Summary
אנו מתארים פרוטוקול זמן התגובה. ממפה את התפוצה המרחבית של אנזימטי לפעילות אנזימים המייצרים nicotinatmide אדנין dinucleotide פוספט (NAD(P)H) + H + ישירות בדגימות רקמה.
Abstract
מיפוי פעילות אנזימטי במרחב ובזמן חיוני להבנת הבסיס המולקולרי של התנהגות התא בתוך הרקמות ומחלות. בחיי עיר פעילות חילוף החומרים מבחני יכול לספק מידע על חלוקת מרחבי פעילות חילוף החומרים בתוך רקמה. אנו מספקים כאן פרוטוקול מפורט עבור ניטור פעילות האנזים לקטט דהידרוגנאז ישירות בדגימות רקמה. לקטט דהידרוגנאז הוא דטרמיננטה חשוב של אם נצרך גלוקוז יומרו האנרגיה דרך גליקוליזה אירובי או אנאירובי. פתרון המכיל NAD ו לקטט מסופק על קטע רקמה קפוא. תאים עם פעילות גבוהה לקטט דהידרוגנאז יהיה להמיר את לקטט שסופקו פירובט, בעוד בו-זמנית המרת nicotinamide אדנין dinucleotide (NAD) NADH ו פרוטון, אשר ניתן לאתרם מבוסס על הפחתת nitrotetrazolium כחול formazan, אשר הוא מדמיין כמו התמיסה כחול. אנו מתארים פרוטוקול מפורט עבור ניטור פעילות לקטט דהידרוגנאז בעור העכבר. יישום פרוטוקול זה, מצאנו כי פעילות לקטט דהידרוגנאז גבוה בתאי גזע השבתה הדרגתית זקיק השיער בתוך העור. החלת הפרוטוקול בתאי גזע עובריים בעכבר בתרבית חשף מכתים גבוה יותר ב בתרבית תאי גזע עובריים מאשר fibroblasts עובריים בעכבר. ניתוח של אבי העורקים העכבר טרי מבודד גילה מכתים בתאי השריר החלק בניצב אבי העורקים. המתודולוגיה המסופקים ניתן למפות במרחב הפעילות של אנזימים המייצרים פרוטון ברקמת קפואים או טריים.
Introduction
הבנה של המיקומים בתוך הרקמות שבו אנזימים יש פעילות גבוהה או נמוכה חיוני עבור פיתוח הבנה ופיזיולוגיה. רמות חלבון או תעתיק משמשים כתחליף לפעילות אנזימטיות. בעוד מחקרים כאלה יכולים להיות אינפורמטיבי, הם אינם מספקים מידע יכול להיות קריטי לקביעת הפעילות של אנזים, כגון שינויים post-translational, הנוכחות של חלבון מתחמי או הלוקליזציה של האנזים subcellular. כאשר פעילות אנזימטי נמדד באופן ישיר, הוא לעתים קרובות מנוטר ב lysates חלבון הומוגני יותר המכילים מידע אודות תאים בודדים בתוך התערובת או את התפוצה המרחבית של התאים עם פעילות גבוה או נמוך בתוך רקמה.
אנו מספקים כאן פרוטוקול מפורט עבור מיפוי את התפוצה המרחבית של פעילות אנזימטי בתוך דגימת רקמה. המתודולוגיה מבוססת על מחקרים מוקדמים יותר הוכחת כי מלחי tetrazolium ניתן למקם את הפעילות של dehydrogenases, reductases ו oxidases רקמות קפוא1. באמצעות שיטות אלה, formazan לא מסיס-מים נוצר כאשר פרוטונים מועברים מלח2,tetrazolium3. גלוקוז-6-פוספט דהידרוגנאז מחוללת nadph של פרוטון, זוהתה עם פעילות tetrazolium. גלוקוז-6-פוספט דהידרוגנאז נמצא במעקב ב התלבט האירופית hepatocytes4, מכתשי מסוג 2 תאים של הריאות5 ו nephrons של כליות5. מלחי Tetrazolium שימשו גם לעקוב אחר פעילות transketolase רקמות קפואים6. בגישה דומה שימש לאחרונה כדי לפקח על הפעילות של dehydrogenases מרובות בתוך הרקמה זהה על שקופיות סמוכים7.
