Denne protokollen beskriver en full nyre arbeidet opp som skal utføres i musen modeller av glomerular sykdom. Metodene gir detaljert funksjonelle, strukturelle og mekanistisk analyse av glomerular-funksjonen, som kan brukes på alle musen modeller av glomerular sykdom.
Bruk av murine modeller å etterligne menneskelige nyresykdom er stadig mer vanlig. Vår forskning er fokusert på vurderingen av glomerular funksjonen i diabetiker nephropathy og podocyte-spesifikke VEGF-en bank-out mus; Derfor beskriver denne protokollen full nyre arbeid-opp brukes i vår lab til å vurdere disse musen modeller av glomerular sykdom, slik at en stor mengde informasjon om nyre og glomerular funksjonen skal hentes fra et enkelt museklikk. I forhold til alternative metoder i litteraturen å vurdere glomerular funksjonen, kan bruk av metoden beskrevet i dette dokumentet glomerular fenotypen evalueres fullt fra flere aspekter. På denne måten, kan forskeren bestemme nyre fenotypen av modellen og vurdere mekanisme som hvorfor fenotypen utvikler. Denne viktige informasjonen på mekanismen av sykdommen er nødvendig når undersøke potensielle terapeutiske avenyene i disse modellene. Metodene tillater detaljert funksjonelle vurdering av glomerular filtrering barrieren gjennom måling av urin albumin creatinine forholdet og personlige glomerular vann permeabilitet, samt både strukturelle og ultra strukturelle undersøkelse ved hjelp av periodiske Acid Schiff flekken og elektronmikroskop. Videre kan analyse av gener dysregulated på mRNA og protein mekanistisk analyse av glomerular funksjonen. Denne protokollen skisserer generiske men tilpasningsdyktige metodene som kan brukes på alle musen modeller av glomerular sykdom.
Bruk av murine modeller å etterligne menneskelige nyresykdom er stadig mer vanlig. Slike murine modeller inkluderer spontan modeller som spontant Hypertensiv rotter (SHR)1, streptozotocin (STZ)-indusert diabetiker rotter og mus2og db/db type II diabetiker mus3, genmodifiserte modeller som primære podocyte-spesifikke fokal Segmentinformasjon glomerular sklerose (FSGS) modeller4, den podocyte-spesifikke vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF A) knock-out (VEGF-A KO) modell5, og Alport syndrom modeller6, og kjøpt modeller som 5/6 nephrectomy7 og ensidig ureteral hindringen (UUO) modell8. Det finnes flere teknikker for å vurdere de ulike aspektene av glomerular funksjonen i disse modellene. Formålet med utredningen metoden er å vise en omfattende arbeidet opp som skal utføres i musen modeller av nyresykdom for å fullt ut vurdere glomerular funksjon.
Begrunnelsen bak bruken av denne metoden er at den lar glomerular fenotypen evalueres fullt fra flere aspekter. Dette inkluderer vurdere glomerular permeabilitet, både protein og vann, glomerular strukturelle unormalt og endringer i uttrykk/skjøting av mRNAs og proteiner viktig for normal glomerular funksjon. På denne måten, er forskeren kjøpedyktig avgjøre nyre fenotypen av modellen og vurdere mekanisme som hvorfor fenotypen utvikler. Dette er viktig informasjon på mekanismen av sykdom, som kreves når undersøke potensielle terapeutiske avenyene i disse modellene.
I litteraturen er det en vanlig foreteelse presenteres med en musemodell av glomerular sykdom der fenotypen bestemmes av et forhøyet nivå av albumin i urinen. Men er det bevis som tyder på at en enkel metode for å bestemme glomerular funksjon ikke er alltid effektiv; måle urin albumin utskillelse hastigheten eller urin albumin creatinine forholdet (uACR) bare gir informasjon på totalt nyre-funksjon, og ikke av de individuelle glomeruli. Tidligere studier har vist at permeabilitet kan variere i ulike glomeruli fra samme nyre5,9,10. I tillegg er vurdering av permeabilitet av personlige glomeruli mer følsom måte vurdere glomerular funksjon; teknikken å måle personlige glomerular vann permeabilitet (LpA / Vjeg) har vist seg for å være mer følsomme for endringer i glomerular funksjon enn måle uACR9. Denne analysen er nyttig i musen modeller som er resistente mot proteinuria, slik som de på en c57BL/6 bakgrunn11. Fordelen med denne metoden utredningen er at den undersøker både totale nyre permeabilitet til albumin samt individuelle glomerular permeabilitet til vann.
