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Évaluation de la fonction rénale chez les modèles murins de la maladie glomérulaire

Published: June 30, 2018 doi: 10.3791/57764
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3
1Institute of Biomedical and Clinical Sciences, Medical School, University of Exeter, 2School of Physiology, Pharmacology and Neurosciences, University of Bristol, 3Bristol Renal, School of Clinical Sciences, University of Bristol

Summary

Ce protocole décrit une marche à suivre complète rein qui devrait être effectué dans des modèles murins de la maladie glomérulaire. Les méthodes permettent d’analyse fonctionnelle et structurelle mécaniste détaillée de la fonction glomérulaire, qui peut être appliquée à tous les modèles murins de la maladie glomérulaire.

Abstract

L’utilisation de modèles murins pour imiter la maladie de rein humain devient de plus en plus fréquente. Notre recherche est axée sur l’évaluation de la fonction glomérulaire dans la néphropathie diabétique et podocyte spécifiques VEGF-A souris knock out ; par conséquent, ce protocole décrit la marche à suivre complète rein utilisé dans notre laboratoire pour évaluer ces modèles murins de la maladie glomérulaire, permettant une grande quantité d’informations au sujet de rein et de la fonction glomérulaire à provenir d’une seule souris. Par rapport aux autres méthodes présentées dans la littérature pour évaluer la fonction glomérulaire, l’utilisation de la méthode décrite dans cet article permet le phénotype glomérulaire à être pleinement évalué à partir des aspects multiples. En utilisant cette méthode, le chercheur peut déterminer le phénotype de rein du modèle et évaluer le mécanisme quant à pourquoi le phénotype se développe. Cette information vitale sur le mécanisme de la maladie est requise lors de l’examen des possibilités thérapeutiques dans ces modèles. Les méthodes permettant une évaluation fonctionnelle détaillée de la barrière de filtration glomérulaire par mesure de la créatinine urinaire d’albumine et perméabilité glomérulaire individuels, ainsi que l’examen tant structurel qu’ultra-structurale à l’aide de la coloration à l’acide périodique de Schiff et microscopie électronique. En outre, l’analyse de la dysrégulation de gènes au niveau de l’ARNm et de protéines permet analyse mécaniste de la fonction glomérulaire. Ce protocole décrit les méthodes génériques mais adaptables qui peuvent être appliquées à tous les modèles murins de la maladie glomérulaire.

Introduction

L’utilisation de modèles murins pour imiter la maladie de rein humain devient de plus en plus fréquente. Ces modèles murins comprennent les modèles spontanées par exemple spontanément hypertensive rats (RSH)1, par la streptozotocine (STZ)-induced rats diabétiques et souris2, et la db/db type II souris diabétiques3, modèles issus du génie génétique comme primaire spécifique podocyte segmentaire glomérulaire sclérose focale (FSG) modèles4, le podocyte spécifiques vasculaire facteur de croissance endothéliale (VEGF-A) knock out (VEGF-A KO) modèle5, syndrome d’Alport modèles et6et acquis les modèles tels que la néphrectomie de 5/67 et l’obstruction urétérale unilatérale (UUO)8. Afin d’évaluer les différents aspects de la fonction glomérulaire dans ces modèles, il existe plusieurs techniques. Le but de cet article de méthode doit démontrer une marche à suivre complète qui doit être effectuée dans des modèles murins de la maladie rénale afin d’évaluer pleinement la fonction glomérulaire.

La justification de l’utilisation de cette méthode est qu’il permet le phénotype glomérulaire à être pleinement évalué à partir des aspects multiples. Cela inclut l’évaluation de la perméabilité glomérulaire, tant aux protéines et à l’eau, anomalies structurelles glomérulaires et changements dans l’expression/épissage des ARNm et de protéines essentielles pour la fonction glomérulaire normale. En utilisant cette méthode, le chercheur est en mesure de déterminer le phénotype de rein du modèle et d’évaluer le mécanisme quant à pourquoi le phénotype se développe. Il s’agit d’informations vitales sur le mécanisme de la maladie, qui est requise lors de l’examen des possibilités thérapeutiques dans ces modèles.

Dans la littérature, c’est une chose courante sera présenté avec un modèle murin de la maladie glomérulaire où le phénotype est déterminé par une augmentation du niveau d’albumine dans les urines. Cependant, il existe des preuves suggérant qu’une seule méthode pour déterminer la fonction glomérulaire n’est pas toujours efficace ; mesurer le taux d’excrétion urinaire de l’albumine ou la créatinine urinaire d’albumine (uACR) seulement fournit des informations sur la fonction rénale totale et pas des glomérules individuels. Des études antérieures ont démontré que la perméabilité peut varier dans les différents glomérules du rein même5,9,10. En outre, l’évaluation de la perméabilité des glomérules individuels est une manière plus sensible de l’évaluation de la fonction glomérulaire ; la technique de mesure de la perméabilité glomérulaire individuels (LpA / Vi) a montré pour être plus sensible aux changements dans la fonction glomérulaire que mesurer l' uACR9. Ce dosage est bénéfique dans des modèles murins qui résistent à une protéinurie, telles que celles sur un fond de c57BL/611. L’avantage du présent livre méthode c’est qu’il examine à la fois la perméabilité rénale totale à l’albumine ainsi que la perméabilité glomérulaire individuelle à l’eau.

Examen des anomalies structurelles glomérulaires est souvent évaluée par une batterie des taches telles que les Schiff d’acide périodique (APS), trichrome et des taches argent. Ceux-ci permettent un pathologiste rénal formé évaluer le niveau de l’insuffisance rénale par une méthode de notation. Bien que toutes les bonnes méthodes, modifications apportées à la macro-structure glomérulaire ne sont pas toujours respectées dans l’insuffisance rénale aiguë modèles12. Cette méthode propose qu’en plus des techniques d’histologie rénale décrites ci-dessus, l’ultra-structure glomérulaire devrait aussi être appréciée par l’intermédiaire de la microscopie électronique (EM). Un glomérule teinté peut sembler relativement normale sous un microscope optique ordinaire ; Toutefois, lors de l’évaluation avec EM, petits changements dans la largeur de la membrane basale glomérulaire (MBG), podocyte pied effacement de processus, fenestrations endothéliales et la couverture de l’espace sub-podocyte est analysée. Par conséquent, il est vital que l’ultra-structure glomérulaire et la microstructure est évalué afin de déterminer le mécanisme de la dysfonction glomérulaire.

En plus d’évaluer les anomalies structurelles glomérulaires, changements dans l’ARNm et expression de la protéine et l’épissage, ainsi qu’activation de la protéine (par exemple, la phosphorylation), doivent être examinées pour élucider davantage les mécanismes de la maladie glomérulaire. Quand on regarde la maladie glomérulaire, ou, par exemple, lorsque KO/over-expressing un gène spécifiquement dans les cellules glomérulaires, comme dans le podocyte spécifiques VEGF-A KO souris5, il est important que les changements d’ARNm et de protéines sont examinées que dans le les cellules glomérulaires et pas le rein entier. Ce protocole décrit une méthode dans laquelle les glomérules sont isolées à partir du cortex rénal de souris, et puis la protéine/ARN sont isolés. Cela permet une analyse spécifique de la protéine/ADN messagère dérèglement dans les glomérules du modèle de la maladie.

