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Medicine

Valutazione della funzione del rene in modelli murini di malattia glomerulare

doi: 10.3791/57764 Published: June 30, 2018

Summary

Questo protocollo descrive un work-up completo del rene che deve essere eseguito in modelli murini di malattia glomerulare. I metodi consentono di dettagliate analisi funzionali, strutturali e meccanicistiche della funzione glomerulare, che può essere applicato a tutti i modelli murini di malattia glomerulare.

Abstract

L'utilizzo di modelli murini per imitare la malattia di rene umano sta diventando sempre più comune. La nostra ricerca è concentrata sulla valutazione della funzione glomerulare in nefropatia diabetica e specifiche del Podocita VEGF-A topi knock-out; di conseguenza, questo protocollo descrive il rene completo work-up utilizzato nel nostro laboratorio per valutare questi modelli murini di malattia glomerulare, consentendo una grande quantità di informazioni per quanto riguarda il rene e la funzione glomerulare devono essere ottenuti da un unico mouse. Rispetto ai metodi alternativi presentati nella letteratura per valutare la funzione glomerulare, l'utilizzo del metodo descritto in questo documento consente il fenotipo glomerulare completamente essere valutata da molteplici aspetti. Utilizzando questo metodo, il ricercatore può determinare il fenotipo renale del modello e valutare il meccanismo quanto a perchè il fenotipo si sviluppa. Queste informazioni vitali sul meccanismo della malattia sono necessarie quando si esaminano le potenziali vie terapeutiche in questi modelli. I metodi consentono dettagliata valutazione funzionale della barriera di filtrazione glomerulare attraverso misurazioni del rapporto creatinina urinaria dell'albumina e permeabilità glomerulare individuali, così come esame sia strutturale che ultra-strutturale usando la macchia dello Schiff dell'acido periodico e la microscopia. Inoltre, analisi della dysregulated geni a livello di mRNA e proteina consente analisi meccanicistica della funzione glomerulare. Questo protocollo descrive i metodi generici ma adattabili che possono essere applicati a tutti i modelli murini di malattia glomerulare.

Introduction

L'utilizzo di modelli murini per imitare la malattia di rene umano sta diventando sempre più comune. Tali modelli murini includono spontanea come spontaneamente ipertesi (SHR) ratti1, streptozotocin (STZ)-indotta in ratti diabetici e topi2, e il db/db tipo II topi diabetici3, modelli geneticamente come primaria specifiche del Podocita sclerosi glomerulare segmentale focale (FSGS) modelli4, specifici del Podocita endoteliale fattore di crescita vascolare (VEGF-A) knock-out (KO VEGF-A) modello5, e la sindrome di Alport modelli6e acquisito modelli come la nefrectomia di 5/67 e l'ostruzione ureteral unilaterale (UUO) modello8. Al fine di valutare i diversi aspetti della funzione glomerulare in questi modelli, sono disponibili diverse tecniche. Lo scopo di questa carta di metodo è quello di dimostrare un work-up completo che deve essere eseguito in modelli murini di malattia renale al fine di valutare appieno la funzione glomerulare.

La spiegazione razionale dietro l'uso di questo metodo è che esso consente il fenotipo glomerulare completamente essere valutata da molteplici aspetti. Questo include la valutazione della permeabilità glomerulare, sia di proteine e di acqua, le anomalie strutturali glomerulari e cambiamenti nell'espressione/impionbatura di mRNA e proteine essenziali per la normale funzione glomerulare. Utilizzando questo metodo, il ricercatore è in grado di determinare il fenotipo renale del modello e valutare il meccanismo quanto a perchè il fenotipo si sviluppa. Si tratta di informazioni vitali sul meccanismo della malattia, che è necessaria quando si esaminano le potenziali vie terapeutiche in questi modelli.

Nella letteratura, è un evento comune per essere presentato con un modello murino di malattia glomerulare dove il fenotipo è determinato da un aumento del livello di albumina nelle urine. Tuttavia, ci è prova per suggerire che un unico metodo per determinare la funzione glomerulare non è sempre efficace; misura il tasso di escrezione urinaria dell'albumina o il rapporto di creatinina urinaria dell'albumina (dell'uACR) fornisce solo informazioni sulla funzione renale totale e non dei singoli glomeruli. Precedenti studi hanno dimostrato che la permeabilità può variare in glomeruli differenti dalla stessa rene5,9,10. Inoltre, la valutazione della permeabilità dei glomeruli individuali è un modo più sensibile di valutazione della funzione glomerulare; la tecnica di misurazione della permeabilità glomerulare individuali (LpA / Vio) ha dimostrato di essere più sensibili ai cambiamenti nella funzione glomerulare rispetto alla valutazione dell'uACR9. Questo test è utile in modelli murini che sono resistenti alla proteinuria, come quelle su una priorità bassa c57BL/611. Il vantaggio della carta metodo attuale è che esamina sia la totale permeabilità renale all'albumina, nonché i singole glomerulare permeabilità all'acqua.

