Det här protokollet beskriver en full njure arbete-up som bör utföras i musmodeller av glomerulär sjukdom. Metoderna som möjliggör detaljerad funktionella, strukturella och mekanistiska analys av glomerulär funktion, som kan tillämpas på alla musmodeller av glomerulär sjukdom.
Användningen av murina modeller att efterlikna mänskliga njursjukdom blir allt vanligare. Vår forskning är inriktad på bedömning av glomerulär funktion i diabetisk nefropati och podocyte-specifika VEGF-A knock-out möss; Det här protokollet beskriver därför full njure arbete-upp används i vårt labb för att bedöma dessa mus-modeller av glomerulär sjukdom, möjliggör en stor mängd information om njur- och glomerulär funktion som kan uppnås genom ett enda musklick. I jämförelse med alternativa metoder som presenteras i litteraturen att bedöma glomerulär funktion, ger användningen av den metod som anges i detta dokument den glomerulära fenotypen utvärderas fullständigt från flera aspekter. Genom att använda denna metod kan forskaren avgöra njure fenotypen av modellen och bedöma mekanismen om varför fenotypen utvecklar. Denna viktiga information på mekanismen av sjukdom krävs när man undersöker potentiella terapeutiska vägar i dessa modeller. Metoderna som möjliggör detaljerad funktionell bedömning av den glomerulära barriären genom mätning av den urin albumin kreatininclearance baserat och enskilda glomerulär vattengenomsläpplighet, samt både strukturella och Ultra strukturella undersökning med hjälp av Perjodsyra-Schiff fläcken och elektronmikroskopi. Dessutom möjliggör analys av de gener dysreglerad på mRNA och protein nivå mekanistiska analys av glomerulär funktion. Detta protokoll beskriver de generiska men anpassningsbara metoder som kan tillämpas på alla musmodeller av glomerulär sjukdom.
Användningen av murina modeller att efterlikna mänskliga njursjukdom blir allt vanligare. Sådan murina modeller inkluderar spontan modeller såsom spontant hypertensiva råttor (SHR)1, streptozotocin (STZ)-inducerad diabetiska råttor och möss2och db/db typ II diabetiker möss3, genetiskt modifierade modeller såsom primär podocyte-specifika fokal segmentell glomerulär skleros (FSGS) modeller4, den podocyte-specifika vaskulär endotelial tillväxtfaktorn (VEGF-A) knock-out (VEGF-A KO) modell5, och Alport syndrom modeller6, och förvärvade modeller såsom den 5/6 nefrektomi7 och den ensidiga uretär obstruktion (UUO) modell8. För att bedöma olika aspekter av glomerulär funktion i dessa modeller, finns flera tekniker tillgängliga. Syftet med denna metod papper är att visa en omfattande arbete-up som bör utföras i musmodeller av njursjukdom för att fullt ut bedöma glomerulär funktion.
Logiken bakom denna metod är att det möjliggör den glomerulära fenotypen utvärderas fullt ur flera aspekter. Detta inkluderar bedömning av glomerulär permeabilitet, både protein och vatten, glomerulär strukturella avvikelser och förändringar i den uttryck/skarvning av mRNA och proteiner viktiga för normal glomerulär funktion. Genom att använda denna metod är forskaren kunna avgöra njure fenotypen av modellen och bedöma mekanismen om varför fenotypen utvecklar. Detta är viktig information om mekanismen av sjukdom, som krävs när man undersöker potentiella terapeutiska vägar i dessa modeller.
I litteraturen är det vanligt att presenteras med en musmodell av glomerulär sjukdom där fenotypen bestäms av en ökad nivå av albumin i urinen. Det finns dock tecken som tyder på att en enda metod för att bestämma glomerulär funktion inte är alltid effektivt. mäta andelen urin albumin utsöndring eller urinvägar albumin kreatinin kvoten (uACR) endast ger information på totala njurfunktionen, och inte de enskilda glomeruli. Tidigare studier har visat att permeabiliteten kan variera i olika glomeruli från samma njure5,9,10. Bedömning av permeabiliteten av enskilda glomeruli är dessutom ett känsligare sätt att utvärdera glomerulär funktion; tekniken att mäta de enskilda glomerulär vattengenomsläpplighet (LpA / Vjag) har visat sig vara mer känslig för förändringar i glomerulär funktion än mätning uACR9. Denna analys är fördelaktigt i musmodeller som är resistenta mot proteinuri, såsom de på en c57BL/6 bakgrunden11. Fördelen med det nuvarande metoden papperet är att det undersöker både totala nedsatt permeabilitet till albumin samt enskilda glomerulär permeabilitet för vatten.