Ce protocole décrit une marche à suivre complète rein qui devrait être effectué dans des modèles murins de la maladie glomérulaire, permettant une grande quantité d’informations au sujet de rein et de la fonction glomérulaire à provenir d’une seule souris. Les méthodes permettent d’analyse fonctionnelle et structurelle mécaniste détaillée de la fonction glomérulaire, qui peut être appliquée à tous les modèles murins de la maladie glomérulaire.

Protocol

Toutes les expériences ont été menées conformément à la législation britannique et à l’approbation du Comité d’éthique local. Les études animales ont été approuvés par l’Université de Bristol Research Ethics Committee.

1. urinaire albumine créatinine (uACR)

Remarque : L’uACR est utilisé pour évaluer la perméabilité du GFB à l’albumine. La présence d’albumine dans les urines indique une perméabilité accrue à travers le GFB, qui est normalisé à la créatinine au contrôle des variations de débit urinaire. Albuminurie est un marqueur commun pour l’insuffisance rénale chronique.

  1. Collecte urine à la ligne de base expérimentale et à intervalles réguliers (une fois par semaine à une fois par mois) jusqu’au point de terminaison expérimentale.
  2. Mis en place des cages métaboliques souris avec alimentation d’eau et de l’enrichissement. Placez les souris (mâles, âgés 6-8 semaines) dans des cages individuelles pendant 6 h dans une pièce silencieuse.
  3. Retour souris à régulier du logement et de l’urine collecter des cages vides. Il faut un minimum de 50 µL.
    Remarque : Si la souris ne produit pas d’urine dans le temps imparti, recommencez un autre jour dans une pièce plus chaude.
  4. Centrifuger l’urine à 500 x g pendant 10 min. collecter l’urine et de retenir les sédiments afin d’évaluer la perte podocyte. Stocker l’urine à-20 ° C à court terme à ce stade.
  5. Diluer l’urine dans les 1 % d’albumine sérique bovine (BSA) 1 x Tris buffered saline (pH 7,5 de TBS) à un 1/500 à une dilution de 1 : 10000, selon la gravité de l’albuminurie.
    Remarque : Le volume de fin doit être > 400 µL. point d’optimiser pour déterminer la bonne dilution à chaque fois.
  6. Quantifier la concentration d’albumine urinaire à l’aide d’une souris albumine dosage immunoenzymatique (ELISA) par les instructions du fabricant.
    1. En bref, enduire la plaque ELISA, qui est optimisée pour la liaison aux protéines, avec 100 µL de l’anticorps primaire anti-souris albumine (10 µg/mL à 0,5 M carbonate-bicarbonate pH 9,6) pendant 1 h à température ambiante.
    2. Lavage excès d’anticorps puits cinq fois avec 1 x TBS plus de 0,05 % de Tween (pH 8,0) et ajouter 200 µL de solution (1 x TBS avec un pH de 1 % BSA 8.0) du jour au lendemain à la température ambiante de blocage.
  7. Laver plaque cinq fois et ajouter 100 µL des normes (dilution en série : 2000 µg/mL à 15,63 µg/mL en 1 x TBS avec 1 % de BSA, pH 8,0), le blanc et les échantillons dilués en triple exemplaire. Laissez pendant 1 h à température ambiante puis laver plaque cinq fois.
    1. Ajouter 100 µL d’anticorps de détection HRP dans chaque puits (10 ng/mL chez 1xTBS avec 1 % de BSA, pH 8,0) et incuber à température ambiante pendant 1 h.
    2. Laver la plaque cinq fois et ajouter 100 µL de solution de substrat enzymatique dans chaque puits. Laisser la plaque dans l’obscurité pour développer pendant 15 minutes et arrêter la réaction en ajoutant 100 µL de 0,18 M d’acide sulfurique (H2SO4).
      ATTENTION : H2SO4 corrosif.
  8. Déterminer la concentration d’albumine de chaque échantillon en lisant la plaque à une absorbance de 450 nm. La courbe d’étalonnage permet de quantifier l’albumine présente dans chaque échantillon. Si les répétitions techniques ont une valeur de CV supérieure à 5 %, répétez le test pour les échantillons.
  9. Vous pouvez également évaluer la concentration d’albumine urinaire par électrophorèse. Ajouter 5 µL de 4 x mémoire tampon échantillon de chargement protéine à 15 µL d’urine. Faire chauffer les échantillons à 95 ° C pendant 10 min et ensuite charger dans un gel de Tris préfabriqué de 4 à 12 %.
    1. Exécutez le gel à 100 V et tache du jour au lendemain au bleu de Coomassie selon le protocole du fabricant.
    2. Après le gel de l’imagerie, utilisez densitométrie pour évaluer la concentration d’albumine pli changement par rapport au témoin.
      Remarque : Si aucune bande n’est observées lorsqu’on attend de l’albumine, évaluer la concentration de la protéine de l’urine et régler le volume d’urine ajouté au gel.
  10. Diluer l’échantillon d’urine brute en dH2O à 01:10, 1:5 et 1:1.
    Remarque : Le volume de fin doit être > 70 µL. optimiser pour déterminer la bonne dilution de chaque échantillon.
  11. Quantifier la concentration en créatinine urinaire à un dosage chimique selon les instructions du kit. En bref, charger 20 µL de créatinine normes, vide, dilué d’urine ou d’une plaque 96 puits en triple exemplaire.
  12. Déterminer la concentration de créatinine de l’échantillon en lisant la plaque à une absorbance de 490 nm avant et après l’ajout de la solution d’acide (attention, corrosive ; éviter tout contact avec la peau).
    NOTE : La différence entre les valeurs d’absorbance est directement proportionnelle à la concentration de créatinine dans chaque échantillon. Une courbe d’étalonnage est la génération des normes. Si les répétitions techniques ont une valeur de CV supérieure à 5 %, répétez le test pour les échantillons.
  13. Générer l’uACR (µg/mg). Normaliser les données de la valeur de référence de chaque souris pour une représentation graphique.

2. tissu et prélèvement sanguin

Remarque : Les reins et les tissus glomérulaire peuvent servir à évaluer les marqueurs d’expression structural, les protéines et ADN messagère de l’insuffisance rénale. Le sang peut être utilisé pour évaluer les marqueurs de la fonction rénale, telles que de la créatinine, qui peut être régulée dans les maladies rénales, indiquant une diminution de la capacité de filtration des glomérules.

