Summary
हम एंजाइमों कि nicotinatmide adenine dinucleotide फॉस्फेट (णड (पी) एच) उत्पंन एंजाइमी गतिविधि के स्थानिक वितरण मानचित्रण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन + एच + सीधे ऊतक के नमूनों में ।
Abstract
मानचित्रण अंतरिक्ष और समय में एंजाइमी गतिविधि सामांय ऊतक और रोग में कोशिका व्यवहार के आणविक आधार को समझने के लिए महत्वपूर्ण है । सीटू चयापचय गतिविधि परख में एक ऊतक के भीतर चयापचय गतिविधि के स्थानिक वितरण के बारे में जानकारी प्रदान कर सकते हैं । हम यहां एंजाइम स्तनपान डिहाइड्रोजनेज की गतिविधि की निगरानी के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल सीधे ऊतक नमूनों में प्रदान करते हैं । स्तनपान डिहाइड्रोजनेज कि भस्म ग्लूकोज एरोबिक या anaerobic glycolysis के माध्यम से ऊर्जा के लिए परिवर्तित हो जाएगा का एक महत्वपूर्ण निर्धारक है । स्तनपान और णड युक्त एक समाधान एक जमे हुए ऊतक अनुभाग के लिए प्रदान की जाती है । उच्च स्तनपान कराने वाली डिहाइड्रोजनेज गतिविधि के साथ कोशिकाओं को प्रदान की स्तनपान पाइरूवेट में परिवर्तित कर दिया जाएगा, जबकि साथ ही परिवर्तित nicotinamide adenine dinucleotide (णड) नध और एक प्रोटॉन, जो की कमी के आधार पर पता लगाया जा सकता है प्रदान की nitrotetrazolium नीले formazan के लिए, जो एक नीली हाला के रूप में visualized है । हम माउस त्वचा में स्तनपान डिहाइड्रोजनेज गतिविधि की निगरानी के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन । इस प्रोटोकॉल को लागू करने, हमने पाया है कि स्तनपान डिहाइड्रोजनेज गतिविधि त्वचा के भीतर quiescent बाल कूप स्टेम कोशिकाओं में उच्च है । संस्कृतिक माउस को प्रोटोकॉल लागू भ्रूण स्टेम कोशिकाओं से पता चला उच्च संस्कृति वाले भ्रूण स्टेम कोशिकाओं में धुंधला माउस भ्रूण fibroblasts से । ताजा पृथक माउस का विश्लेषण महाधमनी महाधमनी करने के लिए सीधा चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं में दाग का पता चला । प्रदान की पद्धति के लिए स्थानिक एंजाइमों कि जमे हुए या ताजा ऊतक में एक प्रोटॉन उत्पंन की गतिविधि नक्शा इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Introduction
ऊतकों जिसमें एंजाइमों उच्च या कम गतिविधि है के भीतर स्थानों को समझना विकास और फिजियोलॉजी को समझने के लिए आवश्यक है । प्रतिलिपि या प्रोटीन के स्तर अक्सर एंजाइमी गतिविधि के लिए किराए के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं । हालांकि इस तरह के अध्ययन जानकारीपूर्ण जा सकता है, वे जानकारी है कि एक एंजाइम की गतिविधि, जैसे कि पोस्ट-शोधों के संशोधन के रूप में निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है प्रदान नहीं करते हैं, प्रोटीन परिसरों की उपस्थिति, या एंजाइम के उपसेलुलर स्थानीयकरण. जब एंजाइमी गतिविधि सीधे मापा जाता है, यह अक्सर homogenized प्रोटीन lysates में नजर रखी है कि अब मिश्रण या एक ऊतक के भीतर उच्च या कम गतिविधि के साथ कोशिकाओं के स्थानिक वितरण के भीतर व्यक्तिगत कोशिकाओं के बारे में जानकारी शामिल है ।
