektive.
    3. Placera strimmiga plattan uppochner i en inkubator vid 37 ° C. Låt de bakterie kolonierna att växa över natten.
      Obs: Inte Inkubera plattorna längre än 16 h som ampicillin försämras och kolonierna som inte bär ampicillin-resistens kan bilda.
  2. Dag 2: Beredning av förrätt kultur och expression media
    1. Ta bort E. coli kulturen från inkubatorn. Parafilm plattan och store för högst 4 dagar vid 4 ° C.
    2. Förbereda en förrätt kultur kolv (250 mL) och uttryck kultur kolvar (12 x 1 L) och autoklav. För 1 L i expression media, lägga till 47,6 g fantastisk buljong och 4 mL glycerol 1 L ultrarent vatten i en 2 L förbryllad kultur kolv och keps med aluminiumfolie.
      Obs: Typiska avkastningen är 60-100 mg/L protein i expression media.
    3. Läsa in Ånghärdad startmotorn i förväg värmde, 37 ° C skakningar inkubator och inkubera utan agitation.
    4. Tillsätt 250 µL av sterila-filtrerad (0,22 µm filter) ampicillin lager (100 mg/mL i ultrarent vatten) till förrätt kultur för en slutlig koncentration på 100 µg/mL. Omedelbart börja agitera förrätt kultur vid 250 rpm.
      Obs: Kloramfenikol används endast för kolonin urval på agarplattor och ingår inte vid flytande kulturer.
    5. Inokulera starter kulturen genom att lägga till en enda ELP plasmid-innehållande E. coli koloni från strimmiga plattan och låt den förrätt kulturen att skaka vid 37 ° C i 16 h.
    6. Placera uttryck kulturmassmedia kolvar i förväg värmts, 37 ° C skakar inkubatorer och inkubera över natten utan agitation så att behållarna är redo att Inokulera nästa morgon.
  3. Dag 3: Inducerande proteinuttryck i E. coli
    1. Se färska, steril-filtrerad ampicillin lager (100 mg/mL i ultrarent vatten). Tillsätt 1 mL av ampicillin lager i varje kolv i expression media för en slutlig koncentration på 100 µg/mL.
    2. Börja agitera uttryck media vid 250 rpm.
    3. Ta en 2 mL prov av media från alla uttryck kolv och lägga till en kyvetten som en tom för en optisk densitet läsning på 600 nm (OD600).
    4. Efter slutförandet av 16 h förrätt kultur inkubation, Inokulera varje uttryck kolv med överför 20 mL av förrätt kultur i varje uttryck kolv via en serologisk pipett.
    5. Efter slutförandet av 1 h agitation, mäta OD600 av en av de uttryck kolvarna. Efter detta steg bör mäta OD600 varje 20 min, kontrollera en annan kolv varje gång.
    6. På en OD600 0,6, minska temperaturen på de shakers som innehåller uttrycket kolvar till 32 ° C.
    7. Kontrollera den OD600 varje 10 min. På en OD600 0.8, inducera uttrycket genom att tillsätta 1 mL 1 M, steril-filtrerad β-isopropyl thiogalactoside (IPTG) i ultrarent vatten till varje uttryck-kolv.
    8. Låt den E. coli i uttrycket kolvar att uttrycka för 7 h.
    9. 20 min före slutet av uttryck, cool före en stor våning centrifug till 4 ° C.
    10. Samla alla 12 L i expression media i enskilda centrifug behållare och balans.
    11. Centrifugera uttryck media på > 12 000 x g i 15 min vid 4 ° C med en våning centrifug.
    12. Häll av supernatanten från varje centrifug behållare. Med hjälp av en spatel, samla in cell pellets i en pre vägde zip-lock påse.
    13. Resuspendera pelleten i steril-filtrerad tio buffert (buffert per 25 g pellet 100 mL) och ta bort någon överflödig luftbubblor genom att massera pelleten. För 1 L av tio buffert, lägga till 5,8 g natriumklorid, 1,21 g av tris base och 0,37 g av etylendiamin tetraacetic acid (EDTA) dinatrium salt dihydrat 900 ml av ultrarent vatten. Justera pH till 8.0 och föra till 1 L. I detta steg måste är pH-remsor tillräckliga.
    14. Placera den zip-lock påse innehållande åter svävande cellpelleten i en sekundär behållare och frysa vid-80 ° C över natten.
  4. Dag 4-6: spricker den bakteriella cellväggen genom frysning-tining cykler
    1. Bort den frysta pelleten från frysen och låt den Tina långsamt vid 4 ° C med mild agitation med orbitalskak.
    2. Låt pelleten Tina tills någon vätska är närvarande. Lägg till ~ 30-40 mg av deoxyribonuclease tinade I (DNase) till lysate. Dessutom, tillsätt 1 mL 100 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF; en proteashämmare) i isopropanol per 100 mL cell lysate. Låt den lysate skaka över natten.
      Obs: Lägga till DNAS och PMSF är endast nödvändigt för den första frysning-tining cykeln.
      Varning: PMSF är giftiga vid inandning. En ansiktsmask ska användas vid hantering av PMSF pulver.
    3. När cellen lysate är helt tinade, frysa den lysate vid-80 ° C över natten, eller tills helt fryst.
    4. Upprepa förfarandet för frysning-tining för sammanlagt tre cykler. Lämna den lysate tinade vid 4 ° C efter den sista frysning-tining. Lagra 100 µL av rå lysate för sodium dodecyl sulfate-polyakrylamid gelelektrofores (SDS-PAGE) analys vid ingående av rening.
    5. Efter sista blidvädret, justera pH-värdet i den tinade lysate 9,0 med 1 M NaOH. I detta steg måste är pH-remsor tillräckliga. Inkubera vid 4 ° C under minst 1 h (över natten är lämpligt) i orbitalskak.
  5. Dag 7-9: ELP rening via kalla och varma spin termisk cykling
    1. Cool golvet centrifugen till 4 ° C 20 min före centrifugering.
    2. Delprov och balans de tinade lysate i centrifug behållare.
    3. Centrifugera proverna på > 15 000 x g för 1 h vid 4 ° C. Lagra 100 μl av supernatanten för SDS-PAGE analys efter slutförandet av rening.
      Obs: Efter centrifugering ELP proteinet bör förbli i supernatanten på grund av dess höga löslighet i vatten vid temperaturer under dess LCST (< 32 ° C).
    4. Överför supernatanten till nya centrifug behållare och balansera på rätt sätt.
    5. Lägga till natriumklorid (NaCl) i tre delar till en slutlig koncentration på 1 M (5,84 g NaCl för varje 100 mL av supernatanten). Kontrollera att NaCl har lagts i tre delar för att möjliggöra tillräcklig upplösning.
    6. Agitera för 3 h vid 37 ° C vid 250 rpm i en skakande inkubator.
    7. 1 h före utgången av agitation, värma pre en golvet centrifug till 37 ° C.
    8. Centrifugera vid > 15 000 x g för 1 h vid 37 ° C. Lagra 100 μl av supernatanten för SDS-PAGE analys efter slutförandet av rening och kassera återstående supernatanten.
      Obs: Efter centrifugering ELP proteinet bör vara pelleterat på grund av dess låga vattenlöslighet vid temperaturer över dess LCST (> 32 ° C).
    9. Resuspendera pelleten genom att tillsätta 10 mL autoklaveras, ultrarent vatten per 1 g pellet. Använd en metall spatel för att mosa pelleten till stöd i upplösningen av proteinet.
    10. Justera pH-värdet i den tinade lysate 9,0 med 1 M NaOH. I detta steg måste är pH-remsor tillräckliga.
    11. Agitera över natten vid 4 ° C i orbitalskak.
    12. Upprepa förfarandet kalla och varma spin termisk cykling för sammanlagt tre cykler (dvs., upprepa steg 1.5.1 genom 1.5.11 för tre totala cykler).
  6. Dag 10-15: ELP dialys och frystorka den
    1. Centrifugera åter suspenderade pelleten i en pre kyld centrifug på > 15 000 x g för 1 h vid 4 ° C. Lagra 100 μl av supernatanten för SDS-PAGE analys efter slutförandet av rening.
    2. Avsalta protein lösningen av dialyzing återstående supernatanten i en 3,5 kDa dialys membran mot 4 L före kylda ultrarent vatten vid 4 ° C. Byta dialys vatten två gånger om dagen totalt 6 gånger över 3 dagar.
      Obs: Typiska supernatant volymer är mellan 5 och 30 mL.
    3. Centrifugera dialyzed lösningen i en nedkylda Centrifugera vid > 15 000 x g för 1 h vid 4 ° C. Lagra 100 μl av supernatanten för SDS-PAGE analys i slutet av rening.
    4. Frysa den resulterande supernatant vid-80 ° C i förväg vägda koniska rör.
    5. Lyophilize frysta lösningen för 3 dagar och massa slutprodukten att bestämma protein avkastningen.
    6. Parafilm rören som innehåller slutliga frystorkade ELP produkt och store vid 4 ° C.
    7. Kör SDS-PAGE för att bestämma renheten av protein.
      Obs: Protokoll för SDS-PAGE kommer att variera beroende på specifika agaros gel villkor. För våra experiment, slutliga frystorkade protein upplöstes till en koncentration av 0,5 mg/mL avjoniserat vatten och kör på 140 V för 70-100 min i en 12% (w/v) akrylamid gel under denatureringen villkor.