Undersøkelse av glomerular strukturelle unormalt vurderes ofte av et batteri av flekker som periodisk Acid Schiff (PAS), trichrome, og sølv flekker. Dette aktiverer en utdannet nyre patologen å evaluere nyresykdom via en scoring metode. Selv om alle gode metoder, endringer i glomerular makro-strukturen ikke er alltid observert i modeller akutt nyre skader12. Denne metoden foreslår at i tillegg til å utføre nyre histology teknikkene ovenfor, glomerular ultra-strukturen bør også vurderes via elektronmikroskop (EM). En farget glomerulus kan se relativt normalt under vanlig lys mikroskop; men på vurderingen EM, små endringer i glomerular kjeller membran (GBM) bredde, er podocyte foten prosessen effacement endotelial fenestrations og sub-podocyte plass dekningen analysert. Derfor er det viktig at både glomerular ultra-struktur og mikro-strukturen er vurdert for å avgjøre mekanismen av glomerular dysfunksjon.
I tillegg til å vurdere glomerular strukturelle unormalt, bør endringer i mRNA protein uttrykk og skjøting, samt protein Aktivisering (f.eks, fosforylering) undersøkes for å belyse ytterligere mekanismer av glomerular sykdom. Når du ser på glomerular sykdom, eller, for eksempel når KO/over-expressing et gen spesielt i glomerular celler, som podocyte-spesifikke VEGF-A KO musen5, er det viktig at protein og mRNA endringene er undersøkt bare innenfor den glomerular celler, og ikke hele nyrene. Denne protokollen beskriver en metode der glomeruli er isolert fra mus nyre cortex, og protein/RNA er isolert. Dette gir bestemte analyse av protein/mRNA feilregulering i glomeruli av sykdom modell.
Denne protokollen beskriver en full nyre arbeidet opp som skal utføres i musen modeller av glomerular sykdom, slik at en stor mengde informasjon om nyre og glomerular funksjonen skal hentes fra et enkelt museklikk. Metodene gir detaljert funksjonelle, strukturelle og mekanistisk analyse av glomerular-funksjonen, som kan brukes på alle musen modeller av glomerular sykdom.
Denne protokollen beskriver en full nyre arbeidet opp som skal utføres i musen modeller av glomerular sykdom, slik at en stor mengde informasjon om nyre og glomerular funksjonen skal hentes fra et enkelt museklikk. Kritisk trinnene i hver metode tillate detaljert funksjonelle, strukturelle og mekanistisk analyse av glomerular-funksjonen, inkludert vurdering av permeabilitet av nyrene som helhet (uACR og plasma creatinine målinger), permeabilitet av Personlige glomeruli (glomerular LpA / Vjeg), undersøkelse av strukturelle endringer (PAS Trichrome blå og EM), protein lokalisering (hvis) og glomerular genuttrykk (RT PCR og vestlige blotting). Disse metodene er nøkkelen til full vurdering av glomerular-funksjonen i musen modeller av nyre sykdom.
Når vurdere permeabilitet av GFB, har mange studier valgt for å bruke konvensjonelle uACR eller 24 h albumin utskillelse hastigheten som et effektivt tiltak17,18. Selv om disse teknikkene tillater vurdering av GFB permeabilitet som helhet, tillater den ikke for individuelle glomerular permeabilitet vurdering og variasjon blant glomeruli. Tidligere studier har funnet måling av glomerular LpA / Vjeg å være litt mer følsomme for den GFB permeabilitet5,9. Faktisk, i representative resultatene i dette papiret, på 14 uker innlegg induksjon av VEGF-A KO, VEGF-A KO X Neph-VEGF-A165b mus har en betydelig lavere uACR sammenlignet med VEGF-A KO mus; men dette resultatet er ikke reflektert i glomerular LpA / Vjeg målinger, hvor VEGF-en165b ikke hindre betydelig øker i GFB permeabilitet (figur 1 og figur 2)5. Dette viser viktigheten av å bruke flere analyser for å vurdere både nyre permeabilitet og permeabilitet av personlige glomeruli. Videre glomerular LpA / Vjeg oncometric analysen antyder at permeabilitet av personlige glomeruli fra samme nyre kan variere sterkt, spesielt i sykdom modeller5,10, 19. en begrensning å måle glomerular LpA / Vjeg er at det kan bare utføres på den eksperimentelle end-point; vanlige uACR mål må derfor gi en indikasjon på den eksperimentelle sluttpunktet.