हम यहां एक ऊतक नमूने के भीतर एंजाइमी गतिविधि के स्थानिक वितरण मानचित्रण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं । इस पद्धति के पहले के अध्ययनों पर आधारित है कि tetrazolium लवण dehydrogenases, reductases, और जमे हुए ऊतक1में oxidases की गतिविधि स्थानीयकरण किया जा सकता है प्रदर्शन । इन तरीकों के साथ, एक पानी अघुलनशील formazan जब प्रोटान एक tetrazolium नमक2,3को हस्तांतरित कर रहे है बनते हैं । ग्लूकोज-6-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज NADPH और एक प्रोटॉन उत्पन्न करता है, और tetrazolium गतिविधि के साथ पाया गया है. ग्लूकोज-6-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज में यूरोपीय अशुद्धि हेपैटोसाइट्स4में निगरानी की गई है, वायुकोशीय टाइप 2 कोशिकाओं में फेफड़ों की5 और बिगडते की किडनी5. Tetrazolium लवण भी जमे हुए ऊतक6में transketolase गतिविधि पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया गया है । इसी तरह के एक दृष्टिकोण हाल ही में आसंन स्लाइड7पर एक ही ऊतक में एकाधिक dehydrogenases की गतिविधि पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया गया था ।
हम यहां एक विधि का वर्णन करने के लिए tetrazolium लवण का उपयोग करने के लिए स्तनपान डिहाइड्रोजनेज गतिविधि के स्थानिक वितरण की निगरानी (चित्रा 1) । स्तनपान डिहाइड्रोजनेज पाइरूवेट परिवर्तित कर सकते है glycolysis द्वारा उत्पंन करने के लिए स्तनपान, और रिवर्स प्रतिक्रिया । स्तनपान डिहाइड्रोजनेज गतिविधि के फलस्वरूप tricarboxylic एसिड चक्र में पाइरूवेट के प्रवेश द्वार के एक महत्वपूर्ण निर्धारक के रूप में अपने स्राव बनाम स्तनपान के रूप में है । रक्त में स्तनपान का स्तर अक्सर कैंसर8,9,10सहित रोगों की एक सीमा का निदान करने के लिए उपयोग किया जाता है, क्योंकि यह संकेत कर सकते हैं कि बीमारी या चोट क्षतिग्रस्त कोशिकाओं है और एंजाइम जारी किया गया है ।
वहां चार स्तनपान डिहाइड्रोजनेज जीन हैं: LDHA, LDHB, LDHC, और LDHD11। LDHA और LDHB के लिए एक प्रारंभिक LDHA जीन12के दोहराव से पैदा हुआ है लगा रहे हैं । LDH एक tetramer और LDHA के रूप में सक्रिय है और LDHB एक दूसरे के साथ homotetramers और heterotetramers फार्म कर सकते हैं । LDHA पाइरूवेट के लिए उच्च संबंध है की सूचना दी है, जबकि LDHB स्तनपान के लिए उच्च समानता है की सूचना दी है, और तरजीही को13पाइरूवेट को स्तनपान में परिवर्तित । LDHA प्रवर्तक HIF1α, cMYC और FOXM1 प्रतिलेखन कारकों11के लिए बाध्यकारी साइटों में शामिल हैं । इसके अलावा, कई अन्य glycolytic एंजाइमों की तरह14,15, LDH पोस्ट-शोधों संशोधनों के द्वारा संशोधित किया जा सकता है. Fibroblast वृद्धि कारक रिसेप्टर 1 Y10 पर LDHA phosphorylate कर सकते हैं, जो tetramer गठन को बढ़ावा देता है, या Y83, जो नध सब्सट्रेट बंधन16को बढ़ावा देता है. LDHA17acetylated भी किया जा सकता है । इन कारणों के लिए, LDH गतिविधि की एक पूरी समझ न केवल LDH प्रोटीन के स्तर की निगरानी की आवश्यकता है, लेकिन है एंजाइम गतिविधि के रूप में अच्छी तरह से ।
विधि हम यहां मौजूद के अलावा, अंय दृष्टिकोण को स्तनपान डिहाइड्रोजनेज गतिविधि पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया गया है । स्तनपान डिहाइड्रोजनेज गतिविधि homogenized प्रोटीन lysate में spectrophotometrically निगरानी की जा सकती है । स्तनपान कराने वाली नध के रूप में पाइरूवेट में परिवर्तित की जाने वाली पीढ़ी को ३४० एनएम पर सोखने के आधार पर मापा जा सकता है, जबकि नध के लापता होने पर नजर रखी जा सकती है पाइरूवेट के रूप में स्तनपान१८में परिवर्तित हो जाता है. स्तनपान कराने की डिहाइड्रोजनेज गतिविधि भी चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) के साथ नजर रखी गई है । 