2. cellen inkapsling i 3D Elastin-liknande Protein Hydrogels

  1. Beredning av silikon formar
    1. Använda en biopsi punch med önskad diameter för att skapa hål i en 0,5 mm tjockt silikon ark och klipp ut en fyrkant runt varje hål. Upprepa för antalet formar önskas.
      Obs: Diameter och tjocklek av formarna kan justeras för den särskilda tillämpning och cell odlingsbetingelser. I praktiken, för cellkulturer av 50 106 celler/mL, 0,5 mm tjocka formar med 4 mm och 5 mm diametrar rekommenderas för tillräcklig DNA/RNA och protein utvinning, respektive. För immunfärgning, kan en 2 mm biopsi punch användas för att istället skapa tre intilliggande hål per kvadrat mögel så att tre replikat kan färgas per brunn.
    2. Ta bort plast wrap på varje sida av enskilda mögel med pincett.
      Obs: Undvik kontakt med exponerade silikon ytan som förorening kan minska framtida plasma limning effektivitet.
    3. Med pincett, ordna samma antal bare silikon formar och glas coverslips (nr 1, 12 mm diameter) i alternerande rader på inverterad locket 48-bra platta. En gång fullständig, täck locket på 48-väl plattan att undvika kontaminering.
    4. Syre plasma behandla hela 48-väl plattan locket (dvs., formar och glasskivor). Omedelbart efter, använda pincett för att invertera silikon mögel in på det angränsande täckglaset. Tryck hårt på mögel att säkerställa limning. Låt formarna Inkubera vid rumstemperatur i 1 h.
      Obs: Syre plasma behandlingstiden varierar beroende på de instrument som används. Typiska villkoren för vårt instrument är ett rörelseresultat gas trycket fönster mellan 0.3-4 mbar, syre gasflödet vid 20 cm3/min och prov exponering för plasma för 10-20 s.
    5. Sterilisera formarna i autoklav. Förvara formarna i rumstemperatur i en steril miljö fram till användning.
      Obs: Formarna kan lagras i detta skede på obestämd tid.
  2. Beredning av elastin-liknande protein stamlösning
    1. Ta bort frystorkade ELP från 4 ° C lagring. Varma proteinet till rumstemperatur innan du öppnar tuben för att säkerställa att ingen kondens bygger på proteinet över upprepad användning.
    2. Upplösa ELP i Dulbeccos fosfatbuffrad saltlösning (DPBS) vid 4 ° C med konstant agitation (dvs., snurrande) över natten.
      Obs: ELP stamlösningens koncentration kommer att spädas ytterligare med tillägg av crosslinker lösning i användardefinierade volymetriska förhållandet. Till exempel för en 3% (w/v) slutlig ELP koncentration, förbereda en 3,75% (w/v) ELP stamlösning som ska spädas i förhållandet 4:1 volymetriska ELP lösning: crosslinker lösning. Justera koncentrationen som krävs för önskat program.
    3. Sterila filter ELP stamlösning använder ett filter med 0,22 µm i sprutan. Lagra ELP på isen när inte i använda.
  3. I biosäkerhet skåp, överföra sterila formarna med steril pincett till ett 24-väl-vävnadskultur tallrik.
  4. Beredning av THPC stamlösning
    1. Späd THPC i DPBS strax före att använda. Justera koncentrationen av THPC lösning enligt slutlig ELP koncentration och önskad crosslinking baserat.
      Obs: För protokollet ELP koncentration på 3% (w/v) kommer att göras genom att blanda ELP stamlösning med THPC lösning på volymetriska förhållandet 4:1. Justera efter behov.
    2. Lägga till 2,6 µL THPC lösning (80% i vatten) 997.4 µL av DPBS.
      Obs: Denna koncentration av THPC motsvarar en stökiometriska förhållandet 1:1 hydroxy metylgrupper på THPC och primära aminer på ELP proteinet vid blandning lösningar på 4:1 beskrivs volymetriska förhållandet för en sista 3% (w/v) ELP hydrogel. Den THPC lösningen är trögflytande och droppar av lösningen kan fastna vid sidan av pipettspetsen. För korrekt koncentrationer, undvika sådana droppar när späda i DPBS. Tömma behållaren THPC lager med kvävgas för att förhindra oxidation av fosfin och inaktivering av crosslinker.
    3. Vortex lösningen att blanda och hålla på is.
    4. Sterila filter THPC stamlösning använder ett filter med 0,22 µm i sprutan. Späd THPC stamlösning ytterligare med sterila DPBS att uppnå lägre stökiometrisk crosslinking nyckeltal (t.ex., 0.5:1 eller 0.75:1).
      Obs: THPC är syre-känslig och den utspädda lösningen ska användas inom ett par timmar efter beredning.
  5. Separera celler genom inkubation med Trypsin-EDTA till en enskild cell suspension, pellet cellerna och räkna cellerna åter upphängd i medium använder en hemocytometer.
    Obs: Exakta protokoll för det här steget beror starkt på önskad celltyp och tillämpning. För de neurala stamceller används i hela detta protokoll, genomfördes en 0,025% Trypsin-EDTA inkubation vid rumstemperatur för 1,5 min. Cellerna var pelleterat vid 200 x g i 2 min. För ökad cellernas viabilitet avbrytas cellerna vid normal medium. Typiska cell densiteterna används för inkapsling cellområde från 1-50 106 celler/mL av slutliga hydrogel volym. Justera efter behov.
  6. Alikvot önskat antal celler i en steril 1,5 mL centrifugrör.
  7. Centrifugera cellerna vid ~ 200 x g i 3 min. noggrant, Aspirera supernatanten och hålla cellpelleten på is.
    Obs: Det är viktigt att helt aspirera alla supernatanten för att mildra ytterligare utspädning av den ELP och THPC crosslinker. Specifika centrifugering hastigheter beroende på celltyp.
  8. Återsuspendering cellpelleten i ELP stamlösning så att volymen är 80% av den slutliga volymen (förutsatt att förhållandet 4:1 ELP lösning: THPC lösning). Pipettera mix 20 - 25 gånger att producera en homogen blandning av cellerna och ELP.
