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Bioengineering

3 डी में Elastin और कोशिकाओं के Immunostaining के लिए प्रोटीन Hydrogels की तरह उत्पादन

Published: May 19, 2018 doi: 10.3791/57739
Automatic Translation
*1, *2, 1, 2
1Department of Bioengineering, Stanford University, 2Department of Materials Science and Engineering, Stanford University
* These authors contributed equally

Summary

रिकॉमबिनेंट प्रोटीन इंजीनियर hydrogels 3d सेल संस्कृति के लिए लाभप्रद है क्योंकि वे बहुलक रीढ़ की पूरी tunability के लिए अनुमति देते है और इसलिए, सेल microenvironment । यहाँ, हम रिकॉमबिनेंट elastin की प्रक्रिया का वर्णन-जैसे प्रोटीन शुद्धि और 3 डी hydrogel सेल encapsulation में अपने आवेदन.

Abstract

दो आयामी (2d) ऊतक संस्कृति तकनीक मौलिक कोशिका जीवविज्ञान की हमारी समझ के लिए आवश्यक हो गया है । हालांकि, पारंपरिक 2d ऊतक संस्कृति प्रणालियों की कमी एक तीन आयामी (3 डी) मैट्रिक्स, परिणामों के बीच एक महत्वपूर्ण डिस्कनेक्ट में जिसके परिणामस्वरूप इन विट्रो में एकत्र और vivo में। इस सीमा को संबोधित करने के लिए, शोधकर्ताओं ने 3d hydrogel टिशू कल्चर प्लेटफॉर्म्स को इंजीनियर किया है जो कि वीवो सेल microenvironment में जैव रासायनिक और भौतिक गुणों की नकल कर सकते हैं । इस शोध के लिए सामग्री प्लेटफार्मों कि समर्थन 3d सेल encapsulation और बहाव जैव रासायनिक परख विकसित करने की आवश्यकता को प्रेरित किया है । रिकॉमबिनेंट प्रोटीन इंजीनियरिंग प्रोटीन अनुक्रम के विशिष्ट नियंत्रण के लिए अनुमति देकर 3 डी hydrogel सामग्री डिजाइन और विकास के लिए एक अनूठा toolset प्रदान करता है और इसलिए, विस्तार से, परिणामी के संभावित यांत्रिक और जैव रासायनिक गुण मैट्रिक्स. यहां, हम recombinantly-व्युत्पंन elastin प्रोटीन (दद), जो स्वतंत्र रूप से स्वरित्र यांत्रिक गुणों और कोशिका चिपकने वाला ligand एकाग्रता के साथ hydrogels फार्म का इस्तेमाल किया जा सकता है की अभिव्यक्ति के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । हम आगे दद hydrogels और बाद में बहाव विश्लेषण और ठहराव के लिए एम्बेडेड कोशिकाओं के दाग immunofluorescent के भीतर सेल encapsulation के लिए एक पद्धति प्रस्तुत करते हैं ।

Introduction

पिछली सदी के दौरान, दो आयामी (2d) ऊतक संस्कृति इन विट्रो मेंमौलिक कोशिका जीवविज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक अभिंन toolset में विकसित किया गया है । इसके अलावा, अपेक्षाकृत कम लागत और 2d सेल संस्कृति के लिए सरल प्रोटोकॉल कई जैविक और चिकित्सा विषयों में अपनी गोद लेने के लिए नेतृत्व किया है । हालांकि, पिछले अनुसंधान से पता चला है कि पारंपरिक 2 डी प्लेटफार्मों परिणाम है कि vivo मेंएकत्र उन से विचलित करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, कीमती समय और धन के कारण नैदानिक उन्मुख अनुसंधान के लिए बर्बाद1,2, 3. हम और दूसरों को परिकल्पना है कि इस विसंगति देशी जैव रासायनिक और भौतिक संकेत की कमी के लिए जिंमेदार ठहराया जा सकता है 2d सतहों पर प्रसंस्कृत कोशिकाओं को प्रदान की है, जो इष्टतम प्रसार और विभिंन प्रकार के सेल के परिपक्वता के लिए आवश्यक हो सकता है ।

इन सीमाओं को हल करने के लिए और मदद इन विट्रो में 2d के बीच अंतर पुल और vivo अध्ययनों में , शोधकर्ताओं ने तीन आयामी विकसित किया है (3 डी) सेल के लिए hydrogel प्लेटफार्मों-encapsulation1,4,5 ,6. Hydrogels आदर्श सामग्री है दोहराऊंगा मैट्रिक्स (extracellular) के अंतर्जात microenvironment के कारण vivo में अपने ऊतक की तरह यांत्रिक गुणों और पानी की सूजन संरचना है कि पोषक तत्वों के तेजी से परिवहन के लिए सक्षम बनाता है और संकेत कारक7,8। इसके अलावा, 3d hydrogels पाड़ के यांत्रिक और जैव रासायनिक गुणों पर स्वतंत्र नियंत्रण करने के लिए डिज़ाइन किया जा सकता है । दोनों मैट्रिक्स यांत्रिकी9,10,11,12 और सेल चिपकने वाला लाइगैंडों13,14,15 सेल को प्रभावित करने के लिए अच्छी तरह से जाना जाता है इन विट्रो में व्यवहार और vivo में । इस प्रकार, स्वरित्र गुणों के साथ 3 डी hydrogels कोशिकाओं और उनके microenvironment के बीच कारण संबंधों का अध्ययन करने के लिए एक मंच प्रदान करते हैं । एक आदर्श 3d hydrogel मैट्रिक्स के लिए मानदंड सरल, गैर साइटोटोक्सिक कोशिका-encapsulation के साथ ही शारीरिक रूप से प्रासंगिक यांत्रिक गुणों के स्वतंत्र tunability और देशी कोशिका चिपकने वाली रूपांकनों की नकल शामिल हैं ।

दोनों सिंथेटिक (जैसे, पॉलीथीन ग्लाइकोल, polylactic एसिड, पाली (glycolic एसिड)) और स्वाभाविक रूप से व्युत्पंन (उदा., alginate, कोलेजन, Matrigel) hydrogels इन विट्रो संस्कृति प्लेटफार्मों में 2d से अधिक लाभ है; हालांकि, वे भी महत्वपूर्ण कमियों जो उनकी प्रयोज्यता की सीमा है । सबसे पहले, कई सिंथेटिक और स्वाभाविक रूप से व्युत्पंन प्लेटफार्मों कठोर crosslinking स्थितियों है कि संभावित स्तनधारी कोशिकाओं को विषाक्त किया जा सकता है की आवश्यकता होती है, कम सेल व्यवहार्यता के लिए अग्रणी7। इसके अतिरिक्त, कई सिंथेटिक प्लेटफार्मों देशी जैव गतिविधि की कमी और माध्यमिक रासायनिक प्रतिक्रियाओं, जो वृद्धि की लागत और जटिलता16जोड़ सकते है के माध्यम से कार्यात्मक होना चाहिए । अंत में, जबकि स्वाभाविक रूप से व्युत्पंन सामग्री आमतौर पर आंतरिक जैव सक्रिय डोमेन होते हैं, वे अक्सर उच्च बैच से त्रस्त है-बैच परिवर्तनशीलता और अक्सर अपेक्षाकृत कमजोर जैल7,17बनाने तक सीमित हैं ।

रिकॉमबिनेंट प्रोटीन इंजीनियरिंग प्रोटीन अनुक्रम पर स्पष्ट नियंत्रण की अनुमति देकर सामग्री डिजाइन के लिए एक अनूठा toolset प्रस्तुत करता है और, विस्तार से, अंतिम hydrogel पाड़18के संभावित यांत्रिक और जैव रासायनिक गुण । इसके अतिरिक्त, प्रोटीन व्यक्त करने के लिए ई कोलाई (ई. कोलाई) की अच्छी तरह से ज्ञात जैविक मशीनरी का लाभ द्वारा, सामग्री लागत प्रभावी ढंग से और लगातार सीमित अंतर के साथ और अंतर-बैच परिवर्तनशीलता का उत्पादन किया जा सकता है । elastin-प्रोटीन की तरह (दद) यहां प्रस्तुत तीन इंजीनियर डोमेन है: (1) एक T7 और His6 टैग है कि फ्लोरोसेंट टैग एंटीबॉडी के द्वारा लेबलिंग के लिए अनुमति देता है, (2) एक ' elastin ' की तरह क्षेत्र है कि लोचदार यांत्रिक गुणों प्रदान और रासायनिक के लिए अनुमति देता है crosslinking, और (3) एक ' जैव सक्रिय ' क्षेत्र है कि सेल चिपकने वाली रूपांकनों के लिए सांकेतिक शब्दों में बदलना ।

हमारे elastin-जैसे क्षेत्र विहित (वैल-प्रो-Gly-Xaa-Gly)5 elastin अनुक्रम पर आधारित है जहां चार ' Xaa ' अमीनो अम्ल स्थलों पर isoleucine (इले) होते हैं, लेकिन इसके अलावा किसी भी अमीनो अम्ल को रेखांकित करने के लिए डिजाइन किया जा सकता है । यह अनुक्रम थर्मल सायक्लिंग19,20के माध्यम से सरल शोधन पद अभिव्यक्ति के लिए शोषण किया जा सकता है कि कम महत्वपूर्ण समाधान तापमान (LCST) व्यवहार के साथ रिकॉमबिनेंट ELPs endows । इस LCST संपत्ति अतिथि ' Xaa ' अवशेषों21,22संशोधित करके अलग तापमान पर थर्मल समग्र को देखते किया जा सकता है ।

यहाँ पाँच elastin में से किसी एक पर ' Xaa ' की स्थिति को इस तरह दोहराया गया है कि अमीना पेश lysine (Lys) अमीनो अम्ल, जो hydrogel crosslinking के लिए उपयोग किया जाता है, के साथ प्रतिस्थापित कर दिया गया है. हमारे पिछले काम अमीना-प्रतिक्रियाशील crosslinker tetrakis (hydroxymethyl) phosphonium क्लोराइड (THPC)23के साथ प्रतिक्रिया के माध्यम से गैर साइटोटोक्सिक और मजबूत crosslinking दिखाया गया है । समग्र प्रोटीन सामग्री और crosslinker एकाग्रता अलग करके, हम hydrogels है कि एक शारीरिक रूप से प्रासंगिक कठोरता सीमा (~ 0.5-50 केपीए)9,23,24अवधि को देखते किया जा सकता है उत्पादन करने में सक्षम हैं । यांत्रिक गुणों ट्यूनिंग के अलावा, hydrogel परिणाम के भीतर सेल आसंजन विहित कोशिका के एकीकरण से चिपकने वाला डोमेन के भीतर दद प्रोटीन की रीढ़. उदाहरण के लिए, विस्तारित fibronectin-व्युत्पंन ' RGDS ' एमिनो एसिड अनुक्रम के शामिल सेल आसंजन और गठन के लचीलेपन के लिए अनुमति देता है, जबकि तले हुए, गैर बाध्यकारी ' RDGS ' संस्करण सेल-मैट्रिक्स आसंजन24प्रतिबंधित करता है । कोशिका-चिपकने वाला गैर-चिपकने वाला प्रोटीन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कुल प्रोटीन एकाग्रता के अनुपात संग्राहक द्वारा, हम प्रभावी ढंग से hydrogels जो ligand एकाग्रता की एक विस्तृत श्रृंखला अवधि का उत्पादन करने में सक्षम हैं । Resultantly, हम कुछ जैव रासायनिक और भौतिक गुणों के साथ एक hydrogel मंच विकसित किया है, जो स्वतंत्र रूप से विभिन्न सेल प्रकार के इष्टतम 3 डी संस्कृति के लिए देखते किया जा सकता है ।