I tillegg til å vurdere funksjonelle fenotypen, oppfordrer metoden finnes også vurdering av strukturelle og ultrastructural fenotypen. Dette kan gjøres ved hjelp av et utvalg av flekker som PAS, trichrome, og sølv flekker; hver å vurdere ulike aspekter av glomerular morfologi. I akutt modeller av glomerular sykdom, som ofte er tilfelle i musen modeller, kan være vanskelig å oppdage noe store strukturelle unormalt bruker disse flekker med mindre du er en utdannet nyre patologen. Derfor er gjennomfører EM foreslått for å vurdere ultrastructure av GFB, hvilke innrømmer kvantitativ måling av parametere som GBM, endotelial fenestrae størrelse og antall og podocyte egenskaper. Slik mål krever minimal opplæring til å utføre og gir etterforskeren å finne celle-typer/strukturer påvirket på en sykdom modell. I eksemplet som vises i representant resultatene VEGF-A KO musen ble funnet å være en mild modell av glomerular sykdom, dermed var ingen store strukturelle forandringer tilstede ved PAS flekker. Podocyte-spesifikk VEGF-A KO imidlertid indusere endringer i GBM, podocytes og endotelceller når undersøke glomerular ultra-struktur5. Utarbeidelse av nyre for EM beskrevet i stede metoden aktiverer dessverre ikke påvisning av endotelial glycocalyx, som også er kjent å ha viktige effekter på permeabilitet av GFB19. For å måle glycocalyx dybden, bør nyre være perfuse-fast med 2,5% glutaraldehyde med 1% Alcian blå for endotelial glycocalyx merking, som beskrevet i Oltean et al19.
Når funksjonelle og strukturelle fenotypen har blitt vurdert, kan deretter uttrykk/aktivisering mønstre av ulike gener og veier vurderes spesielt i glomeruli. Tidligere ultra strukturelle vurdering kan gi noen informasjon om cellen typer/glomerular strukturer involvert, som angir om podocyte – eller endothelial-spesifikk gener/veier bør undersøkes. For eksempel i representant resultatene fra VEGF-A KO musene, ble en reduksjon i hvor endotelial fenestrae observert (figur 3D); Derfor ble glomerular protein uttrykk for en endothelial markør kjent være involvert i VEGF-en veien undersøkt; VEGFR-2 (figur 4B)5. I tillegg til uttrykket av proteiner i glomeruli, kan deres lokalisering også visualiseres med hvis. I en studie av Zhang et al20, ble podocyte-spesifikke overuttrykte GLUT1 bekreftet i podocytes av hvis co lokalisere den økte GLUT1 med podocin.
I forhold til alternative metoder i litteraturen å vurdere glomerular funksjonen, gjør bruk av metoden skissert i denne utredningen å vurdere nyrefunksjon i musen modeller av glomerular sykdom glomerular fenotypen evalueres fullt fra flere aspekter. På denne måten, er forskeren kjøpedyktig avgjøre nyre fenotypen av modellen og vurdere mekanisme som hvorfor fenotypen utvikler. Denne viktige informasjonen på mekanismen av sykdommen er nødvendig når undersøke potensielle terapeutiske avenyene i disse modellene. Denne metoden kan lett brukes på fremtidige etterforskning glomerular funksjonen både i vurderingen av sykdom fenotyper og potensielle therapeutics.
Avslutningsvis beskriver denne generiske og tilpasningsdyktig protokollen en full nyre arbeidet opp for musen modeller av glomerular sykdom, slik at en stor mengde informasjon om nyre og glomerular funksjonen skal hentes fra et enkelt museklikk. Metodene gir detaljert funksjonelle, strukturelle og mekanistisk analyse av glomerular-funksjonen, som kan brukes på alle musen modeller av glomerular sykdom.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av British Heart Foundation, Richard Bright VEGF Research Trust og MRC.