    Obs: Undvik gripande botten av röret för att begränsa temperaturökningen och efterföljande fas övergången av ELP. Varje 2 mm mögel med tre replikat kräver 7,5 µL av slutlig volym (dvs., 6 µL av ELP stamlösning och 1,5 µL av THPC stamlösning) delas lika i de 3 hålen (dvs., 2,5 µL slutlig volym per hål). 4 och 5 mm formarna krävs en slutlig volym av 7,5 µL och 15,5 µL, respektive.
  9. Lägg till THPC stamlösning i cell/ELP suspensionen för resterande 20% sista volymen. Pipettera mix 20 - 25 gånger att producera en homogen blandning.
  10. Pipettera omedelbart de motsvarande slutliga volymerna av cell/ELP/THPC blandning i varje mögel med en cirkelrörelse. Upprepa för alla formar.
  11. Inkubera proverna i rumstemperatur i 15 min, följt av en ytterligare inkubation vid 37 ° C i 15 min.
    Obs: Första inkubationstiden hjälper underlätta inledande crosslinking av hydrogel innan öka temperaturen till som ovan en ELP'S LCST och inducera dess termiska fas segregation.
  12. Tillsätt långsamt 750 µL av varma cellodlingsmedium till varje brunn Skyltens 24-väl, att undvika att störa gelerna.
  13. Inkubera i hydrogels vid 37 ° C i 7 dagar.
    Obs: Full medium ändringar rekommenderas varje 1-2 dagar beroende på celltyp. För att begränsa belastningen på gelen, Använd ett glas Pasteur-pipett fästs med en 200 µL pipettspetsen när aspirera medium från brunnen.

3. immuncytokemi av celler i 3D ELP Hydrogels

  1. Bered den fixering genom att blanda 10 mL 16% (w/v) PARAFORMALDEHYD (PFA) i 30 ml DPBS. Värm lösningen på 37 ° C.
  2. Aspirera på medellång från 24-väl plattan och försiktigt tvätta med 1 mL DPBS.
  3. Lägg till 750 µL av fixering lösning till varje brunn och inkubera vid 37 ° C i 30 min. Använd inte vävnadsodling inkubatorn för att undvika kontaminering av andra kulturer med PFA vapor.
  4. Aspirera försiktigt fixering lösningen från varje brunn, kasta PFA till en lämplig riskavfallsbehållare.
    FÖRSIKTIGHET: Exponering för PFA kan orsaka hud- och ögonirritation. Bär handskar/skyddsglasögon och arbeta i dragskåp kemiska.
  5. Tillsätt 1 mL av DPBS till varje prov. Omedelbart aspirera på DPBS och kasta in PFA avfallsbehållaren.
  6. Tvätta av prov två gånger med 1 mL DPBS för 10 min varje.
    Obs: Prover kan lagras i DPBS vid 4 ° C i upp till en vecka efter tätning plattan med Parafilm.
  7. Permeabilize varje prov med 750 µL permeabilisering lösning (100 mL DPBS och 0,25 mL Triton x-100; PBST) för 1 h i rumstemperatur på en rocker på 15 rpm.
  8. Uppsugning i PBST och tillsätt 750 µL blockerande lösning (95 mL PBS 5 g av bovint serumalbumin (BSA), 5 mL serum och 0,5 mL av Triton x-100) till varje prov. Odla i rumstemperatur i 3 h på en rocker på 15 rpm.
    Obs: Den blockerande lösningen skall innehålla serum från värdarter där de sekundära antikropparna har uppkommit (t.ex., get, åsna) och steril-filtreras genom ett 0,22 µm filter före användning.
  9. Bered den antikropp utspädning (97 mL DPBS, 2,5 g av BSA, 2,5 mL serum (från samma värdart som i steg 3.8) och 0,5 mL av Triton x-100). Späd den primär antikropp med lösningen för spädning antikropp och tillsätt 500 µL av lösningen i varje prov. Försegla plattan med Parafilm och inkubera över natten vid 4 ° C på en rocker.
    Obs: Nestin och Sox2 primära antikroppar var utspädd 1: 400 i lösningen för spädning av antikropp från tillverkarnas ursprungliga koncentration.
  10. Aspirera antikropp lösningen från varje prov och tvätta av prov med PBST i 60 min i rumstemperatur på en rocker på 15 rpm. Upprepa tvättningen 3 gånger.
  11. Späd det sekundära antikroppar och 5 mg/mL lagret DAPI (1:2, 000) med hjälp av antikropp utspädning lösning och tillsätt 500 µL av lösningen i varje prov. Omfattar 24-väl plattan med aluminiumfolie och inkubera över natten vid 4 ° C på en rocker.
    Obs: De sekundära antikropparna är ljuskänsligt, proverna måste skyddas från fotoblekning för alla efterföljande steg. Get antimus- och getsektorn anti-kanin sekundära antikroppar var utspädd 1: 500 i lösningen för spädning av antikropp från tillverkarnas ursprungliga koncentration.
  12. Aspirera antikropp lösningen från varje prov och tvätta av prov med PBST i 30 min i rumstemperatur på navigeringsknappen. Upprepa tvättningen 3 gånger.
  13. Placera en droppe hard-set monteringsmedium på ytan av en glasskiva. Med pincett, ta bort överflödig lösning från mögel genom att lätt läska kanten av formen på en pappershandduk. Placera formen upp och ner på monteringsmedium försiktigt och undvika att införa bubblor.
  14. Möjliggöra montering medellång till härda i 48 h i rumstemperatur. Lagra proverna vid rumstemperatur eller 4 ° C. Möjliggöra montering medellång till fullt Ställ för 48 h innan imaging som brytningsindex av mediet kommer att förändras under loppet av härdning. Försegla proverna i glas täcker bilden med genomskinligt nagellack att minska förorening eller prov rörelse.
  15. Bilden proverna med confocal Mikroskop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De ELPs som används i detta protokoll består av fem regioner: en T7-tagg, His6 tagg, enterokinase (EK) klyvning webbplats, en bio-aktiva region och en elastin-liknande region (figur 1). Taggarna T7 och His6 möjliggör enkel identifiering genom standard Western blot tekniker. Införandet av EK klyvning webbplatsen tillåter för enzymatisk avlägsnande av regionen etiketten, om det behövs. Bio-aktiva regionen kodar för den utökade, Fibronektin-derived cell-lim ('RGDS') eller icke-självhäftande ('RDGS') sekvenser. Slutligen innehåller den centrala upprepningen av regionen elastin-liknande en lysin grupp på webbplatsen guest rester som möjliggör crosslinking via THPC medan de kompletterande repetitioner innehåller isoleucin för att uppnå en LCST ~ 32 ° C31.