Esame delle anomalie strutturali glomerulari è spesso valutata tramite una batteria di macchie quali acido periodico Schiff (PAS), tricromica e le macchie d'argento. Questi strumenti consentono un patologo renale addestrato per valutare il livello di malattia renale tramite un metodo segnante. Anche se tutti i buoni metodi, le modifiche alla macro-struttura glomerulare non sono sempre rispettati nel danno renale acuto modelli12. Questo metodo propone che oltre a svolgere le tecniche di istologia renale sopra descritte, l'ultra-struttura glomerulare dovrebbe essere valutata anche tramite microscopia elettronica (EM). Un glomerulo macchiato può guardare relativamente normale microscopio ottico regolari; Tuttavia, al momento della valutazione con EM, piccoli cambiamenti nella membrana basale glomerulare (GBM) larghezza, Podocita piede processo effacement, fenestrazioni endoteliali e la copertura dello spazio sub-Podocita è analizzato. Pertanto, è essenziale che l'ultra-struttura glomerulare e la microstruttura è valutato per determinare il meccanismo di disfunzione glomerulare.

Oltre a valutare le anomalie strutturali glomerulari, cambiamenti in mRNA e l'espressione della proteina e splicing, come pure l'attivazione della proteina (ad es., fosforilazione), dovrebbero essere esaminati per più ulteriormente per delucidare i meccanismi della malattia glomerulare. Quando guardando la malattia glomerulare, o, per esempio, quando KO/over-expressing un gene specificamente in cellule glomerulari, ad esempio il Podocita specifiche VEGF-A KO del mouse5, è importante che i cambiamenti di mRNA e proteina sono esaminati solo all'interno del cellule glomerulari e non l'intero rene. Questo protocollo descrive un metodo in cui i glomeruli sono isolati dalla corteccia del rene del mouse, e quindi il proteina/RNA sono isolati. Questo permette l'analisi specifica della disregolazione della proteina/mRNA nei glomeruli di modello della malattia.

Questo protocollo descrive un work-up completo del rene che deve essere eseguito in modelli murini di malattia glomerulare, consentendo una grande quantità di informazioni per quanto riguarda il rene e la funzione glomerulare devono essere ottenuti da un unico mouse. I metodi consentono di dettagliate analisi funzionali, strutturali e meccanicistiche della funzione glomerulare, che può essere applicato a tutti i modelli murini di malattia glomerulare.

Protocol

Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con la legislazione del Regno Unito e l'approvazione del comitato etico. Gli studi sugli animali sono stati approvati dall'Università di Bristol Research Ethics Committee.

1. urinaria del rapporto albumina creatinina (dell'uACR)

Nota: Dell'uACR viene utilizzato per valutare la permeabilità di GFB all'albumina. La presenza di albumina nelle urine indica la permeabilità aumentata attraverso la GFB, che si è normalizzato a creatinina al controllo per le variazioni nella portata dell'urina. L'albuminuria è un indicatore comune per la malattia renale cronica.