Metabolic Cages | Harvard Apparatus | 52-6731 | |
Tris buffered saline (10x) | Sigma-Aldrich | T5912-1L | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2058 | |
Mouse Albumin ELISA Quantitation Set | Bethyl Laboratories | E90-134 | |
TMB ELISA Substrate solution | ThermoFisher Scientific | 34028 | |
Sulphuric acid | Sigma-Aldrich | 339741 | |
SPECTRstar nano | BMG Labtech | SPECTRstar nano or equivalent | |
RNAlater stabilisation solution | ThermoFisher Scientific | AM7020 | |
4-15% precast protein gel | BIORAD | 4568084 | |
4x Laaemmli Sample buffer | BIORAD | 161-0747 | |
Mini Trans-Blot cell | BIORAD | 1703930 | |
10x Tris running buffer | BIORAD | 1610732 | |
Coomassie Brilliant Blue Dye | ThermoFisher Scientific | 20278 | |
Creatinine Companion | Exocell | 1012 Strip Plate | |
Glutaraldehyde Solution | Sigma-Aldrich | G5882 | |
Sodium Cacodylate | Sigma-Aldrich | C0250 | |
10x Phosphate Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | AM9625 | |
Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
Sodium Phosphate | Sigma-Aldrich | 342483 | |
Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M2643 | |
Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | |
D(+)Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
EDTA Blood Collection tubes | BD | 367835 | |
23-25G Needle | BD | PMC0735 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
10 ml Glass Vial | Thomas Scientific | 0914X10 | |
Falcon 10 ml Polypropylene Tubes | ThermoFisher Scientific | 10110101 | |
0.5 ml Tubes | ThermoFisher Scientific | 10681894 | |
Disposable Tissue Molds | ThermoFisher Scientific | 22-363-553 | |
Mouse Surgical Disection Kit | ThermoFisher Scientific | 13-005-204 | |
Optimal Cutting Medium | ThermoFisher Scientific | 23-730-571 | |
4% Paraformaldehyde | ThermoFisher Scientific | AAJ19943K2 | |
Glass Capillary Tubes | Harvard Apparatus | EC1 64-0770 | |
Glomerular Permeability Rig | Built at the Univeristy of Bristol – not comercially available | Citation of LpA rig: Salmon et al. 2006; J. Physiol | |
Stainless Steel Sieves | Cole-Parmer | WZ-59984 | |
Periodic Acid-Schiff (PAS) Staining System | Sigma-Aldrich | 395B-1KT | |
Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H3136 | |
Xylene | MerckMillipore | 108298 | |
Poly-Prep Slides | Sigma-Aldrich | P0425-72EA | |
Mounting Medium | ThermoFisher Scientific | 8030 | |
Osmium tetroxide solution | Sigma-Aldrich | 75632 | |
Aradite Resin | Agar Scientific | CY212 | |
Uranyl Acetate | Agar Scientific | AGR1260A | |
Lead Citrate | Agar Scientific | AGR1210 | |
Cryostat | ThermoFisher Scientific | e.g. 957000H | |
Hydrophobic Pen | Abcam | ab2601 | |
Nephrin (1243-1256) Antibody | Acris | BP5030 | |
Anti-Podocin | Sigma-Aldrich | P0372-200UL | |
Anti-CD31 | BD Biosciences | 550274 | |
Alexa Fluor Secondary Antibody | ThermoFisher Scientific | A32732 | |
Vectashield Mounting Medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
NP40 Cell Lysis Buffer | ThermoFisher Scientific | FNN0021 | |
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail | ThermoFisher Scientific | 78437X4 | |
10x Transfer Buffer | BIORAD | 1610734 | |
PVDF Membrane | ThermoFisher Scientific | LC2002 | |
HRP-Conjugated Secondary Antibodies | Abcam | ab6721 | |
ECF Substrate for Western Blotting | Fisher | 10713387 | |
TRIzol | ThermoFisher Scientific | 15596018 | |
Dnase I | New England Biolabs | M0303S | |
M-MLV Reverse Transcriptase | New England Biolabs | M053S | |
Oligo dT | ThermoFisher Scientific | 18418012 | |
Random Primers | ThermoFisher Scientific | 48190011 | |
dNTP | ThermoFisher Scientific | 18427088 | |
Ribonuclease Inhibitor | ThermoFisher Scientific | 10777019 | |
DEPC Water | ThermoFisher Scientific | AM9915G | |
Fluorescent Light Miscroscope | Leica Microsystems | ||
Image J Analysis Software | Image J | ||
PCR Thermocycler | ThermoFisher Scientific | ||
TEM Microscope | Britannica |