Inlägg uttryck, SDS-PAGE eller Western blot kan användas för att visualisera molekylvikten och bekräftar identiteten hos ELPs som innehåller antikroppar taggar, t ex T7 (MASMTGGQQMG) eller His6 (Jennie) (figur 2). Framgångsrika uttryck under kontrollerade betingelser ger en mycket homogen produkt som representeras av närvaron av en enda mörka band på ungefärlig molekylvikt (~ 37 kDa) av dessa proteiner som använder både SDS-PAGE (figur 2A) och Western blot) (Se figur 2B).

Under okontrollerade förhållanden föreslår närvaron av lägre molekylvikt band på en Western blot att en del av proteinerna översattes inte fullständigt eller var förstörd efter uttryck (figur 2 c). Massorna här är specifikt, jämnt fördelade av ~ 9 kDa vilket ungefär motsvarar tyngden av en bio-aktiva regionen och tre elastin-liknande regioner (en ' Upprepa'), eller ungefär en fjärdedel av målproteinet. Dessa mindre protein fragment är vanligt närvarande när uttrycket utförs vid en högre temperatur (> 32 ° C) som i figur 2 c. Förekomsten av dessa lägre molekylvikt proteiner kan leda till oförutsägbara mekaniska egenskaper. Regelbunden screening post uttrycket således rekommenderas för att garantera en högkvalitativ slutprodukt.

Den mekaniska stelhet i ELP-baserade hydrogels kan ändras genom att manipulera koncentrationen av ELP eller förhållandet mellan THPC reaktiva grupper: ELP primära aminer. Samtidigt, kan koncentrationen av cell-självhäftande ligander ställas in genom att ändra förhållandet mellan ELP varianter med cell-limmet (RGDS) till icke-lim (RDGS) sekvenser inom någon stelhet regim. Genom att manipulera dessa två variabler, kan vi producera geler som har ett spektrum av mekaniska egenskaper och ligand koncentrationer (figur 3).

För att kapsla in celler inom 3D ELP hydrogels, är önskat antal celler upphängd i mediet och centrifugeras för att producera en cellpelleten (figur 4A). Mediet är aspirerade från röret, och cellerna är åter svävande jämnt i ELP lösningen av önskad koncentration. Nästa, THPC lösning läggs till cell/ELP fjädringen och pipetteras grundligt för att bilda en homogen blandning. Denna lösning är snabbt överföras till sterila silikon formar inom en 24-well platta med pipett och får crosslink vid rumstemperatur och 37 ° C i 15 min varje (figur 4B). Slutligen, mediet läggs till väl plattan och inkuberas vid 37 ° C i experimentet.

Live/dead färgning kan användas för att bedöma cellernas viabilitet och framgångsrik cell inkapsling inom ELP hydrogels. Som illustreras i figur 5, visar vuxen murina neurala stamceller (NPC) hög cellviabilitet över 7 dagar inom en 3% (w/v) ELP hydrogel.

3D ELP hydrogeler har visat tidigare att stödja NPC stem underhåll mätt genom uttrycket av kanoniska NPC protein markörer SRY (kön bestämma region Y)-box 2 (Sox2) och nestin9. NPC inkapslade i 3% (w/v) ELP hydrogels med låga THPC crosslinking Visa högt uttryck av kärn-lokaliserad Sox2 och cytoplasmiska nestin trådar via immunfärgning och confocal imaging (figur 6).