13 सी-पाइरूवेट प्रशासित किया जा सकता है और स्तनपान कराने के लिए पाइरूवेट के रूपांतरण के अनुपात के रूप में निगरानी की जा सकती है [1-13ग] स्तनपान कराने की/[1-13ग] पाइरूवेट । [1-13ग] स्तनपान का ऊंचा अनुपात/[1-13सी] पाइरूवेट कैंसर ऊतक19में मनाया गया है । जबकि एमआरआई-आधारित दृष्टिकोण सामांय और रोग के ऊतकों में स्तनपान डिहाइड्रोजनेज गतिविधि के बारे में जानकारी प्रदान कर सकते हैं, के तरीके में विशिष्ट कोशिकाओं में गतिविधि स्तर निर्धारित करने के लिए संकल्प की जरूरत नहीं है । यहां प्रदान की पद्धति ऊतक क्षेत्रों में और यहां तक कि एकल कोशिकाओं में स्तनपान डिहाइड्रोजनेज गतिविधि के बारे में जानकारी प्रदान कर सकते हैं ।
सीटू गतिविधि की परख में प्रयोग, हमने पाया है कि स्तनपान डिहाइड्रोजनेज की गतिविधि बाल कूप में उच्च है माउस त्वचा20के स्टेम कोशिकाओं । हम यह भी विधि का उपयोग करने के लिए डिहाइड्रोजनेज की गतिविधि पर नजर रखने के लिए प्रसंस्कृत भ्रूण स्टेम कोशिकाओं में और पाया गतिविधि स्टेम सेल में फीडर परत से अधिक है । अंत में, हम ताजा माउस महाधमनी में स्तनपान डिहाइड्रोजनेज की गतिविधि पर नजर रखी और चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं में दाग मनाया । हम यहां जमे हुए माउस त्वचा में स्तनपान डिहाइड्रोजनेज गतिविधि की निगरानी के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन ।
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Protocol
सभी प्रयोगों को कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, लॉस एंजिल्स में पशु देखभाल समिति द्वारा अनुमोदित किया गया ।
1. जमे हुए माउस त्वचा की स्लाइड उत्पंन
- संस्था नीति के अनुसार चूहों को Euthanize ।
नोट: सुरक्षात्मक कपड़ों के लिए संस्थागत नीति का पालन करें । सभी प्रोटोकॉल पशुओं को शामिल संस्थागत पशु देखभाल समिति द्वारा अनुमोदित किया जाना चाहिए । - एक पशु बाल trimmer के साथ माउस के बाल निकालें ।
- कैंची का उपयोग कर त्वचा में चीरा । संदंश का प्रयोग, त्वचा को माउस से दूर उठा । कैंची का प्रयोग, त्वचा अनुभाग दूर काट ।
- cryomold को जमने वाले रिएजेंट यौगिक के साथ भरें ( सामग्री की तालिकादेखें).
- सुई नाक संदंश का उपयोग कर भरे cryomolds में त्वचा वर्गों प्लेस । ओरिएंट त्वचा इतना है कि ऊतक स्लाइस dermis, hypodermis और मांसपेशी (चित्रा 2) को एपिडर्मिस से त्वचा के एक पार अनुभाग उत्पन्न होगा ।
नोट: यदि संभव हो, तो वे एक ही स्लाइड पर खोदी और एक साथ संसाधित किया जा सकता है, तो प्रयोगात्मक और नियंत्रण चूहों एक साथ एक ही cryomold में माउंट । ध्यान रखना नहीं बुलबुले बनाने के लिए । - एक बर्फ की बाल्टी में सूखी बर्फ के एक ब्लॉक के फ्लैट की सतह पर cryomold प्लेस और फ्रीज चलो । त्वचा के उंमुखीकरण का निरीक्षण करने के लिए जारी रखें । यदि आवश्यक हो तो समायोजित करें ।
नोट: जब सूखी बर्फ से निपटने क्रायोजेनिक दस्ताने पहनते हैं । - भंडारण के लिए एक-८० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में cryomolds स्थानांतरण । नमूनों एंजाइमी गतिविधि का महत्वपूर्ण नुकसान के बिना लगभग 3 महीने के लिए फ्रीजर में बनाए रखा जा सकता है । जमे हुए वर्गों को बाहर शुष्क मत करो ।
- -20 डिग्री सेल्सियस पर एक cryostat का प्रयोग, स्लाइस ऊतक वर्गों बनाने के लिए 7-10 µm सबसे अच्छा त्वचा के लिए मोटी आकृति विज्ञान21.
2. धुंधला के लिए स्लाइड तैयार करना
- परीक्षण किया जा करने के लिए स्लाइड का सेट स्थापित करें । एक नियंत्रण स्लाइड है जिस पर णड रोक और एक अंय नियंत्रण स्लाइड पर सब्सट्रेट, स्तनपान कराने वाली, रोक किया जाएगा शामिल हैं । पहले से खोजी गई एक जमे हुए ऊतक ब्लॉक से एक सकारात्मक नियंत्रण स्लाइड शामिल करें ।
- स्लाइड पर 4% formalin की pipetting 1 मिलीलीटर से या तो 4% formalin वाले कंटेनर में स्लाइडिंग करके, या तो 5 मिनट के लिए 4% formalin के साथ त्वचा अनुभागों वाली स्लाइड्स को संक्षेप में ठीक करें ।
नोट: निर्धारण त्वचा निंनलिखित प्रक्रियाओं के दौरान स्लाइड से छील नहीं करता है और त्वचा आकृति विज्ञान की रक्षा सुनिश्चित करेगा ।
सावधानी: Formalin एक यलो और खतरनाक है; दस्ताने पहनें, यह आपकी त्वचा को छूने और एक रासायनिक धुएं हुड में इस कदम प्रदर्शन मत करो । - pipetting या सूई के अनुसार या तो स्लाइड से कम 1 मिलीलीटर फॉस्फेट, खारा बफर, पीएच ७.४, के साथ स्लाइड धो लो ।
3. तैयारी धुंधला समाधान
- भंवर एक साथ स्तनपान डिहाइड्रोजनेज गतिविधि धुंधला (५० mM Tris पीएच ७.४, ७५० µ एम NADP, ८० µ एम phenazine methosulfate (पीएमएस), ६०० µ एम nitrotetrazolium नीले क्लोराइड, और 30 मिमी स्तनपान कराने के लिए एक साथ रिएजेंट) धुंधला की मात्रा के आधार पर एक उचित आकार ट्यूब में समाधान आवश्यक है ।
नोट: 1 मिलीलीटर पूरी तरह से एक स्लाइड को कवर करने के लिए पर्याप्त है । - एक दूसरा समाधान तैयार करें जिसमें णड को छोड़कर सभी रिएजेंट मौजूद हों । एक तीसरा समाधान है जिसमें सभी एजेंट स्तनपान के अलावा मौजूद हैं तैयार करते हैं ।
4. धुंधला समाधान में मशीन स्लाइड
- धीरे से अपनी संपूर्णता में खंड को कवर तैयार स्लाइड पर धुंधला समाधान या नियंत्रण समाधान प्लास्टिक (1 मिलीलीटर एक स्लाइड के लिए पर्याप्त है) । यदि एकाधिक स्लाइड एक साथ संसाधित किया जा रहा है, एक ही समय में धुंधला समाधान में सभी स्लाइड डुबकी (सुनिश्चित करें कि कंटेनर के लिए पर्याप्त समाधान ऊतक अनुभाग को कवर करने के लिए है) ।
- अंधेरे में ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक humidified वातावरण में स्लाइड की मशीन । यदि धुंधला समाधान स्लाइड के शीर्ष पर है, तो वाष्पीकरण को रोकने के लिए स्लाइड को humidified वातावरण में रखें ।
5. स्लाइड मॉनिटर
- दृश्य निरीक्षण द्वारा नीले रंग के लिए स्पष्ट से धुंधला समाधान के रूपांतरण की निगरानी । जब नमूने नीले रंग के वांछित स्तर तक पहुंच गए हैं, तो धुंधला समाधान निकाल कर प्रतिक्रिया रोकें ।
नोट: त्वचा के लिए, 10 मिनट पर्याप्त है । समय अंग और एंजाइमी गतिविधि पर निर्भर करेगा । - pipetting द्वारा फॉस्फेट बफर खारा के साथ कुल्ला स्लाइड (1 मिलीलीटर प्रत्येक स्लाइड के लिए पर्याप्त है) या सूई ।
नोट: किसी भी नमूने है कि एक दूसरे की तुलना में किया जाएगा समय की एक ही राशि के लिए समाधान धुंधला में बनाए रखा जाना चाहिए ।
6. Counterstain और माउंट
- स्लाइड्स पर किसी counterstain को प्लास्टिक जब स्लाइड् स एक उचित स्तर की नीली पहुंच है ।
नोट: Counterstains कि बारी नाभिक लाल या हरी formazan precipitant द्वारा बनाई गई नीले रंग के साथ अच्छा कंट्रास्ट प्रदान करेगा । - जलीय या गैर जलीय मध्यम22बढ़ते के साथ माउंट । एक से तीन बूंदें (४०-५० µ एल) बढ़ते माध्यम के कवर स्लिप के आकार के आधार पर पर्याप्त है ।
7. छवि स्लाइड और यों तो
- एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत छवि स्लाइड । प्रायोगिक और नियंत्रण के नमूनों और 10x, 20X, और 40X आवर्धन पर सभी नकारात्मक नियंत्रण की तस्वीरें ले लो ।
- छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ विभिंन क्षेत्रों में नीले दाग की तीव्रता का निर्धारण ।
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Representative Results
हम पहले माउस त्वचा20में सीटू गतिविधि परख में के लिए परिणाम की सूचना दी है । चित्रा 3में दिखाया गया है, हम बाल कूप के आधार पर बाल कूप स्टेम कोशिकाओं में स्तनपान डिहाइड्रोजनेज गतिविधि के उच्च स्तर पर मनाया जब प्रक्रियाओं के बाद ऊपर वर्णित किया गया । इन निष्कर्षों से पुष्टि थे प्रतिदीप्ति सक्रिय बालों के कूप स्टेम कोशिकाओं के लिए त्वचा की छंटाई सेल और स्टेम सेल डिब्बा में उच्च स्तनपान डिहाइड्रोजनेज गतिविधि की पुष्टि के साथ हल कोशिकाओं पर गतिविधि परख ।
हमारे निष्कर्ष है कि बाल कूप स्टेम कोशिकाओं उच्च स्तनपान कराने की डिहाइड्रोजनेज गतिविधि के आधार पर, हम संस्कृति भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के हमारे अध्ययन बढ़ाया । माउस भ्रूण एक फीडर परत के रूप में सेवारत fibroblasts अकेले या भ्रूण स्टेम कोशिकाओं की उपस्थिति में विश्लेषण किया गया । प्रसंस्कृत कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए, मध्यम aspirated था, और कोशिकाओं को संक्षेप में तय किया गया और ऊपर वर्णित के रूप में स्तनपान डिहाइड्रोजनेज धुंधला समाधान के साथ मशीन । हम भ्रूण स्टेम कोशिकाओं में उच्च स्तनपान डिहाइड्रोजनेज गतिविधि के रूप में मनाया माउस भ्रूण fibroblasts (चित्रा 4) के साथ तुलना में ।
हम भी हौसले से पृथक ऊतक के लिए दाग प्रोटोकॉल लागू किया है । माउस aortas और विच्छेदित खुला कटा हुआ थे । जहाजों को खोला और मैटीरियल इतना है कि aortas के अंदर लुमेन सुलभ था । नमूने है हांक संतुलित नमक 10 मिनट के लिए ०.५% ट्राइटन-एक्स युक्त समाधान के साथ, फिर स्तनपान कराने के लिए 10 मिनट के लिए डिहाइड्रोजनेज धुंधला समाधान के साथ मशीन थे । स्तनपान डिहाइड्रोजनेज धुंधला समाधान ताजा ऊतक के लिए लागू किया गया था । मशीन के बाद, छवियों को चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं (चित्रा 5) में धुंधला दिखा एकत्र किया गया ।
चित्रा 1 : स्तनपान डिहाइड्रोजनेज और इसकी पहचान की रासायनिक गतिविधि । स्तनपान डिहाइड्रोजनेज धर्मांतरित स्तनपान + णड को पाइरूवेट + नध + ज+. जो प्रोटॉन उत्पन्न होता है nitroblue tetrazolium को formazan में कम कर देगा, जिससे नीली हाला बनेगी । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2 : उंमुख cryomolds में माउस त्वचा की योजनाबद्ध । माउस त्वचा cryomolds के भीतर उंमुख होना चाहिए ताकि प्रत्येक कट अनुभाग एपिडर्मिस, dermis, hypodermis, और मांसपेशियों से पूरी त्वचा के एक पार अनुभाग शामिल होंगे । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 3 : स्तनपान डिहाइड्रोजनेज माउस त्वचा के धुंधला बाल कूप स्टेम कोशिकाओं में उच्च गतिविधि का पता चलता है । माउस त्वचा cryomolds में जमे हुए थे और स्तनपान डिहाइड्रोजनेज धुंधला समाधान के साथ गर्मी स्तनपान शामिल हैं । स्तनपान डिहाइड्रोजनेज गतिविधि बाल कूप स्टेम सेल में प्रमुख था । (A, B) दो छवियों के स्तनपान डिहाइड्रोजनेज गतिविधि परख के माउस त्वचा । (सी, डी) सब्सट्रेट स्तनपान रोक के साथ धुंधला नियंत्रण के दो छवियों । स्केल बार = ५० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 4 : उच्च स्तनपान कराने वाली डिहाइड्रोजनेज गतिविधि में कल्चरल माउस भ्रूण स्टेम कोशिकाओं. सुसंस्कृत माउस भ्रूण स्टेम कोशिकाओं एक विकिरणित माउस भ्रूण fibroblast फीडर परत पर उगाया स्तनपान डिहाइड्रोजनेज गतिविधि के लिए विश्लेषण किया गया । उच्च गतिविधि fibroblasts के साथ तुलना में स्टेम सेल में मनाया गया । माउस भ्रूण fibroblasts के साथ और विकिरण के बिना धुंधला के समान स्तर दिखाया । छवियां एक 20X उद्देश्य के साथ लिया गया । स्केल बार = ५० µm. (A, B, D, E) माउस भ्रूण fibroblasts और स्टेम सेल । (सी, एफ) माउस भ्रूण अकेले fibroblasts । (A-C) छवियां धुंधला समाधान के साथ मशीन के 7 मिनट के बाद लिया गया । (डी एफ) छवियां धुंधला समाधान के साथ मशीन के 20 मिनट के बाद लिया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 5 : उच्च स्तनपान डिहाइड्रोजनेज गतिविधि चिकनी मांसपेशी माउस महाधमनी आसपास की कोशिकाओं में । Aortas euthanized चूहों से अलग-थलग थे. जहाजों 2% paraformaldehyde में 2 मिनट के लिए तय किया गया था और 1x फास्फेट में 3 एक्स 10 मिनट धो लिया खारा बफर । जहाजों है हांक संतुलित नमक समाधान के साथ ०.५% ट्राइटन एक्स के साथ मशीन और फास्फेट में 3 x 5 मिनट धोया गया खारा । स्तनपान डिहाइड्रोजनेज धुंधला समाधान जोड़ा गया था और नमूने 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए मशीन थे और 1x फॉस्फेट के साथ 3 x 5 मिनट धोया-बफर खारा । नमूने तो 2% paraformaldehyde में 1 घंटे के लिए तय किए गए, 1x फॉस्फेट के साथ 3 x 5 मिनट धोया-खारा और imaged बफर । (क) स्तनपान युक्त डिहाइड्रोजनेज समाधान । (ख) एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में स्तनपान कराने के बिना स्तनपान डिहाइड्रोजनेज समाधान । प्रत्येक अनुभाग के लिए, वहां बाईं तरफ एक कम इज़ाफ़ा छवि है और एक निर्दिष्ट क्षेत्र सही पर उच्च आवर्धन के साथ दिखाया गया है । (A, B) पूरा स्तनपान डिहाइड्रोजनेज स्तनपान युक्त समाधान धुंधला के लिए इस्तेमाल किया गया था । ख छवि ए में संकेत क्षेत्र के एक बढ़ाया छवि है (सी, घ) स्तनपान कराने के बिना डिहाइड्रोजनेज समाधान एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में धुंधला के लिए इस्तेमाल किया गया था । D सी में संकेत क्षेत्र की छवि बढ़ाया है । a और C 20X उद्देश्यों के साथ लिया गया था (स्केल बार = ५० µm) और B और D एक 40X उद्देश्य (स्केल बार = 20 µm) के साथ लिया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
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Discussion
विधि यहां वर्णित स्तनपान डिहाइड्रोजनेज या अंय चयापचय एंजाइमों की गतिविधि पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि नध या NADPH, एक ऊतक के भीतर विभिंन प्रकार के कक्ष में या समय के साथ एक ऊतक के विभिंन भागों में उत्पंन करते हैं । स्तनपान डिहाइड्रोजनेज स्टेम कोशिकाओं और ट्यूमर के जीवविज्ञान को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण एंजाइम है, और व्यक्तिगत कोशिकाओं में स्तनपान डिहाइड्रोजनेज गतिविधि की निगरानी करने की क्षमता इस एंजाइम के समारोह में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान करने की संभावना है.
इस प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण लाभ अंय तरीकों के साथ तुलना में है कि एंजाइमी गतिविधि पर नजर रखने की क्षमता है, बल्कि सिर्फ प्रोटीन बहुतायत से, के बारे में अधिक निर्णायक जानकारी में परिणाम कर सकते है न सिर्फ जहां स्तनपान डिहाइड्रोजनेज एंजाइमों रहे है वर्तमान है, लेकिन वे वास्तव में जहां कार्यात्मक हैं । दृष्टिकोण यहां वर्णित immunohistochemistry के साथ जोड़ा जा सकता है ताकि एक चयनित प्रोटीन के स्तर, उदाहरण के लिए, एक कोशिका वंश मार्कर, स्तनपान डिहाइड्रोजनेज गतिविधि के रूप में एक ही ऊतक के नमूनों में निर्धारित किया जाता है । एमआरआई-स्तनपान डिहाइड्रोजनेज गतिविधि की निगरानी के लिए आधारित दृष्टिकोण के साथ तुलना के रूप में, प्रदान की प्रोटोकॉल लाभ है कि यह अधिक से अधिक स्थानिक संकल्प प्रदान करते हैं और एक ऊतक है कि उच्च एंजाइमी गतिविधि है के भीतर विशिष्ट कोशिकाओं को निर्धारित करने में मदद कर सकते हैं . fluorogenic सब्सट्रेट पर आधारित मानचित्रण चयापचय के लिए दृष्टिकोण के साथ तुलना में, वर्णित प्रोटोकॉल के साथ संकेत का पता लगाने1autofluorescence द्वारा सीमित नहीं है. मिलर और सह लेखक समय निर्भरता के एक समान विश्लेषण और पांच अलग एंजाइमों की निर्भरता सब्सट्रेट formazan7को रूपांतरण की निगरानी द्वारा प्रदर्शन किया । एंजाइम कैनेटीक्स के stoichiometric सिद्धांतों का पालन करने के लिए प्रतिक्रियाओं की खोज की गई । मिलर और सह लेखक गैर से mitochondrial एंजाइमों विशिष्ट-mitochondrial एंजाइमों सह द्वारा mitochondrial धुंधला7के साथ स्थानीयकरण । वे 5-Cyano-2, 3-di-(पी-tolyl) tetrazolium क्लोराइड (सीटीसी) एक का पता लगाने के लिए उपसेलुलर सह स्थानीयकरण विश्लेषण7के लिए फोकल माइक्रोस्कोपी के बाद एजेंट के रूप में इस्तेमाल किया ।
वर्णित विधि के रूप में अच्छी तरह से नुकसान है । जबकि एमआरआई आधारित दृष्टिकोण रहने वाले जीवों में इस्तेमाल किया जा सकता है, वर्णित दृष्टिकोण जमे हुए या ताजा ऊतक की आवश्यकता है । जमे हुए ऊतकों कुछ महीनों के लिए ही उपयुक्त हैं, क्योंकि एंजाइमों की गतिविधि समय के साथ नीचा, यहां तक कि जब जमे हुए । इसके अलावा, क्योंकि सब्सट्रेट अतिरिक्त में प्रदान की जाती है, दृष्टिकोण "गतिविधि क्षमता" संभालने सब्सट्रेट मौजूद है पर जानकारी प्रदान करता है । यदि सब्सट्रेट के स्तर को सीमित कर रहे हैं, तो गतिविधि वितरण इस परख के साथ मनाया गतिविधि है कि शारीरिक रूप से होता है की राशि से विचलित हो सकता है । इसके अलावा, यदि एक ही एंजाइमी गतिविधि का प्रदर्शन करने वाले एक ही एंजाइम के विभिन्न isoforms हैं, तो यहाँ प्रस्तुत विधि उनके बीच भेद नहीं कर पा रही है. उदाहरण के लिए, प्रस्तुत विधि LDHA बनाम LDHB की गतिविधि के बीच भेद नहीं कर सकता । एक दृष्टिकोण इस मुद्दे को संबोधित करने के लिए आनुवंशिक रूप से इंजीनियर चूहों में एक एकल एंजाइम isoform आनुवंशिक रूप से निष्क्रिय है का उपयोग किया जाएगा ।
हम पीएमएस के साथ प्रयोग किया है, एक photochemically स्थिर इलेक्ट्रॉन वाहक है कि मध्यस्थता नध और tetrazolium के बीच इलेक्ट्रॉन स्थानांतरण23रंजक. जबकि कुछ वैज्ञानिकों ने बताया है कि पीएमएस ग्लूकोज 6-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज गतिविधि को रोकता है और पीएमएस सहायक5पाया, हम पीएमएस पाया एंजाइम स्थानीयकरण के लिए मूल्यवान है और यह हमारे प्रोटोकॉल में शामिल हैं । कुछ अंय लेखकों polyvinyl शराब का उपयोग करने के लिए ग्लूकोज 6-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज एंजाइम1की सीमा प्रसार की सूचना दी है । हमारे प्रयोगों में हमने polyvinyl शराब को मददगार नहीं पाया और उसे खत्म कर दिया.
सना की सफलता के लिए कुछ कदम अहम हैं । एक महत्वपूर्ण मुद्दा यह सुनिश्चित कर रहा है कि ऊतक के नमूनों cyromolds में ठीक से रखा जाता है । त्वचा वर्गों फ्लैट रखा जाना चाहिए ताकि त्वचा के पार स्लाइसें काट । इसके अलावा, यदि एकाधिक अनुभागों के लिए तैयार हो रहे हैं, यह आदर्श है अगर वे एक ही cryomold के भीतर एंबेडेड है ताकि वे एक ही स्लाइड पर एक साथ कटा हुआ जा सकता है । यह cryostat के साथ काट दिया है कि स्लाइड की मोटाई के कारण भिन्नता को खत्म करने में मदद मिलेगी. यह भी सुनिश्चित करें कि ऊतक अभी भी एंजाइमी गतिविधि बरकरार रखने के लिए महत्वपूर्ण है ।
प्रतिक्रिया को समाप्त करने के लिए सबसे अच्छा समय empirically निर्धारित किया जाना चाहिए । यह गर्मी की अवधि के दौरान बारीकी से नजर रखने के लिए और counterstain जोड़ने और नीले दाग की तीव्रता के आधार पर स्लाइड माउंट करने के लिए उपयुक्त समय निर्धारित करने के लिए आवश्यक है । यदि नमूनों पर भी हल्के दाग लगे हैं तो यह तय करना संभव नहीं होगा कि गतिविधि कहां है । यदि नमूने अधिक दाग हैं, तो formazan हाला फैल सकता है, जिससे विशिष्ट क्षेत्रों का पता लगाना कठिन हो जाता है जो मूल रूप से गतिविधि में उच्च थे ।
हम इस प्रोटोकॉल पूर्वानुमान चयापचय की भूमिका के बारे में सवालों की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ वैज्ञानिकों के लिए मूल्यवान होगा । आवेदन सह चयापचय गतिविधि और कोशिका वंश मार्करों या प्रसार मार्करों के लिए दाग शामिल, आनुवंशिक मॉडल के साथ अलग एंजाइमों के योगदान का आकलन, एंजाइमी गतिविधि के उपसेलुलर स्थानीयकरण का आकलन, निगरानी रोगग्रस्त ऊतक में या विकास के दौरान एंजाइमी गतिविधि ।
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Disclosures
लेखकों के पास कोई प्रतिस्पर्धी हितों का खुलासा नहीं है.
Acknowledgments
HAC रीता एलेन फाउंडेशन (http://www.ritaallenfoundation.org) के मिल्टन ई. Cassel विद्वान थे । यह काम जनरल मेडिकल साइंसेज R01 GM081686, R01 AR070245, राष्ट्रीय जनरल मेडिकल साइंसेज R01 GM0866465, एली और Edythe व्यापक अपक्षयी चिकित्सा और स्टेम सेल रिसर्च के केंद्र के राष्ट्रीय संस्थान से HAC को अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया ( गुलाब हिल्स और एचएएल गाबा पुरस्कार), आईरिस खिचड़ी भाषा महिला स्वास्थ्य केंद्र/UCLA CTSI NIH अनुदान UL1TR000124, ल्यूकेमिया लिंफोमा सोसायटी, प्रभाव पुरस्कार Jonsson व्यापक कैंसर केंद्र से WEL और HAC के लिए । इस प्रकाशन में दी गई अनुसंधान सूचना राष्ट्रीय कैंसर संस्थान द्वारा राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों के पुरस्कार संख्या P50CA092131 के अंतर्गत समर्थित किया गया. funders अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने का निर्णय, या पांडुलिपि की तैयारी में कोई भूमिका नहीं थी । HAC एली और Edythe व्यापक अपक्षयी चिकित्सा और स्टेम सेल अनुसंधान के केंद्र के एक सदस्य है, ucla आणविक जीवविज्ञान संस्थान, और ucla Bioinformatics विभागीय कार्यक्रम ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical instruments | For collecting skin from euthanized mice | ||
| Tissue-tek cryomold 25 mm x 20 mm x 5 mm | Fisher Scientific | NC9511236 | For freezing mouse skin |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Fisher Scientific | NC9638938 | For mounting cryomolds |
| Ice bucket | Fisher Scientific | 07-210-106 | |
| Dry Ice | |||
| Polysine Adhesion Slide | Fisher Scientific | 12-545-78 | |
| 4% formalin | Fisher Scientific | 23-245-684 | Dilluted in water |
| phosphate buffered saline, pH 7.4 | |||
| vortex | |||
| Tris base | Fisher Scientific | 23-245-684 | |
| NAD | Sigma-Aldrich | N7004 | |
| Phenazine methosulfate | Sigma-Aldrich | P9625 | |
| Nitrotetrazolium blue chloride | Sigma-Aldrich | N6876 | |
| Lithium L-lactate | Sigma-Aldrich | L2250 | Substrate |
| 37°C incubator (or tissue culture incubator) | |||
| Braziliant! Counter stain | Anatech | 861 | Counter stain |
| Mounting medium | Vector Laboratories | H-5000 | |
| Cover slips for slides | Fisher Scientific | 12-544D | |
| Light microscope |
References
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