נתאר כאן שיטה לשימוש tetrazolium מלחי כדי לנטר את התפוצה המרחבית של פעילות לקטט דהידרוגנאז (איור 1). לקטט דהידרוגנאז ניתן להמיר פירובט שנוצרו על-ידי גליקוליזה בלי חולצה, ואת התגובה הפוכה. לקטט דהידרוגנאז פעילות היא אפוא דטרמיננטה חשוב של פירובט הכניסה לתוך מחזור חומצה tricarboxylic לעומת שלה הפרשת כפי לקטט. רמת חומצת החלב בדם משמשים לעתים קרובות כדי לאבחן מגוון של מחלות, כולל סרטן8,9,10, כי זה יכול לאותת כי מחלה או פציעה יש התאים הפגועים, האנזים שוחררה.
ישנם ארבעה גנים לקטט דהידרוגנאז: LDHA, LDHB, LDHC ו- LDHD11. LDHA ו- LDHB הם חשבו שהתעוררו כתוצאה לכפל ג'ין מוקדם LDHA12. LDH פעיל כמו tetramer, LDHA, LDHB יכול ליצור homotetramers ו- heterotetramers אחד עם השני. LDHA הוא דיווח יש זיקה גבוהה יותר עבור פירובט, בעוד LDHB הוא דיווח יש זיקה גבוהה יותר עבור לקטט, מעדיפים להמיר לקטט פירובט13. האמרגן LDHA מכיל אתרי קישור HIF1α, cMYC ו FOXM1 שעתוק גורמים11. בנוסף, כמו רבים אחרים אנזימים glycolytic14,15, LDH יכול להיות שונה על-ידי שינויים post-translational. קולטן גורם הצמיחה פיברובלסט 1 יכול phosphorylate LDHA Y10, המקדם גיבוש tetramer, או Y83, אשר מקדם NADH המצע איגוד16. LDHA יכול להיות גם acetylated17. מסיבות אלו, הבנה מלאה של פעילות LDH דורש ניטור רמות החלבון LDH אלא גם הפעילות של האנזים.
בנוסף השיטה שאנו מציגים כאן, גישות אחרות שימשו כדי לעקוב אחר פעילות לקטט דהידרוגנאז. ניתן לנטר פעילות לקטט דהידרוגנאז spectrophotometrically הומוגני חלבון lysate. הדור של NADH כפי מומר לקטט פירובט ניתן למדוד בהתבסס על ספיגת-340 nm, בעוד ניתן לנטר את היעלמותו של NADH כפי פירובט מומר לקטט18. לקטט דהידרוגנאז פעילות גם נמצא במעקב עם תהודה מגנטית (MRI). 13 C-פירובט יכול להינתן ו ניתן לנטר את ההמרה של פירובט תניקי כיחס בין [1 -13C] לקטט / [1 -13C] פירובט. גבוה יחסי של [1 -13C] לקטט / [1 -13C] פירובט נצפו סרטן רקמות19. בעוד גישות MRI יכול לספק מידע על פעילות לקטט דהידרוגנאז רגילה ורקמות המחלה, למתודולוגיות אין רזולוציה צריך לקבוע את רמת פעילות תאים מסוימים. המתודולוגיה שסופק כאן יכול לספק מידע על פעילות לקטט דהידרוגנאז באזורים רקמות, אפילו בתאים בודדים.
שימוש בבאתרו פעילות מבחני, מצאנו כי הפעילות של לקטט דהידרוגנאז גבוה בתאי גזע זקיק השיער העכבר העור20. השתמשנו גם השיטה כדי לפקח על הפעילות של לקטט דהידרוגנאז ב בתרבית תאי גזע עובריים ומצא שהפעילות הוא גבוה בתאי גזע יותר בשכבה מזין. לבסוף אנחנו במעקב את הפעילות של לקטט דהידרוגנאז העכבר טרי לאבי העורקים, נצפתה צביעת תאי שריר חלק. נתאר כאן פרוטוקול מפורט עבור ניטור פעילות לקטט דהידרוגנאז בעור העכבר קפוא.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים המתוארים אושרו על ידי ועדת אכפת לי חיה ב אוניברסיטת קליפורניה, לוס אנג'לס.
1. ליצור שקופיות של העור העכבר קפוא
- המתת חסד עכברים בהתאם למדיניות המוסד.
הערה: בצע את מדיניות מוסדית עבור ביגוד מגן. כל הפרוטוקולים המערבות בעלי חיים תאושר ע י הוועדה המוסדית אכפת לי בעל חיים. - להסיר השיער של העכבר עם טרימר שיער בעלי חיים.
- לעשות חתכים בעור באמצעות מספריים. באמצעות מלקחיים, הרם את העור מן העכבר. בעזרת מספריים, לחתוך את המקטע העור.
- למלא את cryomold עם מקפיא ריאגנט מורכבים (ראה טבלה של חומרים).
- במקום סעיפים העור לתוך cryomolds מלא באמצעות מלקחיים שפיץ. אוריינט העור כך רקמות פרוסות יפיק חתך רוחב של העור מכל האפידרמיס הדרמיס, ובהיפודרמיס, שרירים (איור 2).
הערה: אם הדבר אפשרי, הר ניסיוני ושליטה עכברים יחד ב cryomold אותו אז הם ניתן למחלקה אותן לשקופית באותה ולעבד יחד. לטפל לא כדי ליצור בועות. - במקום cryomold על משטח שטוח של גוש קרח יבש ב דלי קרח ואפשר להקפיא. ממשיכים לבחון את הכיוון של העור. התאם במידת הצורך.
הערה: ללבוש כפפות קריוגני בעת טיפול בקרח יבש. - העברת cryomolds בפריזר-80 ° C עבור אחסון. דוגמאות יכול להישמר במקרר כ 3 חודשים ללא אובדן משמעותי של פעילות אנזימטיות. אל תתנו מקטעים קפוא להתייבש.
- שימוש cryostat ב-20 ° C, פרוסה רקמות כדי ליצור מקטעים 7-10 מיקרומטר עבה מורפולוגיה העור הטוב ביותר21.
2. הכנת את שקופיות עבור צביעת
- להקים את קבוצת שקופיות להיבדק. לכלול שקופית הפקד שעליו יתעכב NAD והחלק פקד אחר שבו המצע, לקטט, תמנע. לכלול שקופית בקרה חיובית של בלוק קפוא רקמות בעבר חקרו.
- בקצרה לתקן שקופיות המכילה סעיפים העור עם 4% פורמלין במשך 5 דקות או על ידי pipetting 1 מ"ל של 4% פורמלין אותן לשקופית, או בעת עיבוד שקופיות מרובות, בטבילת מגלשות לתוך מיכל המכיל 4% פורמלין.
הערה: הקיבעון יבטיח שהעור ואינה מתקלפת מהשקופיות במהלך ההליכים הבאים לשמר המורפולוגיה העור.
זהירות: פורמלין היא גורם מסרטן ו מסוכנים; יש ללבוש כפפות, לא לתת לזה לגעת בעור שלך ולבצע שלב זה בשכונה fume כימי. - שקופיות תשטוף לפחות 1 mL פוספט buffered תמיסת מלח, pH 7.4, לכל שקופית על-ידי pipetting או טבילה.
3. הכנת מכתים פתרון
- מערבולת יחד ריאגנטים עבור צביעת פעילות לקטט דהידרוגנאז (50 מ מ טריס pH 7.4, 750 NADP מיקרומטר, 80 methosulfate phenazine מיקרומטר (PMS), 600 כלוריד nitrotetrazolium כחול מיקרומטר ו לקטט 30 מ מ) בצינור בגודל מתאים בהתאם לכמות מכתים הפתרון הנדרש.
הערה: 1 מ"ל מספיקה לכסות לגמרי את שקופית אחת. - להכין פתרון השני שבו כל ריאגנטים קיימים מלבד NAD. להכין פתרון השלישי שבו כל ריאגנטים קיימים מלבד לקטט.
4. דגירה את השקופיות ב מכתים פתרון
- בעדינות pipet הפתרון מכתימים או פתרונות בקרה על גבי שקופיות שהוכנו מראש המכסה הסעיף בשלמותו (1 מ"ל הוא מספיק עבור שקופית אחת). אם מספר שקופיות המעובדות יחד, טובלים כל השקופיות בתוך תמיסת מכתימים באותו זמן (ודא המכולה יש מספיק הפתרון לכסות לגמרי את סעיף הרקמה).