मैट्रिक्स कठोरता और चिपकने वाला ligand tunability के अलावा, रिकॉमबिनेंट hydrogels के लिए विशिष्ट सामग्री गिरावट प्रोफाइल, जो सेल के प्रसार, प्रसार के लिए आवश्यक है डिजाइन की क्षमता प्रदान करते हैं, और एक 3 डी संदर्भ के भीतर प्रवास4 , 9. इस गिरावट की है कि विशेष रूप से या तो ' विस्तारित ' RGDS9 या elastin-की तरह अनुक्रम25लक्ष्य की चिढ़ाने के सेल स्राव द्वारा afforded है । दद hydrogels भी बाद जैव रासायनिक परख है कि कोशिका व्यवहार्यता और immunocytochemistry सहित समारोह के अध्ययन के लिए आवश्यक है समर्थन दिखाया गया है और साथ ही डीएनए/मात्रात्मक रिवर्स के लिए/ प्रतिलेखन-पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (qRT-पीसीआर) और वेस्टर्न ब्लाटर9. दद वेरिएंट भी vivo में मॉडल की एक संख्या में इस्तेमाल किया गया है और अच्छी तरह से प्रतिरक्षा प्रणाली26द्वारा सहन किया जा करने के लिए जाना जाता है ।

एक साथ ले लिया, सेल-encapsulation के अध्ययन के लिए एक सामग्री मंच के रूप में दद सिंथेटिक या प्राकृतिक रूप से व्युत्पंन सामग्री प्लेटफार्मों, जो अक्सर जैव रासायनिक और भौतिक tunability की एक ही डिग्री की कमी की तुलना में लाभ की एक विस्तृत विविधता समेटे हुए है और reproducibility. इसके अतिरिक्त, है दद सरल और गैर साइटोटोक्सिक उपयोग सेल प्रकार की एक विस्तृत विविधता के साथ (उदा., चिकी पृष्ठीय रूट गैंग्लिया14,24, murine तंत्रिका जनक कोशिकाओं9, मानव mesenchymal स्टेम कोशिकाओं27, गोजातीय नवजात chondrocytes28, मानव endothelial कोशिकाओं29,30) 2d सेल संस्कृति की तुलना में अंतर्जात 3d ECM के एक अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक मॉडल के लिए अनुमति देता है । साथ ही, हम 3 डी सेल encapsulation के लिए एक स्वरित्र hydrogel मंच के रूप में उपयोग के लिए recombinantly-व्युत्पंन, ELPs की अभिव्यक्ति के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । हम आगे नीचे के लिए क्रियाविधि धारा फ्लोरोसेंट लेबलिंग और encapsulated कोशिकाओं के फोकल माइक्रोस्कोपी ।

