इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक पूर्ण गुर्दे का काम है कि बाहर glomerular रोग के माउस मॉडल में किया जाना चाहिए । तरीकों विस्तृत कार्यात्मक, संरचनात्मक, और glomerular समारोह है, जो glomerular रोग के सभी माउस मॉडल के लिए लागू किया जा सकता है की यंत्रवत विश्लेषण के लिए अनुमति देते हैं ।
मानव गुर्दे की बीमारी की नकल करने के लिए murine मॉडलों का उपयोग तेजी से आम होता जा रहा है । हमारे शोध मधुमेह नेफ्रोपैथी और podocyte-विशिष्ट वीईजीएफ़-एक दस्तक चूहों में glomerular समारोह के आकलन पर ध्यान केंद्रित किया है; इसलिए, इस प्रोटोकॉल का वर्णन पूर्ण गुर्दे काम अप हमारे प्रयोगशाला में इस्तेमाल के लिए glomerular रोग के इन माउस मॉडल का आकलन, गुर्दे और glomerular समारोह के बारे में जानकारी का एक विशाल राशि को सक्षम करने के लिए एक ही माउस से प्राप्त किया जाएगा । glomerular फ़ंक्शन का मूल्यांकन करने के लिए साहित्य में प्रस्तुत वैकल्पिक तरीकों की तुलना में, इस पत्र में उल्लिखित विधि का उपयोग glomerular phenotype को अनेक पहलुओं से पूर्णतः मूल्यांकित करने में सक्षम बनाता है. इस विधि का उपयोग करके शोधकर्ता मॉडल के गुर्दा phenotype का निर्धारण कर सकते हैं और तंत्र का आकलन करते हैं कि phenotype क्यों विकसित होता है । रोग के तंत्र पर यह महत्वपूर्ण जानकारी जब इन मॉडलों में संभावित चिकित्सीय रास्ते की जांच की आवश्यकता है । तरीके मूत्र एल्ब्युमिन क्रिएटिनिन अनुपात और व्यक्तिगत glomerular पानी पारगम्यता, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से दोनों संरचनात्मक और अल्ट्रा संरचनात्मक परीक्षा के माप के माध्यम से glomerular निस्पंदन बाधा के विस्तृत कार्यात्मक मूल्यांकन के लिए अनुमति आवधिक अम्ल Schiff दाग और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करना. इसके अलावा, mRNA और प्रोटीन स्तर पर dysregulated जीन का विश्लेषण glomerular समारोह के यंत्रवत विश्लेषण में सक्षम बनाता है । इस प्रोटोकॉल जेनेरिक लेकिन अनुकूलनीय तरीकों कि glomerular रोग के सभी माउस मॉडलों के लिए लागू किया जा सकता रूपरेखा ।
मानव गुर्दे की बीमारी की नकल करने के लिए murine मॉडलों का उपयोग तेजी से आम होता जा रहा है । इस तरह के murine मॉडल सहज मॉडल जैसे सहज ग्रस्त चूहों (SHR)1, streptozotocin (STZ)-प्रेरित मधुमेह चूहों और चूहों2, और db/db प्रकार द्वितीय मधुमेह चूहों3, आनुवंशिक रूप से इंजीनियर मॉडल जैसे शामिल प्राथमिक podocyte-विशिष्ट फोकल फॉल्ट glomerular स्केलेरोसिस (FSGS) मॉडल4, podocyte-विशिष्ट संवहनी endothelial वृद्धि कारक एक (वीईजीएफ़-a) नॉक आउट (वीईजीएफ़-a KO)5मॉडल, और Alport सिंड्रोम मॉडल6, और अधिग्रहीत मॉडल जैसे 5/6 nephrectomy7 और एकतरफा ureteral रुकावट (UUO) मॉडल8। आदेश में इन मॉडलों में glomerular समारोह के विभिंन पहलुओं का आकलन करने के लिए, कई तकनीकों उपलब्ध हैं । इस विधि कागज के प्रयोजन के लिए एक व्यापक काम अप कि गुर्दे की बीमारी के माउस मॉडलों में प्रदर्शन किया जाना चाहिए के लिए पूरी तरह से glomerular समारोह का आकलन है ।
इस विधि के उपयोग के पीछे तर्क यह है कि यह glomerular phenotype को पूरी तरह से कई पहलुओं से मूल्यांकन किया जा करने के लिए सक्षम बनाता है । यह glomerular पारगम्यता का आकलन शामिल है, दोनों प्रोटीन और पानी के लिए, glomerular संरचनात्मक विषमता, और अभिव्यक्ति में परिवर्तन/mRNAs और सामान्य glomerular समारोह के लिए आवश्यक प्रोटीन के ब्याह/ इस विधि का उपयोग करके शोधकर्ता मॉडल की किडनी phenotype का निर्धारण करने में सक्षम होता है और तंत्र का आकलन कर phenotype को विकसित क्यों करता है । यह रोग है, जो जब इन मॉडलों में संभावित चिकित्सीय रास्ते की जांच की आवश्यकता है की व्यवस्था पर महत्वपूर्ण जानकारी है ।
साहित्य में, glomerular रोग के माउस मॉडल के साथ प्रस्तुत किया जाना एक आम घटना है जहां phenotype मूत्र में एल्ब्युमिन के एक वृद्धि स्तर से निर्धारित होता है । हालांकि, glomerular फ़ंक्शन का निर्धारण करने के लिए कोई एकल पद्धति हमेशा प्रभावी नहीं है कि सुझाव देने के लिए सबूत है; मूत्र एल्ब्युमिन उत्सर्जन दर या मूत्र एल्ब्युमिन क्रिएटिनिन अनुपात (uACR) को मापने केवल कुल गुर्दे समारोह के बारे में जानकारी प्रदान करता है, और नहीं व्यक्तिगत glomeruli की । पिछले अध्ययनों से यह प्रदर्शित किया है कि पारगम्यता अलग glomeruli में एक ही गुर्दे से भिन्न हो सकते हैं5,9,10. इसके अलावा, व्यक्तिगत glomeruli की पारगम्यता का आकलन glomerular समारोह का आकलन करने का एक अधिक संवेदनशील तरीका है; व्यक्तिगत glomerular जल पारगम्यता को मापने की तकनीक (एलपीए/मैं9uACR को मापने से glomerular समारोह में परिवर्तन के लिए और अधिक संवेदनशील होना दिखाया गया है । इस परख माउस मॉडल है कि proteinuria के लिए प्रतिरोधी रहे है में लाभप्रद है, ऐसे c57BL पर उन लोगों केरूप में/ वर्तमान विधि कागज का लाभ यह है कि यह दोनों कुल गुर्दे पारगम्यता एल्ब्युमिन करने के लिए जांच के रूप में के रूप में अच्छी तरह से व्यक्ति glomerular पारगम्यता पानी के लिए.
