Summary
يمكننا وصف بروتوكول لرسم خرائط التوزيع المكاني للنشاط الأنزيمي للإنزيمات التي تولد نيكوتيناتميدي الأدنين وأميد النيكوتنك (NAD(P)H) + H + في عينات الأنسجة مباشرة.
Abstract
تعيين النشاط الأنزيمي في الزمان والمكان أمر بالغ الأهمية لفهم الأساس الجزيئي لسلوك الخلية في أنسجة طبيعية والمرض. فحوصات النشاط الأيضي في الموقع يمكن أن توفر معلومات عن التوزيع المكاني لنشاط التمثيل الغذائي داخل أنسجة. نحن نقدم هنا بروتوكولا مفصلاً لرصد نشاط إنزيم لاكتات نازعة في عينات الأنسجة مباشرة. لاكتات نازعة محدداً هاما لما إذا كان سيتم تحويل الجلوكوز المستهلكة للطاقة عن طريق تحلل الهوائية أو اللاهوائية. يتم توفير محلول يحتوي على لاكتات وند لقسم أنسجة مجمدة. سيتم تحويل الخلايا ذات النشاط العالي لاكتات نازعة لاكتات المقدمة إلى بيروفات، بينما في نفس الوقت تحويل توفير نيكوتيناميد الأدنين dinucleotide (NAD) إلى NADH وبروتون، التي يمكن الكشف عنها استناداً إلى الحد من نيتروتيترازوليوم الأزرق إلى فورمازان، الذي هو تصور ترسبات زرقاء. يمكننا وصف بروتوكول مفصلة لمراقبة نشاط نازعة لاكتات في الجلد الماوس. تطبيق هذا البروتوكول، وجدنا أن النشاط نازعة لاكتات مرتفع في الخلايا الجذعية هادئة الشعرة داخل الجلد. وكشف تطبيق البروتوكول على الخلايا الجذعية الجنينية الماوس مثقف تلطيخ أعلى في استزراع الخلايا الجذعية الجنينية من الخلايا الليفية الجنينية الماوس. كشف تحليل للشريان الاورطي الماوس طازجة معزولة تلطيخ في خلايا العضلات الملساء عمودي للشريان الاورطي. يمكن استخدام المنهجية المقدمة إلى خريطة مكانياً نشاط الإنزيمات التي تولد بروتون في الأنسجة المجمدة أو الطازجة.
Introduction
فهم المواقع داخل الأنسجة التي يكون للإنزيمات مرتفعة أو منخفضة النشاط أمر ضروري لفهم التنمية وعلم وظائف الأعضاء. كثيرا ما تستخدم مستويات نسخة أو البروتين كالأمهات البديلات للنشاط الأنزيمي. وفي حين يمكن أن تكون مثل هذه الدراسات مفيدة، أنها لا توفر المعلومات التي يمكن أن تكون حاسمة بالنسبة لتحديد نشاط إنزيم في، مثل التعديلات بوستترانسلاشونال، ووجود البروتين المجمعات، أو الترجمة للانزيم سوبسيلولار. عندما يتم قياس النشاط الأنزيمي مباشرة، فإنه غالباً ما رصد في ليساتيس البروتين المتجانس التي لم تعد تحتوي على معلومات حول الخلايا الفردية داخل الخليط أو التوزيع المكاني للخلايا مع نشاط عالية أو منخفضة داخل أنسجة.
نحن نقدم هنا بروتوكول مفصل لرسم خرائط التوزيع المكاني للنشاط الأنزيمي داخل عينة أنسجة. وتستند المنهجية الدراسات السابقة مما يدل على أنه يمكن استخدام أملاح تيترازوليوم لتعريب النشاط ديهيدروجيناسيس، وريدوكتاسيس، وأوكسيداسيس في الأنسجة المجمدة1. بهذه الأساليب، تتشكل formazan تستعصي على الحل المياه عندما يتم نقل البروتونات إلى سولت2،تيترازوليوم3. نازعة الجلوكوز-6-فوسفات يولد نادف وبروتون، وتم الكشف عن نشاط تيترازوليوم. وقد تم رصد نازعة الجلوكوز-6-فوسفات في السمك المفلطح الأوروبي خلايا الكبد4، في الخلايا السنخية النوع 2 من الرئتين5 والنيفرون الكلي5. كما استخدمت أملاح تيترازوليوم لرصد النشاط transketolase في الأنسجة المجمدة6. واستخدمت مؤخرا نهجاً مماثلاً مراقبة نشاط dehydrogenases متعددة في نفس الأنسجة على الشرائح المجاورة7.