  1. Raccogliere le urine alla linea di base sperimentale e a intervalli regolari (una volta alla settimana a una volta al mese) fino all'endpoint sperimentale.
  2. Impostare il gabbie metaboliche del mouse con dieta acqua e arricchimento. Posizionare i topi (maschile, invecchiate 6-8 settimane) in gabbie individuali per 6 ore in una stanza tranquilla.
  3. Ritorno topi per regolare alloggiamento e raccogliere urina dalle gabbie vuote. Un minimo di 50 µ l è richiesto.
    Nota: Se il mouse non produce urina nel tempo dato, ripetere un altro giorno in una stanza più calda.
  4. Centrifugare le urine a 500 x g per 10 min. raccogliere l'urina e trattenere il sedimento per valutare la perdita del Podocita. Conservare l'urina a-20 ° C a breve termine, a questo punto.
  5. Diluire l'urina in 1% albumina di siero bovino (BSA) in 1 x Tris buffered saline (pH 7.5 del TBS) presso un 1: 500 a diluizione 1: 10000, a seconda della gravità dell'albuminuria.
    Nota: Il volume di fine dovrebbe essere > 400 µ l. punto ottimizza per determinare la giusta diluizione in ogni momento.
  6. Quantificare la concentrazione di albumina urinaria utilizzando un mouse albumina enzima collegata dell'immunosorbente (ELISA) secondo le istruzioni del produttore.
    1. Brevemente, cappotto piastra ELISA, che è ottimizzata per il legame con le proteine, con 100 µ l di anticorpo primario anti-topo albumina (10 µ g/mL a 0,5 M a pH carbonato-bicarbonato 9,6) per 1 h a temperatura ambiente.
    2. Lavaggio dell'anticorpo in eccesso dai pozzetti cinque volte con 1 x TBS plus 0.05% Tween (pH 8.0) e aggiungere 200 µ l di soluzione (1 x TBS con pH di 1% BSA 8.0) durante la notte a temperatura ambiente di blocco.
  7. Lavare la piastra cinque volte e aggiungere 100 µ l dei campioni (diluizione seriale: 2000 µ g/mL a 15,63 µ g/mL in 1 x TBS con BSA 1%, pH 8.0), lo spazio in bianco e i campioni diluiti in triplice copia. Lasciare per 1 h a temperatura ambiente e poi lavare la piastra cinque volte.
    1. Aggiungere 100 µ l di anticorpo di rilevazione HRP in ogni pozzetto (10 ng/mL in 1xTBS con BSA 1%, pH 8.0) e incubare a temperatura ambiente per 1 h.
    2. Lavare la piastra cinque volte e aggiungere 100 µ l di soluzione di substrato enzimatico in ciascun pozzetto. Lasciare la piastra al buio per sviluppare per 15 min e interrompere la reazione aggiungendo 100 µ l di acido solforico 0,18 (H2SO4).
      Attenzione: H2così4 è corrosivo.
  8. Determinare la concentrazione di albumina di ciascun campione leggendo la targhetta di un'assorbanza di 450 nm. Utilizzare la curva standard per quantificare l'albumina presente in ciascun campione. Se il tecniche ripetizioni hanno un valore di CV supera al 5%, è possibile ripetere il dosaggio per i campioni.
  9. In alternativa, valutare la concentrazione di albumina urinaria mediante elettroforesi. Aggiungere 5 µ l di tampone di caricamento del campione della proteina: 4x a 15 µ l di urina. Riscaldare campioni a 95 ° C per 10 min e poi caricare in un gel di Tris prefabbricati di 4-12%.
    1. Esegua il gel a 100 V e macchia durante la notte in blu di Coomassie secondo il protocollo del produttore.
    2. Dopo il gel di imaging, è possibile utilizzare densitometria per valutare la concentrazione di albumina piega cambiamento relativo al controllo.
      Nota: Se nessuna band si osservano per l'albumina, quando previsto, valutare la concentrazione di proteina dell'urina e regolare il volume di urina aggiunto al gel.
  10. Diluire il campione di urina crudo in dH2O alle 01:10, 1:5 e 1:1.
    Nota: Il volume di fine dovrebbe essere > 70 µ l. Optimize per determinare la giusta diluizione di ciascun campione.
  11. Quantificare la concentrazione di creatinina urinaria usando un'analisi chimica per le istruzioni del kit. Brevemente, caricare 20 µ l di urina di standard, creatinina in vuoto, o diluito in un piatto ben 96 in triplice copia.
  12. Determinare la concentrazione di creatinina di ciascun campione leggendo la targhetta di un'assorbanza di 490 nm prima e dopo l'aggiunta della soluzione di acido (attenzione, corrosivi; evitare il contatto con la pelle).
    Nota: La differenza tra i valori di assorbanza è direttamente proporzionale alla concentrazione di creatinina in ciascun campione. Una curva standard è generazione dagli standard. Se il tecniche ripetizioni hanno un valore di CV supera al 5%, è possibile ripetere il dosaggio per i campioni.
  13. Generare dell'uACR (µ g/mg). Normalizzare i dati al valore basale di ogni mouse per rappresentazione grafica.

2. i tessuti e la raccolta del sangue

Nota: Il rene e il tessuto glomerulare utilizzabile per valutare indicatori di espressione strutturale, proteine e mRNA della malattia renale. Il sangue può essere utilizzato per valutare gli indicatori della funzione renale, come creatinina, che può essere up-regolati nella malattia renale, che indica una riduzione della capacità di filtrazione dei glomeruli.

  1. Preparare le seguenti soluzioni: fresca 2,5% glutaraldeide in 0.1 M sodio cacodilato (pH 7,3), paraformaldeide al 4% in tampone fosfato salino (PBS), soluzione di Ringer nei mammiferi (115 mM sodio cloruro (NaCl), acetato di sodio 10 mM (CH3COONa), 1.2: 1x Millimetri di fosfato di sodio (Na2HPO4), 25 MM sodio bicarbonato (NaHCO3), il solfato di magnesio di 1,2 mM (MgSO4), 1 mM di cloruro di calcio (CaCl2), 5,5 millimetri di glucosio di D (+), pH 7.4) con BSA 1% e 1x PBS.
    Attenzione: 2.5% di glutaraldeide: toxic, sensibilizzante, irritante; utilizzare in un cabinet di fumi. 0.1 M sodio cacodilato: tossici, uso in un armadio di fumi. 4% PFA: fissativo, uso nel gabinetto di fumi
  2. Preparare i seguenti materiali: isoflurano, acido etilendiamminotetracetico piccolo (ed)-rivestito provette di sangue, aghi 23-25G, 5ml EDTA rivestito siringhe, fiale di vetro da 10 mL, fiale di plastica da 10 mL, tubi di plastica da 0,5 mL, stampi di fazzoletti di carta, ghiaccio secco, liquido N 2, strumenti chirurgici del mouse e medio taglio ottimale (OCT).
  3. Posizionare il mouse in anestesia profonda, che viene verificato dal mouse essendo non-responsivi a una puntura di ago per il rilievo del piede, utilizzando una camera di isoflurano o vie di anestesia terminale come agenti anestetici iniettabili (pentobarbital, 50 mg/kg equivalenti intraperitoneale [IP]; Avertin, 240 mg/kg IP), o anidride carbonica (CO2) esposizione (75% CO225% O2).
  4. Abbattere il mouse tramite puntura cardiaca nel ventricolo di sinistra e raccogliere quanto più sangue possibile. Trasferire nella provetta di sangue EDTA-rivestito per fino a 4 h. Se si preferisce, topi possono essere abbattuti tramite dislocazione cervicale con cura di non rompere la vena giugulare.
  5. Sezionare i reni attraverso l'addome e il lavaggio in PBS 1X freddo di ghiaccio.
  6. Per esaminare i glomeruli corticali, rimuovere un polo della corticale del rene e tagliate a pezzetti3 1 mm. Per esaminare i glomeruli profondo juxta-midollare, ripetere la stessa tecnica con il tessuto dal midollo. Posto in 5 mL di soluzione di glutaraldeide al 2,5% in un flaconcino di vetro EM. Conservare a 4 ° C.
    Attenzione: soluzione di glutaraldeide 2,5%: toxic, sensibilizzante, irritante; utilizzare in un cabinet di fumi
    Nota: processo entro 1 mese per i migliori risultati.
  7. Per istologia, rimuovere il terzo superiore di un rene, per garantire dei glomeruli juxta-midollare e corticali sarà presenti e la correzione in 5 mL di paraformaldeide al 4% a 4 ° C per 24 h. trasferimento a 5 mL di 70% EtOH per 24 ore prima dell'inclusione in paraffina.
    Attenzione: 4% PFA: fissativo, uso nel gabinetto di fumi
  8. Per l'immunofluorescenza, posizionare un terzo del rene, affinché sia corticali e midollari glomeruli sarà presenti, nel tessuto stampo e cappotto in ottobre posto su ghiaccio secco per congelare e conservare a-80 ° C.
  9. Per proteine e RNA, posto 3 x 2 mm3 pezzi della corteccia del rene in tubi di plastica da 0,5 mL e riagganciare congelare in liquido N2. Conservare a-80 ° C. Per l'archiviazione a lungo termine del tessuto RNA, posizionare il tessuto in 5 volumi di soluzione di stabilizzazione di RNA e conservare a-80 ° C.
  10. Per l'isolamento dei glomeruli, tagliare il tessuto del rene restante e posto in 5 mL di soluzione di Ringer mammiferi con BSA 1% sul ghiaccio. Preparare al setaccio dei glomeruli immediatamente.