  1. Préparer les solutions suivantes : frais 2,5 % glutaraldéhyde dans cacodylate de sodium 0,1 M (pH 7,3), 4 % de paraformaldéhyde à 1 x tamponné phosphate salin (PBS), une solution de Ringer mammifères (115 mM chlorure de sodium (NaCl), acétate de sodium 10 mM (CH3COONa), 1.2 mM de phosphate de sodium (Na2HPO4), le bicarbonate de sodium (NaHCO3) 25 MM, 1,2 mM de sulfate de magnésium (MgSO4), chlorure de calcium 1 mM (CaCl2), D (+) glucose de 5,5 mM, pH 7,4) avec 1 % de BSA et 1 x PBS.
    ATTENTION : 2.5 % de glutaraldéhyde : toxic, sensibilisant, irritante ; utiliser dans une armoire de fumées. 0,1 cacodylate de sodium M : toxique, usage dans une armoire de fumées. 4 % PFA : fixateur, utilisation dans le cabinet de fumées
  2. Préparer les matériaux suivants : isoflurane, acide éthylènediaminetétraacétique petit (EDTA)-revêtement des tubes de sang, 23-25G aiguilles, seringues de 5 mL EDTA enduit, 10 mL flacons en verre, flacons en plastique de 10 mL, tubes en plastique de 0,5 mL, tissu jetable moules, glace sèche, liquide N 2, outils chirurgicaux de souris et support de coupe optimale (OCT).
  3. Placez votre souris sous anesthésie profonde, qui est vérifiée par la souris étant irrecevable à une piqûre d’aiguille à la garniture de pied, à l’aide d’une chambre d’isoflurane, ou voies équivalents d’anesthésie terminaux tels que des agents anesthésiques injectables (pentobarbital, 50 mg/kg intrapéritonéale [IP] ; avertin, IP 240 mg/kg), ou le dioxyde de carbone (CO2) exposition (75 % CO225 % O2).
  4. Abattre les souris par ponction cardiaque dans le ventricule gauche et de recueillir autant de sang que possible. Transférer dans le tube de sang EDTA-enduit jusqu'à 4 h. Si vous préférez, souris peuvent être abattus par dislocation cervicale avec soin ne pas de rupture de la veine jugulaire.
  5. Disséquer les reins à travers l’abdomen et les laver dans du PBS 1 x contre le rhume de glace.
  6. Afin d’examiner les glomérules corticales, supprimer un des pôles du cortex rénal et couper en morceaux de3 mm 1. Pour examiner les glomérules juxta-médullaire profonde, répétez la même technique avec les tissus de la moelle. Placer dans 5 mL de solution de glutaraldéhyde 2,5 % dans un flacon en verre de EM. Conserver à 4 ° C.
    ATTENTION : solution de glutaraldéhyde 2,5 % : toxic, sensibilisant, irritante ; utiliser dans une armoire de fumées
    NOTE : processus au cours du mois pour des résultats optimaux.
  7. Pour histologie, enlever le tiers supérieur d’un rein, afin d’assurer des glomérules corticales et médullaires juxta seront présents et le fixer dans 5 mL de paraformaldéhyde à 4 ° C pendant 24 h. transfert à 5 mL de 70 % à 4 % EtOH pendant 24 heures avant l’intégration à la paraffine.
    ATTENTION : 4 % PFA : fixateur, utilisation dans le cabinet de fumées
  8. Pour l’immunofluorescence, placer un tiers du rein, afin d’assurer des glomérules corticales et médullaires seront présents, dans le tissu moule et le manteau en octobre Place sur la glace sèche pour congeler et stocker à-80 ° C.
  9. Pour les protéines et l’ARN, placer 3 x 2 mm3 morceaux du cortex rénal dans les tubes en plastique de 0,5 mL et snap gel en liquide N2. Conserver à-80 ° C. Pour le stockage de tissus à long terme pour l’ARN, placez le tissu en 5 volumes de la solution de stabilisation RNA et conserver à-80 ° C.
  10. Pour l’isolation des glomérules, découper le tissu rénal restant et placer dans 5 mL de solution de Ringer mammifères avec 1 % de BSA sur la glace. Préparez-vous à tamis glomérules immédiatement.

3. créatinine plasmatique

NOTE : Créatinine plasmatique peut être régulée dans les maladies rénales, indiquant une diminution de la capacité de filtration des glomérules. La concentration d’azote (BUN) urée sanguine peut également être évaluée, bien que le protocole n’est pas décrit ici.

  1. Centrifuger l’échantillon de sang à 500 g pendant 15 min à 4 ° C.
  2. Recueillir le plasma, qui peut être conservé à-20 ° C à court terme, à ce stade.
  3. Quantifier la concentration de créatinine plasmatique à un dosage de créatinine chimique selon les instructions ci-dessus pour la créatinine urinaire en protocole 1.11.
  4. Déterminer la concentration de créatinine de l’échantillon en lisant la plaque à une absorbance de 490 nm avant et après l’ajout de la solution acide.
    NOTE : La différence entre ces valeurs d’absorbance est directement proportionnelle à la concentration de créatinine dans chaque échantillon. Une courbe d’étalonnage est la génération des normes. Si les répétitions techniques ont une valeur de CV supérieure à 5 %, répétez le test pour les échantillons.

4. isolement des glomérules

Remarque : Les glomérules peuvent être isolés afin d’évaluer la perméabilité des glomérules individuels ex vivo, ainsi que l’expression de la protéine spécifique et des marqueurs d’ADN messagère de la maladie glomérulaire.

  1. Prendre le tissu rénal, placé dans une solution de Ringer mammifères avec 1 % de BSA et disséquer les glomérules à l’aide d’une norme technique13de tamisage. En bref, empiler les 70 µm (en bas), 100 µm, 125 µm, 175 µm, 250 µm et 425 µm tamis (en haut) sur une carafe en verre.
  2. Écraser le rein, à l’aide d’un piston de la seringue, dans le µm 425 tamis et faire passer à l’aide de glace froide mammifères de Ringer avec 1 % de BSA. Comme les bits du rein sont poussés à travers, enlever le tamis supérieur et continuez à faire de même sur l’autre. Répéter jusqu'à ce que seulement les 100 µm et 70 µm tamis demeurent.
  3. Transférer la récolte glomérulaire conservée par le µm 100 et 70 µm tamis à 10 mL de solution de Ringer mammifères frais avec 1 % de BSA, sur la glace.
    Remarque : Si le nombre de glomérules par une solution de Ringer mL c’est peu, réduire le volume de solution de Ringer utilisé pour recueillir les glomérules des dernière deux tamis.
  4. Prélever 5 mL de la solution contenant les glomérules dans deux tubes séparés (2,5 mL chacun) et centrifuger à 1 000 x g pendant 10 min à 4 ° C. Retirez le surnageant et composant logiciel enfichable geler les glomérules dans liquide N2 avant de le stocker à-80 ° C pour les protéines et l’extraction de l’ARN à une date ultérieure.
  5. Placer le reste de la solution contenant les glomérules dans un bain-marie à 37 ° C pour la mesure de la glomérulaire LpA / Viex vivo. Terminer en 3 h d’enlever le rein.