Figure 1
Figur 1 : En schematisk representation av ELP och motsvarande aminosyresekvenser. En ELP som används i denna studie innehåller en T7 och His6 tagg för antikroppsbaserade imaging, en bioaktiva region för införandet av cell-självhäftande domäner och en elastin-liknande region som ger elastiska mekaniska egenskaper och möjliggör kemiska crosslinking. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Mål proteinuttryck kan valideras med SDS-PAGE och Western blot att bekräfta molekylvikt och identitet av den slutliga frystorkade produkten. Ren fullängds ELP körs på en molekylvikt av 37 kDa som rapporterats av både SDS-PAGE (A) och Western blot med T7 (MASMTGGQQMG) eller histidin 6 (Jennie) tag (B). (C). orena partier av ELP på grund av avvikelserna i ELP uttryck protokollet kan leda till ett uttryck för ELPs med lägre molekylvikt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: RGDS ligand innehåll kan stämmas självständigt från mekaniska egenskaper inom ELP hydrogels. 5% (w/v) och 3% (w/v) ELP hydrogeler har skeva moduli ~ 800 Pa och ~ 400 Pa, respektive. Hydrogeler med förhållandet 1:1 THPC reaktiva grupper: ELP primära aminer var tvärbundna i rumstemperatur i 15 min, värms upp till 37 ° C, och tillåtas att låt jämvikta i 5 min före mätning. Data är medelvärde ± s.d., *p < 0,001. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Schematisk av cell inkapsling i ELP hydrogels. (A). celler dissocieras inledningsvis till en enskild cell suspension i medium och pelleterat med hjälp av en centrifug. Mediet är aspirerade från röret, och cellerna är åter upphängd i ELP lösning på önskad koncentration och blandas väl. Slutligen THPC crosslinking lösningen läggs och blandas väl. (B). omedelbart efter tillägg av THPC, är lösningen kastade i en gjutform med en pipett. Lösningen får crosslink i rumstemperatur i 15 min följt av en andra 15 min inkubation vid 37 ° C. Medlet läggs sedan till kulturen väl under experimentet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Neurala stamceller upprätthålla hög lönsamhet i ELP hydrogels. Representativ bild av neurala stamceller inkapslade i 3% (w/v) ELP hydrogels med 1:1 crosslinking (THPC reaktiva grupper: ELP primära aminer) efter 7 dagar i kultur. Grön: live färgning (calcein-AM); Röd: döda färgning (etidiumbromid homodimer). Skalstapeln = 100 µm.

Figure 6
Figur 6 : 3D ELP hydrogels stödja neurala stamceller cell stem maker uttryck. Immunofluorescens bild av neurala stamceller att uttrycka Sox2 och nestin proteiner efter 7 dagar av kultur i ELP hydrogels. Bilderna visar celler inkapslade i 3% (w/v) ELP geler med 0.5:1 crosslinking (THPC reaktiva grupper: ELP primära aminer). Blå: DAPI (kärnor); Röd: Sox2; Grön: nestin. Skalstapeln = 25 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Rekombinant proteinuttryck och rening är ett kraftfullt verktyg att syntetisera biomaterial med hög reproducerbarhet. På grund av i stort sett tillkomsten av kommersialiserade molekylär kloning, kan anpassade rekombinant plasmider köpas från flera leverantörer, vilket avsevärt minskar den tid att arbeta med material som ELPs. Likaså kan plasmider beställas direkt från den ursprungliga lab när det ursprungliga arbetet stöddes av federala kontrakt och det framtida arbetet blir för ideella användning. Den fullständiga ELP aminosyrasekvensen har tidigare publicerats för flera ELP varianter31. Processen från uttryck till eventuell rening av rekombinanta proteiner innebär dock ett antal kritiska steg som ofta kan leda till minskad avkastning eller en lägre kvalitetsprodukt. Några av de vanligaste frågorna för ELP förberedelse uppstår i något av följande: (1) kvaliteten på lagrade bakteriell bestånd, (2) första frysning-tining cykel för att störa den bakteriella membran, och (3) protein rening genom termisk cykling.

En stor skillnad mellan proteinuttryck och andra icke-biologiska medel producera material är att vi utnyttjar den biologiska maskinen av rekombinant värdar att syntetisera polymerer. Därefter denna teknik kommer med en unik begränsning: cellulär dödsfall eller skada. Celldöd yttrar oftast sig som ett minskat antal bakteriekolonier efter strimmor tallriken eller onormalt liten kolonier som växer relativt långsamt. Bakteriella bestånd, kan om upprätthålls noggrant, förbli stabila i år; successiva frysning-tining cykler på grund av upprepad användning eller frys kan dock minska cellernas viabilitet eller leda till DNA-skador. Typiska BL21 bakterier bestånd använda mellan 10% och 40% glycerol volymprocent blandat med suspenderade celler. Syftet med glycerol är att minska membran skador från nukleations iskristaller under frysning. Därför använder låga koncentrationer (< 10%) kan leda till en komprometterad membran, medan högre koncentrationer (> 40%) kan undertrycka fryspunkten tillräckligt för att där beståndet aldrig fryser leder till celldöd. Dock även inom optimal glycerol nivåer, bör bakteriell bestånd inte tillåtas fullt blidvädret som en kombination av membran skador från åter frysning och cytotoxiska effekter från glycerol kan leda till minskat lager livskraft och DNA-skador. Därför, om det har observerats att en bakteriell lager resulterar i en låg kolonin räkna eller att cellerna delar sig konsekvent långsamt (manifesterad som långsamt OD600 rampen under uttryck), åter omvandla plasmiden och göra ett nytt lager är en enkel första metod för felsökning av problemet. Med detta i åtanke, för att säkerställa långsiktiga underhåll av bakteriell bestånd och integritet av DNA, är det bäst att lagra kopior av din plasmiden som renade DNA fryst i vatten och inte inom celler. Förvaring DNA på detta sätt kommer att säkerställa att en tillförlitlig källa för den ursprungliga DNA i oförutsedda händelser såsom ett misslyckade bestånd eller frys misslyckande, kan användas för omvandling.

En annan avgörande steg i ELP fabrication är rening av målproteinet från uttryck värden. Protein utvinning från E. coli uppnås genom att bryta cellväggen använder nukleations iskristaller som bildas i hela den svävande cell lysate vid frysning, som förvärras ytterligare med successiva frysning-tining cykler. Alternativa metoder för spricker cellväggen kan utnyttjas till exempel ultraljudsbehandling eller ett tryck. I synnerhet är i rad frysa-upptining av den lysate fördelaktigt eftersom det endast krävs en frys och ingen annan specialutrustning. Dock släpper proceduren nonspecifically DNA, RNA och protein föroreningar, förutom proteaser som har potential att brytas ned målproteinet. Därför att undvika kontaminering och minskad avkastning, deoxyribonuclease jag (DNase) och phenylmethanesulfonyl fluor (PMSF) läggs till cell lysate försämra DNA och hämmar proteaser, respektive. Förekomst av DNA före tillsats av DNAS kan observeras visuellt som en 'trådiga' utseende i hela cellen åter svävande lysate efter första blidvädret. DNAS försämrar aktivt detta DNA och därmed minskar viskositeten hos cellen lysate gör det lättare att rena via centrifugering. Optimal bryter ner av DNA kan bekräftas visuellt genom att säkerställa att cellen lysate verkar vara helt flytande och att det trådiga utseendet är inte längre synlig. I praktiken har vi observerat att tillägg av ~0.1 mg per mL cell lysate DNAS är tillräckligt för att uppnå nödvändig nedbrytning. Dock om förekomst av DNA observeras fortfarande, kan mer DNAS läggas följt av ytterligare två till tre timmar av agitation. Ett liknande problem kan också uppstå om DNAS läggs tidigt innan någon av den lysate har haft potential att tillräckligt Tina. I det här fallet kan de kalla temperaturerna begränsa effektiviteten i DNA nedbrytning på grund av för tidig inaktivering av DNAS. För att undvika problemet, är det ofta bäst att tillåta åter suspenderade pelleten Tina i cirka 8 timmar innan behandling med DNAS. Dessutom om låg protein avkastning redovisas och nedbrytningen av DNA har varit tillräcklig, kan tillägg av mer PMSF för att ytterligare minska potentiella proteinnedbrytning från proteaser krävas.