3. plasma creatinina

Nota: Creatinina del Plasma può essere up-regolati nella malattia renale, che indica una riduzione della capacità di filtrazione dei glomeruli. I livelli nel sangue dell'urea azoto (BUN) possono essere valutati anche, anche se il protocollo non è descritto qui.

  1. Centrifugare il campione di sangue a 500 x g per 15 min a 4 ° C.
  2. Raccogliere il plasma, che possa essere conservato a-20 ° C a breve termine a questo punto.
  3. Quantificare la concentrazione di creatinina del plasma usando un'analisi chimica della creatinina seguendo le istruzioni sopra per creatinina urinaria nel protocollo 1.11.
  4. Determinare la concentrazione di creatinina di ciascun campione leggendo la targhetta di un'assorbanza di 490 nm prima e dopo l'aggiunta della soluzione acida.
    Nota: La differenza tra questi valori di assorbanza è direttamente proporzionale alla concentrazione di creatinina in ciascun campione. Una curva standard è generazione dagli standard. Se il tecniche ripetizioni hanno un valore di CV supera al 5%, è possibile ripetere il dosaggio per i campioni.

4. isolamento dei Glomeruli

Nota: Glomeruli possono essere isolati per valutare la permeabilità dei glomeruli individuali ex vivo, nonché l'espressione di specifiche proteine e mRNA markers di malattia glomerulare.

  1. Prendere il tessuto del rene collocato in soluzione di Ringer mammiferi con BSA 1% e sezionare i glomeruli usando uno standard di setacciatura tecnica13. Brevemente, impilare i 70 µm (in basso), 100 µm, 125 µm, 175 µm, 250 µm e 425 µm setacci (superiore) a un bicchiere di vetro.
  2. Schiacciare il rene, utilizzando un stantuffo della siringa, nel µm 425 setaccio e spingere attraverso utilizzando lattato ghiaccio freddo mammiferi Ringer con BSA 1%. Come i bit del rene sono spinti attraverso, rimuovete il setaccio superiore e procedere a fare lo stesso sul prossimo. Ripetere fino a quando solo i 100 µm e 70 µm setacci rimangono.
  3. Trasferire il raccolto glomerulare trattenuto da 100 µm e 70 µm setacci a 10 mL di soluzione di Ringer mammiferi fresco con BSA 1%, sul ghiaccio.
    Nota: Se il numero dei glomeruli per lattato mL di Ringer è pochi, ridurre il volume di soluzione di Ringer, utilizzato per raccogliere i glomeruli dalle ultime due setacci.
  4. Prelevare 5 mL di soluzione contengono glomeruli in due tubi separati (2,5 mL ciascuno) e centrifugare a 1.000 x g per 10 min a 4 ° C. Rimuovere il supernatante e snap congelare i glomeruli in liquido N2 prima della conservazione a-80 ° C per proteina e l'estrazione di RNA in una data successiva.
  5. Posizionare la soluzione rimanente contenente dei glomeruli in un bagno di acqua a 37 ° C per la misura del glomerulare LpA / Vhoex vivo. Completare entro 3h di rimozione del rene.