Undersökning av glomerulär strukturella avvikelser bedöms ofta av ett batteri av fläckar såsom Perjodsyra Schiff (PAS), trikrom, och silver fläckar. Dessa möjliggör en utbildad nedsatt patolog att utvärdera nivån på njursjukdom via en Poängmetod. Även om alla bra metoder, förändringar i glomerulär makro-strukturen inte alltid iakttas i modeller akut njurskada12. Denna metod föreslår att utöver nedsatt histologi metoder som beskrivs ovan, bör glomerulär ultra-strukturen också bedömas via elektronmikroskopi (EM). En betsad glomeruli kan se relativt normalt under ett vanligt ljusmikroskop; dock vid bedömning med EM, små förändringar i den glomerulära basalmembranet (GBM) bredden, analyseras podocyte fot processen utplåning, endothelial fenestrations och sub-podocyte utrymme täckningen. Därför är det viktigt att både glomerulär ultra-struktur och mikrostruktur utvärderas för att bestämma mekanismen av glomerulär dysfunktion.
Förutom att bedöma glomerulär strukturella avvikelser, bör förändringar i mRNA och proteinuttryck och skarvning, samt protein aktivering (t.ex., fosforylering), undersökas för att ytterligare belysa mekanismerna av glomerulär sjukdom. När man tittar på glomerulär sjukdom, eller, till exempel när KO/över-expressing en gen specifikt i glomerulära celler, såsom i den podocyte-specifika VEGF-A KO mus5, är det viktigt att protein och mRNA ändringarna undersöks endast inom den glomerulära celler, och inte hela njuren. Det här protokollet beskriver en metod där glomeruli är isolerade från mus njure cortex, och sedan protein/RNA isoleras. Detta tillåter särskild analys av den protein/mRNA dysreglering i glomeruli av sjukdom modell.
Det här protokollet beskriver en full njure arbete-up som bör utföras i musmodeller av glomerulär sjukdom, möjliggör en stor mängd information om njur- och glomerulär funktion som kan uppnås genom ett enda musklick. Metoderna som möjliggör detaljerad funktionella, strukturella och mekanistiska analys av glomerulär funktion, som kan tillämpas på alla musmodeller av glomerulär sjukdom.
Det här protokollet beskriver en full njure arbete-up som bör utföras i musmodeller av glomerulär sjukdom, möjliggör en stor mängd information om njur- och glomerulär funktion som kan uppnås genom ett enda musklick. De kritiska steg i varje metod möjliggör detaljerad funktionella, strukturella och mekanistiska analys av glomerulär funktion, inklusive bedömning av permeabiliteten i njurarna som helhet (uACR och plasma kreatinin mätningar), permeabiliteten i enskilda glomeruli (glomerulär LpA / Vjag), undersökning av strukturella förändringar (PAS, Trichrome blå och EM), protein lokalisering (om), och glomerulär genuttryck (RT-PCR och Western blotting). Dessa metoder är nyckeln till den fullständiga utvärderingen av glomerulär funktion i musmodeller av njursjukdom.
Vid bedömningen av permeabiliteten i GFB, har många studier valt för att använda den konventionella uACR eller 24 h albumin utsöndring kursen som en effektiv åtgärd17,18. Även om dessa tekniker tillåter bedömning av GFB permeabilitet som helhet, tillåter det inte för enskilda glomerulär permeabilitet bedömning och variation bland glomeruli. Tidigare studier har hittat mätning av den glomerulära LpA / Vi att vara ett känsligare mått på förändringar till GFB permeabilitet5,9. Faktiskt, i de representativa resultat visat i detta papper, på 14 veckor post induktion av VEGF-A KO, VEGF-A KO X Neph-VEGF-A165b möss har en betydligt lägre uACR jämfört med VEGF-A KO möss; men detta resultat inte återspeglas i den glomerulära LpA / Vjag mätningar, där VEGF-A165b betydligt inte hindrade ökar i GFB permeabilitet (figur 1 och figur 2)5. Detta visar vikten av att använda flera analyser för att bedöma både njure permeabilitet och genomträngligheten av enskilda glomeruli. Dessutom den glomerulära LpA / Vjag oncometric analysen antyder att permeabiliteten av enskilda glomeruli från samma njuren kan variera kraftigt, särskilt i sjukdom modeller5,10, 19. en begränsning till mätning av glomerulär LpA / Vjag är att den endast kan utföras på experimentell slutpunkten; regelbundna uACR mätningar måste således ge en indikation av experimentella slutpunkten.
Förutom att bedöma funktionella fenotypen, uppmuntrar denna metod också bedömning av strukturella och ultrastrukturella fenotypen. Detta kan göras med hjälp av ett urval av fläckar som PAS, trikrom, och silver fläckar; var och en att bedöma olika aspekter av glomerulär morfologi. I akut modeller av glomerulär sjukdom, som ofta är fallet i musmodeller, kan vara svårt att upptäcka eventuella stora strukturella avvikelser med dessa fläckar om du är en utbildad nedsatt patolog. Därför föreslås genomför EM för att bedöma ultrastruktur av den GFB, som tillåter kvantitativ mätning av parametrar såsom GBM, endothelial fenestrae storlek och antal och podocyte egenskaper. Sådana mätningar kräver minimal utbildning för att utföra och gör utredaren att avgöra de cell-typer/strukturer påverkas i en sjukdom modell. I exemplet som visas i de representativa resultat, VEGF-A KO musen konstaterades vara en mild modell av glomerulär sjukdom, således var inga stora strukturella avvikelser närvarande vid PAS färgning. Dock inducerade podocyte-specifika VEGF-A KO förändringar till GBM, podocytes och endotelceller vid prövningen av den glomerulära ultra-struktur5. Utarbetandet av njuren för EM som beskrivs i denna metod kan tyvärr inte upptäckt av den endothelial glykokalyx, som också är känd att ha betydande effekter på permeabilitet av GFB19. För att noggrant mäta glykokalyx djupet, bör njurarna BEGJUTA-fast med 2,5% glutaraldehyd med 1% Alcian blå endothelial glykokalyx märkning, som beskrivs i Nicolae Oltean et al19.
När den funktionella och strukturella fenotypen har bedömts, kan uttryck/aktivering mönster av olika gener och vägar då bedömas särskilt i glomeruli. Ultra strukturella förhandsbedömning kan ge viss information om cellen typer/glomerulär strukturer involverade, som anger om podocyte – eller endotel-specifika gener/vägar bör undersökas. Exempelvis i representativa resultat från VEGF-A KO möss observerades en minskning av antalet endothelial fenestrae (figur 3D); Därför undersöktes glomerulär proteinuttryck för en endothelial markör kända för att vara involverade i VEGF-A väg; VEGFR-2 (figur 4B)5. Förutom att uttrycket av proteiner i glomeruli, kan deras localization också visualiseras med om. I en studie av Zhang et al20bekräftades podocyte-specifika överuttryck av GLUT1 i podocytes av om samtidig lokalisera den ökade GLUT1 med podocin.
I jämförelse med alternativa metoder som presenteras i litteraturen att bedöma glomerulär funktion, ger användningen av den metod som anges i detta dokument att bedöma njurfunktion i musmodeller av glomerulär sjukdom den glomerulära fenotypen utvärderas helt från flera aspekter. Genom att använda denna metod är forskaren kunna avgöra njure fenotypen av modellen och bedöma mekanismen om varför fenotypen utvecklar. Denna viktiga information på mekanismen av sjukdom krävs när man undersöker potentiella terapeutiska vägar i dessa modeller. Metoden kan enkelt tillämpas på framtida utredningar av glomerulär funktion både i bedömningen av sjukdom fenotyper och potentiella therapeutics.
Avslutningsvis beskriver detta generiska och anpassningsbar protokollet en full njure arbete upp för musmodeller av glomerulär sjukdom, möjliggör en stor mängd information om njur- och glomerulär funktion som kan uppnås genom ett enda musklick. Metoderna som möjliggör detaljerad funktionella, strukturella och mekanistiska analys av glomerulär funktion, som kan tillämpas på alla musmodeller av glomerulär sjukdom.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av stiftelsen brittiska hjärtat, Richard Bright VEGF forskning lita och MRC.
Metabolic Cages | Harvard Apparatus | 52-6731 | |
Tris buffered saline (10x) | Sigma-Aldrich | T5912-1L | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2058 | |
Mouse Albumin ELISA Quantitation Set | Bethyl Laboratories | E90-134 | |
TMB ELISA Substrate solution | ThermoFisher Scientific | 34028 | |
Sulphuric acid | Sigma-Aldrich | 339741 | |
SPECTRstar nano | BMG Labtech | SPECTRstar nano or equivalent | |
RNAlater stabilisation solution | ThermoFisher Scientific | AM7020 | |
4-15% precast protein gel | BIORAD | 4568084 | |
4x Laaemmli Sample buffer | BIORAD | 161-0747 | |
Mini Trans-Blot cell | BIORAD | 1703930 | |
10x Tris running buffer | BIORAD | 1610732 | |
Coomassie Brilliant Blue Dye | ThermoFisher Scientific | 20278 | |
Creatinine Companion | Exocell | 1012 Strip Plate | |
Glutaraldehyde Solution | Sigma-Aldrich | G5882 | |
Sodium Cacodylate | Sigma-Aldrich | C0250 | |
10x Phosphate Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | AM9625 | |
Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
Sodium Phosphate | Sigma-Aldrich | 342483 | |
Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M2643 | |
Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | |
D(+)Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
EDTA Blood Collection tubes | BD | 367835 | |
23-25G Needle | BD | PMC0735 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
10 ml Glass Vial | Thomas Scientific | 0914X10 | |
Falcon 10 ml Polypropylene Tubes | ThermoFisher Scientific | 10110101 | |
0.5 ml Tubes | ThermoFisher Scientific | 10681894 | |
Disposable Tissue Molds | ThermoFisher Scientific | 22-363-553 | |
Mouse Surgical Disection Kit | ThermoFisher Scientific | 13-005-204 | |
Optimal Cutting Medium | ThermoFisher Scientific | 23-730-571 | |
4% Paraformaldehyde | ThermoFisher Scientific | AAJ19943K2 | |
Glass Capillary Tubes | Harvard Apparatus | EC1 64-0770 | |
Glomerular Permeability Rig | Built at the Univeristy of Bristol – not comercially available | Citation of LpA rig: Salmon et al. 2006; J. Physiol | |
Stainless Steel Sieves | Cole-Parmer | WZ-59984 | |
Periodic Acid-Schiff (PAS) Staining System | Sigma-Aldrich | 395B-1KT | |
Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H3136 | |
Xylene | MerckMillipore | 108298 | |
Poly-Prep Slides | Sigma-Aldrich | P0425-72EA | |
Mounting Medium | ThermoFisher Scientific | 8030 | |
Osmium tetroxide solution | Sigma-Aldrich | 75632 | |
Aradite Resin | Agar Scientific | CY212 | |
Uranyl Acetate | Agar Scientific | AGR1260A | |
Lead Citrate | Agar Scientific | AGR1210 | |
Cryostat | ThermoFisher Scientific | e.g. 957000H | |
Hydrophobic Pen | Abcam | ab2601 | |
Nephrin (1243-1256) Antibody | Acris | BP5030 | |
Anti-Podocin | Sigma-Aldrich | P0372-200UL | |
Anti-CD31 | BD Biosciences | 550274 | |
Alexa Fluor Secondary Antibody | ThermoFisher Scientific | A32732 | |
Vectashield Mounting Medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
NP40 Cell Lysis Buffer | ThermoFisher Scientific | FNN0021 | |
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail | ThermoFisher Scientific | 78437X4 | |
10x Transfer Buffer | BIORAD | 1610734 | |
PVDF Membrane | ThermoFisher Scientific | LC2002 | |
HRP-Conjugated Secondary Antibodies | Abcam | ab6721 | |
ECF Substrate for Western Blotting | Fisher | 10713387 | |
TRIzol | ThermoFisher Scientific | 15596018 | |
Dnase I | New England Biolabs | M0303S | |
M-MLV Reverse Transcriptase | New England Biolabs | M053S | |
Oligo dT | ThermoFisher Scientific | 18418012 | |
Random Primers | ThermoFisher Scientific | 48190011 | |
dNTP | ThermoFisher Scientific | 18427088 | |
Ribonuclease Inhibitor | ThermoFisher Scientific | 10777019 | |
DEPC Water | ThermoFisher Scientific | AM9915G | |
Fluorescent Light Miscroscope | Leica Microsystems | ||
Image J Analysis Software | Image J | ||
PCR Thermocycler | ThermoFisher Scientific | ||
TEM Microscope | Britannica |