يصف لنا هنا أسلوب استخدام أملاح تيترازوليوم لمراقبة التوزيع المكاني للنشاط نازعة لاكتات (الشكل 1). ويمكن تحويل نازعة لاكتات بيروفات المتولدة عن تحلل اللبن، ورد فعل عكسي. النشاط نازعة لاكتات نتيجة لذلك محدداً هاما لدخول بيروفات دورة حمض تريكاربوكسيليك مقابل لها إفراز كما لاكتات. كثيرا ما تستخدم مستويات اللاكتات في الدم لتشخيص مجموعة من الأمراض، بما في ذلك السرطان8،،من910، نظراً لأنه يمكن الإشارة أن المرض أو الإصابة أضرار الخلايا وقد تم الإفراج عن الإنزيم.
وهناك أربعة اللاكتات نازعة الجينات: لدها، لدب، لدهك، ولدهد11. ويعتقد أن نشأت من الازدواجية في أوائل الجينات لدها12لدها ولدهب. رابطة حقوق الإنسان النشط تيترامير ويمكن أن تشكل لدها ولدب هوموتيتراميرس وهيتيروتيتراميرس مع بعضها البعض. ويقال لدها أن يكون أعلى النسب بيروفات، بينما يقال لدهب تقارب أعلى لاكتات، وترتبط بشكل تفضيلي بتحويل اللاكتات إلى بيروفات13. مروج لدها يحتوي على مواقع الربط ل HIF1α، كميك و FOXM1 عوامل النسخ11. وباﻹضافة إلى ذلك، مثل العديد من الآخرين الإنزيمات جليكوليتيك14،15، يمكن تعديل رابطة حقوق الإنسان بواسطة التعديلات بوستترانسلاشونال. يمكن فوسفوريلاتي مستقبلات عامل النمو تنتجها الخلايا الليفية 1 لدها Y10، الذي يشجع تشكيل تيترامير، أو Y83، الذي يعزز NADH الركازة ملزمة16. كما يمكن لدها أسيتيلاتيد17. لهذه الأسباب، يتطلب فهم كامل لنشاط رابطة حقوق الإنسان رصد مستويات البروتين رابطة حقوق الإنسان، بل نشاط الإنزيم كذلك.
بالإضافة إلى الأسلوب نحن الحاضرين هنا، استخدمت نهج أخرى لمراقبة نشاط نازعة لاكتات. ويمكن رصد نشاط نازعة لاكتات سبيكتروفوتوميتريكالي في البروتين المتجانس ليستي. توليد NADH كما يتم تحويل اللاكتات إلى بيروفات يمكن أن يقاس استناداً إلى امتصاص في 340 نانومتر، بينما يمكن رصدها في اختفاء NADH كما يتم تحويل بيروفات إلى لاكتات18. وقد تم رصد نشاط نازعة لاكتات أيضا مع التصوير بالرنين المغناطيسي (التصوير بالرنين المغناطيسي). 13 ج-بيروفات يمكن أن تدار وتحويل بيروفات لاكتات يمكن رصدها بنسبة [1-13ج] لاكتات/[1-13ج] بيروفات. ارتفاع نسب [1-13ج] لاكتات/[1-13ج] بيروفات قد لوحظت في أنسجة السرطان19. بينما النهج القائم على التصوير بالرنين المغناطيسي يمكن أن تقدم معلومات عن النشاط نازعة لاكتات في العادي وأمراض الأنسجة، المنهجيات التي لا تملك القرار بحاجة إلى تحديد مستوى النشاط في الخلايا المحددة. المنهجية المقدمة هنا يمكن تقديم معلومات عن نشاط نازعة لاكتات في مجالات النسيج وحتى في الخلايا المفردة.
استخدام فحوصات النشاط في الموقع ، وجدنا أن نشاط نازعة لاكتات مرتفع في الخلايا الجذعية جريب الشعر من الجلد الماوس20. كما استخدمنا الطريقة لرصد نشاط نازعة لاكتات في استزراع الخلايا الجذعية الجنينية والعثور على النشاط أعلى في الخلايا الجذعية من الطبقة المغذية. وأخيراً، رصد نشاط نازعة لاكتات في الشريان الاورطي الماوس الطازجة ولاحظ تلطيخ في خلايا العضلات الملساء. يصف لنا هنا بروتوكول مفصلة لمراقبة نشاط نازعة لاكتات في الجلد الماوس المجمدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
جميع التجارب التي وصفت بموافقة "اللجنة رعاية الحيوان" في جامعة كاليفورنيا، لوس أنجلوس.