5. permeabilità all'acqua glomerulare (LpA / Vho)

Nota: La glomerulare LpA / analisi di V consente la misurazione di ex vivo della permeabilità dei glomeruli individuali in modo rapido un modo riproducibile. Un aumento della glomerulare LpA / V indica interruzione di GFB, che è indicativa della malattia renale.

  1. Impostare il glomerulare LpA / Vho rig come descritto nel salmone et al10. Fare riferimento alla Figura 1 per un diagramma dettagliato del set up.
  2. Preparare le seguenti soluzioni: soluzione di Ringer mammiferi con BSA 1% (pH 7,4) e lattato mammiferi Ringer con 8% BSA (pH 7.4). Caldo sia a 37 ° C.
  3. Tirare le micropipette da tubi capillari di vetro (densità ottica: 1,2 mm). Generare un suggerimento di apertura di 5-8 µm tagliando la micropipetta sotto un microscopio.
  4. Utilizzare il glomerulare LpA / Vho rig per catturare intatti glomeruli individuali che sono privi di capsula di Bowman e tubolare frammenti sulla micropipetta mediante aspirazione. Un riepilogo dettagliato del dosaggio oncometric è trovato in salmone et al10. In breve, una volta un glomerulo viene catturato e bloccato sulla micropipetta aspirazione, iniziare a registrare il video del glomerulo sotto il microscopio.
  5. In primo luogo, equilibrare il glomerulo in soluzione di Ringer di BSA 1% per 30 s prima di passare il perifusate lattato concentrato 8% BSA Ringer per 10 s. Quindi il perifusate tornare alla soluzione di Ringer lattato BSA 1% e interrompere la registrazione.
  6. Mondare il glomerulo e ripetere il processo per 10-15 glomeruli per topo. Garantire le portate perifusate sono identici e non a veloce (10 mL/min) per non distorcere la struttura glomerulare.
  7. Misurare il tasso iniziale di restringimento glomerulare per calcolare la permeabilità glomerulare (LpA) normalizzata al volume glomerulare (Vio). Informazioni dettagliate per quanto riguarda l'analisi possono essere trovati in salmone et al10.

6. acido periodico di Schiff (PAS) macchia

Nota: La macchia PAS metterà in evidenza le membrane dello scantinato dei cicli capillari glomerulari e l'epitelio tubolare. Permette la visualizzazione dettagliata del cellule glomerulari, mesangiali matrice e potenziale espansione e potenziali cambiamenti del GBM (cioè, ispessimento e irregolarità).

  1. Sezione della corteccia del rene di paraffina, PFA-fisso usando un microtomo a 5 µm spessore sui vetrini rivestiti di poli-L-lisina. Secco a 37 ° C per 1 h. Assicurarsi che la sezione non contiene eventuali pieghe o fori, che possono distorcere la morfologia al microscopio.
  2. Deparaffinizzare diapositive incubando due volte in xilene (attenzione, irritante; uso nel gabinetto di fumi) per 3 minuti ciascuno, due volte in 100% EtOH per 3 minuti ciascuno e poi una volta in 95%, 70% e 50% EtOH per 3 minuti ciascuno, tutti a temperatura ambiente. Reidratare le diapositive in dH2O.
  3. Incubare i vetrini nella soluzione di acido periodico (attenzione, irritante; uso nel gabinetto di fumi) (1 g/dL) per 5 min e poi risciacquare le diapositive in diverse modifiche di dH2O. utilizzano un contenitore con 100 mL dH2O a temperatura ambiente.
    Attenzione: soluzione di acido periodico: irritante; utilizzare nel gabinetto di fumi
  4. Incubare i vetrini nel reattivo di Schiff (metabisolfito di sodio e 6 g/L di HCl Parasoaniline 4% in HCl 0,25 mol/L) per 15 min a temperatura ambiente. Lavare i vetrini in acqua corrente per 5 min.
  5. Colorazione con ematossilina per 3 s prima di risciacquare accuratamente scivoli in acqua corrente per 15 min.
    Nota: Alcune ottimizzazione può essere necessaria per determinare il momento ottimale per ematossilina.
  6. Disidratare i vetrini usando la marcia indietro del protocollo Sparaffinatura al punto 6.2. Finitura con xilene.
  7. Aria secche diapositive e montaggio con supporto di montaggio a base di xilene.
  8. Immagine su un microscopio ottico a 400 ingrandimenti per valutare strutture glomerulari. Valutare quanto segue: ispessimento e irregolarità del GBM, crollando di cicli capillari, tessuto fibrotico, sclerosi, proliferazione cellulare (endoteliale, Podocita e mesangiali, o cellule infiammatorie infiltranti il ciuffo).
    Nota: Per una valutazione completa della patofisiologia glomerulare, lesioni altrove nel rene dovrebbero essere valutata, ad esempio i tubuli.

7. trasmissione microscopia elettronica (TEM)

Nota: TEM consente l'esame delle anomalie ultrastrutturali nel rene, ad esempio il GBM Podocita piede processi e fenestrazioni endoteliali, che non sono visibili con la microscopia chiara. Questo è importante nei modelli dove danno renale non è così pronunciata (cioè, senza albuminuria e anomalie strutturali maggiori).