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Protocol

1. दद एक्सप्रेशन प्रोटोकॉल

  1. दिन 1: स्टार्टर कॉलोनी बढ़ रही है
    1. Luria शोरबा के autoclaving 25 ग्राम और ultrapure पानी के 1 L प्रति आगर के 15 ग्राम तक एम्पीसिलीन और क्लॉरॅंफेनिकोल आगार प्लेटें तैयार करें । एक बार हल करने के लिए ठंडा है ~ ६० ° c, एम्पीसिलीन स्टॉक की 1 मिलीलीटर जोड़ें (ultrapure पानी में १०० मिलीग्राम/एमएल) और क्लॉरॅंफेनिकोल स्टॉक के 1 मिलीलीटर (३४ मिलीग्राम/एमएल में ७०% इथेनॉल) के लिए 1 एल के अंतिम सांद्रता के लिए आगर समाधान १०० µ जी/एमएल और ३४ µ जी/ क्रमशः. एक सीरम वैज्ञानिक पिपेट के साथ 10 सेमी पेट्री व्यंजन के लिए अंतिम समाधान के 20 मिलीलीटर स्थानांतरण और आगर जमना के लिए अनुमति देते हैं । parafilm के साथ पेट्री व्यंजन लपेटें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
      नोट: पेट्री व्यंजन को दो हफ्तों तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है ।
    2. लकीर BL21 का एक छोटा सा नमूना (DE3) pLysS ई. कोलाई एक पूर्व से बना एक pET15b वेक्टर एक एम्पीसिलीन और क्लॉरॅंफेनिकोल आगर प्लेट पर ब्याज की दद एंकोडिंग युक्त ।
      नोट: एम्पीसिलीन और क्लॉरॅंफेनिकोल दोनों pET15b और pLysS वैक्टर, क्रमशः युक्त बैक्टीरिया के लिए चयन करें ।
    3. एक मशीन में ३७ डिग्री सेल्सियस पर उलटा प्लेट उल्टा रखें । बैक्टीरियल कॉलोनियों को रात भर बढ़ने दें ।
      नोट: एम्पीसिलीन नीचा और कालोनियों कि एम्पीसिलीन प्रतिरोध नहीं ले जा सकते है फार्म के रूप में 16 से अधिक घंटे के लिए प्लेटें मशीन नहीं है ।
  2. 2 दिन: स्टार्टर संस्कृति और अभिव्यक्ति मीडिया की तैयारी
    1. मशीन से ई. कोलाई संस्कृति को हटा दें । Parafilm 4 डिग्री सेल्सियस पर अधिकतम 4 दिनों के लिए थाली और स्टोर करें ।
    2. एक स्टार्टर कल्चर कुप्पी (२५० मिलीलीटर) और अभिव्यक्ति संस्कृति कुप्पी (12x 1 L) और आटोक्लेव तैयार करें । अभिव्यक्ति मीडिया के 1 एल के लिए, एक 2 l चकित संस्कृति कुप्पी में ultrapure पानी की 1 एल के लिए भयानक शोरबा और ग्लिसरॉल के 4 मिलीलीटर के ४७.६ ग्राम जोड़ें, और एल्यूमीनियम पंनी के साथ टोपी ।
      नोट: ठेठ पैदावार कर रहे हैं 60-100 मिलीग्राम/एल अभिव्यक्ति मीडिया के प्रोटीन ।
    3. पूर्व में autoclaved स्टार्टर गर्म, ३७ डिग्री सेल्सियस मिलाते हुए मशीन और आंदोलन के बिना गर्मी लोड ।
    4. जोड़ें २५० µ के एल बाँझ-फ़िल्टर्ड (०.२२ µm फ़िल्टर) एम्पीसिलीन स्टॉक (१०० मिलीग्राम/एमएल ultrapure पानी में) १०० µ g/एमएल के अंतिम एकाग्रता के लिए स्टार्टर संस्कृति के लिए । तुरंत २५० rpm पर स्टार्टर संस्कृति आंदोलन शुरू करते हैं ।
      नोट: केवल क्लॉरॅंफेनिकोल प्लेटों पर कॉलोनी चयन के लिए प्रयोग किया जाता है और तरल संस्कृतियों के लिए शामिल नहीं है ।
    5. एक एकल दद प्लाज्मिड से जोड़कर स्टार्टर संस्कृति Inoculate-लकीर प्लेट से ई. कोलाई कॉलोनी से युक्त है और स्टार्टर संस्कृति 16 एच के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर मिलाने के लिए अनुमति देते हैं ।
    6. पूर्व में अभिव्यक्ति संस्कृति मीडिया कुप्पी प्लेस, गरम, ३७ ° c मिलाते हुए और आंदोलन के बिना रात भर गर्मी इतनी है कि कुप्पी अगली सुबह inoculate के लिए तैयार हैं ।
  3. 3 दिन: ई. कोलाई में प्रोटीन अभिव्यक्ति उत्प्रेरण
    1. ताजा करें, बाँझ-फ़िल्टर्ड एम्पीसिलीन स्टॉक (१०० मिलीग्राम/ultrapure पानी में). १०० µ g/एमएल के अंतिम एकाग्रता के लिए अभिव्यक्ति मीडिया की प्रत्येक कुप्पी के लिए एम्पीसिलीन स्टॉक के 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
    2. २५० rpm पर अभिव्यक्ति मीडिया आंदोलन शुरू करते हैं ।
    3. किसी भी अभिव्यक्ति कुप्पी से मीडिया का एक 2 मिलीलीटर नमूना ले और ६०० एनएम (आयुध डिपो६००) में एक ऑप्टिकल घनत्व पढ़ने के लिए एक खाली के रूप में एक cuvette को जोड़ने ।
    4. 16 एच स्टार्टर संस्कृति की मशीन के पूरा होने के बाद, एक सीरम वैज्ञानिक पिपेट के माध्यम से प्रत्येक अभिव्यक्ति कुप्पी को स्टार्टर संस्कृति के 20 मिलीलीटर स्थानांतरित करके प्रत्येक अभिव्यक्ति कुप्पी inoculate ।
    5. 1 ज आंदोलन के पूरा होने के बाद, माप की एक अभिव्यक्ति कुप्पी के आयुध डिपो६०० । इस कदम के बाद, प्रत्येक समय एक अलग कुप्पी की जाँच, आयुध डिपो६०० हर 20 मिनट मापने ।
    6. ०.६ के एक आयुध डिपो६०० में, अभिव्यक्ति कुप्पी के ३२ डिग्री सेल्सियस से युक्त के तापमान को कम ।
    7. आयुध डिपो की जांच करें६०० हर 10 मिनट । ०.८ के एक आयुध डिपो६०० पर, प्रत्येक अभिव्यक्ति कुप्पी के लिए ultrapure पानी में 1 मीटर, बाँझ-फ़िल्टर β-isopropyl thiogalactoside (IPTG) के 1 मिलीलीटर जोड़कर अभिव्यक्ति प्रेरित ।
    8. अभिव्यक्ति कुप्पी में ई. कोलाई को व्यक्त करने के लिए 7 एच के लिए अनुमति दें ।
    9. 20 मिनट अभिव्यक्ति के अंत करने से पहले, एक बड़ी मंजिल 4 डिग्री सेल्सियस के लिए पूर्व शांत ।
    10. व्यक्तिगत केंद्रापसारक कंटेनरों और संतुलन में अभिव्यक्ति मीडिया के सभी 12 एल ले लीजिए ।
    11. 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर > 12, 000 x g पर अभिव्यक्ति मीडिया केंद्रापसारक एक मंजिल केंद्रापसारक का उपयोग कर ।
    12. प्रत्येक केंद्रापसारक कंटेनर से supernatant डालो । एक रंग का प्रयोग, एक पूर्व तौला ज़िप ताला बैग में सेल छर्रों इकट्ठा ।
    13. पुनः में गोली स्थगित बाँझ-फ़िल्टर्ड दस बफर (गोली के 25 ग्राम प्रति बफर के १०० मिलीलीटर) और गोली की मालिश से किसी भी अतिरिक्त हवा के बुलबुले को हटा दें । दस बफर के 1 एल के लिए, सोडियम क्लोराइड, tris बेस के १.२१ ग्राम के ५.८ ग्राम जोड़ें, और ethylenediamine tetraacetic एसिड (EDTA) disodium नमक डाईहाइड्रेट के ०.३७ ग्राम ultrapure पानी की ९०० मिलीलीटर के लिए । ८.० के लिए पीएच समायोजित करें और 1 एल लाने के लिए । इस कदम के लिए, पीएच स्ट्रिप्स पर्याप्त हैं ।
    14. ज़िप-ताला बैग एक माध्यमिक कंटेनर में पुनः निलंबित सेल गोली युक्त प्लेस और-८० ° c रात भर फ्रीज ।
  4. दिन 4-6: फ्रीज-गल चक्र के माध्यम से बैक्टीरियल सेल दीवार Rupturing
    1. फ्रीजर से जमे हुए गोली निकालें और एक कक्षीय शेखर का उपयोग कर कोमल आंदोलन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर धीरे से गल करने के लिए अनुमति देते हैं ।
    2. कुछ तरल मौजूद है जब तक कि गोली गल को अनुमति दें । जोड़ ~ 30-40 मिलीग्राम deoxyribonuclease I (DNase) से गल lysate । साथ ही, सेल lysate के १०० मिलीलीटर प्रति isopropanol में १०० mM phenylmethylsulphonyl फ्लोराइड (PMSF; a छेड़ने वाला अवरोधक) की 1 मिलीलीटर जोड़ें । lysate को रात भर हिलाने की अनुमति दें ।
      नोट: DNase और PMSF जोड़ना केवल पहले फ्रीज-गल चक्र के लिए आवश्यक है ।
      चेतावनी: PMSF विषाक्त अगर सांस है । PMSF पाउडर को संभालते समय फेस मास्क का इस्तेमाल करना चाहिए ।
    3. एक बार सेल lysate पूरी तरह से गल गया है, lysate पर-८० ° c रात भर फ्रीज, या पूरी तरह से जमे हुए जब तक ।
    4. तीन चक्रों की कुल के लिए फ्रीज-गल प्रक्रिया को दोहराएँ । पिछले फ्रीज-गल के बाद 4 डिग्री सेल्सियस पर गल lysate छोड़ दें । स्टोर १०० सोडियम dodecyl सल्फेट के लिए कच्चे lysate के µ एल-polyacrylamide जेल ट्रो (एसडीएस-पृष्ठ) विश्लेषण शुद्धि के समापन पर ।
    5. पिछले गल के बाद, गल lysate के पीएच को 1 मीटर NaOH का उपयोग कर ९.० पर समायोजित करें । इस कदम के लिए, पीएच स्ट्रिप्स पर्याप्त हैं । 4 डिग्री सेल्सियस से कम 1 घंटे के लिए मशीन (रात भर उपयुक्त है) एक कक्षीय शेखर पर ।
  5. दिन 7-9: शीत और गर्म स्पिन थर्मल सायक्लिंग के माध्यम से दद शुद्धि
    1. शांत फर्श 4 डिग्री सेल्सियस 20 मिनट के लिए पहले केंद्रापसारक करने के लिए केंद्रापसारक ।
    2. Aliquot और केंद्रापसारक कंटेनरों में पिघला lysate संतुलन ।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए > 15, 000 एक्स जी पर नमूने केंद्रापसारक । संग्रह १०० शुद्धि के समापन के बाद एसडीएस-पृष्ठ विश्लेषण के लिए supernatant के µ l ।
      नोट: केंद्रापसारक के बाद, दद प्रोटीन अपने LCST (< 32 डिग्री सेल्सियस) से नीचे के तापमान पर पानी में अपनी उच्च घुलनशीलता के कारण supernatant में रहना चाहिए ।
    4. नए केंद्रापसारक कंटेनरों करने के लिए supernatant हस्तांतरण और उचित संतुलन ।
    5. सोडियम क्लोराइड (NaCl) को तीन भागों में 1 मीटर की अंतिम एकाग्रता में जोड़ें (supernatant के हर १०० मिलीलीटर के लिए NaCl की ५.८४ ग्राम) । सुनिश्चित करें कि NaCl पर्याप्त विघटन के लिए अनुमति देने के लिए तीन भागों में जोड़ा जाता है ।
    6. ३७ डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के लिए आंदोलन एक मिलाते हुए मशीन में २५० rpm पर ।
    7. 1 आंदोलन के अंत से पहले एच, पूर्व गर्म एक मंजिल को 37 डिग्री सेल्सियस के लिए केंद्रापसारक ।
    8. ३७ डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए > 15, 000 एक्स जी पर केंद्रापसारक । स्टोर १०० शुद्धि के पूरा होने के बाद एसडीएस-पृष्ठ विश्लेषण के लिए supernatant के µ l और शेष supernatant को त्यागें.
      नोट: केंद्रापसारक के बाद, दद प्रोटीन अपने LCST (> 32 डिग्री सेल्सियस) के ऊपर तापमान पर पानी में अपनी कम घुलनशीलता के कारण गोली की जानी चाहिए ।
    9. फिर से गोली autoclaved, गोली के 1 जी प्रति ultrapure पानी की 10 मिलीलीटर जोड़ने से सस्पेंड । एक धातु रंग का प्रयोग करने के लिए गोली मैश करने के लिए प्रोटीन के विघटन में सहायता ।
    10. 1 M NaOH का उपयोग करके गल lysate के पीएच को ९.० पर समायोजित करें । इस कदम के लिए, पीएच स्ट्रिप्स पर्याप्त हैं ।
    11. एक कक्षीय शेखर पर 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर आंदोलन ।
    12. तीन चक्रों (यानी, तीन कुल चक्र के लिए 1.5.11 के माध्यम से 1.5.1 कदम दोहराएं) की कुल के लिए ठंडा और गर्म स्पिन थर्मल सायक्लिंग प्रक्रिया को दोहराएँ ।
  6. दिन 10-15: दद डायलिसिस और lyophilization
    1. एक पूर्व में पुनः निलंबित गोली केंद्रापसारक > 15, 000 x 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए जी पर ठंडा केंद्रापसारक । संग्रह १०० शुद्धि के समापन के बाद एसडीएस-पृष्ठ विश्लेषण के लिए supernatant के µ l ।
    2. dialyzing में बचे हुए supernatant को ३.५ केडीए डायलिसिस झिल्ली के 4 L के मुकाबले 4 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व ठंडा ultrapure पानी में मिलाकर प्रोटीन सॉल्यूशन का घोल डालें । डायलिसिस पानी को दिन में दो बार बदल कर 3 दिन के लिए कुल 6 गुना कर दीजिये ।
      नोट: ठेठ supernatant वॉल्यूम के बीच 5 और 30 मिलीलीटर हैं ।
    3. एक पूर्व में dialyzed समाधान केंद्रापसारक > 15, 000 x 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए जी में ठंडा केंद्रापसारक । स्टोर १०० शुद्धि के अंत में एसडीएस पृष्ठ विश्लेषण के लिए supernatant के µ एल ।
    4. पूर्व तौला शंकु ट्यूबों में परिणामी supernatant पर-८० ° c फ्रीज ।
    5. Lyophilize 3 दिनों के लिए जमे हुए समाधान और बड़े पैमाने पर अंतिम उत्पाद प्रोटीन उपज निर्धारित करने के लिए ।
    6. Parafilm 4 डिग्री सेल्सियस पर अंतिम lyophilized दद उत्पाद और स्टोर युक्त ट्यूबों.
    7. भागो एसडीएस-पृष्ठ प्रोटीन की शुद्धता निर्धारित करने के लिए ।
      नोट: एसडीएस-पृष्ठ के लिए प्रोटोकॉल विशिष्ट agarose जेल शर्तों के आधार पर भिंन होगा । हमारे प्रयोगों के लिए, अंतिम lyophilized प्रोटीन के एक एकाग्रता के लिए भंग कर दिया गया था ०.५ मिलीग्राम/एमएल में पानी और 70-100 मिनट के लिए १४० v पर चलाने में एक 12% (डब्ल्यू/वी) denaturing शर्तों के तहत acrylamide जेल ।