1-إنشاء شرائح جلد الماوس المجمدة
- Euthanize الفئران وفقا لسياسة المؤسسة.
ملاحظة: اتباع سياسة مؤسسية للملابس الواقية. يجب أن يوافق جميع البروتوكولات التي تنطوي على الحيوانات "لجنة رعاية الحيوان المؤسسية". - إزالة الشعر الماوس مع المتقلب شعر الحيواني.
- جعل شقوق في الجلد باستخدام مقص. استخدام الملقط، رفع الجلد بعيداً عن الماوس. باستخدام مقص، قص المقطع الجلد بعيداً.
- ملء كريومولد مع تجميد كاشف مركب (انظر الجدول للمواد).
- مكان الجلد المقاطع إلى كريومولدس مليئة باستخدام الملقط إبرة الآنف. توجيه الجلد حيث أن شرائح الأنسجة سوف تولد مقطع عرضي في الجلد من البشرة إلى الأدمة واللحمة والعضلات (الشكل 2).
ملاحظة: إذا كان ذلك ممكناً، جبل التجريبي ومكافحة الفئران معا في كريومولد نفسه حتى يمكن مقطوع على الشريحة نفسها ومعالجتها معا. الحرص على عدم خلق فقاعات. - وضع كريومولد على سطح مستو كتلة من الثلج الجاف دلو الجليد وتتيح تجميد. وتواصل مراقبة التوجه للجلد. تعديل إذا لزم الأمر.
ملاحظة: ارتداء القفازات المبردة عند التعامل مع الثلج الجاف. - نقل كريومولدس في ثلاجة-80 درجة مئوية للتخزين. يمكن الاحتفاظ بالعينات في الثلاجة لمدة 3 أشهر تقريبا دون فقدان كبير للنشاط الأنزيمي. لا تدع الأجزاء المجمدة تجف.
- استخدام كريوستات في-20 درجة مئوية، الأنسجة شريحة لإنشاء الأقسام 7-10 ميكرون سميكة ل مورفولوجية الجلد أفضل21.
2-إعداد الشرائح لتلطيخ
- إنشاء مجموعة الشرائح لفحصها. وتشمل شريحة تحكم التي سيتم حجب ند وعنصر تحكم آخر الشرائح التي الركازة، لاكتات، سيتم اقتطاع. وتشمل شريحة تحكم إيجابي من كتلة أنسجة مجمدة سابقا بالتحقيق.
- بإيجاز فيكس الشرائح التي تحتوي على أقسام الجلد مع 4% فورمالين لمدة 5 دقائق أما بواسطة بيبيتينج 1 مل من 4% فورمالين على الشريحة، أو عند تجهيز شرائح متعددة، بغمس الشرائح في وعاء يحتوي على 4% فورمالين.
ملاحظة: تثبيت البرنامج سيكفل الجلد لا تقشر من الشرائح أثناء الإجراءات التالية والحفاظ على مورفولوجية الجلد.
تنبيه: الفورمالين مادة مسرطنة وخطرة؛ ارتداء القفازات، لا تدع أنها تلمس جلدك وتنفيذ هذه الخطوة في غطاء الأبخرة كيميائية. - أغسل الشرائح مع مالا يقل عن 1 مل الفوسفات مخزنة المالحة، درجة الحموضة 7.4، كل شريحة أما عن طريق بيبيتينج أو غمس.
3-إعداد تلطيخ الحل
- دوامة الكواشف معا لتلطيخ نازعة لاكتات النشاط (50 مم تريس الأس الهيدروجيني 7.4، 750 ميكرون NADP، 80 ميكرومتر phenazine ميثوسولفاتي (PMS) وكلوريد نيتروتيترازوليوم الأزرق ميكرومتر 600 ولاكتات 30 ملم) في أنبوب حجم مناسب اعتماداً على مقدار التلوين الحل المطلوب.
ملاحظة: 1 مل كافية لتغطي كامل شريحة واحدة. - تعد حلاً ثانية التي يوجد جميع الكواشف ما عدا NAD. إعداد حل ثالث فيه جميع الكواشف موجودة ما عدا لاكتات.