  1. Prendere il 2,5% gluteraldehdye - rene fisso a dadini e post-fissare in tetrossido di osmio 1% per 1 h. lavaggio in 50 mL di tampone cacodilato 0.1 M (pH 7,3) e quindi 50 mL di dH2O (3 x 15 min modifiche).
    Attenzione: 2.5% di glutaraldeide: toxic, sensibilizzante, irritante; utilizzare in un cabinet di fumi. 0.1 M sodio cacodilato: tossici, uso in un armadio di fumi
  2. Disidratare con EtOH e incorporare in resina Araldite.
  3. Tagliare sezioni allo spessore di 50-100 nm e macchia con 3% acetato di uranile (acquosa) e soluzione di citrato di piombo Reynolds.
  4. Assumere diverse aree del glomerulo 940 X digitale micrografie, 1250 X e 6200 X per essere sicuri che i podociti, GEnCs, GBM e mesangium possono essere identificati.
  5. Utilizzare ImageJ per analizzare i glomeruli accecati. Impostare la scala per ogni micrografo di 6200 X tracciando una linea tra due punti di distanza nota, ad esempio un righello. Va ad per analizzare e quindi impostare la scala, dove la lunghezza della linea verrà visualizzata in pixel. Digitare la distanza nota e unità di misura. Utilizzare i protocolli elencati di seguito per la misurazione di ogni parametro.
    Nota: Questa analisi richiede circa 1 giorno per topo. Per un'adeguata potenza statistica, utilizzare le misure media da 3 glomeruli da 3 topi.
    1. Per GBM, inserire una griglia fissa digitale (10x10) sopra il micrografo di 6200 X e misurare lo spessore del GBM nel punto dove si incrociano le linee della griglia il GBM. Misura dalla membrana delle cellule endoteliale basale alla membrana basale Podocita piede processo cellulare in una tangente perpendicolare alla membrana delle cellule endoteliale utilizzando lo strumento linea retta. Determinare la misura media per ogni glomerulo da 10 misurazioni individuali.
    2. Per il numero di finestratura endoteliale, misurare la lunghezza del GBM presente nel micrografo di 6200 X e contare il numero di fenestrazioni endoteliali per unità di lunghezza di GBM. Prendere una media da almeno 4 micrografie al glomerulo.
    3. Per il Podocita piede processo larghezza, inserire una griglia fissa digitale (10x10) sopra il micrografo di 6200 X. Misurare la larghezza del Podocita piede processi che attraversano le linee della griglia. Misurare la larghezza nella parte più larga del piede processo dove si incontra il GBM; Assicurarsi che la linea è perpendicolare alla tangente della membrana basale Podocita. Determinare la misura media per ogni glomerulo da 10 misurazioni individuali.
    4. Per Podocita larghezza a fessura, inserire una griglia fissa digitale (10x10) sopra il micrografo di 6200 X. Misurare la larghezza dei podociti fessura diaframmi che attraversano le linee della griglia. Questo è il punto dove i processi di piedi sono più vicini insieme, nella parte più larga di ogni processo di piede, da podociti membrana a membrana. Assicurarsi che la misura sia perpendicolare alla tangente della membrana basale Podocita. Determinare la misura media per ogni glomerulo da 10 misurazioni individuali.
    5. Per il numero di Podocita piede processi, misurare la lunghezza del GBM presente nel micrografo di 6200 X e contare il numero di processi pedicellari Podocita per unità di lunghezza di GBM. Prendere una media da almeno 4 micrografie al glomerulo.
    6. Per la copertura di spazio sub-Podocita, vedere Metodo dettagliato a Neal et al. 14.
  6. Utilizzando le micrografie X 940, esaminare glomeruli per la presenza di struttura anormale, depositi e infiltrati dall'occhio.

8. immunofluorescenza per Podocita e marcatori endoteliali

Nota: Immunostaining permette la visualizzazione dei modelli di espressione della proteina, ad esempio cicli capillari endoteliali, che possono comprimere nella malattia glomerulare.

  1. Posizionare il OCT-stampo contenente rene congelato a-20 ° C per 2 h prima del sezionamento. Assicurarsi che la superficie di taglio del rene è messo attentamente contro il fondo dello stampo-OCT per attivare le sezioni di tessuto ben orientato.
  2. Utilizzando un criostato, vetrini rivestiti con tessuto di sezione con uno spessore di 5 µm a poli-L-lisina.
    Nota: Assicurarsi che ci siano pieghe o buchi nella sezione del tessuto, che può alterare la morfologia.
  3. Dopo l'estrazione dal criostato, Difficoltà diapositive nel 4% PFA per 10 min Wash diapositive 3 x 5 min in un contenitore con 100 mL di dH2O.
    Attenzione: 4% PFA: fissativo, uso nel gabinetto di fumi
  4. Per ridurre al minimo la quantità di anticorpo usato, disegnare intorno sezioni con una penna idrofobica. Non lasciare asciugare le sezioni.
  5. Incubare in blocco soluzione (BSA 3% e 5% di siero normale in 1X PBS) per 1 h a temperatura ambiente.
  6. Rimuovere la soluzione di blocco con un aspiratore e incubare sezioni con anticorpo primario (Nefrina, podocina o PECAM-1) diluito 1: 250 (3% BSA in PBS 1X). Mettere i vetrini in una camera umidificata a 4 ° C durante la notte. Se non è disponibile una camera umida, leggermente di posizionare una piccola striscia di parafilm sopra la diapositiva anticorpo-rivestite. Fare attenzione quando si rimuove il giorno successivo per non disturbare la sezione.
  7. Lavare i vetrini 3 x 5 min in 1X PBS.
  8. Incubare con l'anticorpo secondario fluorescente appropriato diluizione 1: 1000 (3% BSA in PBS 1X) per 2 h a temperatura ambiente al buio.
  9. Lavare i vetrini 3 x 5 min in 1X PBS. Montare con fluorescenti montaggio supporti contenenti DAPI.
  10. Diapositive di immagini con un microscopio a fluorescenza a 400 ingrandimenti per visualizzare dei glomeruli. Garantire che questo è accecato per evitare distorsione.
  11. Uso ImageJ per analizzare l'intensità di colorazione, normalizzate in zona glomerulare e il modello di macchiatura, vale a dire, numero di cicli capillari normalizzato alla zona glomerulare, in un modo accecato.