5. perméabilité à l’eau glomérulaire (LpA / Vj’ai)

Remarque : Le glomérulaire LpA / Vj’ai permet la mesure ex vivo de la perméabilité des glomérules individuels dans un jeûne de façon reproductible. Une augmentation de la glomérulaire LpA / Vj’ai indique perturbation de GFB, qui est évocatrice d’une maladie rénale.

  1. Mettre en place le glomérulaire LpA / Vj’ai gréer comme décrit dans le saumon et al.10. Veuillez vous reporter à la Figure 1 pour un plan détaillé de la mise en place.
  2. Préparer les solutions suivantes : une solution de Ringer mammifères avec 1 % de BSA (pH 7,4) et mammifères Ringer avec 8 % de BSA (pH 7,4). Chaud à 37 ° C.
  3. Tirez les micropipettes de tubes capillaires de verre (densité optique : 1,2 mm). Générer une astuce d’aperture 5-8 µm en coupant la micropipette sous un microscope.
  4. Utilisez le glomérulaire LpA / Vj’ai gréer pour attraper des glomérules individuels intacts qui sont exempts de la capsule de Bowman et tubulaires fragments sur la micropipette à l’aide de dragues. Un résumé détaillé de l’essai d’oncometric se trouve dans le saumon et al.10. En bref, une fois un glomérule est capturé et sécurisé sur la micropipette d’aspiration, commencer l’enregistrement de la vidéo du glomérule sous le microscope.
  5. Tout d’abord, équilibrer le glomérule dans le 1 % de Ringer BSA pour 30 s avant de passer la périfusées le concentré 8 % de Ringer BSA pour 10 s. Puis revenir la périfusées de 1 % Ringer BSA et arrêter l’enregistrement.
  6. Laver le glomérule et répétez le processus pour les glomérules de 10-15 par souris. S’assurer que les débits de périfusées sont identiques et pas de jeûner (10 mL/min) de manière à ne pas déformer la structure glomérulaire.
  7. Mesurer la vitesse initiale de rétraction glomérulaire pour calculer la perméabilité glomérulaire (LpA) normalisée au volume glomérulaire (Vi). On trouvera des informations détaillées relatives à l’analyse en saumon et al.10.

6. acide periodique Schiff (PAS) tache

Remarque : La tache PAS mettra en évidence les membranes basales des boucles capillaires glomérulaires et l’épithélium tubulaire. Il permet la visualisation détaillée des cellules glomérulaires, mésangiales expansion de matrice et de potentiel et les changements éventuels de la GBM (c.-à-d., épaississement et irrégularités).

  1. L’article le cortex de rein de paraffine, PFA-correction à l’aide d’un microtome à 5 µm d’épaisseur sur glissières revêtus de poly-L-lysine. Sec à 37 ° C pendant 1 h. s’assurer que la section ne contient-elle pas plis ni trous, qui peuvent fausser la morphologie sous le microscope.
  2. Déparaffiner diapositives en incubant deux fois dans le xylène (attention, irritant ; utilisation au cabinet de fumées) pendant 3 min chacun, deux fois en 100 % EtOH pendant 3 min de chaque et puis une fois à 95 %, 70 % et 50 % EtOH pendant 3 min chacun, le tout à température ambiante. Réhydrater les diapositives de dH2O.
  3. Incuber les lames dans une solution acide périodique (attention, irritant ; l’utilisation des fumées Cabinet) (1 g/dL) pour 5 min et puis rincez les diapositives de plusieurs changements de dH2O. utilisent un récipient avec 100 mL dH2O à température ambiante.
    Mise en garde : solution l’acide périodique : irritant ; utiliser dans les fumées cabinet
  4. Incuber les lames dans le réactif de Schiff (Parasoaniline HCl 6 g/L et sodium métabisulfite 4 % en HCl 0,25 mol/L) pendant 15 min à température ambiante. Les lames à l’eau courante pendant 5 min.
  5. Contre-colorant avec l’hématoxyline pendant 3 s avant de rincer soigneusement les lames dans l’eau courante pendant 15 minutes.
    NOTE : Certaine optimisation peut être nécessaire pour déterminer le moment optimal pour la coloration hématoxyline.
  6. Déshydrater les diapositives à l’aide de l’inverse du protocole déparaffinage à l’étape 6.2. Terminer par le xylène.
  7. Air secs diapositives et monter avec les supports de montage à base de xylène.
  8. Image sur un microscope photonique à un grossissement de X 400 pour évaluer les structures glomérulaires. Évaluer ce qui suit : épaississement et les irrégularités de la GBM, effondrement des boucles capillaires, tissu fibreux, la sclérose en plaques, une prolifération cellulaire (endothélial, podocyte et mésangiales, ou des cellules inflammatoires, infiltrant la touffe).
    Remarque : Pour une évaluation complète de physiopathologie glomérulaire, lésions ailleurs dans le rein doivent être évaluée, comme dans les tubules.

7. transmission Electron Microscopy (TEM)

Remarque : TEM permet l’examen des anomalies ultra-structurale dans le rein, comme le GBM, podocyte pied processus et endothéliales fenestrations, qui ne sont pas visibles avec la microscopie photonique. Ceci est important dans les modèles où atteinte rénale n’est pas si prononcé (c'est-à-dire, sans albuminurie et anomalies structurelles majeures).