4-احتضان الشرائح في تلطيخ الحل
- بلطف بيبيت الحل المصبوغة أو حلول السيطرة على استعداد الشرائح يشمل المقطع بأكمله (1 مل غير كافية لشريحة واحدة). إذا كان يجري تجهيز شرائح متعددة معا، وتراجع كافة الشرائح في الحل المصبوغة في نفس الوقت (تأكد من الحاوية وقد حل ما يكفي لتغطي كامل المقطع الأنسجة).
- احتضان الشرائح في بيئة هوميديفيد على 37 درجة مئوية في الظلام. إذا كان تلطيخ الحل فوق الشريحة، ضع الشريحة في بيئة هوميديفيد لمنع التبخر.
5-جهاز عرض الشرائح
- مراقبة تحويل الحل المصبوغة من واضحة إلى الأزرق بالمعاينة البصرية. عندما وصلت العينات إلى المستوى المنشود من الزرقة، التوقف عن رد فعل عن طريق إزالة الحل المصبوغة.
ملاحظة: للجلد، يكفي 10 دقيقة. الوقت سيتوقف على الجهاز والنشاط الأنزيمي. - شطف الشرائح مع الفوسفات مخزنة المالحة قبل بيبيتينج (1 مل غير كافية لكل شريحة) أو غمس.
ملاحظة: يجب الاحتفاظ أي العينات التي سيتم مقارنتها ببعضها البعض في حل المصبوغة لنفس المقدار من الوقت.
6-كونتيرستين وجبل
- بيبيت كونتيرستاين على الشرائح عند الشرائح وصلت إلى مستوى مناسب من الزرقة.
ملاحظة: سوف توفر كونتيرستينس التي بدورها النواة أحمر أو أخضر الجيدة النقيض الأزرق تم إنشاؤها بواسطة formazan مرسب. - جبل مع مائي أو غير المائية تصاعد المتوسطة22. قطرات واحد إلى ثلاثة (40-50 ميليلتر) من تصاعد المتوسطة يكفي تبعاً لحجم بكشف الغطاء.
7-صورة الشرائح وتحديدها كمياً
- صورة الشرائح تحت مجهر خفيفة. تأخذ صوراً لتجريبية ونماذج التحكم وكافة عناصر سلبية في 10 X 20 X و 40 X التكبير.
- تحديد كثافة وصمة عار الزرقاء في مناطق مختلفة مع برمجيات تحليل الصورة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
أننا قد أبلغوا نتائج لفحوصات في الموقع النشاط في الماوس الجلد20. كما هو موضح في الشكل 3، لاحظنا أعقبت ارتفاع مستويات النشاط نازعة لاكتات في الخلايا الجذعية جريب الشعر في قاعدة الشعرة عند الإجراءات الموصوفة أعلاه. هذه النتائج كانت تؤكده الأسفار تنشيط الخلية الفرز للجلد للخلايا الجذعية جريب الشعر ويؤكد النشاط ارتفاع اللاكتات نازعة في حجرة الخلايا الجذعية مع النشاط فحوصات على خلايا تم فرزها.
وبناء على النتائج التي توصلنا إليها أن الخلايا الجذعية جريب الشعر وقد نازعة لاكتات عالية النشاط، مددنا دراساتنا استزراع الخلايا الجذعية الجنينية. وجرى تحليل الليفية الجنينية الماوس بمثابة تغذية طبقة وحدها أو بوجود الخلايا الجذعية الجنينية. لتحليل الخلايا المستزرعة، كان يستنشق المتوسطة، والخلايا بإيجاز ثابتة والمحتضنة مع نازعة لاكتات تلطيخ الحل كما هو موضح أعلاه. لاحظنا ارتفاع اللاكتات نازعة النشاط في الخلايا الجذعية الجنينية بالمقارنة مع الماوس الليفية الجنينية (الشكل 4).
ونحن أيضا تطبيق البروتوكول المصبوغة للأنسجة المعزولة حديثا. تشريح الفأر أورتاس وشرائح مفتوحة. فتحت السفن ومعطلة حتى الداخل التجويف أورتاس كان موجوداً. كانت المحتضنة عينات مع هانك في "متوازنة الحل الملح" التي تحتوي على 0.5% تريتون-X لمدة 10 دقيقة، ثم مع نازعة لاكتات تلطيخ الحل للحد الأدنى 10 اللاكتات نازعة تلطيخ الحل تم تطبيقها على أنسجة جديدة. بعد الحضانة، جمعت الصور، تظهر بقع في خلايا العضلات الملساء (الشكل 5).