2.3d Elastin में सेल encapsulation-जैसे प्रोटीन Hydrogels

  1. सिलिकॉन मोल्ड की तैयारी
    1. एक ०.५ mm मोटी सिलिकॉन शीट में छेद बनाने के लिए वांछित व्यास के साथ एक बायोप्सी पंच का प्रयोग करें और प्रत्येक छेद के चारों ओर एक वर्ग को काट । वांछित मोल्ड की संख्या के लिए दोहराएँ ।
      नोट: व्यास और मोल्ड की मोटाई विशेष आवेदन और सेल संस्कृति की स्थिति के लिए समायोजित किया जा सकता है । अभ्यास में, ५० १० 6 कोशिकाओं के सेल संस्कृतियों के लिए/एमएल, 4 मिमी और 5 मिमी व्यास के साथ ०.५ मिमी मोटी molds पर्याप्त डीएनए के लिए सिफारिश की है/ immunostaining के लिए, एक 2 मिमी बायोप्सी पंच के बजाय तीन दोहराने के प्रति अच्छी तरह से दाग लगाया जा सकता है कि इतना वर्ग मोल्ड प्रति आसंन छेद बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
    2. चिमटी के साथ व्यक्तिगत मोल्ड के प्रत्येक पक्ष पर प्लास्टिक लपेटो निकालें ।
      नोट: संदूषण के रूप में उजागर सिलिकॉन सतह के साथ संपर्क से बचें भविष्य प्लाज्मा संबंधों दक्षता कम कर सकते हैं ।
    3. चिमटी का प्रयोग, एक ४८-अच्छी तरह से प्लेट के उल्टे ढक्कन पर बारी पंक्तियों में नंगे सिलिकॉन मोल्ड और ग्लास coverslips (नंबर 1, 12 मिमी व्यास) की एक ही नंबर की व्यवस्था । एक बार पूरा, ४८-अच्छी तरह से प्लेट के ढक्कन कवर करने के लिए संदूषण से बचने ।
    4. ऑक्सीजन प्लाज्मा पूरे ४८-अच्छी तरह से प्लेट ढक्कन (यानी, मोल्ड और ग्लास स्लाइड) का इलाज । तुरंत बाद, संदंश का उपयोग करने के लिए आसंन कांच coverslip पर सिलिकॉन मोल्ड पलटना । मजबूती से मोल्ड पर संबंध को सुनिश्चित करने के लिए प्रेस । मोल्ड्स को 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर दें ।
      नोट: ऑक्सीजन प्लाज्मा उपचार की अवधि इस्तेमाल किया साधन के आधार पर भिन्न होगा. हमारे साधन के लिए ठेठ शर्तों 0.3-4 mbar के बीच एक ऑपरेटिंग गैस दबाव खिड़की, 20 सेमी3लैंडलाइंस में ऑक्सीजन गैस प्रवाह, और 10-20 एस के लिए प्लाज्मा के लिए नमूना जोखिम है ।
    5. autoclaving द्वारा molds निष्फल । एक बाँझ वातावरण में कमरे के तापमान पर molds का उपयोग जब तक स्टोर ।
      नोट: मोल्डों को अनिश्चित काल के लिए इस स्तर पर संग्रहित किया जा सकता है ।
  2. प्रोटीन शेयर समाधान की तरह elastin की तैयारी
    1. 4 ° c हण से lyophilized दद निकाल ᱶ । यह सुनिश्चित करने के लिए ट्यूब खोलने से पहले कमरे के तापमान को प्रोटीन गर्म करें, दोहराया गया उपयोग पर प्रोटीन पर कोई भी संघनित्र नहीं बनाता है ।
    2. Dulbecco के फास्फेट-बफर खारा (DPBS) में 4 डिग्री सेल्सियस पर लगातार आंदोलन के साथ (यानी, कताई) रात भर में दद भंग.
      नोट: दद स्टॉक समाधान एकाग्रता और एक प्रयोक्ता परिभाषित volumetric अनुपात में crosslinker समाधान के अलावा के साथ पतला हो जाएगा । उदाहरण के लिए, एक 3% (w/v) अंतिम दद एकाग्रता के लिए, एक ३.७५% (w/v) दद स्टॉक समाधान है कि दद समाधान के एक 4:1 volumetric अनुपात में पतला हो जाएगा तैयार: crosslinker समाधान । वांछित आवेदन के लिए आवश्यक के रूप में एकाग्रता समायोजित करें ।
    3. बाँझ फ़िल्टर दद स्टॉक एक ०.२२ µm सिरिंज फिल्टर का उपयोग कर समाधान. जब उपयोग में न हो तब बर्फ पर दद.
  3. एक 24-अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति की थाली बाँझ चिमटी का उपयोग कर बाँझ molds में, सुरक्षा कैबिनेट में स्थानांतरण ।
  4. THPC स्टॉक समाधान की तैयारी
    1. DPBS में THPC पतला बस का उपयोग करने से पहले । अंतिम दद एकाग्रता और इि crosslinking अनुपात के अनुसार THPC समाधान की एकाग्रता को समायोजित करें ।
      नोट: प्रोटोकॉल के लिए, 3% (w/v) के एक अंतिम दद एकाग्रता 4:1 के एक volumetric अनुपात में THPC समाधान के साथ दद स्टॉक समाधान मिश्रण द्वारा किया जाएगा । आवश्यकतानुसार समायोजित करें ।
    2. Add २.६ µ l का THPC सॉल्यूशन (८०% पानी में) से ९९७.४ µ l को DPBS.
      नोट: THPC की यह एकाग्रता एक अंतिम 3% के लिए वर्णित 4:1 volumetric अनुपात में समाधान मिश्रण करते समय दद प्रोटीन पर THPC और प्राथमिक अमीन पर hydroxy मिथाइल समूहों के एक 1:1 stoichiometric अनुपात से मेल खाती है (w/v) दद hydrogel. THPC समाधान चिपचिपा और बूंदें समाधान की पिपेट टिप के पक्ष के लिए छड़ी हो सकता है । सटीक सांद्रता के लिए, ऐसी बूंदों से बचें जब DPBS में कमजोर । phosphine के ऑक्सीकरण और crosslinker की निष्क्रियता को रोकने के लिए नाइट्रोजन गैस के साथ THPC स्टॉक कंटेनर को पर्ज करें ।
    3. भंवर मिश्रण और बर्फ पर रखने के लिए समाधान ।
    4. एक ०.२२ µm सिरिंज फिल्टर का उपयोग कर THPC शेयर समाधान बाँझ फिल्टर. कम stoichiometric crosslinking अनुपात (उदा, 0.5:1 या 0.75:1) को प्राप्त करने के लिए बाँझ DPBS के साथ THPC स्टॉक सॉल्यूशन को पतला करें ।
      नोट: THPC ऑक्सीजन के प्रति संवेदनशील है, और पतला समाधान तैयार करने के बाद कुछ ही घंटों के भीतर किया जाना चाहिए ।
  5. एक एकल सेल निलंबन में Trypsin-EDTA के साथ मशीन द्वारा कोशिकाओं अलग कर देना, कोशिकाओं गोली, और एक hemocytometer का उपयोग कर मध्यम में फिर से निलंबित कोशिकाओं की गिनती.
    नोट: इस चरण के लिए सटीक प्रोटोकॉल इच्छित कक्ष प्रकार और अनुप्रयोग पर भारी निर्भर करेगा । इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त तंत्रिका जनक कोशिकाओं के लिए, एक ०.०२५% Trypsin-१.५ मिनट के लिए कमरे के तापमान पर EDTA मशीन का आयोजन किया गया था । कोशिकाओं को 2 मिनट के लिए २०० x जी में गोली लगी थी । वृद्धि की कोशिका व्यवहार्यता के लिए, कोशिकाओं सामांय मध्यम परिस्थितियों में निलंबित कर दिया जाना चाहिए । सेल encapsulation के लिए प्रयोग किया जाता विशिष्ट सेल घनत्व से 1-50 10 6 कक्षों/ आवश्यकतानुसार समायोजित करें ।
  6. एक बाँझ १.५ मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब में कोशिकाओं की वांछित संख्या Aliquot ।
  7. 3 मिनट के लिए ~ २०० x g पर कोशिकाओं के केंद्रापसारक. ध्यान से, महाप्राण supernatant और बर्फ पर सेल गोली रखो ।
    नोट: यह सभी supernatant को दद और THPC crosslinker के आगे कमजोर पड़ने के लये पूरी तरह से महाप्राण करने के लिए महत्वपूर्ण है. विशिष्ट केंद्रापसारक गति सेल प्रकार के साथ भिंन हो जाएगा ।
  8. Re-reसस्पेंड सेल गोली में दद स्टॉक समाधान इस तरह कि मात्रा अंतिम मात्रा का ८०% है (दद समाधान का एक 4:1 अनुपात संभालने: THPC समाधान). पिपेट मिश्रण 20-25 बार कोशिकाओं और दद का एक समरूप मिश्रण का उत्पादन करने के लिए.
    नोट: तापमान में वृद्धि और दद के बाद के चरण संक्रमण को कम करने के लिए ट्यूब के नीचे मनोरंजक से बचें. तीन प्रतिकृतियां के साथ प्रत्येक 2 मिमी मोल्ड अंतिम मात्रा के ७.५ µ एल (यानी, THPC स्टॉक समाधान के 6 µ l और १.५ µ l के 3 छेद (यानी, २.५ µ एल छेद प्रति अंतिम मात्रा) में समान रूप से विभाजित की आवश्यकता है । 4 और 5 मिमी molds के लिए, ७.५ µ एल और १५.५ µ एल की एक अंतिम मात्रा क्रमशः की आवश्यकता है ।
  9. शेष 20% अंतिम वॉल्यूम के लिए सेल/दद निलंबन के लिए THPC स्टॉक समाधान जोड़ें । पिपेट मिश्रण 20-25 बार एक समरूप मिश्रण का उत्पादन करने के लिए ।
  10. तुरंत एक परिपत्र गति से प्रत्येक मोल्ड में सेल/दद/THPC मिश्रण के इसी अंतिम मात्रा पिपेट । सभी मोल्ड के लिए दोहराएँ ।
  11. 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर नमूनों की मशीन, 15 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक अतिरिक्त मशीन द्वारा पीछा किया ।
    नोट: पहली मशीन अवधि के लिए है कि है दद LCST ऊपर तापमान बढ़ाने और इसके थर्मल चरण अलगाव उत्प्रेरण से पहले hydrogel के प्रारंभिक crosslinking की सुविधा में मदद मिलेगी ।
  12. धीरे गर्म सेल संस्कृति मध्यम के ७५० µ एल 24 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से जोड़ने के लिए, जैल बाधित करने से परहेज ।
  13. 7 दिनों के लिए ३७ ° c पर hydrogels की मशीन ।
    नोट: पूर्ण माध्यम परिवर्तन सेल प्रकार के आधार पर हर 1-2 दिन की सिफारिश कर रहे हैं । जेल पर तनाव को सीमित करने के लिए, एक गिलास पाश्चर पिपेट एक २०० µ l पिपेट टिप के साथ चिपका जब अच्छी तरह से aspirating माध्यम का उपयोग करें ।