- דגירה השקופיות בסביבה humidified ב 37 מעלות צלזיוס בחושך. אם צביעת פתרון נמצאת מעל לשקופית, למקם את השקופית בסביבה humidified כדי למנוע אידוי.
5. הצג השקופיות
- לפקח על ההמרה של הפתרון מכתימים שקוף כחול על ידי בדיקה חזותית. כאשר הדגימות הגיעו את הרמה הרצויה של מתפרצים, להפסיק את התגובה על ידי הסרת הפתרון מוכתמים.
הערה: לעור, 10 דקות היא מספקת. הזמן תלוי האיבר ועל הפעילות האנזימטית מתרחשת. - לשטוף שקופיות עם תמיסת מלח פוספט buffered מאת pipetting (1 מ"ל מספיקה עבור כל שקופית) או טבילה.
הערה: דוגמיות תיערך השוואה בין אחד לשני. זה חייב להישמר בפתרון מכתימים עבור אותה כמות של זמן
6. counterstain והר
- Pipet counterstain על השקופיות כאשר השקופיות הגיעו רמה מתאימה של מתפרצים.
הערה: Counterstains שהופכים את הגרעינים אדום או ירוק יעניק קונטרסט טוב הכחול שנוצר formazan precipitant. - הר עם מימית או הלא-מימית הרכבה בינונית22. שנה עד שלוש טיפות (40-50 µL) של הרכבה בינונית מספיקה בהתאם לגודל של תגית כיסוי.
7. תמונה שקופיות ולכמת
- תמונות שקופיות תחת מיקרוסקופ אור. קח תמונות של הניסוי, ודוגמאות שליטה כל הפקדים שלילי-10 X 20 X, 40 X הגדלה.
- קבע את עוצמת כתם כחול באזורים שונים עם תוכנת ניתוח התמונה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אנחנו דיווחו בעבר כי תוצאות בחיי עיר פעילות מבחני העור העכבר20. כפי שמוצג באיור3, נצפו רמות גבוהות של לקטט דהידרוגנאז פעילות תאי גזע זקיק השיער בבסיס זקיק השיער כאשר ההליכים המתוארים לעיל עקבו. ממצאים אלה אומתו תא פלורסצנטיות מופעל מיון של עור תאי גזע זקיק השיער ולאשר גבוהה לקטט דהידרוגנאז פעילות בתוך התא בתאי גזע עם פעילות מבחני על תאים ממוינים.
בהתבסס על הממצאים שלנו כי תאי גזע זקיק השיער יש פעילות גבוהה לקטט דהידרוגנאז, הרחבנו את המחקרים שלנו של בתרבית תאי גזע עובריים. העכבר מתחלקים fibroblasts הגשה שכבה מזין נותחו לבד או בנוכחות תאי גזע עובריים. כדי לנתח תאים בתרבית, המדיום היה aspirated, ואת התאים היו בקצרה קבוע מודגרות עם לקטט דהידרוגנאז מכתים פתרון כמתואר לעיל. . הבחנו גבוהה לקטט דהידרוגנאז פעילות תאי גזע עובריים לעומת העכבר מתחלקים fibroblasts (איור 4).
לנו יש להחיל גם על פרוטוקול מכתימים לרקמות טרי מבודד. העכבר aortas היו גזור, פעור לרווחה. כלי היו נפתח, מרותק למיטה כך מבפנים לומן של aortas היה נגיש. הדגימות היו מודגרות של האנק מאוזנת תמיסת מלח המכילה 0.5% טריטון-X 10 דקות, ואז עם לקטט דהידרוגנאז מכתים פתרון עבור 10 דקות לקטט דהידרוגנאז מכתים הפתרון היה מוחל על הרקמה טריים. לאחר דגירה, תמונות נאספו, מציג מכתים בתאי השריר החלק (איור 5).
איור 1 : פעילות כימית של לקטט דהידרוגנאז, זיהוי שלו. לקטט דהידרוגנאז ממירה לקטט + NAD פירובט + NADH + H+. הפרוטונים שנוצר תפחית nitroblue tetrazolium כדי formazan, אשר יהוו את התמיסה כחול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : סכימטי של המכוונת העכבר העור ב- cryomolds. העכבר העור צריך להיות מונחה עצמים בתוך cryomolds כך כל מקטע לחתוך יכיל חתך רוחב של העור כולו מן האפידרמיס, הדרמיס, ובהיפודרמיס, השריר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : לקטט דהידרוגנאז צביעת העור העכבר מגלה פעילות גבוה בתאי גזע זקיק השיער. העכבר העור היה קפוא cryomolds, מודגרות עם לקטט דהידרוגנאז מכתים פתרון מכילים חומצת החלב. לקטט דהידרוגנאז פעילות היה בולט בתאי גזע זקיק השיער. (A, B) שתי תמונות של לקטט דהידרוגנאז assay פעילות של העכבר העור. (C, D) שתי תמונות של שליטה מכתים עם חומצת החלב המצע שנוכה במקור. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : פעילות גבוהה לקטט דהידרוגנאז בתאי גזע עובריים בעכבר בתרבית. בתאי גזע עובריים בעכבר בתרבית גדל על שכבת מזין פיברובלסט עובריים בעכבר לקרינה נותחו לפעילות לקטט דהידרוגנאז. פעילות גבוהה נצפתה בתאי גזע לעומת fibroblasts. העכבר מתחלקים fibroblasts הראו רמות דומות של צביעת עם או בלי הקרנה. התמונות צולמו עם יעד X 20. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. (A, B, D, E) העכבר מתחלקים fibroblasts ותאי גזע. (C, F) העכבר מתחלקים fibroblasts לבד. (א-ג) התמונות צולמו לאחר 7 דקות של דגירה עם צביעת פתרון. (D-F) התמונות צולמו לאחר 20 דקות של דגירה עם צביעת פתרון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5 : פעילות גבוהה לקטט דהידרוגנאז בתאי השריר החלק המקיף את העורקים העכבר. Aortas הם בודדו אותנו מהמתרחש עכברים לאללה. כלי היה קבוע למשך 2 דקות ב- 2% paraformaldehyde, שטף 3 x 10 דקות ב- 1 x פוספט buffered מלוחים. כלי היו מודגרות עם תמיסת מלח מאוזנת של האנק עם 0.5% טריטון-X ו שטף 3 x 5 דקות בתוך תמיסת מלח פוספט באגירה מלאה. לקטט דהידרוגנאז מכתים פתרון נוסף, הדגימות היו הדגירה למשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ושטף 3 x 5 דקות עם 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח. דוגמאות מכן תוקנו במשך שעה ב- 2% paraformaldehyde, 3 x 5 דקות עם 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח שטופים עם תמונה. (א) פתרון לקטט דהידרוגנאז המכיל חומצת החלב. (ב) לקטט דהידרוגנאז פתרון ללא לקטאט כפקד שלילי. עבור כל מקטע, יש תמונה ההגדלה התחתונה בצד השמאל, אזור ייעודי מוצג עם הגדלה גבוהה יותר בצד הימין. (A, B) פתרון מלא לקטט דהידרוגנאז המכיל חומצת החלב שימש מכתים. B היא שתמונה מוגדלת של האזור המסומן בפתרון לקטט דהידרוגנאז א (C, D) תמונה בלי חומצת החלב שימשו מכתים כפקד שלילי. D היא תמונה מוגדלת של האזור המסומן ב- C. A ו- C צולמו עם מטרות X 20 (סולם בר = 50 מיקרומטר) B ו- D נלקחו עם יעד X 40 (סולם בר = 20 מיקרומטר). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השיטה המתוארת כאן יכול לשמש כדי לפקח על הפעילות של לקטט דהידרוגנאז או אחרים אנזימים מטבוליים הפקת NADH או nadph ל, סוגי תאים שונים בתוך רקמה או חלקים שונים של רקמה לאורך זמן. לקטט דהידרוגנאז הוא אנזים חשוב להבנת הביולוגיה של תאי גזע, גידולים, היכולת לעקוב אחר פעילות לקטט דהידרוגנאז בתאים בודדים סביר לספק תובנות חשובות הפונקציה של אנזים זה.
אחד יתרון חשוב של פרוטוקול זה לעומת שיטות אחרות זה היכולת צג פעילות אנזימטיות, ולא רק חלבון שפע, יכול לגרום יותר חד משמעיות מידע אודות לא רק איפה אנזימים לקטט דהידרוגנאז נוכח, אבל איפה הם למעשה תפקודית. ניתן לשלב את הגישה המתוארת כאן אימונוהיסטוכימיה כך רמת חלבון שנבחר, למשל, תא שושלת היוחסין סמן, נקבע בדגימות רקמה אותה כפעילות לקטט דהידרוגנאז. לעומת גישות מבוססות-MRI לניטור פעילות לקטט דהידרוגנאז, פרוטוקול מסופקים יש יתרון כי זה יכול לספק רזולוציה מרחבית יותר ולעזור כדי לקבוע את התאים ספציפיים בתוך רקמה יש פעילות גבוהה אנזימטי . לעומת גישות מיפוי החומרים בהתבסס על fluorogenic סובסטרטים, גילוי אותות עם פרוטוקול המתואר אינו מוגבל על-ידי autofluorescence1. מילר, המחברים לבצע ניתוח דומה של זמן התמכרות ותלות המצע של חמישה אנזימים שונים על-ידי ניטור המרה ל- formazan7. התגובות התגלו לעקוב stoichiometric עקרונות קינטיקה אנזימטית. מילר, המחברים מכובד מיטוכונדריאלי אנזימים של אנזימים שאינם מיטוכונדריאלי על ידי לוקליזציה שיתוף עם צביעת מיטוכונדריאלי7. הם משמשים 5-Cyano-2,3-di-(p-tolyl)tetrazolium כלוריד (CTC) ריאגנט לזיהוי ואחריו מיקרוסקופיה קונפוקלית עבור ניתוח לוקליזציה שיתוף subcellular7.
השיטה המתוארת יש גם חסרונות. בעוד גישות MRI יכול לשמש היצורים החיים, הגישה המתוארת דורש רקמות קפואים או טריים. רקמות קפוא מתאימים רק במשך כמה חודשים כי הפעילות של האנזימים להיפגם עם הזמן, אפילו כשהם קפואים. עוד, כי המצע מסופק עודף, הגישה מספק מידע על "פעילות פוטנציאליות" בהנחה המצע קיים. אם הרמות של המצע המגבילים, ההתפלגות הפעילות נצפתה עם assay הזה עשוי לחרוג ממנה כמות הפעילות המתרחשת פיזיולוגית. בנוסף, אם איזופורמים שונים של האנזים לביצוע הפעילות האנזימטית מתרחשת באותו, השיטה המובאת כאן אינו מסוגל להבחין בין אותם. למשל, השיטה המובאת מסוגל להבחין בין הפעילות של LDHA נגד LDHB. גישה אחת לכתובת שבעיה זו יהיה להשתמש גנטית מתוכנן עכברים בו isoform אנזים יחיד היא גנטית מוחלש.
אנחנו ניסויים עם PMS, נשא אלקטרונים photochemically יציב המעביר העברת-אלקטרונים בין NADH tetrazolium צבענים23. בעוד כמה מדענים דיווחו תסמונת קדם וסתית PMS בדפוסי5מעכב גלוקוז 6-פוספט דהידרוגנאז הפעילות ומצא, מצאנו את PMS כדי להיות יקר עבור אנזים לוקליזציה ולכלול אותה פרוטוקול שלנו. יש מחברים אחרים דיווחו באמצעות אלכוהול כדי להגביל דיפוזיה של גלוקוז 6-פוספט דהידרוגנאז אנזים1. בניסויים שלנו, אנו לא מצא את האלכוהול פוליוויניל להיות מועיל, לסלק אותו.