glomerular संरचनात्मक विषमताओं की परीक्षा अक्सर ऐसे आवधिक एसिड Schiff (क़दम), trichrome, और चांदी के दाग के रूप में दाग की एक बैटरी द्वारा मूल्यांकन किया जाता है । ये एक प्रशिक्षित गुर्दे पैथोलॉजिस्ट एक स्कोरिंग विधि के माध्यम से गुर्दे की बीमारी के स्तर का मूल्यांकन करने के लिए सक्षम. हालांकि सभी अच्छे तरीके, glomerular स्थूल संरचना में परिवर्तन हमेशा तीव्र गुर्दे की चोट मॉडल12में नहीं मनाया जाता है । इस विधि का प्रस्ताव है कि बाहर ले जाने के अलावा गुर्दे प्रोटोकॉल तकनीकों ऊपर वर्णित है, glomerular अल्ट्रा संरचना भी इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (EM) के माध्यम से मूल्यांकन किया जाना चाहिए । एक दाग glomerulus एक नियमित रूप से प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत अपेक्षाकृत सामान्य देख सकते हैं; हालांकि, आकलन पर उंहें, glomerular तहखाने झिल्ली में छोटे परिवर्तन (जीबीएम) चौड़ाई, podocyte पैर प्रक्रिया effacement, endothelial fenestrations, और उप podocyte अंतरिक्ष कवरेज का विश्लेषण किया है । इसलिए, यह महत्वपूर्ण है कि दोनों glomerular अल्ट्रा संरचना और सूक्ष्म संरचना glomerular शिथिलता के तंत्र का निर्धारण करने के लिए मूल्यांकन किया है ।
glomerular संरचनात्मक विषमताओं का आकलन करने के अलावा, mRNA और प्रोटीन अभिव्यक्ति और ब्याह में परिवर्तन, साथ ही साथ प्रोटीन सक्रियण (जैसे, फास्फारिलीकरण), glomerular रोग के तंत्र स्पष्ट आगे की जांच की जानी चाहिए । जब glomerular रोग में देख, या, उदाहरण के लिए, जब ko/glomerular कोशिकाओं में विशेष रूप से एक जीन व्यक्त, जैसे podocyte में विशेष वीईजीएफ़-एक को माउस5, यह महत्वपूर्ण है कि प्रोटीन और mRNA परिवर्तन के भीतर ही जांच कर रहे है glomerular कोशिकाओं, और नहीं पूरी किडनी । इस प्रोटोकॉल जिसमें glomeruli माउस गुर्दे प्रांतस्था से अलग कर रहे हैं एक विधि का वर्णन करता है, और फिर प्रोटीन/आरएनए अलग कर रहे हैं । यह रोग मॉडल के glomeruli में प्रोटीन/mRNA dysregulation के विशिष्ट विश्लेषण की अनुमति देता है ।
इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक पूर्ण गुर्दे का काम है कि बाहर glomerular रोग के माउस मॉडल में किया जाना चाहिए, गुर्दे और glomerular समारोह के बारे में जानकारी का एक विशाल राशि को सक्षम करने के लिए एक ही माउस से प्राप्त किया जाना है । तरीकों विस्तृत कार्यात्मक, संरचनात्मक, और glomerular समारोह है, जो glomerular रोग के सभी माउस मॉडल के लिए लागू किया जा सकता है की यंत्रवत विश्लेषण के लिए अनुमति देते हैं ।
इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक पूर्ण गुर्दे का काम है कि बाहर glomerular रोग के माउस मॉडल में किया जाना चाहिए, गुर्दे और glomerular समारोह के बारे में जानकारी का एक विशाल राशि को सक्षम करने के लिए एक ही माउस से प्राप्त किया जाना है । प्रत्येक विधि में महत्वपूर्ण कदम विस्तृत कार्यात्मक, संरचनात्मक, और एक पूरे (uACR और प्लाज्मा क्रिएटिनिन माप) के रूप में गुर्दे की पारगम्यता का आकलन सहित glomerular समारोह के यंत्रवत विश्लेषण के लिए अनुमति देते हैं, की पारगम्यता व्यक्तिगत glomeruli (glomerular एलपीए/वीमैं), संरचनात्मक परिवर्तन की परीक्षा (क़दम, Trichrome नीला, और EM), प्रोटीन स्थानीयकरण (यदि), और glomerular जीन अभिव्यक्ति (आरटी-पीसीआर और पश्चिमी सोख्ता) । इन पद्धतियों गुर्दे की बीमारी के माउस मॉडल में glomerular समारोह का पूरा आकलन करने के लिए महत्वपूर्ण हैं ।
जब GFB की पारगम्यता का आकलन, कई अध्ययनों से एक प्रभावी उपाय17,18के रूप में पारंपरिक uACR या 24 एच एल्ब्युमिन उत्सर्जन दर का उपयोग करने के लिए चुना है. हालांकि इन तकनीकों के एक पूरे के रूप में GFB पारगम्यता के आकलन की अनुमति, यह व्यक्तिगत glomerular पारगम्यता मूल्यांकन और glomeruli के बीच भिन्नता के लिए अनुमति नहीं है. पिछले अध्ययन glomerular एलपीए/वीमैं GFB पारगम्यता5,9के लिए परिवर्तन का एक और अधिक संवेदनशील उपाय हो की माप पाया है । वास्तव में, प्रतिनिधि परिणामों में इस पत्र में प्रदर्शन किया, 14 सप्ताह में वीईजीएफ़ की प्रेरण-एक ko, वीईजीएफ़-a ko X Neph-वीईजीएफ़-a१६५बी चूहों uACR की तुलना में एक काफी कम वीईजीएफ़-a को चूहों; हालांकि, इस परिणाम में प्रतिबिंबित नहीं है glomerular Lpa/Vi माप, जहां वीईजीएफ़-a१६५b काफी GFB पारगम्यता में वृद्धि को रोकने नहीं किया है (चित्रा 1 और चित्रा 2)5. यह कई परख का उपयोग करने के लिए दोनों गुर्दे पारगम्यता और व्यक्तिगत glomeruli की पारगम्यता का आकलन करने के महत्व से पता चलता है. इसके अलावा, glomerular एलपीए/वीमैं oncometric परख पता चलता है कि एक ही गुर्दे से व्यक्तिगत glomeruli की पारगम्यता बहुत भिंन हो सकते हैं, विशेष रूप से रोग मॉडल में5,10, 19. glomerular को मापने के लिए एक सीमा एलपीए/मैं यह है कि यह केवल प्रयोगात्मक अंत बिंदु पर प्रदर्शन किया जा सकता है; इस प्रकार, नियमित uACR माप प्रयोगात्मक अंत बिंदु का एक संकेत देने के लिए आवश्यक हैं ।
कार्यात्मक phenotype का आकलन करने के अलावा, वर्तमान विधि संरचनात्मक और ultrastructural phenotype के आकलन को भी प्रोत्साहित करती है । इस तरह के क़दम, trichrome, और चांदी के दाग के रूप में दाग के चयन का उपयोग किया जा सकता है; प्रत्येक glomerular आकृति विज्ञान के विभिन्न पहलुओं का आकलन करने के लिए. glomerular रोग है, जो अक्सर माउस मॉडल में मामला है की तीव्र मॉडल में, इन दाग का उपयोग कर किसी भी प्रमुख संरचनात्मक असामान्यताओं का पता लगाने के लिए मुश्किल हो सकता है जब तक आप एक प्रशिक्षित गुर्दे पैथोलॉजिस्ट हैं । इसलिए, उंहें ले जाने के लिए GFB, जो जैसे जीबीएम, endothelial fenestrae आकार और संख्या, और podocyte विशेषताओं के रूप में मानकों के मात्रात्मक माप की अनुमति देता है की ultrastructure का आकलन करने का सुझाव दिया है । इस तरह के मापन के लिए प्रदर्शन करने के लिए न्यूनतम प्रशिक्षण की आवश्यकता है और एक रोग मॉडल में प्रभावित कोशिका-प्रकारों/संरचनाओं का निर्धारण करने के लिए जांचकर्ता सक्षम बनाता है । प्रतिनिधि परिणामों में दिखाया उदाहरण में, वीईजीएफ़-एक को माउस glomerular रोग का एक हल्का मॉडल, इस प्रकार पाया गया था, कोई बड़ी संरचनात्मक विषमता क़दम धुंधला पर मौजूद थे । हालांकि, podocyte-विशिष्ट वीईजीएफ़-एक KO जीबीएम, podocytes, और endothelial जब glomerular अल्ट्रा संरचना5की जांच कोशिकाओं में परिवर्तन प्रेरित किया । दुर्भाग्य से, उंहें वर्तमान विधि में वर्णित के लिए गुर्दे की तैयारी endothelial glycocalyx, जो भी GFB19की पारगम्यता पर महत्वपूर्ण प्रभाव है जाना जाता है का पता लगाने के लिए सक्षम नहीं है । आदेश में सही glycocalyx गहराई उपाय करने के लिए, गुर्दे perfuse-1% के साथ २.५% glutaraldehyde के साथ तय किया जाना चाहिए Alcian ब्लू endothelial glycocalyx लेबलिंग के लिए, के रूप में Oltean एट अल19में वर्णित है ।
एक बार कार्यात्मक और संरचनात्मक phenotype का मूल्यांकन किया गया है, अलग जीन और रास्ते की अभिव्यक्ति/सक्रियकरण पैटर्न तो glomeruli में विशेष रूप से मूल्यांकन किया जा सकता है । पहले अल्ट्रा संरचनात्मक मूल्यांकन कुछ सेल प्रकार के बारे में जानकारी दे सकता/glomerular संरचनाओं शामिल है, यह दर्शाता है कि क्या podocyte-या endothelial-विशिष्ट जीन/ उदाहरण के लिए, वीईजीएफ़-a KO चूहों से प्रतिनिधि परिणामों में, endothelial fenestrae संख्या में कमी (चित्रा 3 डी) मनाया गया था; इसलिए, एक endothelial मार्कर के glomerular प्रोटीन अभिव्यक्ति वीईजीएफ़ में शामिल होने के लिए जाना जाता है-एक मार्ग की जांच की थी; VEGFR-2 (figure 4B)5. glomeruli में प्रोटीन की अभिव्यक्ति के अलावा, उनके स्थानीयकरण भी अगर का उपयोग कर visualized किया जा सकता है । झांग एट अल20, podocyte-GLUT1 के विशेष एक्सप्रेस द्वारा एक अध्ययन में podocytes में पुष्टि की थी अगर सह podocin के साथ बढ़ा GLUT1 स्थानीयकृत ।
glomerular फ़ंक्शन का मूल्यांकन करने के लिए साहित्य में प्रस्तुत वैकल्पिक तरीकों की तुलना में, glomerular रोग के माउस मॉडलों में गुर्दे के कार्य का आकलन करने के लिए इस पत्र में उल्लिखित विधि का उपयोग glomerular phenotype से पूर्णतः मूल्यांकित होने के लिए सक्षम करता है कई पहलुओं । इस विधि का उपयोग करके शोधकर्ता मॉडल की किडनी phenotype का निर्धारण करने में सक्षम होता है और तंत्र का आकलन कर phenotype को विकसित क्यों करता है । रोग के तंत्र पर यह महत्वपूर्ण जानकारी जब इन मॉडलों में संभावित चिकित्सीय रास्ते की जांच की आवश्यकता है । इस विधि glomerular समारोह में दोनों रोग phenotypes और संभावित चिकित्सकीय के आकलन में भविष्य की जांच करने के लिए आसानी से लागू किया जा सकता है ।
अंत में, इस सामांय और अनुकूलनीय प्रोटोकॉल एक पूर्ण गुर्दे glomerular रोग के माउस मॉडल के लिए काम अप का वर्णन, गुर्दे और glomerular समारोह के बारे में जानकारी का एक विशाल राशि को सक्षम करने के लिए एक ही माउस से प्राप्त किया जाएगा । तरीकों विस्तृत कार्यात्मक, संरचनात्मक, और glomerular समारोह है, जो glomerular रोग के सभी माउस मॉडल के लिए लागू किया जा सकता है की यंत्रवत विश्लेषण के लिए अनुमति देते हैं ।
The authors have nothing to disclose.
इस काम को ब्रिटिश हार्ट फाउंडेशन, रिचर्ड ब्राइट वीईजीएफ़ रिसर्च ट्रस्ट, और MRC ने सपोर्ट किया था ।
Metabolic Cages | Harvard Apparatus | 52-6731 | |
Tris buffered saline (10x) | Sigma-Aldrich | T5912-1L | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2058 | |
Mouse Albumin ELISA Quantitation Set | Bethyl Laboratories | E90-134 | |
TMB ELISA Substrate solution | ThermoFisher Scientific | 34028 | |
Sulphuric acid | Sigma-Aldrich | 339741 | |
SPECTRstar nano | BMG Labtech | SPECTRstar nano or equivalent | |
RNAlater stabilisation solution | ThermoFisher Scientific | AM7020 | |
4-15% precast protein gel | BIORAD | 4568084 | |
4x Laaemmli Sample buffer | BIORAD | 161-0747 | |
Mini Trans-Blot cell | BIORAD | 1703930 | |
10x Tris running buffer | BIORAD | 1610732 | |
Coomassie Brilliant Blue Dye | ThermoFisher Scientific | 20278 | |
Creatinine Companion | Exocell | 1012 Strip Plate | |
Glutaraldehyde Solution | Sigma-Aldrich | G5882 | |
Sodium Cacodylate | Sigma-Aldrich | C0250 | |
10x Phosphate Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | AM9625 | |
Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
Sodium Phosphate | Sigma-Aldrich | 342483 | |
Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M2643 | |
Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | |
D(+)Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
EDTA Blood Collection tubes | BD | 367835 | |
23-25G Needle | BD | PMC0735 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
10 ml Glass Vial | Thomas Scientific | 0914X10 | |
Falcon 10 ml Polypropylene Tubes | ThermoFisher Scientific | 10110101 | |
0.5 ml Tubes | ThermoFisher Scientific | 10681894 | |
Disposable Tissue Molds | ThermoFisher Scientific | 22-363-553 | |
Mouse Surgical Disection Kit | ThermoFisher Scientific | 13-005-204 | |
Optimal Cutting Medium | ThermoFisher Scientific | 23-730-571 | |
4% Paraformaldehyde | ThermoFisher Scientific | AAJ19943K2 | |
Glass Capillary Tubes | Harvard Apparatus | EC1 64-0770 | |
Glomerular Permeability Rig | Built at the Univeristy of Bristol – not comercially available | Citation of LpA rig: Salmon et al. 2006; J. Physiol | |
Stainless Steel Sieves | Cole-Parmer | WZ-59984 | |
Periodic Acid-Schiff (PAS) Staining System | Sigma-Aldrich | 395B-1KT | |
Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H3136 | |
Xylene | MerckMillipore | 108298 | |
Poly-Prep Slides | Sigma-Aldrich | P0425-72EA | |
Mounting Medium | ThermoFisher Scientific | 8030 | |
Osmium tetroxide solution | Sigma-Aldrich | 75632 | |
Aradite Resin | Agar Scientific | CY212 | |
Uranyl Acetate | Agar Scientific | AGR1260A | |
Lead Citrate | Agar Scientific | AGR1210 | |
Cryostat | ThermoFisher Scientific | e.g. 957000H | |
Hydrophobic Pen | Abcam | ab2601 | |
Nephrin (1243-1256) Antibody | Acris | BP5030 | |
Anti-Podocin | Sigma-Aldrich | P0372-200UL | |
Anti-CD31 | BD Biosciences | 550274 | |
Alexa Fluor Secondary Antibody | ThermoFisher Scientific | A32732 | |
Vectashield Mounting Medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
NP40 Cell Lysis Buffer | ThermoFisher Scientific | FNN0021 | |
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail | ThermoFisher Scientific | 78437X4 | |
10x Transfer Buffer | BIORAD | 1610734 | |
PVDF Membrane | ThermoFisher Scientific | LC2002 | |
HRP-Conjugated Secondary Antibodies | Abcam | ab6721 | |
ECF Substrate for Western Blotting | Fisher | 10713387 | |
TRIzol | ThermoFisher Scientific | 15596018 | |
Dnase I | New England Biolabs | M0303S | |
M-MLV Reverse Transcriptase | New England Biolabs | M053S | |
Oligo dT | ThermoFisher Scientific | 18418012 | |
Random Primers | ThermoFisher Scientific | 48190011 | |
dNTP | ThermoFisher Scientific | 18427088 | |
Ribonuclease Inhibitor | ThermoFisher Scientific | 10777019 | |
DEPC Water | ThermoFisher Scientific | AM9915G | |
Fluorescent Light Miscroscope | Leica Microsystems | ||
Image J Analysis Software | Image J | ||
PCR Thermocycler | ThermoFisher Scientific | ||
TEM Microscope | Britannica |