9. proteina estrazione e Western Blotting

Nota: Western blotting permette di valutare l'espressione di proteine conosciute per essere dysregulated nella malattia renale. Ad esempio, una riduzione dell'espressione podocina e Nefrina indica una perdita di podociti.

  1. Estrarre la proteina da corticale del rene e setacciati glomeruli; il protocollo è lo stesso per ciascuno e il volume di tampone di Lisi è regolato per la quantità di tessuto.
  2. Disgelo del rene/glomeruli sul ghiaccio prima di aggiungere NP-40 Lisi tampone contenenti inibitori di proteasi e fosfatasi (150 mM NaCl, 1% NP-40, 50 mM Tris pH 8). Omogeneizzare il campione per 30 s.
  3. Incubare i campioni omogeneizzati in ghiaccio per 30 minuti, Vortex a intervalli regolari.
  4. Centrifugare i campioni a 10.000 x g per 15 min a 4 ° C.
  5. Eliminare il surnatante in una nuova provetta sul ghiaccio.
    Nota: si aspettano di recuperare circa 1 mg di proteina per campione.
  6. Denaturare le proteine usando il tampone standard 4 x Laemmli. Far bollire la miscela a 95-100 ° C per 5 min.
  7. Valutare l'espressione di proteine marker delle cellule glomerulari (Nefrina, podocina, PECAM-1, ecc.) e la fosforilazione e l'espressione delle proteine conosciute/supposto essere alterato nei glomeruli renali/del modello di malattia mediante Western blotting ( Metodo standard; Meneghini e Yang15).
    Nota: Il protocollo variano a seconda le dimensioni e l'abbondanza della proteina di interesse.

10. RNA estrazione e reazione a catena della polimerasi (PCR)

Nota: analisi di espressione di mRNA permette di determinare come i geni sono regolati nella malattia renale, come i cambiamenti nell'espressione genica e splicing alternativo.

  1. Mentre la corteccia del rene è ancora congelata, accuratamente macinare in 3 mL di reagente fenolo usando un pestello e mortaio. Se usando gli estratti glomerulari, aggiungere 1 mL di reagente fenolo e omogeneizzare il campione per 30 s.
    Attenzione: Reagente TRIzol: irritante; utilizzare nel gabinetto di fumi
  2. Eseguire un'estrazione di RNA usando il metodo descritto da Chomczynski e Sacchi16.
    Nota: Kit di estrazione di RNA commerciali sono disponibili in alternativa a questo metodo.
  3. Valutare la quantità e la qualità del RNA ottenuto utilizzando uno dei vari metodi disponibili. il RNA è a questo punto aliquotati e conservati a-80 ° C. Evitare di ripetere congelare lo scongelamento.
    Nota: Se nuovo a questo metodo, controllare la qualità del RNA prima di procedere al passaggio successivo eseguendo il RNA su un gel di agarosio per garantire un chiaro 28S e 18S ribosomal banda. Aspettiamo di recuperare tra 2 a 5 µ g di RNA usando questo metodo.
  4. Dnasi trattare 1 µ g di RNA (marca volume fino a 10 µ l con acqua RNasi-free plus 1 µ l di DNasi e 1 µ l di tampone di DNasi) per 1 h a 37 ° C. Fermare la reazione con 1 µ l di soluzione bloccante dnasi a 65 ° C per 10 min.
  5. Aggiungere 0,5 µ l di oligo (dT) e gli iniettori casuali. Incubare a 70 ° C per 10 min.
  6. Spegnere immediatamente in ghiaccio per 5 min.
  7. Aggiungere quanto segue; Enzima trascrittasi inversa MMLV (400 U; Sostituisci con DEPC H2O in RT - esempio di controllo), buffer di MMLV (1x), dNTP mix (0,5 mM) e ribonucleasi inibitore (40 ore); fare fino a 50 µ l con acqua DEPC.
  8. Incubare a 37 ° C per 1 h seguita da 95 ° C per 5 min disattivare l'enzima la miscela di reazione.
    Nota: Per generare un rendimento superiore del cDNA, incubare a 37 ° C per 3 h.
  9. Valutare la quantità e la qualità del cDNA usando i vari metodi disponibili.
  10. Uso PCR per valutare i modelli di espressione e di splicing di mRNA di geni supposto essere dysregulated nel modello malattia glomerulare. Il protocollo varia a seconda del gene di interesse.