3.3d दद Hydrogels में कोशिकाओं का Immunocytochemistry

  1. एमएल DPBS के 30 में 10 मिलीलीटर 16% (डब्ल्यू/वी) paraformaldehyde (पीएफए) को मिलाकर निर्धारण समाधान तैयार करें । ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए समाधान गर्म ।
  2. महाप्राण को 24 तरह से मीडियम प्लेट पर लगाकर धीरे से 1 मिलीलीटर DPBS से धो लें ।
  3. एक अच्छी तरह से और 30 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर गर्मी के लिए निर्धारण समाधान के ७५० µ एल जोड़ें । पीएफए वाष्प के साथ अन्य संस्कृतियों के संक्रमण से बचने के लिए ऊतक संस्कृति मशीन का उपयोग न करें ।
  4. एक उचित खतरनाक अपशिष्ट कंटेनर के लिए पीएफए को छोड कर, प्रत्येक कुआं से निर्धारण समाधान को सावधानीपूर्वक महाप्राण ।
    चेतावनी: पीएफए के लिए जोखिम त्वचा और आंखों में जलन पैदा कर सकता है । दस्ताने पहनें/सुरक्षा चश्मा और एक रासायनिक धुएं हुड में काम करते हैं ।
  5. प्रत्येक नमूने के लिए DPBS के 1 मिलीलीटर जोड़ें । DPBS को तुरंत महाप्राण और पीएफए अपशिष्ट कंटेनर में छोड़ दें ।
  6. 10 मिनट प्रत्येक के लिए DPBS के 1 मिलीलीटर के साथ दो बार नमूने धो लें ।
    नोट: नमूने Parafilm के साथ प्लेट सील करने के बाद एक सप्ताह तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर DPBS में संग्रहीत किया जा सकता है ।
  7. Permeabilize प्रत्येक नमूने के साथ ७५० µ l के permeabilization समाधान (१०० मिलीलीटर की DPBS और ०.२५ मिलीलीटर की ट्राइटन X-१००; PBST) 15 rpm पर एक घुमाव पर कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए ।
  8. महाप्राण PBST और अवरुद्ध समाधान के ७५० µ एल जोड़ने (पंजाब के ९५ मिलीलीटर, गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन के 5 ग्राम (BSA), सीरम के 5 मिलीलीटर, और ०.५ मिलीलीटर की ट्राइटन एक्स-१००) प्रत्येक नमूने के लिए । 15 rpm पर एक झूली कुरसी पर 3 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर मशीन ।
    नोट: अवरुद्ध समाधान के लिए उपयोग करने से पहले एक ०.२२ µm फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर (उदा, बकरी, गधा) और बाँझ-उठाया गया था जिसमें मेजबान प्रजातियों से सीरम शामिल होना चाहिए ।
  9. तैयार एंटीबॉडी कमजोर पड़ने समाधान (९७ मिलीलीटर के DPBS, २.५ ग्राम के BSA, २.५ मिलीलीटर के सीरम (एक ही मेजबान प्रजातियों से चरण में ३.८ के रूप में), और ०.५ एमएल के ट्राइटन X-१००) । एंटीबॉडी कमजोर पड़ने समाधान का उपयोग प्राथमिक एंटीबॉडी पतला और प्रत्येक नमूने के समाधान के ५०० µ एल जोड़ें । Parafilm के साथ प्लेट सील और एक झूली कुरसी पर 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर गर्मी ।
    नोट: Nestin और Sox2 प्राथमिक एंटीबॉडी ' निर्माताओं मूल एकाग्रता से एंटीबॉडी कमजोर पड़ने समाधान में 1:400 पतला थे ।
  10. महाप्राण प्रत्येक नमूने से एंटीबॉडी समाधान और 15 rpm पर एक झूली कुरसी पर कमरे के तापमान पर ६० मिनट के लिए PBST के साथ नमूनों धो लो । धो चरण 3 बार दोहराएं ।
  11. माध्यमिक एंटीबॉडी और 5 मिलीग्राम/एमएल स्टॉक DAPI (1:2000) एंटीबॉडी कमजोर पड़ने समाधान का उपयोग कर पतला और प्रत्येक नमूने के समाधान के ५०० µ एल जोड़ें । एल्यूमीनियम पंनी के साथ 24 अच्छी तरह से थाली कवर और एक झूली कुरसी पर 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर गर्मी ।
    नोट: के रूप में माध्यमिक एंटीबॉडी हल्के संवेदनशील हैं, नमूनों photobleaching से सभी अनुवर्ती चरणों के लिए संरक्षित किया जाना चाहिए. बकरी विरोधी माउस और बकरी विरोधी खरगोश माध्यमिक एंटीबॉडी ' निर्माताओं मूल एकाग्रता से एंटीबॉडी कमजोर पड़ने समाधान में 1:500 पतला थे ।
  12. महाप्राण प्रत्येक नमूने से एंटीबॉडी समाधान और झूली कुरसी पर कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए PBST के साथ नमूने धो लो । धो चरण 3 बार दोहराएं ।
  13. एक गिलास स्लाइड की सतह पर हार्ड सेट बढ़ते मध्यम की एक बूंद की स्थिति । संदंश का प्रयोग, मोल्ड से हल्के से अतिरिक्त समाधान निकालें एक कागज तौलिया पर मोल्ड के किनारे सोख्ता । ध्यान से मोल्ड ऊपर नीचे बढ़ते माध्यम पर जगह और बुलबुले शुरू करने से बचें ।
  14. बढ़ते माध्यम को कमरे के तापमान पर ४८ घंटे के लिए कठोर अनुमति देते हैं । कमरे के तापमान या 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों की दुकान । मध्यम के अपवर्तन सूचकांक के रूप में इमेजिंग से पहले पूरी तरह से ४८ ज के लिए सेट करने के लिए बढ़ते माध्यम सख्त के पाठ्यक्रम पर बदल जाएगा अनुमति देते हैं । संदूषण या नमूना आंदोलन को कम करने के लिए स्पष्ट नेल पॉलिश के साथ ग्लास कवर स्लाइड के लिए नमूने सील ।
  15. छवि एक फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग कर नमूने ।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त ELPs पांच क्षेत्रों में शामिल हैं: एक T7 टैग, His6 टैग, enterokinase (EK) क्लीवेज साइट, एक जैव सक्रिय क्षेत्र, और एक elastin जैसे क्षेत्र (चित्रा 1) । T7 और His6 टैग मानक पश्चिमी दाग तकनीक के माध्यम से आसान पहचान के लिए अनुमति देते हैं । EK क्लीवेज साइट का परिचय टैग क्षेत्र के एंजाइमी हटाने के लिए अनुमति देता है, अगर जरूरत है । विस्तारित, fibronectin-व्युत्पन्न कोशिका-चिपकने वाला (' RGDS ') या गैर-चिपकने वाला (' RDGS ') अनुक्रम के लिए बायो-एक्टिव क्षेत्र एन्कोड होता है. अंत में, elastin की तरह क्षेत्र के केंद्रीय दोहराने अतिथि अवशेष स्थल है जो THPC के माध्यम से crosslinking में सक्षम बनाता है जबकि पार्श्व दोहराने isoleucine के एक LCST को प्राप्त करने के लिए शामिल है पर एक lysine समूह शामिल है ~ ३२ ° c31।

पोस्ट अभिव्यक्ति, एसडीएस-पृष्ठ या पश्चिमी ब्लाट आणविक वजन कल्पना और ELPs की पहचान की पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एंटीबॉडी टैग होते हैं, जैसे T7 (MASMTGGQQMG) या His6 (HHHHHH) (चित्रा 2). नियंत्रित शर्तों के तहत सफल अभिव्यक्ति एक उच्च सजातीय उत्पाद अनुमानित आणविक भार में एक एकल अंधेरे बैंड की उपस्थिति द्वारा प्रतिनिधित्व (~ ३७ केडीए) इन प्रोटीन का उपयोग दोनों एसडीएस-PAGE (चित्र 2a) और पश्चिमी दाग ( चित्र b) ।

अनियंत्रित परिस्थितियों में, एक पश्चिमी दाग पर कम आणविक वजन बैंड की उपस्थिति का पता चलता है कि प्रोटीन के कुछ अंश पूरी तरह से अनुवाद नहीं किया गया था और/या अभिव्यक्ति के बाद नीचा दिखाया गया था (चित्र 2c) । विशेष रूप से, यहां जनता द्वारा समान रूप से स्थान पर है ~ 9 केडीए जो मोटे तौर पर एक जैव सक्रिय क्षेत्र और तीन elastin क्षेत्रों की तरह वजन से मेल खाती है (एक ' दोहराने '), या लगभग एक चौथे लक्ष्य प्रोटीन की । अभिव्यक्ति एक उच्च तापमान पर किया जाता है जब इन छोटे प्रोटीन अंशों आमतौर पर मौजूद हैं (> 32 ° c) के रूप में चित्रा 2cमें. इन कम आणविक वजन प्रोटीन की उपस्थिति अप्रत्याशित यांत्रिक गुणों के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । इस प्रकार, नियमित स्क्रीनिंग पोस्ट अभिव्यक्ति एक उच्च गुणवत्ता अंतिम उत्पाद सुनिश्चित करने के लिए सिफारिश की है ।

दद-आधारित hydrogels की यांत्रिक कठोरता को दद की एकाग्रता या THPC प्रतिक्रियाशील समूहों के अनुपात से जोड़कर संशोधित किया जा सकता है: दद प्राथमिक अमीन. समवर्ती, कोशिका चिपकने वाले लाइगैंडों की एकाग्रता कोशिका के साथ दद वेरिएंट का अनुपात बदलकर चिपकने वाला (RGDS) किसी भी कठोरता शासन के भीतर गैर चिपकने वाला (RDGS) अनुक्रम को देखते किया जा सकता है । इन दो चर जोड़ तोड़ करके, हम जैल कि यांत्रिक गुणों और ligand सांद्रता (चित्रा 3) की एक स्पेक्ट्रम है उत्पादन कर सकते हैं ।

3d दद hydrogels के भीतर कोशिकाओं encapsulate करने के लिए, कोशिकाओं की वांछित संख्या मध्यम में निलंबित कर रहे हैं और एक सेल गोली (चित्रा 4a) का उत्पादन करने के लिए केंद्रापसारक. मध्यमा ट्यूब से aspirated है, और वांछित एकाग्रता के दद समाधान में कोशिकाओं को फिर से समान रूप से निलंबित कर दिया जाता है । अगले, THPC समाधान सेल/दद निलंबन और pipetted एक समरूप मिश्रण बनाने के लिए अच्छी तरह से जोड़ा जाता है । यह समाधान जल्दी से एक 24 अच्छी तरह से एक पिपेट का उपयोग कर प्लेट के भीतर बाँझ सिलिकॉन molds को हस्तांतरित और कमरे के तापमान और ३७ ° c के लिए 15 मिनट प्रत्येक (चित्रा 4B) पर crosslink की अनुमति दी है । अंत में, मध्यम अच्छी तरह से थाली में जोड़ा जाता है और प्रयोग में ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन ।

जीवित/मृत धुंधला करने के लिए सेल व्यवहार्यता का आकलन किया जा सकता है और सफल सेल encapsulation के भीतर दद hydrogels । के रूप में चित्रा 5में सचित्र, वयस्क murine तंत्रिका जनक कोशिकाओं (NPCs) 7 दिनों में एक 3% के भीतर उच्च कोशिका व्यवहार्यता दिखाएं (w/दद hydrogel ।

3d दद hydrogels पहले का समर्थन करने के लिए दिखाया गया है एनपीसी स्टेम रखरखाव विहित एनपीसी प्रोटीन मार्करों की अभिव्यक्ति के माध्यम से मापा SRY (लिंग का निर्धारण क्षेत्र Y)-बॉक्स 2 (Sox2) और nestin9। NPCs encapsulated in 3% (w/v) दद hydrogels कम THPC के साथ crosslinking नाभिकीय स्थानीयकृत Sox2 की उच्च अभिव्यक्ति और cytoplasmic के माध्यम से nestin immunostaining रेशा दिखाने के लिए और फोकल इमेजिंग (चित्रा 6).