Ytterligare överväganden för att säkerställa optimal expression av ELPs inkluderar en noggrann förståelse för fördelarna och begränsningarna med en valda antibiotika. Här användes pET15b vektorer innehållande en genen för ampicillin-resistens för proteinuttryck. Funktionellt, möjliggör den sällskapsdjur vector-serien betydande proteinuttryck med så mycket som 50% av en bakterie proteinuttryck tillägnad målproteinet efter en framgångsrik induktion32,33. Ampicillin som en val av antibiotikum kommer dock med vissa begränsningar som kan interferera med optimalt uttryck. Först kan av ampicillin i närvaro av E. coli försämras snabbt på grund av lanseringen av beta-laktamas. Om en tillräcklig mängd av ampicillin är förstörd, försvinna ampicillin-encoding plasmiden (dvs ELP-encoding plasmiden) helt. Som ett resultat, när uttrycker ELPs för längre löptider, övervakas protein uttryck nivåer noggrant vid efterföljande tidpunkter att säkerställa tillräcklig mängd ELP-encoding genen förblir för att möjliggöra önskvärt uttryck. Möjliga metoder för felsökning ackumulering av betalaktamaser inkluderar spinning ner förrätt kultur och åter uppskjutande cellerna i antibiotikum-fri medium innan vaccinera uttryck medium. Denna process effektivt begränsar överföringen av antibiotikum-nedbrytande enzymer och säkerställer en större del av cellerna innehåller target-protein-encoding vektorn. Dessutom, har ampicillin en begränsad hållbarhet på cirka två till tre veckor. Därför ska kultur plattor för proteinuttryck förvaras vid 4 ° C i högst två veckor före användning. Slutligen, för att säkerställa effekten av ampicillin inom starter och expression media, ampicillin stamlösningen bör vara producerade färska omedelbart innan använder, eftersom långvarig lagring kan leda till en mindre effektiva antibiotika.

Närvaron av en LCST tillåter enkel rening av ELPs genom termisk cykling. Specifikt, orsakar vid en högre temperatur och i närvaro av salter, entropisk styrkor ELPs blir mindre lösligt och därefter bilda en polymer-rika coacervate fas. Däremot, vid lägre temperaturer, ELPs förbli lösliga och lös lätt i lösningen. Cykling mellan dessa två temperatur regimer tillsammans med centrifugering steg att samla in och kassera den icke-ELP-innehållande fasen successivt koncentrerar sig proteinet och minskar samtidigt förekomsten av icke-ELP föroreningar.

Det finns dock ett antal steg där ELPs kan gå förlorade i denna reningsprocess. Först, före varje kall spinn, är proteinhaltiga lösningen alkaliseras för ett pH på 9,0. Denna högre pH tjänar till att deprotonate vissa aminosyror på protein ryggrad, effektivt lämnar dem i ett fulladdat tillstånd och ytterligare stärka deras löslighet. Följaktligen, ovanstående detta steg eller inte ger tillräckligt med tid för protein upplösning kan leda till en minskning av avkastning som icke-solubilized proteiner kommer att pelleterat under centrifugeringen och kasseras.

Likaså kan målproteiner förloras under förfarandet för hot spin när en ELP är pelleterat. Initialt läggs NaCl till proteinrika supernatanten att minska lösligheten hos en ELP. Saltar arbetar för att skydda elektrostatiska växelverkan mellan protein och vatten molekylerna, orsakar proteinet att separera från vattenfasen. Denna effekt förstärks genom att värma den lösning som, på grund av entropieffekter, ytterligare bryter ner hydrous 'buren' kring ELPs och tvingar sammanläggning av proteinerna. Vid lägre protein koncentrationer (dvs., den första termisk cykeln), tillsats av salter ensam räcker ofta för att orsaka denna fasseparation. Men som koncentrationen av protein ökar (dvs., senare termiska cykler), och det finns mindre sekundära föroreningar att interagera med salter, en ELP kommer lättare fällning. Som ett resultat, om salter läggs alltför snabbt, kan de bli fysiskt instängd bladserverchassin proteiner, vilket effektivt minskar den salt koncentrationen av lösningen och begränsar ytterligare protein nederbörd. Salt bör således läggas till i tre små partier att säkerställa att de har tillräckligt med tid att distribuera likartad genom lösningen. Som en sista anmärkning, variationer till ELP ryggraden, antingen genom ytterligare ändringar till gäst återstoden av regionen elastin-liknande eller förändringar regionen bio-aktiva kan avsevärt påverka beteendet LCST. Följaktligen, för att säkerställa optimal protein avkastning över protein varianter, är det avgörande att optimera den pH, salthalt och salt typ (t.ex., monovalenta eller tvåvärda) för kalla och varma spins.

Kör SDS-PAGE efter protokollet avslutad rekommenderas eftersom det kan användas för att enkelt avgöra om betydande ELP förlust inträffar under någon av reningssteg. Kortfattat om ELP upptäcks i supernatanten efter en het spin, är sedan proteinet inte effektivt utfälls. Likaså om ELPs identifieras i ett prov av solubilized pellets efter en kall spin, är sedan proteinet inte effektivt upplöses.

ELP hydrogels erbjuder många fördelar jämfört med syntetiskt eller naturligt framställda material. Specifikt, ger användningen av den amine-reaktivt crosslinker THPC en låg kostnad, enkel och avstämbara mekanism av protein crosslinking. Dock finns det tydliga begränsningar inom crosslinking protokollet som bör noteras. THPC är syre känsliga och lagras under olämpliga förhållanden, det kan snabbt försämras i reaktion effektivitet. Dessutom, på grund av sin reaktivitet med primära aminer, kan THPC reagera med omgivande proteiner i media eller de på cellytan som är rika på aminer. Därför, när bildar ELP hydrogels, det rekommenderas att undvika media kontaminering med cellpelleten att minska möjliga exogent protein korsreaktivitet och därmed en minskning i crosslinking effektivitet. Slutligen, denna crosslinking mekanism utesluter sekvensen bio-aktiva regionen till de som innehåller inga lysin rester och därmed begränsar potentiell integrering av vissa cell-självhäftande motiv (t.ex., IKVAV34). Att ta itu med dessa begränsningar, ändringar till ELP stamnätet med natriumazid och bicyclononyne (BCN) reaktion partners möjliggör bio-ortogonala crosslinking, som tidigare beskrivits27.