  1. Prenez le rein en dés 2,5 % gluteraldehdye - fixe et fixer au tétroxyde d’osmium 1 % pendant 1 h. lavage dans 50 mL de tampon de cacodylate de 0,1 M (pH 7,3) et ensuite 50 mL de dH2O (changements de 3 x 15 min).
    ATTENTION : 2.5 % de glutaraldéhyde : toxic, sensibilisant, irritante ; utiliser dans une armoire de fumées. 0,1 cacodylate de sodium M : toxique, usage dans une armoire de fumées
  2. Déshydrater avec EtOH et incorporer en résine de l’Araldite.
  3. Coupes à l’épaisseur de 50 à 100 nm et coloration à l’acétate d’uranyle (aqueuse) de 3 % et de solution de citrate de plomb Reynolds.
  4. Prendre des photographies au microscope numériques sur plusieurs zones du glomérule à 940 X, 1250 X et 6200 X pour être sûr les podocytes, GCS, GBM et mesangium peuvent être identifiés.
  5. ImageJ permet d’analyser les glomérules aveugles. Définissez l’échelle pour chaque micrograph 6200 X en traçant une ligne entre deux points de distance connue, comme une règle. Allez à analyser et puis définissez échelle, où la longueur de la ligne s’afficheront en pixels. Tapez la distance connue et unités de mesure. Utiliser les protocoles listés ci-dessous pour la mesure de chaque paramètre.
    Remarque : Cette analyse nécessite environ 1 jour par souris. Pour une puissance statistique adéquate, utiliser les mesures moyennes de 3 glomérules de 3 souris.
    1. Pour GBM, insérer une grille fixe numérique (10 x 10) sur la micrographie de 6200 X et mesurer l’épaisseur de la GBM à l’endroit où croisent les lignes de la grille le GBM. Mesurer de la membrane basale des cellules endothéliale à la membrane des cellules basales podocyte pied processus dans une tangente perpendiculaire à la membrane des cellules endothéliale à l’aide de l’outil de ligne droite. Déterminer la valeur moyenne mesurée pour chaque glomérule de 10 mesures individuelles.
    2. Pour le nombre de fenestration endothéliale, mesurer la longueur de la GBM présent dans la micrographie de 6200 X et compter le nombre de fenestrations endothéliales par unité de longueur de GBM. Prendre une moyenne d’au moins 4 photographies au microscope par le glomérule.
    3. Pour le podocyte pied largeur de processus, insérer une grille fixe numérique (10 x 10) sur la micrographie de 6200 X. Mesurez la largeur des processus podocyte pied qui traversent les lignes de la grille. Mesurez la largeur à la partie la plus large du processus pied où elle rencontre le GBM ; s’assurer que la ligne soit perpendiculaire à la tangente de la membrane basale podocyte. Déterminer la valeur moyenne mesurée pour chaque glomérule de 10 mesures individuelles.
    4. Pour podocyte largeur de fente, insérer une grille fixe numérique (10 x 10) sur la micrographie de 6200 X. Mesurez la largeur des diaphragmes podocyte fente qui traversent les lignes de la grille. C’est le point où les processus de pied sont plus près de l’ensemble, la partie la plus large de chaque processus de pied, de podocyte membrane à membrane. S’assurer que la mesure est perpendiculaire à la tangente de la membrane basale podocyte. Déterminer la valeur moyenne mesurée pour chaque glomérule de 10 mesures individuelles.
    5. Pour le nombre de podocyte pied processus, mesurer la longueur de la GBM présent dans la micrographie de 6200 X et compter le nombre de processus de pied podocyte par unité de longueur de GBM. Prendre une moyenne d’au moins 4 photographies au microscope par le glomérule.
    6. Pour la couverture de l’espace sub-podocyte, voir la méthode détaillée dans Neal et al. 14.
  6. À l’aide de la microscopie X 940, examiner les glomérules de la présence d’une structure anormale, les dépôts et s’infiltre par oeil.

8. immunofluorescence pour Podocyte et marqueurs endothéliales

NOTE : Immunomarquage permet la visualisation des patrons d’expression de protéines, telles que des boucles capillaires endothéliales, qui peuvent s’effondrer dans la maladie glomérulaire.

  1. Placer le moule en OCT contenant des reins congelé à-20 ° C pendant 2 h avant incision. S’assurer que la surface coupée du rein est soigneusement placée contre le fond du moule-OCT pour permettre des coupes de tissus bien orienté.
  2. À l’aide d’un cryostat, tissu de section sur une épaisseur de 5 µm à la poly-L-lysine enduite de diapositives.
    Remarque : Assurez-vous qu’il n’y a aucun plis ou les trous dans la section de tissus, qui peuvent fausser la morphologie.
  3. Lors du retrait du cryostat, Difficulté diapositives dans 4 % PFA pendant 10 min. Lavez glisse 3 x 5 min dans un contenant de 100 mL de dH2O.
    ATTENTION : 4 % PFA : fixateur, utilisation dans le cabinet de fumées
  4. Pour réduire la quantité d’anticorps utilisé, dessinez autour des sections avec un stylo hydrophobe. Ne laissez pas les sections à sec.
  5. Incuber en bloquant la solution (BSA 3 % et 5 % de sérum normal en solution 1 PBS x) pendant 1 h à température ambiante.
  6. Enlever la solution de blocage avec un aspirateur et incuber des sections avec l’anticorps primaire (néphrine, podocin ou PECAM-1) dilué 1/250 (3 % de BSA dans du PBS 1 x). Placer les lames dans une chambre humidifiée à 4 ° C durant la nuit. Si une chambre humide n’est pas disponible, légèrement recouvrir une petite bande de parafilm la diapositive revêtus d’anticorps. Faites attention en enlevant le lendemain quant à ne pas perturber la section.
  7. Les lames 3 x 5 min dans du PBS 1 x.
  8. Incubation avec l’anticorps secondaire fluorescent approprié dilution 1 : 1000 (3 % de BSA dans du PBS 1 x) pendant 2 h à température ambiante dans l’obscurité.
  9. Les lames 3 x 5 min dans du PBS 1 x. Monter avec fluorescentes montage média contenant DAPI.
  10. Diapositives d’image avec un microscope à fluorescence à un grossissement de X 400 pour afficher les glomérules. S’assurer que cela est aveuglé pour éviter les biais.
  11. Utilisation ImageJ pour analyser l’intensité de coloration, normalisée à la zone glomérulaire et le patron de coloration, c'est-à-dire, le nombre de boucles capillaires normalisés à la zone glomérulaire, d’une manière aveugle.

9. protein Extraction et Western Blot

NOTE : Éponger occidental nous permet d’évaluer les protéines d’expression connues pour être la dysrégulation en insuffisance rénale. Par exemple, une réduction de l’expression podocin et néphrine indique podocyte perte.

  1. Extrait de protéines de cortex rénal et glomérules tamisées ; le protocole est le même pour chacun, et le volume de tampon de lyse est ajusté pour la quantité de tissu.
  2. Dégel rein/glomérules sur la glace avant d’ajouter la lyse NP-40 tampon contenant inhibiteurs de protéase et de la phosphatase (150 mM NaCl, 1 % NP-40, 50 mM Tris pH 8). Homogénéiser l’échantillon pendant 30 s.
  3. Incuber les échantillons homogénéisés sur glace pendant 30 min, Vortex à intervalles réguliers.
  4. Centrifuger les échantillons à 10 000 g pendant 15 min à 4 ° C.
  5. Retirez le surnageant dans un nouveau tube sur la glace.
    Remarque : s’attendre à récupérer environ 1 mg de protéine par exemple.
  6. Dénaturer les protéines en utilisant le tampon standard de x Laemmli 4. Faire bouillir le mélange à 95-100 ° C pendant 5 min.
  7. Évaluer l’expression des protéines de marqueur de cellules glomérulaire (néphrine, Podocin, PECAM-1, etc.) et de la phosphorylation et l’expression des protéines connues / l’hypothèse soit modifiée dans les rein/glomérules du modèle de la maladie à l’aide de Western Blot) méthode standard ; Mahmood et Yang15).
    Remarque : Le protocole variera selon la taille et l’abondance de la protéine d’intérêt.

10. RNA Extraction et amplification génique (PCR)

NOTE : ARNm expression analyse nous permet de déterminer comment les gènes sont régulés dans les maladies rénales, tels que les changements dans l’expression des gènes et d’épissage alternatif.