Figure 1
चित्र 1 : दद और इसी एमिनो एसिड अनुक्रम का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व । इस अध्ययन में प्रयुक्त दद एंटीबॉडी-आधारित इमेजिंग, सेल-चिपकने वाले डोमेन की शुरूआत के लिए एक जैव सक्रिय क्षेत्र के लिए एक T7 और His6 टैग, और लोचदार यांत्रिक गुणों प्रदान करता है और रासायनिक crosslinking के लिए अनुमति देता है कि एक elastin की तरह क्षेत्र शामिल हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : लक्ष्य प्रोटीन अभिव्यक्ति एसडीएस के साथ मांय किया जा सकता है पृष्ठ और पश्चिमी दाग आणविक वजन और अंतिम lyophilized उत्पाद की पहचान की पुष्टि करने के लिए । T7 (MASMTGGQQMG) या histidine 6 (HHHHHH) टैग (ख) का उपयोग करते हुए दोनों एसडीएस-पृष्ठ (क) और पश्चिमी दाग द्वारा रिपोर्ट के रूप में शुद्ध पूर्ण लंबाई दद ३७ केडीए के एक आणविक भार पर चलाता है. (ग). दद. के. एक्सप्रेशन प्रोटोकॉल में विचलन की वजह से दद. के. की अशुद्ध बैचों को कम आणविक भार के साथ ELPs की अभिव्यक्ति तक ले जा सकता है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: RGDS ligand सामग्री स्वतंत्र रूप से दद hydrogels के भीतर यांत्रिक गुणों से देखते जा सकते हैं । 5% (w/v) और 3% (w/v) दद hydrogels है कतरनी moduli के ~ ८०० pa और ~ ४०० pa, क्रमशः । THPC प्रतिक्रियाशील समूहों के 1:1 अनुपात के साथ Hydrogels: दद प्राथमिक अमीन 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर crosslinked थे, ३७ डिग्री सेल्सियस से गरम, और 5 मिनट के लिए माप से पहले equilibrate के लिए अनुमति दी । डेटा का अर्थ है ± s.d., * **p < 0.001 । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4: में सेल encapsulation की योजनाबद्ध दद hydrogels. (A). cells शुरू में असंबद्ध मध्यम में एक एकल सेल निलंबन में है और एक केंद्रापसारक का उपयोग कर गोली । मध्यम ट्यूब से aspirated है, और कोशिकाओं को फिर से वांछित एकाग्रता पर दद समाधान में निलंबित कर रहे हैं और अच्छी तरह से मिलाया. अंत में, THPC crosslinking समाधान जोड़ा और अच्छी तरह से मिलाया जाता है । (ख). तुरंत THPC के अलावा निंनलिखित, समाधान एक पिपेट के साथ एक सिलिकॉन मोल्ड में डाली है । समाधान 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर crosslink करने की अनुमति दी है ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक दूसरे 15 मिनट की मशीन द्वारा पीछा किया । इसके बाद माध्यम ने प्रयोग की अवधि के लिए संस्कृति को अच्छी तरह से जोड़ा है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5: तंत्रिका जनक कोशिकाओं को बनाए रखने में उच्च व्यवहार्यता दद hydrogels. प्रतिनिधि छवि तंत्रिका जनक कोशिकाओं में समझाया 3% (w/v) दद hydrogels के साथ 1:1 crosslinking (THPC प्रतिक्रियाशील समूह: दद प्राथमिक अमीन) संस्कृति में 7 दिनों के बाद. ग्रीन: लाइव धुंधला (calcein-AM); लाल: मृत दाग (ethidium homodimer) । स्केल बार = १०० µm ।

Figure 6
चित्र 6 : 3d दद hydrogels का समर्थन तंत्रिका जनक कोशिका स्टेम निर्माता अभिव्यक्ति. इम्यूनोफ्लोरेसेंस की छवि तंत्रिका जनक कोशिकाओं को व्यक्त Sox2 और nestin प्रोटीन के बाद 7 दिनों की संस्कृति में दद hydrogels. छवियां दिखाएं कोशिकाओं में encapsulated 3% (w/v) दद जैल विथ 0.5:1 crosslinking (THPC रिएक्टिव ग्रुप्स: दद प्राइमरी अमीन). नीला: DAPI (नाभिक); लाल: Sox2; हरा: nestin । स्केल बार = 25 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

रिकॉमबिनेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति और शुद्धि उच्च reproducibility के साथ संश्लेषित करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है । काफी हद तक व्यावसायिक आणविक क्लोनिंग के आगमन के कारण, कस्टम रिकॉमबिनेंट plasmids कई आपूर्तिकर्ताओं, जो काफी समय ELPs तरह सामग्री के साथ काम करने के लिए कम से खरीदा जा सकता है । इसी तरह, plasmids प्रारंभिक प्रयोगशाला से सीधे अनुरोध किया जा सकता है जब मूल काम एक संघीय अनुबंध द्वारा समर्थित किया गया था और भविष्य के काम गैर लाभ के लिए उपयोग किया जाएगा । पूरा दद अमीनो अम्ल अनुक्रम पहले कई दद वेरिएंट31के लिए प्रकाशित किया गया है । हालांकि, रिकॉमबिनेंट प्रोटीन की अंतिम शुद्धि के लिए अभिव्यक्ति से प्रक्रिया महत्वपूर्ण कदम है कि सामांयतः कम पैदावार या कम गुणवत्ता के उत्पाद के लिए नेतृत्व कर सकते है की एक संख्या शामिल है । दद तैयार करने के लिए सबसे आम मुद्दों में से कुछ निम्नलिखित में से एक में पैदा होते हैं: (1) संग्रहित बैक्टीरियल स्टॉक्स की गुणवत्ता, (2) जीवाणु झिल्ली को बाधित करने के लिए पहली फ्रीज-गल चक्र, और (3) थर्मल साइकलिंग के माध्यम से प्रोटीन शुद्धि ।

प्रोटीन अभिव्यक्ति और अंय गैर के बीच एक प्रमुख अंतर-सामग्री के उत्पादन के जैविक साधन है कि हम रिकॉमबिनेंट मेजबान की जैविक मशीनरी का लाभ के लिए बहुलक संश्लेषित कर रहे हैं । सेलुलर मौत या क्षति: बाद में, इस तकनीक एक अद्वितीय सीमा के साथ आता है । कोशिका मृत्यु सबसे अधिक एक प्लेट या असामान्य रूप से छोटे कालोनियों कि अपेक्षाकृत धीरे बढ़ने के बाद बैक्टीरियल कालोनियों की एक कम संख्या के रूप में ही प्रकट होता है । बैक्टीरियल स्टॉक्स, अगर ध्यान से बनाए रखा, साल के लिए स्थिर रह सकते हैं; हालांकि, दोहराया उपयोग या फ्रीजर विफलता के कारण लगातार फ्रीज-गल चक्र कोशिका व्यवहार्यता को कम करने या डीएनए क्षति के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । ठेठ BL21 बैक्टीरिया स्टॉक 10% और ४०% ग्लिसरॉल निलंबित कोशिकाओं के साथ मिश्रित मात्रा के बीच का उपयोग करें । ग्लिसरॉल का उद्देश्य ठंड के दौरान nucleating बर्फ क्रिस्टल से झिल्ली की क्षति को कम करने के लिए है । इसलिए, कम सांद्रता का उपयोग करके (< 10%), एक समझौता झिल्ली का नेतृत्व कर सकते हैं, जबकि उच्च सांद्रता (> 40%) फ्रीजिंग पॉइंट को पर्याप्त रूप से दबा सकते हैं, जहां स्टॉक को कभी भी सेल की मृत्यु के लिए अग्रणी नहीं रखा जाता । हालांकि, यहां तक कि इष्टतम ग्लिसरॉल के स्तर के भीतर, बैक्टीरियल शेयरों पुनः ठंड और ग्लिसरॉल से साइटोटोक्सिक प्रभाव से झिल्ली क्षति का एक संयोजन के रूप में पूरी तरह से गल की अनुमति नहीं दी जानी चाहिए कम स्टॉक व्यवहार्यता और डीएनए क्षति के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । इसलिए, अगर यह देखा गया है कि एक कम कॉलोनी गिनती में एक जीवाणु स्टॉक परिणाम या कि कोशिकाओं को एक लगातार धीमी दर पर विभाजित कर रहे हैं (अभिव्यक्ति के दौरान एक धीमी आयुध डिपो६०० रैंप दर के रूप में प्रकट), फिर से प्लाज्मिड बदलने और एक नया शेयर बनाने एक सरल है इस समस्या के निवारण के लिए पहला तरीका । इस के साथ मन में, बैक्टीरियल स्टॉक और डीएनए की अखंडता के दीर्घकालिक बनाए रखने के लिए, यह सबसे अच्छा है के रूप में शुद्ध डीएनए पानी में जमे हुए और नहीं कोशिकाओं के भीतर अपने प्लाज्मिड की प्रतियां स्टोर । इस तरह से डीएनए भंडारण यह सुनिश्चित करेगा कि अप्रत्याशित घटनाओं में एक असफल शेयर या फ्रीजर विफलता, मूल डीएनए के एक विश्वसनीय स्रोत के रूप में परिवर्तन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