Det bör noteras att beteendet ELP LCST spelar en viktig roll i dikterar hydrogel mikrostruktur. Vid temperatur regimer över LCST fällningen ELPs ur lösningen leder till bildandet av proteinrika och protein-brist faser som kan påverka matrix porositet och crosslinking effektivitet av matrix9. Eftersom de flesta cell kultur experiment utförs vid fysiologiskt relevanta temperaturer (~ 37 ° C) över den ELP LCST, bör dessa effekter övervägas. För hydrogels till effektivt crosslink och bildar en sammankopplade protein nätverk, den primära aminen från lysin måste vara fysiskt tillgänglig för den THPC crosslinker. Om ELP sammanläggning inträffar innan den når tillräcklig crosslinking, kan ELPs instängd i den proteinrika fasen vara otillgängliga och sålunda inte kunna delta i crosslinking. För att lösa denna begränsning, kräver vår protokollet en inledande 15 min crosslinking period vid rumstemperatur, vilket möjliggör preliminära crosslinking av hydrogel innan en ELP genomgår dess termiska fasövergång. Denna rumstemperatur inkubation följs av en ytterligare 15 min inkubation vid 37 ° C att slutföra hydrogel crosslinking. Detta förfarande är kritiska för tillräcklig crosslinking och robust, reproducerbara gelation ELP material.