צעדים ספורים הם קריטיים להצלחת ההכתמה. נושא חשוב אחד הוא להבטיח כי דגימות רקמה מוצבים כראוי cyromolds. צריך להיות מונח העור מקטעים במול כך לחתוך פרוסות על פני העור. בנוסף, אם מספר מקטעים להיות מוכנים, זה אידיאלי אם הן מוטבעות בתוך cryomold אותו אז הם יכולים נפרס ביחד על השקופית אותו. זה יעזור לסלק וריאציה בגלל העובי של השקופית בה נחתך עם cryostat. חשוב גם לוודא כי הרקמה עדיין שומרת על פעילות אנזימטיות.
הזמן הטוב ביותר כדי לסיים את התגובה צריך להיקבע מדעית. יש צורך לפקח על השקופיות מקרוב במהלך תקופת הדגירה, לקבוע את הזמן המתאים כדי להוסיף counterstain והר שקופיות בהתבסס על האינטנסיביות של הכתם הכחול. אם הדגימות מוכתמים בקלות רבה מדי, זה לא יהיה אפשר לקבוע איפה הפעילות. אם הדגימות הן overstained, התמיסה formazan יכול להתפשט, ולכן קשה לוודא אזורים מסוימים שהיו במקור גבוהה בפעילות.
אנו צופים שפרוטוקול זה יהיה יקר עבור מדענים עם מגוון רחב של שאלות לגבי תפקידם של חילוף החומרים. היישומים כוללים שיתוף מכתים פעילות חילוף החומרים, סמני שושלת היוחסין התא או סמנים התפשטות, הערכת התרומות של אנזימים שונים עם דגמים גנטיים, הערכת subcellular לוקליזציה של פעילות אנזימטיות, ניטור פעילות אנזימטי רקמה חולה או במהלך הפיתוח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים יש אינטרסים מתחרים לא לחשוף.
Acknowledgments
HAC היה המלומד במילטון אי קסל של קרן אלן ריטה (http://www.ritaallenfoundation.org). עבודה זו מומן על ידי מענקים כדי HAC מן הלאומית המכון של R01 מדעי רפואי כללי GM081686, R01 AR070245, המכון הלאומי של כללי רפואי (מדעי R01 GM0866465, אלי & אידית במרכז רחבה של רפואה רגנרטיבית & מחקר בתאי גזע רוז והרי האל גאבא פרסים), הבריאות מרכז/UCLA CTSI NIH גרנט UL1TR000124, לוקמיה לימפומה החברה, השפעת איריס חזן הנשים פרסים של Jonsson מקיף במרכז לחקר הסרטן אל טוב ואל -חאק. מחקר דיווח בפרסום זה נתמך על ידי המכון הלאומי לסרטן של מכוני הבריאות הלאומיים תחת פרס מספר P50CA092131. התורמים שחיים היה אין תפקיד תכנון המחקר, איסוף נתונים, ניתוח, ההחלטה לפרסם או אופן ההכנה של כתב היד. HAC הוא חבר של אלי את & אידית במרכז רחבה של רפואה רגנרטיבית & מחקר תאי גזע, המכון לביולוגיה מולקולרית באוניברסיטת UCLA, התוכנית באצירת לביואינפורמטיקה באוניברסיטת UCLA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical instruments | For collecting skin from euthanized mice | ||
| Tissue-tek cryomold 25 mm x 20 mm x 5 mm | Fisher Scientific | NC9511236 | For freezing mouse skin |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Fisher Scientific | NC9638938 | For mounting cryomolds |
| Ice bucket | Fisher Scientific | 07-210-106 | |
| Dry Ice | |||
| Polysine Adhesion Slide | Fisher Scientific | 12-545-78 | |
| 4% formalin | Fisher Scientific | 23-245-684 | Dilluted in water |
| phosphate buffered saline, pH 7.4 | |||
| vortex | |||
| Tris base | Fisher Scientific | 23-245-684 | |
| NAD | Sigma-Aldrich | N7004 | |
| Phenazine methosulfate | Sigma-Aldrich | P9625 | |
| Nitrotetrazolium blue chloride | Sigma-Aldrich | N6876 | |
| Lithium L-lactate | Sigma-Aldrich | L2250 | Substrate |
| 37°C incubator (or tissue culture incubator) | |||
| Braziliant! Counter stain | Anatech | 861 | Counter stain |
| Mounting medium | Vector Laboratories | H-5000 | |
| Cover slips for slides | Fisher Scientific | 12-544D | |
| Light microscope |
References
- Boonacker, E., Van Noorden, C. J. Enzyme cytochemical techniques for metabolic mapping in living cells, with special reference to proteolysis. J Histochem Cytochem. 49, 1473-1486 (2001).