  1. Tandis que le cortex rénal est encore gelé, broyer soigneusement dans 3 mL de réactif de phénol en utilisant un mortier et un pilon. Si vous utilisez des extraits glomérulaires, ajouter 1 mL de réactif de phénol et homogénéiser l’échantillon pendant 30 s.
    ATTENTION : Le réactif de TRIzol : irritant ; utiliser dans les fumées cabinet
  2. Effectuer une extraction de l’ARN à l’aide de la méthode décrite par Chomczynski et Sacchi16.
    NOTE : Commercial RNA extraction kits sont disponibles comme alternative à cette méthode.
  3. Évaluer la quantité et la qualité de l’ARN obtenue à l’aide d’une des diverses méthodes disponibles. L’ARN est aliquotés et congelés à-80 ° C à ce stade. Éviter de répéter gel dégel.
    Remarque : Si nouveau pour cette méthode, vérifiez la qualité de l’ARN avant de passer à l’étape suivante en exécutant l’ARN sur gel d’agarose pour assurer un clair 28 s et 18 s ribosomal bande. S’attendre à récupérer entre 2 à 5 µg d’ARN à l’aide de cette méthode.
  4. Traiter la DNase 1 µg d’ARN (volume de faire jusqu'à 10 µL d’eau exempte de RNase plus 1 µL de DNase et 1 µL de tampon de DNase) pendant 1 h à 37 ° C. Arrêter la réaction 1 µl de solution d’arrêt DNase à 65 ° C pendant 10 min.
  5. Ajouter 0,5 µL d’oligo (dT) et amorces aléatoires. Incuber à 70 ° C pendant 10 min.
  6. Étancher immédiatement sur la glace pendant 5 min.
  7. Ajouter ce qui suit : Transcriptase inverse MMLV (400 U ; remplacer par DEPC H2O dans le RT - témoin), tampon MMLV (1 x), inhibiteur de mix (0,5 mM) et ribonucléase dNTP (40 U) ; faire jusqu'à 50 µL d’eau DEPC.
  8. Incuber le mélange réactionnel à 37 ° C pendant 1 h, suivi de 95 ° C pendant 5 min désactiver l’enzyme.
    NOTE : Pour générer un rendement plus élevé de l’ADNc, incuber à 37 ° C pendant 3 h.
  9. Évaluer la quantité et la qualité de cDNA en utilisant diverses méthodes disponibles.
  10. Utilisation PCR afin d’évaluer les comportements d’expression et épissage des ARNm des gènes supposé être dysrégulation dans le modèle de la maladie glomérulaire. Le protocole variera selon le gène d’intérêt.

Representative Results

Urine ont été recueilli à l’aide de cages métaboliques de type sauvage (WT), inductible podocyte spécifiques VEGF-A knock out (VEGF-A KO) et la VEGF-A KO X Neph-VEGF165b souris (souris VEGF-A KO qui surexpriment l’isoforme b de humaine VEGF-A165dans les podocytes dans un manière constitutive). À la mesure de la créatinine urinaire d’albumine aux semaines 0, 4, 10 et 14 après l’induction de la doxycycline de VEGF-A KO, KO VEGF-A souris ont développé albuminurie progressive de 10 semaines par rapport aux témoins de même portée WT. Les valeurs absolues sont visibles dans la Figure 2 aet le normalisé à la base de valeurs de chaque souris Figure2 b. Cependant, albuminurie dans pas observé chez les souris de b165VEGF-A X Neph-VEGF-A (Figure 2), indiquant que de VEGF-A165b assure une protection dans le modèle de l’albuminurie5.

Le glomérulaire LpAVj’ai a été mesurée dans les glomérules individuels tamisés de WT, VEGF-A KO et VEGF-A X Neph-VEGF-A165b reins. Un exemple de comment un glomérule est interceptée et le rétrécissement observé lorsque perfusées avec 8 % de BSA sont indiquée dans la Figure 3 a. Ce retrait est ensuite utilisé pour déterminer la glomérulaire LpA / Vj’ai pour chaque glomérule (Figure 3 b). Souris KO VEGF-A eu une augmentation significative glomérulaire LpA / V j’à 14 semaines après induction de VEGF-KO par rapport aux glomérules contrôle WT. Bien que plus faible chez les souris de VEGF-A X Neph-VEGF-A165b, l’augmentation glomérulaire LpA / Vj’ai ne était pas empêché par la surexpression du VEGF-A165b à 14 semaines5.

PAS la coloration des parties du cortex rénal 14 semaines après l’induction de VEGF-A KO n’a révélé aucune anomalies structurelles glomérulaires chez le VEGF-A KO ou VEGF-A X Neph-VEGF-A165b (Figure 4 a). Cependant, après une analyse de la structure ultra glomérulaire par EM, souris KO VEGF-A avaient développé une largeur accrue de GBM, a diminué le nombre de perforations endothéliales, a diminué de couverture SPS et augmenté podocyte moyenne largeur de fente (Figure 4-4F ). Le pied moyen podocyte traite largeur et nombre de fentes est demeurée inchangée (Figure 3 b et 3 G). La surexpression du VEGF-A165b chez les souris KO VEGF-A empêche les changements sur le GBM et fente de largeur (Figure 4 et 4F). Cependant, VEGF-A165b a eu aucun effet sur le nombre de perforations altérée et le SPS couverture (Figure 4 et 4E)5.

RT-PCR effectuée sur l’ARN extrait de glomérules tamisées a révélé que le VEGF-A165b humaine ARNm n’est présent que chez les souris de b165VEGF-A KO X Neph-VEGF-A (Figure 5 a). Lors de l’extraction protéique de glomérules tamisées et d’évaluer les niveaux de protéines par Western Blot, l’expression de la protéine glomérulaire du VEGFR-2 s’est avérée être tombée chez la souris KO VEGF-A, qui a été empêché par la surexpression du VEGF-A165b ( Figure 5 b et 5c)5.