الشكل 1 : النشاط الكيميائي نازعة لاكتات والكشف عنها- تحويل نازعة لاكتات لاكتات + NAD إلى ح++ بيروفات + NADH. بروتون الذي تم إنشاؤه سوف يقلل تيترازوليوم نيتروبلوي إلى فورمازان، التي ستشكل ترسبات زرقاء. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : التخطيطي لتوجيه الجلد الماوس في كريومولدس- ينبغي أن يكون الجلد الماوس داخل كريومولدس حيث يحتوي كل مقطع قطع مقطع عرضي للجلد كله من البشرة، الأدمة، واللحمة، والعضلات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : نازعة لاكتات تلطيخ الجلد الماوس يكشف ارتفاع النشاط في الخلايا الجذعية جريب الشعر. المجمدة في كريومولدس الجلد الماوس والمحتضنة مع نازعة لاكتات تلطيخ الحل تتضمن لاكتات. وكان النشاط نازعة لاكتات بارزة في الخلايا الجذعية جريب الشعر. (أ، ب) صورتين من نازعة لاكتات نشاط الإنزيم من الجلد الماوس. (ج، د) صورتين لمراقبة تلطيخ مع لاكتات الركازة حجب. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : النشاط ارتفاع اللاكتات نازعة في الخلايا الجذعية الجنينية الماوس مثقف. وجرى تحليل الخلايا الجذعية الجنينية الماوس مثقف نمت على طبقة وحدة تغذية تنتجها الخلايا الليفية جنينية ماوس المشع للنشاط نازعة لاكتات. لوحظ عالية النشاط في الخلايا الجذعية مقارنة الخلايا الليفية. الليفية الجنينية الماوس أظهرت مستويات مماثلة من تلطيخ مع أو بدون المعالجة بالإشعاعات. وقد اتخذت الصور مع هدف X 20. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. (أ، ب، د، ه) الماوس الليفية الجنينية والخلايا الجذعية. (ج، و) ماوس الليفية الجنينية وحدها. (أ-ج) صور أخذت بعد 7 دقائق حضانة مع تلطيخ الحل. (د-و) صور أخذت بعد 20 دقيقة حضانة مع تلطيخ الحل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5 : النشاط ارتفاع اللاكتات نازعة في خلايا العضلات الملساء المحيطة بالشريان الاورطي الماوس. أورتاس كانت معزولة من الفئران euthanized. السفن كانت ثابتة لمدة دقيقتين في بارافورمالدهيد 2% وغسلها 3 × 10 دقائق في 1 x الفوسفات مخزنة المالحة. كانت سفن المحتضنة مع الحل هانك الملح متوازنة مع 0.5% X تريتون وغسلها 3 x 5 دقائق في الفوسفات مخزنة المالحة. وأضيفت نازعة لاكتات تلطيخ الحل والعينات كانت المحتضنة لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية وغسلها 3 x 5 دقيقة مع 1 x فوسفات مخزنة المالحة. عينات تم إصلاحها بعد ذلك لمدة ساعة واحدة في بارافورمالدهيد 2% وغسلها دقيقة 3 × 5 مع 1 × مخزنة الفوسفات المالحة وتصويرها. (أ) نازعة لاكتات محلول يحتوي على لاكتات. (ب) نازعة لاكتات الحل دون لاكتات كعنصر سلبي. لكل قسم، هناك صورة تكبير أقل على اليسار ويتم عرض منطقة معينة مع التكبير أعلى على اليمين. (أ، ب) الحل الكامل لاكتات نازعة تتضمن لاكتات استخدمت لتلوين. ب صورة مكبرة للمنطقة المشار إليها في الصورة ألف (ج، د) نازعة لاكتات الحل دون لاكتات كان يستخدم لتلوين كعنصر سلبي. د صورة مكبرة للمنطقة المشار إليها في C. أخذت ألف وجيم مع 20 X أهداف (شريط المقياس = 50 ميكرومتر) وب ود وقد اتخذت مع 40 وهدف العاشر (شريط مقياس = 20 ميكرومتر). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يمكن استخدام الأسلوب الموصوفة هنا لرصد نشاط نازعة لاكتات أو غيرها الإنزيمات الاستقلابية التي تولد NADH أو نادف، في أنواع الخلايا المختلفة داخل أنسجة أو في أجزاء مختلفة من الأنسجة على مر الزمن. لاكتات نازعة إنزيم مهم لفهم بيولوجيا الخلايا الجذعية والأورام، والقدرة على مراقبة نشاط نازعة لاكتات في الخلايا المفردة من المرجح أن توفر معلومات هامة عن وظيفة هذا الإنزيم.
واحد الميزة الهامة لهذا البروتوكول بالمقارنة مع المنهجيات الأخرى هو أن القدرة على رصد النشاط الأنزيمي، بدلاً من مجرد وفرة البروتين، يمكن أن ينتج أكثر حسما من المعلومات حول ليس فقط حيث تكون الإنزيمات نازعة لاكتات هذا، ولكن أين هم فعلا الوظيفية. يمكن الجمع بين النهج الموصوفة هنا مع إيمونوهيستوتشيميستري حيث أن مستوى البروتين المحددة، على سبيل المثال، علامة نسب خلية، يتحدد في عينات الأنسجة نفسها كنشاط نازعة لاكتات. بالمقارنة مع النهج القائم على التصوير بالرنين المغناطيسي لمراقبة نشاط نازعة لاكتات، ينص البروتوكول يتميز بأنه يمكن تقديم القرار المكانية أكبر وتساعد على تحديد خلايا معينة في أنسجة التي لديها عالية النشاط الأنزيمي . بالمقارنة مع النهج الأيض التعيين استناداً إلى ركائز فلوروجينيك، والكشف عن إشارة مع بروتوكول وصف لا يقتصر أوتوفلوريسسينسي1. ميلر ومؤلفين وأجرى تحليلاً مماثلة الاعتماد على الوقت والاعتماد على الركازة خمسة إنزيمات مختلفة بمراقبة التحويل إلى فورمازان7. تم اكتشاف ردود الفعل على اتباع مبادئ حركية إنزيم المقايسة. ميلر ومؤلفين الموقر المتقدرية الإنزيمات من الإنزيمات غير المتقدرية بالتعريب المشارك مع المصبوغة المتقدرية7. أنها تستخدم كلوريد 5-Cyano-2,3-di-(p-tolyl)tetrazolium (لجنة مكافحة الإرهاب) ككاشف كشف تليها مجهرية [كنفوكل] ل تحليل التعريب المشارك سوبسيلولار7.
يحتوي الأسلوب على وصف عيوب كذلك. وفي حين يمكن استخدام النهج القائم على التصوير بالرنين المغناطيسي في الكائنات الحية، يتطلب النهج المذكور الأنسجة المجمدة أو الطازجة. الأنسجة المجمدة مناسبة فقط لبضعة أشهر لأن نشاط الإنزيمات تتحلل بمرور الوقت، حتى عندما جمدت. علاوة على ذلك، لأنه يتم توفير الركيزة في الزائدة، النهج الذي يوفر معلومات حول "إمكانات النشاط" افتراض الركيزة الحالية. إذا كان يتم الحد من مستويات الركازة، ثم توزيع النشاط ولاحظ مع هذا التحليل قد تنحرف عن مقدار النشاط الذي يحدث من الناحية الفسيولوجية. وبالإضافة إلى ذلك، إذا كان هناك isoforms مختلفة لنفس الإنزيم التي تقوم بنفس النشاط الأنزيمي، الطريقة المعروضة هنا ليست قادرة على التمييز بينهما. على سبيل المثال، طريقة عرض لا يمكن التمييز بين نشاط لدها مقابل لدب. نهج واحد لمعالجة هذه المسألة سيكون لاستخدام جينياً هندسيا الفئران التي isoform إنزيم واحد المعطل جينياً.
أننا قد جربت مع الدورة الشهرية، والأصباغ ناقل إلكترون الهيدروكسى مستقر الذي يتوسط نقل الإلكترون بين NADH وتيترازوليوم23. بينما قد أفادت بعض العلماء أن الدورة الشهرية يحول دون الجلوكوز 6-فوسفات نازعة النشاط والاطلاع على الدورة الشهرية غير مفيد5، وجدنا الدورة الشهرية تكون ذات قيمة للتعريب الإنزيم وإدراجه في البروتوكول لدينا. وأفادت بعض الكتاب الآخرين باستخدام البولي فينيل الكحول للحد من نشر الجلوكوز 6-فوسفات نازعة إنزيم1. في تجاربنا، ونحن لم تجد البولي فينيل الكحول مفيدة والقضاء عليه.
خطوات قليلة وحاسمة بالنسبة لنجاح تلطيخ. مسألة هامة، هو ضمان أن عينات الأنسجة يتم وضعها بشكل صحيح في سيرومولدس. ينبغي وضع أقسام الجلد شقة حيث أن قطع شرائح عبر الجلد. وبالإضافة إلى ذلك، إذا كان إعداد مقاطع متعددة، مثالي إذا كانت مدرجة ضمن كريومولد نفسه حيث أنها يمكن أن تكون شرائح معا على الشريحة نفسها. وهذا سيساعد على القضاء على التباين بسبب السمك الشريحة التي يتم قطع مع كريوستات. من المهم أيضا لضمان أن الأنسجة لا يزال يحتفظ بالنشاط الأنزيمي.
ينبغي أن تحدد أفضل وقت لوضع حد لرد فعل تجريبيا. من الضروري رصد الشرائح عن كثب خلال فترة الحضانة وتحديد الوقت المناسب لإضافة كونتيرستاين وجبل الشرائح استناداً إلى كثافة وصمة عار الزرقاء. إذا كانت العينات ملطخة طفيفة جداً، لن يمكن البت فيها النشاط. إذا كان يتم أوفيرستاينيد العينات، يمكن أن تنتشر ترسبات فورمازان، مما يجعل من الصعب التحقق من المجالات المحددة التي كانت أصلاً مرتفعة في النشاط.
ونحن نتوقع أن هذا البروتوكول سوف تكون ذات قيمة للعلماء مع طائفة واسعة من الأسئلة حول الدور التمثيل الغذائي. وتشمل التطبيقات تلطيخ المشترك للنشاط الأيضي وعلامات النسب خلية أو علامات الانتشار، تقييم مساهمات الإنزيمات المختلفة مع النماذج الوراثية، تقييم التعريب سوبسيلولار النشاط الأنزيمي، رصد النشاط الأنزيمي في الأنسجة المريضة أو أثناء التطوير.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب قد لا المصالح المتنافسة الكشف.
Acknowledgments
وكان HAC الباحث ميلتون هاء كاسل مؤسسة ألن ريتا (http://www.ritaallenfoundation.org). تم تمويل هذا العمل بالمنح إلى HAC من معهد المعهد الوطني ل R01 العلوم الطبية العامة GM081686، R01 AR070245، الوطنية العامة (العلوم R01 GM0866465، إيلي & اديثي مركز واسع للطب التجديدي وبحوث الخلايا الجذعية الطبية روز التلال وغابا Hal جوائز)، تأثير مركز الصحة/جامعة كاليفورنيا كتسي المعاهد الوطنية للصحة منحة UL1TR000124، بمجتمع اللوكيميا اللمفاوية، "المرأة كانتور آيريس" جوائز من مركز السرطان الشامل يونسون أهلا وسهلا و HAC. وأيد البحث عنها في هذا المنشور المعهد الوطني للسرطان من "معاهد الصحة الوطنية في" إطار جائزة رقم P50CA092131. وكان الممولين أي دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات والتحليل، وقرار نشر أو إعداد المخطوطة. HAC عضو إيلي & "أديت مركز واسع للطب التجديدي" & "بحوث الخلايا الجذعية" ومعهد البيولوجيا الجزيئية في جامعة كاليفورنيا و "جامعة كاليفورنيا المعلوماتية البرنامج المشترك بين الإدارات".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical instruments | For collecting skin from euthanized mice | ||
| Tissue-tek cryomold 25 mm x 20 mm x 5 mm | Fisher Scientific | NC9511236 | For freezing mouse skin |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Fisher Scientific | NC9638938 | For mounting cryomolds |
| Ice bucket | Fisher Scientific | 07-210-106 | |
| Dry Ice | |||
| Polysine Adhesion Slide | Fisher Scientific | 12-545-78 | |
| 4% formalin | Fisher Scientific | 23-245-684 | Dilluted in water |
| phosphate buffered saline, pH 7.4 | |||
| vortex | |||
| Tris base | Fisher Scientific | 23-245-684 | |
| NAD | Sigma-Aldrich | N7004 | |
| Phenazine methosulfate | Sigma-Aldrich | P9625 | |
| Nitrotetrazolium blue chloride | Sigma-Aldrich | N6876 | |
| Lithium L-lactate | Sigma-Aldrich | L2250 | Substrate |
| 37°C incubator (or tissue culture incubator) | |||
| Braziliant! Counter stain | Anatech | 861 | Counter stain |
| Mounting medium | Vector Laboratories | H-5000 | |
| Cover slips for slides | Fisher Scientific | 12-544D | |
| Light microscope |
References
- Boonacker, E., Van Noorden, C. J. Enzyme cytochemical techniques for metabolic mapping in living cells, with special reference to proteolysis. J Histochem Cytochem. 49, 1473-1486 (2001).
- Seidler, E. The tetrazolium-formazan system: Design and histochemistry. Prog Histochem Cytochem. 24, 1-86 (1991).
- Van Noorden, C. J. F., Frederiks, W. M. Enzyme Histochemistry: A Laboratory Manual of Current Methods. , Bios. (1992).
- Winzer, K., Van Noorden, C. J., Kohler, A. Quantitative cytochemical analysis of glucose-6-phosphate dehydrogenase activity in living isolated hepatocytes of European flounder for rapid analysis of xenobiotic effects. J Histochem Cytochem. 49, 1025-1032 (2001).
- Negi, D. S., Stephens, R. J. An improved method for the histochemical localization of glucose-6-phoshate dehydrogenase in animal and plant tissues. J Histochem Cytochem. 25, 149-154 (1977).
- Boren, J., et al. In situ localization of transketolase activity in epithelial cells of different rat tissues and subcellularly in liver parenchymal cells. J Histochem Cytochem. 54, 191-199 (2006).
- Miller, A., et al. Exploring metabolic configurations of single cells within complex tissue microenvironments. Cell Metab. , (2017).
- Shen, J., et al. Prognostic value of serum lactate dehydrogenase in renal cell carcinoma: a systematic review and meta-analysis. PLoS One. 11, e0166482 (2016).
- Zhang, X., et al. Prognostic significance of serum LDH in small cell lung cancer: A systematic review with meta-analysis. Cancer Biomark. 16, 415-423 (2016).
- Petrelli, F., et al. Prognostic role of lactate dehydrogenase in solid tumors: a systematic review and meta-analysis of 76 studies. Acta Oncol. 54, 961-970 (2015).
- Valvona, C. J., Fillmore, H. L., Nunn, P. B., Pilkington, G. J. The regulation and function of lactate dehydrogenase A: Therapeutic potential in brain tumor. Brain Pathol. 26, 3-17 (2016).
- Markert, C. L., Shaklee, J. B., Whitt, G. S. Evolution of a gene: Multiple genes for LDH isozymes provide a model of the evolution of gene structure, function and regulation. Science. 189, 102-114 (1975).
- Read, J. A., Winter, V. J., Eszes, C. M., Sessions, R. B., Brady, R. L. Structural basis for altered activity of M- and H-isozyme forms of human lactate dehydrogenase. Proteins. 43, 175-185 (2001).
- Holness, M. J., Sugden, M. C. Regulation of pyruvate dehydrogenase complex activity by reversible phosphorylation. Biochem Soc Trans. 31, 1143-1151 (2003).
- Yi, W., et al. Phosphofructokinase 1 glycosylation regulates cell growth and metabolism. Science. 337, 975-980 (2012).
- Fan, J., et al. Tyrosine phosphorylation of lactate dehydrogenase A is important for NADH/NAD(+) redox homeostasis in cancer cells. Mol Cell Biol. 31, 4938-4950 (2011).
- Zhao, D., et al. Lysine-5 acetylation negatively regulates lactate dehydrogenase A and is decreased in pancreatic cancer. Cancer Cell. 23, 464-476 (2013).
- Vanderlinde, R. E. Measurement of total lactate dehydrogenase activity. Ann Clin Lab Sci. 15, 13-31 (1985).
- Nelson, S. J., et al. Metabolic imaging of patients with prostate cancer using hyperpolarized [1-(1)(3)C]pyruvate. Sci Transl Med. 5, 198ra108 (2013).
- Flores, A., et al. Lactate dehydrogenase activity drives hair follicle stem cell activation. Nat Cell Biol. , (2017).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Cryosectioning tissues. CSH Protoc. 2008, pdb prot4991 (2008).
- Espada, J., et al. Non-aqueous permanent mounting for immunofluorescence microscopy. Histochem Cell Biol. 123, 329-334 (2005).
- Hisada, R., Yagi, T. 1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate. A photochemically stable electron mediator between NADH and various electron acceptors. J Biochem. 82, 1469-1473 (1977).