Sammanfattningsvis, erbjuder rekombinant protein hydrogels dikta ihop användande ELP enastående tunability av sekvensen protein och därför den 3D cell mikromiljö. ELP polymerer har visat sig vara går att uttrycka i hög avkastning, enkelt renat på grund av deras LCST beteende, och biokompatibla i en mängd olika in vitro- och in-vivo -system. Användningen av E. coli som en rekombinant värd ger ett enkelt och billigt förfarande som ger upphov till nära perfekt kontroll av polymer molekylvikt och funktionalitet. Tillsammans gör denna teknik för robusta tunability och reproducerbarhet av hydrogel plattformen möjliggör kulturen av en rad olika celltyper i 3D. Slutligen, denna ELP hydrogel plattform är mottagliga för många nedströms biokemiska analyser inklusive qRT-PCR, Western blot, DNA-extraktion och cell immunfärgning9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Författarna tackar T. Palmer och H. Babu (Stanford neurokirurgi) för att tillhandahålla murina NPCs. vektor konst i figur 4 användes och anpassad från Servier medicinska konsten under Creative Commons Attribution 3.0 Unported License (https://creativecommons.org/ licenses/by/3.0/legalcode). En del av detta arbete utfördes på den Stanford Nano delade faciliteter (SNSF), stöds av National Science Foundation under award ECCS-1542152. N.A.S. erkänner stöd från National Institute of General Medical Sciences av National Institutes of Health (32GM 008412). C.M.M. medger stöd från en NIH NRSA pre forskarnivå fellowship (F31 EB020502) och till Siebel Scholars-programmet. SCH erkänner stöd från National Institutes of Health (U19 AI116484 och R21 EB018407), National Science Foundation (DMR 1508006) och California Institute for Regenerative Medicine (RT3-07948). Denna forskning fått finansiering från alliansen för regenerativ rehabiliteringsforskning & utbildning (AR3T), som stöds av Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health och mänsklig utveckling (NICHD), Konjunkturinstitutet Neurologiska sjukdomar och Stroke (NINDS) och nationella institutet för biomedicinsk Imaging och bioteknik (NIBIB) av de National institutionerna of Health under Award nummer P2CHD086843. Innehållet ansvarar enbart för författarna och representerar inte nödvändigtvis åsikter National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Elastin-Like Protein Expression and Purification
10 cm Petri Dishes Thermo Fisher Scientific FB0875713
70% Ethanol RICCA Chemical 2546.70-1
Ammonium Sulfate Sigma-Aldrich A3920-500G
Ampicillin Thermo Fisher Scientific BP1760-25G
Bacto Agar Thermo Fisher Scientific 9002-18-0 
BL21(DE3)pLysS Competent Cells Invitrogen C606003
Chloramphenicol Amresco 0230-100G 
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas Sigma-Aldrich DN25
EDTA disodium salt, dihydrate Thermo Fisher Scientific O2793-500
Glycerol Thermo Fisher Scientific BP229-4
Isopropanol Thermo Fisher Scientific A451-4
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)  Thermo Fisher Scientific BP1755-10G
Luria Broth EMD Millipore 1.10285.5007
Parafilm VWR 52858-000
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) MP Biomedicals 195381
Sodium Chloride Thermo Fisher Scientific BP358-212
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich S 8045-1KG
Syringe Filter Unit (0.22 μm) Millipore SLGP033RB
Terrific Broth Millipore 71754-4
Tris Base Thermo Fisher Scientific BP152-1
Cell Encapsulation in 3D ELP Hydrogels
0.22 μm syringe filters Millipore SLGV004SL
0.5 mm thick silicone sheet Electron Microscopy Science 70338-05
24-well tissue culture plates  Corning 353047
Disposable Biopsy Punch (2 mm) Integra Miltex 33-31
Disposable Biopsy Punch (4 mm) Integra Miltex 33-34
Disposable Biopsy Punch (5 mm) Integra Miltex 33-35
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS)  Corning 21-031-CM
No. 1 12 mm glass coverslips Thermo Fisher Scientific 12-545-80
Tetrakis(hydroxymethyl)phosphonium chloride (THPC) Sigma-Aldrich 404861-100ML
0.5% Tryspin/EDTA Thermo Fisher  15400054
Immunocytochemistry of Cells in 3D ELP Hydrogels
16% (w/v) Paraformaldehyde (PFA) Electron Microscopy Sciences 15701
Bovine Serum Albumin (BSA) Roche 3116956001
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Molecular Probes D1306 
Donkey Serum Lampire Biological Labs 7332100
Goat anti-mouse Secondary Antibody (AF488) Molecular Probes A-11017
Goat anti-rabbit Secondary Antibody (AF546) Molecular Probes A-11071
Goat Serum Gibco 16210-072
Mouse Nestin Primary Antibody BD Pharmingen 556309
Mouse Sox2 Primary Antibody Cell Signaling Technology 23064S
Nail Polish Electron Microscopy Sciences 72180
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100-100ML
Vectashield Hardset Mounting Medium  Vector Labs H-1400 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking Cell-Matrix Adhesions to the Third Dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
  2. Birgersdotter, A., Sandberg, R., Ernberg, I. Gene expression perturbation in vitro-A growing case for three-dimensional (3D) culture systems. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 405-412 (2005).
  3. Gómez-Lechón, M. J., et al. Long-term expression of differentiated functions in hepatocytes cultured in three-dimensional collagen matrix. Journal of Cellular Physiology. 177 (4), 553-562 (1998).
  4. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension - how 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).
  5. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
  6. Justice, B. A., Badr, N. A., Felder, R. A. 3D cell culture opens new dimensions in cell-based assays. Drug Discovery Today. 14 (1-2), 102-107 (2009).
  7. Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
  8. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and Bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).
  9. Madl, C. M., et al. Maintenance of neural progenitor cell stemness in 3D hydrogels requires matrix remodelling. Nature Materials. 16 (12), 1233-1242 (2017).
  10. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. Tissue Cells Feel and Respond to the Stiffness of Their Substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
  11. Sun, Y., Villa-Diaz, L. G., Lam, R. H. W., Chen, W., Krebsbach, P. H., Fu, J. Mechanics Regulates Fate Decisions of Human Embryonic Stem Cells. PLoS ONE. 7 (5), e37178 (2012).
  12. Ehrbar, M., et al. Elucidating the Role of Matrix Stiffness in 3D Cell Migration and Remodeling. Biophysical Journal. 100 (2), 284-293 (2011).
  13. Rowlands, A. S., George, P. A., Cooper-White, J. J. Directing osteogenic and myogenic differentiation of MSCs: interplay of stiffness and adhesive ligand presentation. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 295 (4), 1037-1044 (2008).
  14. Lampe, K. J., Antaris, A. L., Heilshorn, S. C. Design of three-dimensional engineered protein hydrogels for tailored control of neurite growth. Acta Biomaterialia. 9 (3), 5590-5599 (2013).
  15. Kilian, K. A., Mrksich, M. Directing Stem Cell Fate by Controlling the Affinity and Density of Ligand-Receptor Interactions at the Biomaterials Interface. Angewandte Chemie International Edition. 51 (20), 4891-4895 (2012).
  16. Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of Hydrogel Substrates with Tunable Mechanical Properties. Current Protocols in Cell Biology. , 10.16.1-10.16.16 (2010).
  17. Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: A complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
  18. DiMarco, R. L., Heilshorn, S. C. Multifunctional Materials through Modular Protein Engineering. Advanced Materials. 24 (29), 3923-3940 (2012).
  19. Meyer, D. E., Chilkoti, A. Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides. Nature Biotechnology. 17 (11), 1112-1115 (1999).
  20. Aladini, F., Araman, C., Becker, C. F. W. Chemical synthesis and characterization of elastin-like polypeptides (ELPs) with variable guest residues. Journal of Peptide Science. 22 (5), 334-342 (2016).
  21. McMillan, R. A., Caran, K. L., Apkarian, R. P., Conticello, V. P. High-Resolution Topographic Imaging of Environmentally Responsive, Elastin-Mimetic Hydrogels. Macromolecules. 32 (26), 9067-9070 (1999).
  22. McMillan, R. A., Conticello, V. P. Synthesis and Characterization of Elastin-Mimetic Protein Gels Derived from a Well-Defined Polypeptide Precursor. Macromolecules. 33 (13), 4809-4821 (2000).
  23. Chung, C., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. Tetrakis(hydroxymethyl) Phosphonium Chloride as a Covalent Cross-Linking Agent for Cell Encapsulation within Protein-Based Hydrogels. Biomacromolecules. 13 (12), 3912-3916 (2012).
  24. Romano, N. H., Madl, C. M., Heilshorn, S. C. Matrix RGD ligand density and L1CAM-mediated Schwann cell interactions synergistically enhance neurite outgrowth. Acta Biomaterialia. 11, 48-57 (2015).
  25. Shah, M., Hsueh, P. Y., Sun, G., Chang, H. Y., Janib, S. M., MacKay, J. A. Biodegradation of elastin-like polypeptide nanoparticles. Protein Science. 21 (6), 743-750 (2012).
  26. Nettles, D. L., Chilkoti, A., Setton, L. A. Applications of elastin-like polypeptides in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 62 (15), 1479-1485 (2010).
  27. Madl, C. M., Heilshorn, S. C. Tyrosine-Selective Functionalization for Bio-Orthogonal Cross-Linking of Engineered Protein Hydrogels. Bioconjugate Chemistry. 28 (3), 724-730 (2017).
  28. Zhu, D., Wang, H., Trinh, P., Heilshorn, S. C., Yang, F. Elastin-like protein-hyaluronic acid (ELP-HA) hydrogels with decoupled mechanical and biochemical cues for cartilage regeneration. Biomaterials. , 132-140 (2017).
  29. Madl, C. M., Katz, L. M., Heilshorn, S. C. Bio-Orthogonally Crosslinked, Engineered Protein Hydrogels with Tunable Mechanics and Biochemistry for Cell Encapsulation. Advanced Functional Materials. 26 (21), 3612-3620 (2016).
  30. Cai, L., Dinh, C. B., Heilshorn, S. C. One-pot synthesis of elastin-like polypeptide hydrogels with grafted VEGF-mimetic peptides. Biomater Sci. 2 (5), 757-765 (2014).
  31. Straley, K. S., Heilshorn, S. C. Independent tuning of multiple biomaterial properties using protein engineering. Soft Matter. 5 (1), 114-124 (2009).
  32. Baneyx, F. Recombinant protein expression in Escherichia coli. Current Opinion in Biotechnology. 10 (5), 411-421 (1999).
  33. Graumann, K., Premstaller, A. Manufacturing of recombinant therapeutic proteins in microbial systems. Biotechnology Journal. 1 (2), 164-186 (2006).
  34. Tashiro, K., et al. A Synthetic Peptide Containing the IKVAV Sequence from the A Chain of Laminin Mediates Cell Attachment, Migration, and Neurite Outgrowth. Journal of Biological Chemistry. 264 (27), 16174-16182 (1989).

Tags

Bioteknik fråga 135 Elastin-liknande protein ELP hydrogel 3D cell kultur immunfärgning proteinuttryck rekombinant protein
Produktionen av Elastin-liknande Protein hydrogeler för inkapsling och immunfärgning av celler i 3D
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

LeSavage, B. L., Suhar, N. A., Madl, … More

LeSavage, B. L., Suhar, N. A., Madl, C. M., Heilshorn, S. C. Production of Elastin-like Protein Hydrogels for Encapsulation and Immunostaining of Cells in 3D. J. Vis. Exp. (135), e57739, doi:10.3791/57739 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter