Summary
Descreveremos um protocolo para mapear a distribuição espacial da atividade enzimática por enzimas que geram nicotinatmide adenina dinucleótido fosfato (NAD(P)H) + H + diretamente em amostras de tecido.
Abstract
Mapeamento de atividade enzimática no espaço e no tempo é fundamental para o entendimento da base molecular do comportamento celular em tecido normal e doença. Ensaios de atividade metabólica in situ podem fornecer informações sobre a distribuição espacial da atividade metabólica dentro de um tecido. Nós fornecemos aqui um protocolo detalhado para monitorar a atividade da enzima lactato desidrogenase diretamente em amostras de tecido. Lactato desidrogenase é um determinante importante de se glicose consumida será convertido em energia via glicólise aeróbica ou anaeróbica. Uma solução contendo lactato e NAD é fornecida para uma secção de tecido congelado. Células com atividade alta lactato desidrogenase irão converter o fornecido lactato para piruvato, enquanto simultaneamente converter fornecido nicotinamida adenina dinucleótido (NAD) para NADH e um próton, o que pode ser detectado com base na redução da nitrotetrazolium azul para formazan, que é visualizada como um precipitado azul. Descreveremos um protocolo detalhado para monitorar a atividade da lactato desidrogenase em pele de rato. Aplicação deste protocolo, encontramos que a atividade de lactato desidrogenase é alta em células-tronco a quiescente do folículo de cabelo dentro da pele. Aplicando o protocolo de células-tronco embrionárias cultivadas rato revelou maior coloração em células-tronco embrionárias cultivadas de fibroblastos embrionários de rato. Análise da aorta de rato recém isolado revelou coloração em células musculares lisas perpendicular à aorta. A metodologia fornecida pode ser usada para mapear espacialmente a atividade das enzimas que geram um próton em tecido congelado ou fresco.
Introduction
Compreender os locais dentro de tecidos em que as enzimas têm alta ou baixa atividade é essencial para a fisiologia e desenvolvimento da compreensão. Níveis de transcrição ou proteína são frequentemente utilizados como substitutos para a atividade enzimática. Embora tais estudos podem ser informativos, eles não fornecem informações que podem ser críticas para determinar a atividade de uma enzima, tais como modificações borne-translational, a presença de complexos de proteínas, ou Localização subcellular da enzima. Quando a atividade enzimática é medida diretamente, é frequentemente monitorado em proteína homogeneizada lysates que já não contêm informações sobre células individuais dentro a mistura ou a distribuição espacial das células com alta ou baixa atividade dentro de um tecido.
Nós fornecemos aqui um protocolo detalhado para mapear a distribuição espacial da atividade enzimática dentro de uma amostra de tecido. A metodologia é baseada em estudos anteriores, demonstrando que os sais de tetrazólio podem ser usados para localizar a atividade de desidrogenases, redutases e oxidases em tecido congelado1. Com esses métodos, um formazan insolúvel em água é formado quando os prótons são transferidos para um tetrazólio sal2,3. Glicose-6-fosfato desidrogenase gera NADPH e um próton e foi detectada com actividade de tetrazólio. Glicose-6-fosfato desidrogenase tem sido monitorado em hepatócitos linguado Europeu4, em células alveolares tipo 2 dos pulmões5 e néfrons do rim5. Sais de tetrazólio também tem sido usados para monitorar atividade transketolase em tecido congelado6. Uma abordagem semelhante foi usada recentemente para monitorar a atividade de desidrogenases múltiplas no mesmo tecido adjacente slides7.
Descrevemos aqui um método para usar sais de tetrazólio para monitorar a distribuição espacial da atividade da lactato desidrogenase (Figura 1). Lactato desidrogenase pode converter piruvato gerado pela glicólise de lactato e a reação inversa. Atividade da lactato desidrogenase, consequentemente, é um determinante importante da entrada do piruvato no ciclo do ácido cítrico contra sua secreção como lactato. Níveis de lactato no sangue são frequentemente usados para diagnosticar uma variedade de doenças, incluindo câncer,8,9,10, porque ele pode sinalizar que doença ou lesão tem células danificadas e a enzima foi liberada.
Existem quatro genes de lactato desidrogenase: LDHA, LDHB, LDHC e LDHD11. LDHA e LDHB são pensados para ter surgido de duplicação de um início de gene LDHA12. LDH é ativo como um tetrâmero e LDHA e LDHB podem formar homotetramers e heterotetramers uns com os outros. LDHA é relatado para ter maior afinidade para o piruvato, enquanto LDHB é relatado para ter maior afinidade para lactato e preferencialmente converter lactato para piruvato13. O promotor LDHA contém sítios de ligação para o HIF1α, cMYC e FOXM1 fatores transcrição11. Além disso, como muitas outras enzimas glicolíticas14,15, LDH pode ser modificado por modificações borne-translational. Receptor 1 do fator de crescimento fibroblástico pode fosforilar LDHA em Y10, que promove a formação do tetrâmero, ou Y83, que promove o NADH substrato ligação16. LDHA também pode ser acetilado17. Por estas razões, uma compreensão completa da atividade LDH requer monitoramento não só os níveis de proteína LDH, mas atividade de enzima também.
O método que apresentamos aqui, além de outras abordagens têm sido utilizadas para monitorar a atividade da lactato desidrogenase. Atividade da lactato desidrogenase pode ser monitorada por espectrometria no lisado homogeneizada proteína. A geração de NADH como o lactato é convertido em piruvato pode ser medida com base na absorbância em 340 nm, enquanto o desaparecimento do NADH pode ser monitorado como o piruvato é convertido em lactato18. Atividade de lactato desidrogenase também tem sido monitorada com ressonância magnética (MRI). 13 C-piruvato pode ser administrada e a conversão de piruvato para lactato pode ser monitorizada como a razão de [1 -13C] lactato / [1 -13C] piruvato. Elevados índices de [1 -13C] lactato / [1 -13C] piruvato têm sido observadas no câncer de tecido19. Enquanto abordagens baseadas em MRI podem fornecer informações sobre a atividade da lactato desidrogenase no normal e doença os tecidos, as metodologias não têm a resolução necessária para determinar o nível de atividade em células específicas. A metodologia fornecida aqui pode fornecer informações sobre a atividade da lactato desidrogenase em áreas de tecido e até mesmo em células únicas.
Usando em situ ensaios de atividade, encontramos que a atividade da lactato desidrogenase é rica em células-tronco o folículo piloso da pele de rato20. Nós também usamos o método para monitorar a atividade da lactato desidrogenase em células-tronco embrionárias cultivadas e encontrou que a atividade é superior nas células-tronco da camada do alimentador. Finalmente, monitorado a atividade da lactato desidrogenase em aorta de rato fresco e observado a coloração em células musculares lisas. Descrevemos aqui um protocolo detalhado para monitorar a atividade da lactato desidrogenase em pele de rato congelado.
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Protocol
Todos os experimentos descritos foram aprovados pelo Comitê de cuidado Animal a Universidade da Califórnia, Los Angeles.
1. gerar Slides de pele de rato congelado
- Eutanásia em ratos, em conformidade com a política da instituição.
Nota: Siga a política institucional para vestuário de protecção. Todos os protocolos que envolvam animais devem ser aprovados pelo Comitê institucional Animal conta. - Remova o cabelo do rato com um aparador de pelos de animais.
- Faça incisões na pele com uma tesoura. Usando fórceps, levante a pele longe do mouse. Usando a tesoura, corte a seção da pele.
- Preencha o cryomold com o congelamento reagente composto (ver Tabela de materiais).
- Coloque a pinça de seções em cryomolds preenchido usando bico de pele. Oriente a pele para que fatias de tecido irão gerar uma secção transversal da pele da epiderme para a derme, hipoderme e músculo (Figura 2).
Nota: se possível, montar experimental e controlar ratos juntos no mesmo cryomold para que possam ser seccionados a mesma lâmina e processados juntos. Tome cuidado para não criar bolhas. - Coloque cryomold na superfície plana de um bloco de gelo seco em um balde de gelo e deixe congelar. Continue a observar a orientação da pele. Ajuste se necessário.
Nota: Use criogênicas luvas ao manusear o gelo seco. - Transferi o cryomolds em um freezer-80 ° C para armazenamento. As amostras podem ser mantidas no congelador por aproximadamente 3 meses sem perda significativa de atividade enzimática. Não deixe as seções congeladas dessecar.
- Usando um criostato a-20 ° C, pedaço de tecido para criar seções 7-10 µm de espessura para a melhor pele morfologia21.
2. Preparar lâminas para coloração
- Estabelece o conjunto de slides para ser testado. Incluem um slide de controle no qual NAD vai ser retido e outro controle slide no qual o substrato, lactato, vai ser retido. Incluem uma lâmina de controlo positivo de um bloco de tecido congelado anteriormente investigado.
- Brevemente corrigi slides contendo seções de pele com formol a 4% por 5 min por pipetagem 1 mL de formol a 4% para o slide, ou durante o processamento de vários slides, mergulhando de slides em um recipiente que contém formol a 4%.
Nota: A fixação irá garantir que a pele não descasque fora das lâminas de durante os seguintes procedimentos e preservar a morfologia da pele.
Cuidado: Formol é uma substância cancerígena e perigosos; usar luvas, não deixe que ele toque sua pele e execute esta etapa em uma coifa de química. - Lave slides pelo menos 1 fosfato mL tampão salino, pH 7,4, por slide por pipetagem ou mergulhando.
3. preparar a solução de coloração
- Reagentes juntos de vórtice para coloração de atividade de lactato desidrogenase (pH de Tris 50mm 7.4, 750 µM NADP, 80 µM Fenazina methosulfate (PMS), cloreto de nitrotetrazolium azul 600 µM e lactato de 30 mM) em um tubo de tamanho apropriado dependendo da quantidade de coloração solução necessária.
Nota: 1 mL é suficiente para cobrir completamente um slide. - Prepare uma solução de segunda em que todos os reagentes estão presentes exceto NAD. Prepare uma solução de terceiros, em que todos os reagentes estão presentes exceto lactato.
4. Incubar em solução de coloração
- Suavemente a pipeta a coloração da solução ou soluções de controle sobre as guias preparadas cobrindo a seção em sua totalidade (1ml é suficiente para um slide). Se vários slides estão sendo processados juntos, mergulhar todos os slides na solução de coloração ao mesmo tempo (verifique se o recipiente tem a solução suficiente para cobrir completamente a secção de tecido).
- A incubar em um ambiente umidificado a 37 ° C, no escuro. Se a solução de coloração é em cima do slide, coloque o slide em um ambiente umidificado para evitar a evaporação.
5. monitorar os Slides
- Monitore a conversão da solução de coloração de clear para azul por inspeção visual. Quando as amostras atingiram o nível desejado de cor azul, pare a reação, removendo a coloração da solução.
Nota: Para a pele, 10 minutos é suficiente. O tempo depende do órgão e a atividade enzimática. - Enxágue slides com solução salina tamponada fosfato pipetando (1ml é suficiente para cada slide) ou mergulhando.
Nota: a colheita de amostras que será comparada entre si deve ser mantida na coloração da solução para a mesma quantidade de tempo.
6. counterstain e montar
- Pipetar um corante de contraste para os slides quando as lâminas atingem um nível adequado de cor azul.
Nota: Counterstains que por sua vez os núcleos vermelho ou verde fornecerá bom contraste com o azul criado pelo formazan precipitant. - Montar com aquosa ou aquosos médio22de montagem. Uma a três gotas (40-50 µ l) de meio de montagem é suficiente, dependendo do tamanho da lamínula.
7. imagem slides e quantificar
- Slides de imagem sob um microscópio de luz. Tire fotografias de experimental e amostras de controle e todos os controles negativos em 10x, 20x e ampliação de 40 X.
- Determine a intensidade da mancha azul em diferentes regiões com software de análise de imagem.
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Representative Results
Nós já relatado resultados para ensaios em situ de atividade em pele de rato20. Como mostrado na Figura 3, observou-se altos níveis de atividade da lactato desidrogenase em células-tronco no folículo piloso na base do folículo de cabelo quando os procedimentos descritos acima foram seguidos. Estas conclusões foram corroboradas pela célula de fluorescência ativada triagem de pele para pilhas de haste do folículo piloso e confirmando a atividade elevada lactato desidrogenase no compartimento das células-tronco com ensaios de atividade sobre células classificadas.
Baseado em nossos achados que as células do folículo piloso tem atividade alta lactato desidrogenase, ampliamos nossos estudos de células-tronco embrionárias cultivadas. Fibroblastos embrionários mouse, servindo como uma camada de alimentador foram analisados sozinho ou na presença de células-tronco embrionárias. Para analisar as células cultivadas, o médio foi aspirado, e as células foram brevemente fixo e incubadas com lactato desidrogenase coloração solução conforme descrito acima. Observamos a atividade alta lactato desidrogenase nas células-tronco embrionárias em comparação com o mouse a fibroblastos embrionários (Figura 4).
Também aplicamos o protocolo de coloração ao tecido recém isolado. Aorta de rato foram dissecada e abriu. Os vasos foram abertos e imobilizados para que o interior o lúmen da aorta era acessível. As amostras foram incubadas com solução Hank salina balanceada contendo 0,5% Triton-X por 10 min, depois com o lactato desidrogenase manchando a solução por 10 min. lactato desidrogenase solução de coloração foi aplicada para o tecido fresco. Após a incubação, foram coletadas imagens, mostrando a mancha nas células musculares lisas (Figura 5).
Figura 1 : Atividade química do lactato desidrogenase e sua detecção. Lactato desidrogenase converte lactato + NAD Piruvato + NADH + H+. O proton gerado irá reduzir Tetrazolium tetrazólio para formazan, que formará um precipitado azul. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Esquemático de orientar a pele do rato em cryomolds. Pele de rato deve ser orientada dentro de cryomolds para que cada seção de corte irá conter uma seção transversal da pele toda a epiderme, derme, hipoderme e músculo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Lactato desidrogenase a coloração da pele do rato revela alta atividade no folículo piloso células-tronco. Pele de rato foi congelado em cryomolds e incubada com lactato desidrogenase coloração solução contêm lactato. Atividade da lactato desidrogenase foi proeminente em pilhas de haste do folículo piloso. (A, B) Duas imagens do ensaio da atividade lactato desidrogenase da pele do rato. (C, D) Duas imagens de coloração com o substrato lactato retido de controle. Barra de escala = 50 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Atividade alta lactato desidrogenase em células-tronco embrionárias cultivadas rato. Culta do mouse as células estaminais embrionárias cultivadas em uma camada de alimentador de fibroblastos embrionários rato irradiadas foram analisadas para a atividade da lactato desidrogenase. Observou-se alta atividade nas células tronco em comparação com os fibroblastos. Mouse embrionários fibroblastos mostraram níveis semelhantes de coloração com e sem irradiação. Imagens foram tiradas com um objectivo X 20. Barra de escala = 50 µm. (A, B, D, E) Mouse embrionários fibroblastos e células-tronco. (C, F) Fibroblastos embrionários mouse sozinhos. (A-C) Imagens foram tomadas após 7 minutos de incubação com solução de coloração. (D-F) Imagens foram tomadas após 20 minutos de incubação com solução de coloração. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : Alta lactato desidrogenase atividade nas células de músculo liso em torno da aorta de rato. Aorta foram isolada de ratos sacrificados. Os navios foram fixados por 2 minutos em 2% paraformaldeído e lavagem 3 x 10 minutos em 1 tamponado de fosfato x salina. Os navios foram incubados com solução salina equilibrada de Hank com 0,5% Triton-X e lavados 3 x 5 minutos em solução salina tamponada fosfato. Lactato desidrogenase coloração solução foi adicionado e as amostras foram incubadas durante 10 min a 37° C e lavagem 3 x 5 min com 1 x fosfato-salino. Amostras foram então corrigidas por 1 hora em 2% paraformaldeído, lavagem 3 x 5 min com 1 x fosfato-salino e fotografaram. (A) solução de lactato desidrogenase que contenham lactato. (B) solução de lactato desidrogenase sem lactato como controlo negativo. Para cada seção, há uma imagem de ampliação inferior à esquerda e uma área designada é mostrada com maior ampliação à direita. (A, B) Solução completa lactato desidrogenase contendo lactato foi usada para a coloração. B é que uma imagem ampliada da área indicada em solução de lactato desidrogenase de r. (C, D) imagem sem lactato foi usada para a coloração como controlo negativo. D é uma imagem ampliada da área indicada em C. A e C foram tiradas com 20 objetivos X (barra de escala = 50 µm) e B e D foram tiradas com um objectivo X 40 (barra de escala = 20 µm). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O método descrito aqui pode ser usado para monitorar a atividade da lactato desidrogenase ou outras enzimas metabólicas que geram NADH ou NADPH, em diferentes tipos de células em um tecido ou dentro de diferentes partes de um tecido ao longo do tempo. Lactato desidrogenase é uma enzima importante para a compreensão da biologia das células-tronco e tumores, e a capacidade de monitorar a atividade da lactato desidrogenase em células individuais é susceptível de fornecer importantes insights sobre a função desta enzima.
Uma vantagem importante do presente protocolo em comparação com outras metodologias que é a capacidade de monitor de atividade enzimática, ao invés de apenas abundância de proteína, pode resultar em informações mais conclusivas sobre não apenas onde são enzimas lactato desidrogenase presente, mas onde eles estão realmente funcionais. A abordagem descrita aqui pode ser combinada com imuno-histoquímica é determinar o nível de uma proteína selecionada, por exemplo, um marcador de linhagem de células, as mesmas amostras de tecido, como atividade da lactato desidrogenase. Em comparação com abordagens baseadas em MRI para monitorar a atividade da lactato desidrogenase, o protocolo fornecido tem a vantagem que ele pode proporcionar maior resolução espacial e ajudar a determinar as células específicas dentro de um tecido com alta atividade enzimática . Em comparação com abordagens ao metabolismo de mapeamento com base em substratos fluorogenic, detectar o sinal com o protocolo descrito não é limitado por autofluorescência1. Miller e co-autores realizaram uma análise similar da dependência temporal e dependência de substrato de cinco diferentes enzimas por conversão de formazan7de monitoramento. As reações foram descobertas a seguir estequiométricos princípios de cinética enzimática. Miller e co-autores distinto mitocondriais enzimas de enzimas mitocondriais-não por localização co com coloração mitocondrial7. Eles usaram cloreto de 5-Cyano-2,3-di-(p-tolyl)tetrazolium (CTC) como um reagente de detecção seguido por microscopia confocal para análise de Localização subcellular co7.
O método descrito tem desvantagens também. Enquanto abordagens baseadas em MRI podem ser usadas em organismos vivos, a abordagem descrita requer tecido congelado ou fresco. Os tecidos congelados só são adequados para alguns meses, porque a atividade das enzimas que degradam ao longo do tempo, mesmo quando congelada. Além disso, porque o substrato é fornecido em excesso, a abordagem fornece informações sobre "potencial de atividade" supondo que o substrato estiver presente. Se os níveis do substrato estão limitando, então a distribuição da atividade observada com este ensaio pode desviar-se da quantidade de atividade que ocorre fisiologicamente. Além disso, se existem diferentes isoformas da mesma enzima que realizam a mesma atividade enzimática, o método apresentado aqui não é capaz de distinguir entre eles. Por exemplo, o método apresentado não conseguem distinguir entre a atividade de LDHA contra LDHB. Uma abordagem para endereço que esse problema seria usar geneticamente projetado ratos em que uma única enzima isoform é geneticamente inactivada.
Nós têm experimentado com PMS, um transportador de elétrons fotoquimicamente estável que medeia a transferência de elétrons entre NADH e tetrazólio corantes23. Enquanto alguns cientistas têm relatado que os PMS inibe a atividade de glicose 6-fosfato desidrogenase e encontrou PMS inútil5, encontramos o PMS para ser valiosa para a localização da enzima e incluí-lo em nosso protocolo. Alguns outros autores relataram utilizando álcool polivinílico para limitar a difusão da glicose 6-fosfato desidrogenase enzima1. Em nossos experimentos, nós não encontramos o álcool polivinílico, para ser útil e o eliminou.
A poucos passos são críticos para o sucesso da coloração. Uma questão importante é assegurar que as amostras de tecido são colocadas corretamente no cyromolds. Seções de pele ser conveniente plana para que as fatias cortadas através da pele. Além disso, se várias seções ser preparados, é ideal se eles são incorporados dentro do cryomold mesmo assim eles podem ser cortados juntos no mesmo slide. Isto ajudará a eliminar a variação devido a espessura da lâmina que é cortada com o criostato. Também é importante garantir que o tecido ainda mantém a atividade enzimática.
O melhor momento para acabar com a reação deve ser determinado empiricamente. É necessário acompanhar de perto os slides durante o período de incubação e determinar o momento adequado para Adicionar corante de contraste e montar as lâminas com base na intensidade da mancha azul. Se as amostras são também levemente coradas, não será possível determinar onde é a atividade. Se as amostras são overstained, o precipitado de formazan pode se espalhar, tornando-se difícil apurar as áreas específicas que foram originalmente elevadas em atividade.
Prevemos que este protocolo será valioso para cientistas com uma ampla gama de questões sobre o papel do metabolismo. As aplicações incluem co mancha para a atividade metabólica e marcadores de linhagem de célula ou marcadores de proliferação, avaliando as contribuições de diferentes enzimas com modelos genéticos, avaliando a Localização subcellular da atividade enzimática, monitoramento atividade enzimática no tecido doente ou durante o desenvolvimento.
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Disclosures
Os autores têm sem interesses concorrentes para divulgar.
Acknowledgments
HAC foi o estudioso Milton E. Cassel da Rita Allen Foundation (http://www.ritaallenfoundation.org). Este trabalho foi financiado por subsídios para HAC de nacional Instituto de médico geral Ciências R01 GM081686, R01 AR070245, Instituto Nacional de geral (médico de Ciências R01 GM0866465, o Eli e Edythe amplo centro de medicina regenerativa & investigação em células estaminais Rose Hills e Hal Gaba awards), centro de saúde/UCLA CTSI NIH Grant UL1TR000124, a sociedade de leucemia linfoma, impacto Iris Cantor feminino presenteia partir do Jonsson Comprehensive Cancer Center de WEL e HAC. Pesquisa reportada nesta publicação foi apoiada pelo Instituto Nacional de câncer do institutos nacionais da saúde sob prêmio número P50CA092131. Os financiadores não tinham qualquer papel no projeto de estudo, coleta de dados e análise, a decisão de publicar ou preparação do manuscrito. HAC é um membro do Eli & Edythe amplo centro de medicina regenerativa & investigação em células estaminais, o Instituto de Biologia Molecular de UCLA e o programa interdepartamental de bioinformática da UCLA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical instruments | For collecting skin from euthanized mice | ||
| Tissue-tek cryomold 25 mm x 20 mm x 5 mm | Fisher Scientific | NC9511236 | For freezing mouse skin |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Fisher Scientific | NC9638938 | For mounting cryomolds |
| Ice bucket | Fisher Scientific | 07-210-106 | |
| Dry Ice | |||
| Polysine Adhesion Slide | Fisher Scientific | 12-545-78 | |
| 4% formalin | Fisher Scientific | 23-245-684 | Dilluted in water |
| phosphate buffered saline, pH 7.4 | |||
| vortex | |||
| Tris base | Fisher Scientific | 23-245-684 | |
| NAD | Sigma-Aldrich | N7004 | |
| Phenazine methosulfate | Sigma-Aldrich | P9625 | |
| Nitrotetrazolium blue chloride | Sigma-Aldrich | N6876 | |
| Lithium L-lactate | Sigma-Aldrich | L2250 | Substrate |
| 37°C incubator (or tissue culture incubator) | |||
| Braziliant! Counter stain | Anatech | 861 | Counter stain |
| Mounting medium | Vector Laboratories | H-5000 | |
| Cover slips for slides | Fisher Scientific | 12-544D | |
| Light microscope |
References
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