- Seidler, E. The tetrazolium-formazan system: Design and histochemistry. Prog Histochem Cytochem. 24, 1-86 (1991).
- Van Noorden, C. J. F., Frederiks, W. M. Enzyme Histochemistry: A Laboratory Manual of Current Methods. , Bios. (1992).
- Winzer, K., Van Noorden, C. J., Kohler, A. Quantitative cytochemical analysis of glucose-6-phosphate dehydrogenase activity in living isolated hepatocytes of European flounder for rapid analysis of xenobiotic effects. J Histochem Cytochem. 49, 1025-1032 (2001).
- Negi, D. S., Stephens, R. J. An improved method for the histochemical localization of glucose-6-phoshate dehydrogenase in animal and plant tissues. J Histochem Cytochem. 25, 149-154 (1977).
- Boren, J., et al. In situ localization of transketolase activity in epithelial cells of different rat tissues and subcellularly in liver parenchymal cells. J Histochem Cytochem. 54, 191-199 (2006).
- Miller, A., et al. Exploring metabolic configurations of single cells within complex tissue microenvironments. Cell Metab. , (2017).
- Shen, J., et al. Prognostic value of serum lactate dehydrogenase in renal cell carcinoma: a systematic review and meta-analysis. PLoS One. 11, e0166482 (2016).
- Zhang, X., et al. Prognostic significance of serum LDH in small cell lung cancer: A systematic review with meta-analysis. Cancer Biomark. 16, 415-423 (2016).
- Petrelli, F., et al. Prognostic role of lactate dehydrogenase in solid tumors: a systematic review and meta-analysis of 76 studies. Acta Oncol. 54, 961-970 (2015).
- Valvona, C. J., Fillmore, H. L., Nunn, P. B., Pilkington, G. J. The regulation and function of lactate dehydrogenase A: Therapeutic potential in brain tumor. Brain Pathol. 26, 3-17 (2016).
- Markert, C. L., Shaklee, J. B., Whitt, G. S. Evolution of a gene: Multiple genes for LDH isozymes provide a model of the evolution of gene structure, function and regulation. Science. 189, 102-114 (1975).
- Read, J. A., Winter, V. J., Eszes, C. M., Sessions, R. B., Brady, R. L. Structural basis for altered activity of M- and H-isozyme forms of human lactate dehydrogenase. Proteins. 43, 175-185 (2001).
- Holness, M. J., Sugden, M. C. Regulation of pyruvate dehydrogenase complex activity by reversible phosphorylation. Biochem Soc Trans. 31, 1143-1151 (2003).
- Yi, W., et al. Phosphofructokinase 1 glycosylation regulates cell growth and metabolism. Science. 337, 975-980 (2012).
- Fan, J., et al. Tyrosine phosphorylation of lactate dehydrogenase A is important for NADH/NAD(+) redox homeostasis in cancer cells. Mol Cell Biol. 31, 4938-4950 (2011).
- Zhao, D., et al. Lysine-5 acetylation negatively regulates lactate dehydrogenase A and is decreased in pancreatic cancer. Cancer Cell. 23, 464-476 (2013).
- Vanderlinde, R. E. Measurement of total lactate dehydrogenase activity. Ann Clin Lab Sci. 15, 13-31 (1985).
- Nelson, S. J., et al. Metabolic imaging of patients with prostate cancer using hyperpolarized [1-(1)(3)C]pyruvate. Sci Transl Med. 5, 198ra108 (2013).
- Flores, A., et al. Lactate dehydrogenase activity drives hair follicle stem cell activation. Nat Cell Biol. , (2017).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Cryosectioning tissues. CSH Protoc. 2008, pdb prot4991 (2008).
- Espada, J., et al. Non-aqueous permanent mounting for immunofluorescence microscopy. Histochem Cell Biol. 123, 329-334 (2005).
- Hisada, R., Yagi, T. 1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate. A photochemically stable electron mediator between NADH and various electron acceptors. J Biochem. 82, 1469-1473 (1977).