Figure 1
La figure 1. Diagrammatique mise en place de la plate-forme de la perméabilité glomérulaire (LpA). (A) le glomérule est interceptée sur (B) la micropipette dans un support à l’aide de succion, qui est fixé sur une monture pour la stabilité. (C) rectangulaire micro-lames. (D) les objectif 4 X d’un microscope avec une caméra vidéo. (E) solution à 1 % BSA chauffé à 37 ° C. (F) 8 % solution de BSA chauffé à 37 ° C. (G) Remote tap portant deux lignes contenant périfusées, permettant l’échange rapide périfusées. (H) Route de périfusées vers des micro-lames, qui baigne ensuite le glomérule. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Créatinine urinaire d’albumine. (A) les valeurs d’uACR aux semaines 0, 4, 10 et 14 après l’induction de VEGF-A KO chez WT, VEGF-A KO et VEGF-A X Neph-VEGF-A165b. (B) les mêmes valeurs uACR normalisés à la valeur de base (semaine 0) de chaque souris individuels. L’uACR a notablement augmenté chez les souris VEGF-A KO aux semaines 10 et 14 par rapport aux témoins WT de même portée, qui n’a pas pu chez les souris de b VEGF-A X Neph-VEGF-A165(* p < 0,05 ; ANOVA bidirectionnelle, correction pour la comparaison entre les paires ; n = 4-12 souris par point dans le temps ; barres d’erreur : erreur-type de la moyenne [SEM]). Ce chiffre a été modifié par Stevens et al.5. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Mesure de la perméabilité glomérulaire. (A) le glomérule est pris sur la micropipette par aspiration ; la périfusées sont passée de 1 % de BSA (IA) à 8 % de BSA (Aii), et on observe une rétraction glomérulaire. (B) les mesures prises avant et après le passage de BSA 8 % servent à déterminer la glomérulaire LpA / Vj’ai. (C) VEGF-A KO souris développent une augmentation glomérulaire LpA / V j’à 14 semaines après induction de VEGF-A KO par rapport aux témoins WT. Cela n’empêche pas significativement chez les souris de VEGF-A X Neph-VEGF-A165b (* p < 0,05 ; Aller simple ANOVA, correction de Bonferroni pour comparaison entre paires ; n = 4-9 souris, 15-30 glomérules ; barres d’erreur : SEM). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4. Analyse structurale glomérulaire. (A) PAS de coloration du cortex rénal n’a pas indiqué toutes les anomalies structurales dans les glomérules, les souris de b165WT, VEGF-A KO et VEGF-A X Neph-VEGF-A (Ai - iii). EM a révélé des anomalies ultra-structurale dans les glomérules VEGF-A KO (Aiv - vi). (B) la moyenne FPW n’a pas changé entre les groupes. (C) le GBM a augmenté dans les glomérules KO VEGF-A, qui a été empêché par le VEGF-A165b. (D) le nombre de fenêtres est diminué dans les glomérules KO VEGF-A, qui est resté inchangés de VEGF-A165b. couverture de la SPS (E) a été diminué en glomérules KO VEGF-A, qui est également resté inchangés de VEGF-A165b. (F) la moyenne largeur de fente a été augmentée dans les glomérules KO VEGF-A, qui a été empêché par le VEGF-A165b. (G) le nombre de fente est demeurée inchangé entre les trois groupes (* p < 0,05 ; Aller simple ANOVA, correction de Bonferroni pour comparaison entre paires ; n = 3 souris, 9 glomérules ; barres d’erreur : SEM). Ce chiffre a été modifié par Stevens et al.5. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5. expression ARNm et de protéines de marqueurs. (A) RT-PCR a montré qu’expression de l’ARNm humaine VEGF-A165b n’était évidente dans les glomérules tamisées de souris de VEGF-A KO X Neph-VEGF-A165b. (B) Western Blot a indiqué que VEGFR-2 expression de la protéine était diminuées dans les glomérules VEGF-A KO, qui n’a pas pu en glomérules de VEGF-A KO X Neph-VEGF-A165b (* p < 0,05 ; Aller simple ANOVA, correction de Bonferroni pour comparaison entre paires ; n = 3 - 6 souris ; barres d’erreur : SEM). Ce chiffre a été modifié par Stevens et al.5. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

Ce protocole décrit une marche à suivre complète rein qui devrait être effectué dans des modèles murins de la maladie glomérulaire, permettant une grande quantité d’informations au sujet de rein et de la fonction glomérulaire à provenir d’une seule souris. Les étapes critiques de chaque méthode permettant l’analyse fonctionnelle et structurelle mécaniste détaillée de la fonction glomérulaire, y compris l’évaluation de la perméabilité des reins dans son ensemble (mesures d’uACR et plasmatique créatinine), la perméabilité des les glomérules (glomérulaire LpA / Vj’ai), examen des altérations structurales (Fe, Trichrome bleu et EM), localisation des protéines (IF) et l’expression des gènes glomérulaire (RT-PCR et Western Blot). Ces méthodes sont essentielles pour l’évaluation complète de la fonction glomérulaire dans des modèles murins de la maladie rénale.

Lors de l’évaluation de la perméabilité du GFB, de nombreuses études ont choisi d’utiliser le taux de l’excrétion d’albumine uACR ou 24h classique comme une mesure efficace17,18. Ces techniques permettent l’évaluation de la perméabilité GFB dans son ensemble, il ne permet pas pour l’évaluation de la perméabilité glomérulaire individuels et variation parmi les glomérules. Des études antérieures ont trouvé la mesure de la glomérulaire LpA / Vi une mesure plus sensible des modifications apportées à la GFB perméabilité5,9. En effet, dans les résultats représentatifs démontrés dans cet article, à 14 semaines après induction de VEGF-A KO, VEGF-A KO X Neph-VEGF-A165b souris ont présenté un uACR significativement plus faible par rapport aux souris VEGF-A KO ; Cependant, ce résultat n’est pas reflété dans le glomérulaire LpA / Vje mesures, où VEGF-A165b n’empêche pas sensiblement augmente dans le GFB perméabilité (Figure 1 et Figure 2)5. Cela montre l’importance d’utiliser plusieurs tests pour évaluer la perméabilité rénale tant la perméabilité des glomérules individuels. En outre, le glomérulaire LpA / test de V oncometricje suggère que la perméabilité des différents glomérules du rein même peut varier considérablement, en particulier la maladie modèles5,10, 19. l’une des limitations à la mesure de la glomérulaire LpA / Vj’ai est qu’il ne peut être effectuée à la fin de l’expérimentation ; ainsi, uACR régulière des mesures sont nécessaires pour donner une indication de l’effet expérimental.

En plus d’évaluer le phénotype fonctionnel, la présente méthode encourage également évaluation du phénotype structurel et ultrastructural. Cela peut être fait à l’aide d’une sélection des taches telles que PAS, trichrome et des taches argent ; chacun pour évaluer différents aspects de la morphologie glomérulaire. Dans les modèles aiguës de la maladie glomérulaire, qui est souvent le cas dans des modèles murins, est peut être difficile de détecter d’éventuelles anomalies structurelles principales à l’aide de ces taches, sauf si vous êtes un pathologiste rénal formé. Exécution de EM est donc proposé d’évaluer l’ultrastructure de GFB, qui permet la mesure quantitative des paramètres tels que le GBM, fenestrae endothéliales taille et nombre et caractéristiques podocyte. Ces mesures exigent une formation minimale à effectuer et permet au chercheur de déterminer les structures cellulaires-types/affectés à un modèle de maladie. Dans l’exemple illustré dans les résultats représentatifs, la souris VEGF-A KO a été trouvée pour être un modèle doux de la maladie glomérulaire, ainsi, aucune anomalie structurale majeure n’était présents sur le PAS de coloration. Toutefois, podocyte spécifiques VEGF-A KO n’a induit des changements pour le GBM, podocytes et les cellules endothéliales lorsqu’on examine le glomérulaire ultra-structure5. Malheureusement, la préparation du rein pour EM décrit dans la méthode actuelle ne permet pas de détecter le glycocalyx endothélial, qui est également connu pour avoir des effets significatifs sur la perméabilité du GFB19. Afin de mesurer avec précision la profondeur de glycocalyx, le rein doit être perfuse-fixés au glutaraldéhyde de 2,5 % au bleu Alcian 1 % pour l’étiquetage de glycocalyx endothéliale, comme décrit dans Oltean et al.,19.