दद निर्माण में एक और महत्वपूर्ण कदम अभिव्यक्ति मेजबान से लक्ष्य प्रोटीन की शुद्धि है । ई. कोलाई से प्रोटीन निष्कर्षण nucleating बर्फ क्रिस्टल का उपयोग कर सेल दीवार तोड़ने से हासिल की है कि ठंड पर निलंबित सेल lysate भर में फार्म, जो आगे लगातार फ्रीज-गल चक्र के साथ जटिल है । rupturing के लिए वैकल्पिक तरीकों सेल दीवार जैसे sonication या एक प्रेस के रूप में उपयोग किया जा सकता है । विशेष रूप से, लगातार फ्रीज lysate के गल के रूप में यह केवल एक फ्रीजर और कोई अंय विशेषता उपकरण की आवश्यकता है लाभप्रद है । हालांकि, इस प्रक्रिया को विशेष रूप से डीएनए, आरएनए, और प्रोटीन संदूषण, कि लक्ष्य प्रोटीन नीचा करने की क्षमता है के अलावा में, विज्ञप्ति । इसलिए, संक्रमण और कम उपज से बचने के लिए, deoxyribonuclease I (DNase) और phenylmethanesulfonyl फ्लोराइड (PMSF) को कोशिका lysate में जोड़ दिया जाता है ताकि डीएनए को नीचा कर दिया जाए और वह क्रमशः बाधित हो जाए । डीएनए की उपस्थिति से पहले DNase के अलावा नेत्रहीन देखा जा सकता है एक ' रेशेदार ' प्रकटन के रूप में पुन: निलंबित सेल lysate पहले गल के बाद । DNase सक्रिय रूप से इस डीएनए नीचा और इस तरह यह आसान केंद्रापसारक के माध्यम से शुद्ध करने के लिए बनाने lysate कोशिका की चिपचिपाहट कम कर देता है । डीएनए के इष्टतम तोड़ नेत्रहीन सुनिश्चित करना है कि सेल lysate के लिए पूरी तरह से तरल प्रतीत होता है और यह है कि रेशेदार उपस्थिति अब दिखाई नहीं है द्वारा की पुष्टि की जा सकती है । हम अभ्यास में देखा है कि के अलावा के ~ ०.१ मिलीग्राम DNase प्रति मिलीलीटर सेल lysate के लिए आवश्यक क्षरण को प्राप्त करने के लिए पर्याप्त है । हालांकि, अगर डीएनए की उपस्थिति अभी भी मनाया जाता है, अधिक DNase आंदोलन के एक अतिरिक्त दो से तीन घंटे के बाद जोड़ा जा सकता है । एक समान मुद्दा भी पैदा कर सकते है अगर DNase समय से पहले जोड़ा है lysate के किसी भी पर्याप्त रूप से गल की क्षमता पड़ा है । इस मामले में, ठंडा तापमान DNase की समयपूर्व निष्क्रियता के कारण डीएनए गिरावट की क्षमता को सीमित कर सकते हैं । इस मुद्दे से बचने के लिए, यह अक्सर सबसे अच्छा अभ्यास के लिए DNase के साथ इलाज करने से पहले लगभग 8 घंटे के लिए गल को फिर से निलंबित गोली की अनुमति है । इसके अलावा, यदि कम प्रोटीन की पैदावार की सूचना और डीएनए के टूटने के लिए पर्याप्त किया गया है, और अधिक PMSF के अलावा मदद करने के लिए आगे की आवश्यकता हो सकती है कि संभावित प्रोटीन गिरावट को कम करने के लिए ।

ELPs की इष्टतम अभिव्यक्ति सुनिश्चित करने के लिए अतिरिक्त विचार एक चुने हुए एंटीबायोटिक के लाभों और सीमाओं की एक सावधान समझ शामिल हैं । यहां, pET15b एक एम्पीसिलीन प्रतिरोध जीन युक्त वैक्टर प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए इस्तेमाल किया गया । कार्यात्मक, पीईटी वेक्टर श्रृंखला एक जीवाणु प्रोटीन अभिव्यक्ति के रूप में ज्यादा के रूप में ५०% के साथ महत्वपूर्ण प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए अनुमति देने के लक्ष्य प्रोटीन के लिए समर्पित एक सफल प्रेरण३२निंनलिखित,३३। हालांकि, एक चयन एंटीबायोटिक के रूप में एम्पीसिलीन कुछ सीमाएं है कि इष्टतम अभिव्यक्ति के साथ हस्तक्षेप कर सकते है के साथ आता है । सबसे पहले, एम्पीसिलीन के ई. कोलाई की उपस्थिति में गिरावट तेजी से बीटा-lactamase के रिलीज के कारण हो सकता है । यदि एम्पीसिलीन की पर्याप्त मात्रा में नीचाई है तो एम्पीसिलीन-एंकोडिंग प्लाज्मिड (अर्थात दद-एंकोडिंग प्लाज्मिड) पूरी तरह से खो सकती है । एक परिणाम के रूप में, जब लंबी अवधि के लिए ELPs व्यक्त, प्रोटीन अभिव्यक्ति का स्तर ध्यान से लगातार समय अंक पर नजर रखी जानी चाहिए को दद-एंकोडिंग जीन की पर्याप्त मात्रा में सुनिश्चित करने के लिए वांछनीय अभिव्यक्ति के लिए अनुमति देता रहता है । बीटा-लैक्टमेज़ के buildup की समस्या निवारण के लिए संभावित तरीकों में शामिल है स्टार्टर कल्चर का कताई करना और अभिव्यक्ति माध्यम को inoculating से पहले एंटीबायोटिक मुक्त माध्यम में कोशिकाओं को फिर से सस्पैंड करना । इस प्रक्रिया को प्रभावी ढंग से एंटीबायोटिक अपमानजनक एंजाइमों के हस्तांतरण सीमा और कोशिकाओं का एक बड़ा हिस्सा लक्ष्य प्रोटीन एंकोडिंग वेक्टर होते है सुनिश्चित करता है । इसके अतिरिक्त, एम्पीसिलीन लगभग दो से तीन सप्ताह के एक सीमित शैल्फ जीवन है । इसलिए, प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए संस्कृति प्लेटें 4 डिग्री सेल्सियस पर दो सप्ताह पहले उपयोग करने के लिए अधिकतम के लिए संग्रहित किया जाना चाहिए । अंत में, स्टार्टर और अभिव्यक्ति मीडिया के भीतर एम्पीसिलीन की प्रभावकारिता सुनिश्चित करने के लिए, एम्पीसिलीन स्टॉक समाधान तुरंत उपयोग करने से पहले ताजा उत्पादन किया जाना चाहिए, के रूप में लंबी अवधि के भंडारण एक कम प्रभावी एंटीबायोटिक के लिए नेतृत्व कर सकते हैं ।

एक LCST की उपस्थिति थर्मल साइकिल चालन के माध्यम से ELPs के सरल शुद्धिकरण के लिए अनुमति देता है । विशेष रूप से, एक उच्च तापमान पर और लवण की उपस्थिति में, entropic बलों ELPs कारण कम घुलनशील हो और बाद में एक बहुलक युक्त coacervate चरण फार्म । दूसरी ओर, कम तापमान पर, ELPs में घुलनशील रहते है और आसानी से समाधान में भंग । इन दो तापमान केंद्रापसारक कदम उठाने और गैर-दद-युक्त चरण क्रमिक को त्यागने के साथ मिलकर शासन के बीच सायक्लिंग प्रोटीन ध्यान केंद्रित है और एक साथ गैर-दद संदूषण के अस्तित्व को कम कर देता है ।

हालांकि, वहां चरणों के एक नंबर रहे है जहां ELPs इस शुद्धि प्रक्रिया में खो सकते हैं । सबसे पहले, हर ठंड स्पिन से पहले, प्रोटीन युक्त समाधान ९.० के एक पीएच करने के लिए alkalized है । यह उच्च पीएच प्रोटीन रीढ़ पर कुछ एमिनो एसिड deprotonate करने के लिए, प्रभावी ढंग से उंहें एक आरोप लगाया राज्य में छोड़ने और आगे अपने घुलनशीलता बढ़ाने के लिए कार्य करता है । नतीजतन, इस कदम पूर्वगामी या अनुमति प्रोटीन विघटन के लिए पर्याप्त समय गैर के रूप में उपज में कमी करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं-solubilized प्रोटीन केंद्रापसारक के दौरान गोली और छोड़ दिया जाएगा ।

इसी तरह, लक्ष्य प्रोटीन गर्म स्पिन प्रक्रिया के दौरान खो जा सकता है जब दद गोली है । शुरू में NaCl की घुलनशीलता को कम करने के लिए प्रोटीन से भरपूर supernatant को जोड़ा जाता है । लवण प्रोटीन और पानी के अणुओं के बीच इलेक्ट्रोस्टैटिक बातचीत ढाल काम करते हैं, प्रोटीन जलीय चरण से अलग करने के लिए कारण । इस आशय का समाधान ताप से परिलक्षित होता है, जो, entropic प्रभाव के कारण, आगे जलयुक्त ' पिंजर ' आसपास के ELPs को तोड़ता है और प्रोटीन के एकत्रीकरण को बल देता है. कम प्रोटीन सांद्रता (यानी, पहले थर्मल चक्र), अकेले लवण के अलावा अक्सर इस चरण जुदाई पैदा करने के लिए अपर्याप्त है । हालांकि, के रूप में प्रोटीन की एकाग्रता (यानी, बाद में थर्मल चक्र) बढ़ जाती है, और वहाँ लवण के साथ बातचीत करने के लिए कम माध्यमिक संदूषित कर रहे हैं, दद अधिक आसानी से हाला जाएगा. एक परिणाम के रूप में, यदि लवण भी जल्दी से जोड़ रहे हैं, वे शारीरिक रूप से प्रोटीन का एकत्रीकरण, जो प्रभावी ढंग से समाधान के नमक एकाग्रता को कम कर देता है और आगे प्रोटीन वर्षण सीमा के द्वारा फंस हो सकता है । इस प्रकार, नमक तीन छोटे बैचों में जोड़ा जाना चाहिए सुनिश्चित करने के लिए वे समाधान के माध्यम से homogenously वितरित करने के लिए पर्याप्त समय है । एक अंतिम नोट के रूप में, दद रीढ़ की भिन्नता, या तो elastin-जैसे क्षेत्र या जैव-सक्रिय क्षेत्र में परिवर्तन के अतिथि अवशेषों के लिए आगे संशोधनों के माध्यम से काफी LCST व्यवहार को प्रभावित कर सकते हैं. नतीजतन, प्रोटीन वेरिएंट में इष्टतम प्रोटीन पैदावार सुनिश्चित करने के लिए, यह करने के लिए महत्वपूर्ण है पीएच, नमक एकाग्रता, और नमक प्रकार का अनुकूलन (उदा, monovalent या divalent) ठंड और गर्म spins के लिए ।

एसडीएस रनिंग-प्रोटोकॉल पूरा होने पर पृष्ठ की सिफारिश की है के रूप में यह आसानी से निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है अगर महत्वपूर्ण दद नुकसान शुद्धि चरणों में से किसी के दौरान होता है । संक्षेप में, अगर एक गर्म स्पिन के बाद supernatant में दद का पता चला है, तो प्रोटीन प्रभावी रूप से उपजी नहीं किया जा रहा है । इसी तरह, अगर ELPs एक ठंडी स्पिन के बाद solubilized गोली के एक नमूने में पहचान कर रहे हैं, तो प्रोटीन प्रभावी ढंग से भंग नहीं किया जा रहा है ।

दद hydrogels सिंथेटिक या प्राकृतिक रूप से व्युत्पंन सामग्री पर कई लाभ प्रदान करते हैं । विशेष रूप से, अमीन के उपयोग-प्रतिक्रियाशील crosslinker THPC एक कम लागत, सरल, और स्वरित्र तंत्र प्रोटीन crosslinking के मुलाजिम । हालांकि, वहां crosslinking प्रोटोकॉल है कि ध्यान दिया जाना चाहिए भीतर अलग सीमाएं हैं । THPC ऑक्सीजन संवेदनशील है, और अगर अनुचित शर्तों के तहत संग्रहीत, यह जल्दी से प्रतिक्रिया दक्षता में खराब कर सकते हैं । इसके अलावा, प्राथमिक अमीन के साथ अपनी जेट के कारण, THPC मीडिया या सेल की सतह है कि अमीन में अमीर है पर उन में आसपास के प्रोटीन के साथ प्रतिक्रिया कर सकते हैं । इसलिए, जब दद hydrogels बनाने, यह सेल गोली के साथ मीडिया संदूषण संभव exogenous प्रोटीन पार जेट कम करने के लिए और इस प्रकार, crosslinking दक्षता में कमी से बचने के लिए सिफारिश की है । अंत में, इस crosslinking तंत्र precludes कोई lysine अवशेषों युक्त उन लोगों के लिए जैव सक्रिय क्षेत्र अनुक्रम और इस प्रकार, कुछ कोशिका चिपकने वाली रूपांकनों (जैसे, IKVAV३४) के संभावित एकीकरण की सीमा । इन सीमाओं को संबोधित करने के लिए, azide और bicyclononyne (BCN) प्रतिक्रिया भागीदारों के साथ दद रीढ़ के लिए संशोधन जैव ओर्थोगोनल crosslinking के लिए अनुमति देता है, के रूप में पहले27वर्णित ।

यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि दद LCST व्यवहार hydrogel microstructure को हुक्म देने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. LCST के ऊपर तापमान शासनों से कम, ELPs समाधान के गठन के लिए अग्रणी प्रोटीन से भरपूर और प्रोटीन की कमी चरणों कि मैट्रिक्स porosity और मैट्रिक्स के crosslinking क्षमता को प्रभावित कर सकते हैं9. क्योंकि सबसे सेल संस्कृति प्रयोगों शारीरिक रूप से प्रासंगिक तापमान पर आयोजित कर रहे हैं (~ ३७ ° c) दद LCST के ऊपर, इन प्रभावों पर विचार किया जाना चाहिए. hydrogels को प्रभावी ढंग से crosslink और एक परस्पर प्रोटीन नेटवर्क फार्म के लिए, lysine से प्राथमिक अमीन THPC crosslinker के लिए शारीरिक रूप से सुलभ होना चाहिए । यदि पर्याप्त crosslinking पहुंचने से पहले दद एकत्रीकरण होता है, तो प्रोटीन-रिच चरण के भीतर फंसे ELPs दुर्गम हो सकते हैं और इस प्रकार crosslinking में भाग लेने में असमर्थ होते हैं । इस सीमा को हल करने के लिए, हमारे प्रोटोकॉल कमरे के तापमान पर एक प्रारंभिक 15 मिनट crosslinking अवधि की आवश्यकता है, जो hydrogel के प्रारंभिक crosslinking के लिए अनुमति देता है पहले दद अपने थर्मल चरण संक्रमण से गुजरती है । इस कमरे के तापमान गर्मी ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक अतिरिक्त 15 मिनट की मशीन द्वारा पीछा किया जाता है hydrogel crosslinking को अंतिम रूप देने के लिए । यह कार्यविधि पर्याप् त crosslinking और मजबूती के लिए महत् वपूर्ण है, reproducible जमाना की दद सामग्री है ।

अंत में, रिकॉमबिनेंट प्रोटीन hydrogels का उपयोग कर निर्मित दद प्रोटीन अनुक्रम के असाधारण tunability प्रस्ताव और इसलिए 3 डी सेल microenvironment । दद पॉलिमर उच्च पैदावार में expressible होने के लिए दिखाया गया है, उनके LCST व्यवहार के कारण आसानी से शुद्ध, और इन विट्रो में की एक विस्तृत विविधता में और विवो सिस्टम में संगत. एक रिकॉमबिनेंट मेजबान के रूप में ई. कोलाई का उपयोग एक सरल और सस्ती प्रक्रिया है कि बहुलक आणविक वजन और कार्यशीलता के निकट पूर्ण नियंत्रण को जंम देता है प्रदान करता है । संयोजन के रूप में, इस तकनीक की अनुमति देता है मजबूत tunability और hydrogel मंच 3 डी में सेल प्रकार की एक विस्तृत श्रृंखला की संस्कृति के लिए अनुमति के reproducibility के लिए । अंत में, इस दद hydrogel मंच qRT-पीसीआर, पश्चिमी दाग, डीएनए निष्कर्षण, और सेल immunostaining9सहित कई बहाव जैव रासायनिक परख के लिए उत्तरदायी है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक टी पामर और एच बाबू (स्टैनफोर्ड न्यूरोसर्जरी) murine NPCs. वेक्टर में कला प्रदान करने के लिए धंयवाद चित्रा 4 का उपयोग किया गया था और Servier चिकित्सा कला से अनुकूलित के तहत क्रिएटिव कॉमंस रोपण ३.० unported लाइसेंस (https://creativecommons.org/ /3.0/legalcode) द्वारा लाइसेंस । इस काम का हिस्सा स्टैनफोर्ड नैनो साझा सुविधाओं (SNSF), पुरस्कार ECCS-१५४२१५२ के तहत राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन द्वारा समर्थित पर प्रदर्शन किया था । N.A.S. राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (32GM008412) के जनरल मेडिकल साइंसेज के नेशनल इंस्टिट्यूट से समर्थन स्वीकार करता है । C.M.M. एक NIH NRSA पूर्व डॉक्टरेट फैलोशिप (F31 EB020502) और Siebel विद्वानों कार्यक्रम से समर्थन स्वीकार करता है । S.C.H. स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों (U19 AI116484 और R21 EB018407), राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (DMR १५०८००६), और reअपक्षय चिकित्सा के लिए कैलिफोर्निया संस्थान (RT3-07948) से समर्थन स्वीकार करता है । इस अनुसंधान reअपक्षयी पुनर्वास अनुसंधान और प्रशिक्षण (एआर3टी), जो Eunice कैनेडी श्राइवर बाल स्वास्थ्य और मानव विकास के राष्ट्रीय संस्थान (niched), राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित है के लिए एलायंस से धन प्राप्त मस्तिष्क संबंधी विकार और स्ट्रोक (NINDS), और नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ बायोमेडिकल इमेजिंग और जैव इंजीनियरिंग (NIBIB) पुरस्कार संख्या P2CHD086843 के तहत स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के । सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिंमेदारी है और जरूरी नहीं कि स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के विचारों का प्रतिनिधित्व करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Elastin-Like Protein Expression and Purification
10 cm Petri Dishes Thermo Fisher Scientific FB0875713
70% Ethanol RICCA Chemical 2546.70-1
Ammonium Sulfate Sigma-Aldrich A3920-500G
Ampicillin Thermo Fisher Scientific BP1760-25G
Bacto Agar Thermo Fisher Scientific 9002-18-0 
BL21(DE3)pLysS Competent Cells Invitrogen C606003
Chloramphenicol Amresco 0230-100G 
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas Sigma-Aldrich DN25
EDTA disodium salt, dihydrate Thermo Fisher Scientific O2793-500
Glycerol Thermo Fisher Scientific BP229-4
Isopropanol Thermo Fisher Scientific A451-4
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)  Thermo Fisher Scientific BP1755-10G
Luria Broth EMD Millipore 1.10285.5007
Parafilm VWR 52858-000
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) MP Biomedicals 195381
Sodium Chloride Thermo Fisher Scientific BP358-212
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich S 8045-1KG
Syringe Filter Unit (0.22 μm) Millipore SLGP033RB
Terrific Broth Millipore 71754-4
Tris Base Thermo Fisher Scientific BP152-1
Cell Encapsulation in 3D ELP Hydrogels
0.22 μm syringe filters Millipore SLGV004SL
0.5 mm thick silicone sheet Electron Microscopy Science 70338-05
24-well tissue culture plates  Corning 353047
Disposable Biopsy Punch (2 mm) Integra Miltex 33-31
Disposable Biopsy Punch (4 mm) Integra Miltex 33-34
Disposable Biopsy Punch (5 mm) Integra Miltex 33-35
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS)  Corning 21-031-CM
No. 1 12 mm glass coverslips Thermo Fisher Scientific 12-545-80
Tetrakis(hydroxymethyl)phosphonium chloride (THPC) Sigma-Aldrich 404861-100ML
0.5% Tryspin/EDTA Thermo Fisher  15400054
Immunocytochemistry of Cells in 3D ELP Hydrogels
16% (w/v) Paraformaldehyde (PFA) Electron Microscopy Sciences 15701
Bovine Serum Albumin (BSA) Roche 3116956001
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Molecular Probes D1306 
Donkey Serum Lampire Biological Labs 7332100
Goat anti-mouse Secondary Antibody (AF488) Molecular Probes A-11017
Goat anti-rabbit Secondary Antibody (AF546) Molecular Probes A-11071
Goat Serum Gibco 16210-072
Mouse Nestin Primary Antibody BD Pharmingen 556309
Mouse Sox2 Primary Antibody Cell Signaling Technology 23064S
Nail Polish Electron Microscopy Sciences 72180
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100-100ML
Vectashield Hardset Mounting Medium  Vector Labs H-1400 

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References

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इंजीनियरिंग अंक १३५ Elastin-जैसे प्रोटीन दद hydrogel 3डी सेल कल्चर immunostaining प्रोटीन एक्सप्रेशन रिकॉमबिनेंट प्रोटीन
3 डी में Elastin और कोशिकाओं के Immunostaining के लिए प्रोटीन Hydrogels की तरह उत्पादन
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LeSavage, B. L., Suhar, N. A., Madl, … More

LeSavage, B. L., Suhar, N. A., Madl, C. M., Heilshorn, S. C. Production of Elastin-like Protein Hydrogels for Encapsulation and Immunostaining of Cells in 3D. J. Vis. Exp. (135), e57739, doi:10.3791/57739 (2018).

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