Une fois que le phénotype fonctionnel et structurel ont été évalués, les patrons d’expression/activation de gènes différents et les voies puis évaluer plus précisément dans les glomérules. Assessment ultra-structurale préalable pourrait donner quelques informations concernant la cellule types/glomérulaire structures impliquées, indiquant si les gènes spécifiques podocyte ou endothéliales et des sentiers doivent être examinés. Par exemple, dans les résultats représentatifs des souris KO VEGF-A, une réduction du nombre de perforations endothéliales a été observée (Figure 3D) ; par conséquent, l’expression de la protéine glomérulaire d’un marqueur endothélial connu pour être impliqués dans la voie du VEGF-A a été examinée ; VEGFR-2 (Figure 4 b)5. En plus de l’expression des protéines dans les glomérules, leur localisation peut également être visualisée à l’aide de si. Dans une étude par Zhang et al.20, podocyte spécifiques surexpression de GLUT1 a été confirmée dans les podocytes par si co localisation les GLUT1 accrue avec podocin.

Par rapport aux autres méthodes présentées dans la littérature pour évaluer la fonction glomérulaire, l’utilisation de la méthode décrite dans cet article pour évaluer la fonction rénale chez les modèles murins de la maladie glomérulaire permet le phénotype glomérulaire à être pleinement évalué à partir plusieurs aspects. En utilisant cette méthode, le chercheur est en mesure de déterminer le phénotype de rein du modèle et d’évaluer le mécanisme quant à pourquoi le phénotype se développe. Cette information vitale sur le mécanisme de la maladie est requise lors de l’examen des possibilités thérapeutiques dans ces modèles. Cette méthode peut être facilement appliquée à de nouvelles études en fonction glomérulaire dans l’évaluation des phénotypes de la maladie et la thérapeutique possible.

En conclusion, ce protocole générique et adaptable décrit une marche à suivre complète rein pour modèles murins de la maladie glomérulaire, permettant une grande quantité d’informations au sujet de rein et de la fonction glomérulaire à provenir d’une seule souris. Les méthodes permettent d’analyse fonctionnelle et structurelle mécaniste détaillée de la fonction glomérulaire, qui peut être appliquée à tous les modèles murins de la maladie glomérulaire.

Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par la Fondation britannique de cardiologie, Richard Bright VEGF Research Trust et la MRC.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Metabolic Cages Harvard Apparatus 52-6731
Tris buffered saline (10x) Sigma-Aldrich T5912-1L
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A2058
Mouse Albumin ELISA Quantitation Set Bethyl Laboratories E90-134
TMB ELISA Substrate solution ThermoFisher Scientific 34028
Sulphuric acid Sigma-Aldrich 339741
SPECTRstar nano BMG Labtech SPECTRstar nano or equivalent
RNAlater stabilisation solution ThermoFisher Scientific AM7020
4-15% precast protein gel BIORAD 4568084
4x Laaemmli Sample buffer BIORAD 161-0747
Mini Trans-Blot cell BIORAD 1703930
10x Tris running buffer BIORAD 1610732
Coomassie Brilliant Blue Dye ThermoFisher Scientific 20278
Creatinine Companion Exocell 1012 Strip Plate
Glutaraldehyde Solution Sigma-Aldrich G5882
Sodium Cacodylate Sigma-Aldrich C0250
10x Phosphate Buffered Saline ThermoFisher Scientific AM9625
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S7653
Sodium Acetate Sigma-Aldrich S2889
Sodium Phosphate Sigma-Aldrich 342483
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich S5761
Magnesium Sulfate Sigma-Aldrich M2643
Calcium Chloride Sigma-Aldrich C5670
D(+)Glucose Sigma-Aldrich G8270
EDTA Blood Collection tubes BD 367835
23-25G Needle BD PMC0735
EDTA Sigma-Aldrich E9884
10 ml Glass Vial Thomas Scientific 0914X10
Falcon 10 ml Polypropylene Tubes ThermoFisher Scientific 10110101
0.5 ml Tubes ThermoFisher Scientific 10681894
Disposable Tissue Molds ThermoFisher Scientific 22-363-553
Mouse Surgical Disection Kit ThermoFisher Scientific 13-005-204
Optimal Cutting Medium ThermoFisher Scientific 23-730-571
4% Paraformaldehyde ThermoFisher Scientific AAJ19943K2
Glass Capillary Tubes Harvard Apparatus EC1 64-0770
Glomerular Permeability Rig Built at the Univeristy of Bristol - not comercially available Citation of LpA rig: Salmon et al. 2006; J. Physiol
Stainless Steel Sieves Cole-Parmer WZ-59984
Periodic Acid-Schiff (PAS) Staining System Sigma-Aldrich 395B-1KT
Hematoxylin Sigma-Aldrich H3136
Xylene MerckMillipore 108298
Poly-Prep Slides Sigma-Aldrich P0425-72EA
Mounting Medium ThermoFisher Scientific 8030
Osmium tetroxide solution Sigma-Aldrich 75632
Aradite Resin Agar Scientific CY212
Uranyl Acetate Agar Scientific AGR1260A
Lead Citrate Agar Scientific AGR1210
Cryostat ThermoFisher Scientific e.g. 957000H
Hydrophobic Pen Abcam ab2601
Nephrin (1243-1256) Antibody Acris BP5030
Anti-Podocin Sigma-Aldrich P0372-200UL
Anti-CD31 BD Biosciences 550274
Alexa Fluor Secondary Antibody ThermoFisher Scientific A32732
Vectashield Mounting Medium with DAPI Vector Labs H-1200
NP40 Cell Lysis Buffer ThermoFisher Scientific FNN0021
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail ThermoFisher Scientific 78437X4
10x Transfer Buffer BIORAD 1610734
PVDF Membrane ThermoFisher Scientific LC2002
HRP-Conjugated Secondary Antibodies Abcam ab6721
ECF Substrate for Western Blotting Fisher 10713387
TRIzol ThermoFisher Scientific 15596018
Dnase I New England Biolabs M0303S
M-MLV Reverse Transcriptase New England Biolabs M053S
Oligo dT ThermoFisher Scientific 18418012
Random Primers ThermoFisher Scientific 48190011
dNTP ThermoFisher Scientific 18427088
Ribonuclease Inhibitor ThermoFisher Scientific 10777019
DEPC Water ThermoFisher Scientific AM9915G
Fluorescent Light Miscroscope Leica Microsystems
Image J Analysis Software Image J
PCR Thermocycler ThermoFisher Scientific
TEM Microscope Britannica

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References

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Médecine numéro 136 phénotype glomérulaire modèles murins de la maladie rénale perméabilité glomérulaire ultra-structure glomérulaire mécanismes de la fonction glomérulaire VEGF-A
Évaluation de la fonction rénale chez les modèles murins de la maladie glomérulaire
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Stevens, M., Oltean, S. Assessment… More

Stevens, M., Oltean, S. Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease. J. Vis. Exp. (136), e57764, doi:10.3791/57764 (2018).

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