Representative Results

Urina è stata raccolta utilizzando gabbie metaboliche da wild type (WT), inducibile Podocita specifiche VEGF-A knock out (VEGF-A KO) e VEGF-A KO X Jhonny-VEGF165b topi (VEGF-A KO topi che over-esprimono l'isoforma b umano VEGF-A165in podociti in un maniera costitutiva). Su misura del rapporto albumina urinaria della creatinina alle settimane 0, 4, 10 e 14 dopo induzione di doxiciclina di VEGF-A KO, VEGF-A KO topi sviluppato progressivo albuminuria da 10 settimane rispetto al WT littermate controlli. I valori assoluti può essere visto in Figura 2Ae la normalizzazione alla linea di base di ogni valori del mouse nella Figura 2B. Tuttavia, albuminuria in non osservato nei topi di b165VEGF-A X Jhonny-VEGF-A (Figura 2), che indica che il VEGF-A165b è protettiva nel modello dell'albuminuria5.

La glomerulare LpAVmi è stata misurata in singoli glomeruli setacciati da WT, VEGF-A KO e VEGF-A X Jhonny-VEGF-A165b reni. Un esempio di come un glomerulo viene catturato e la contrazione osservata quando perifused con 8% BSA è mostrato in Figura 3A. Questo restringimento viene quindi utilizzato per determinare la glomerulare LpA / Vho per ogni glomerulo (Figura 3B). Topi KO per il VEGF-A ha avuto un significativo aumento glomerulare LpA / Vho a 14 settimane post induzione di VEGF-KO rispetto ai glomeruli controllo WT. Anche se più bassi in VEGF-A X Jhonny-VEGF-A165b topi, l'aumentata glomerulare LpA / V non è stato impedito di sovra-espressione di VEGF-A165b a 14 settimane5.

PAS di colorazione di sezioni di corteccia del rene 14 settimane dopo induzione di VEGF-A KO non ha rivelato alcune anomalie strutturali glomerulari nei VEGF-A KO o VEGF-A X Jhonny-VEGF-A165b topi (Figura 4A). Tuttavia, sull'analisi della ultra-struttura glomerulare tramite EM, VEGF-A KO topi avevano sviluppato una maggiore larghezza GBM, riduzione del numero di fenestrae endoteliale, è diminuito di copertura SPS e maggiore Podocita medio taglio (Figura 4-4F ). Il piede Podocita medio processo di larghezza e il numero di strisce è rimasto invariato (Figura 3B e 3G). Sovra-espressione di VEGF-A165b nei topi KO VEGF-A ha impedito i cambiamenti per il GBM e taglio (Figura 4 e 4F). Tuttavia, il VEGF-A165b ha avuto alcun effetto sul numero di fenestrae alterata e SPS copertura (Figura 4 e 4E)5.

RT-PCR effettuata su RNA Estratto da glomeruli setacciati ha rivelato che l'umano VEGF-A165b mRNA è presente solo nei topi di b165VEGF-A KO X Jhonny-VEGF-A (Figura 5A). Durante l'estrazione della proteina da glomeruli setacciati e valutazione dei livelli di proteine tramite Western blotting, l'espressione della proteina glomerulare di VEGFR-2 è stata trovata per essere diminuita in topi KO VEGF-A, che è stata impedita da sovra-espressione di VEGF-A165b ( Figura 5B e 5 C)5.

Figure 1
Figura 1. Impostare schematica dell'impianto di perforazione permeabilità glomerulare (LpA). (A) il glomerulo è catturato su (B) la micropipetta all'interno di un supporto mediante aspirazione, che è fissato su un supporto per la stabilità. (C) rettangolare 2mpx. Obiettivo 4x (D) di un microscopio con una videocamera. (E) soluzione di BSA 1% riscaldato a 37 ° C. (F) soluzione all'8% BSA riscaldato a 37 ° C. (G) remoto toccare cuscinetto perifusate-contenente due linee, che consente lo scambio rapido perifusate. (H) itinerario di perifusate verso la 2mpx, che poi si bagna il glomerulo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2. Rapporto della creatinina urinaria dell'albumina. (A) i valori dell'uACR alle settimane 0, 4, 10 e 14 dopo induzione di VEGF-A KO in topi165b WT, VEGF-A KO e VEGF-A X Jhonny-VEGF-A. (B) gli stessi valori dell'uACR normalizzato al valore basale (settimana 0) di ogni singoli mouse. Dell'uACR aumentato significativamente in topi KO per VEGF-A alle settimane 10 e 14 confrontati ai comandi di littermate WT, che è stata impedita nei topi di b165VEGF-A X Jhonny-VEGF-A (* p < 0,05; ANOVA a due vie, correzione per il confronto tra le coppie; n = 4-12 topi al punto di tempo; barre di errore: errore standard della media [SEM]). Questa figura è stata modificata da Stevens et al.5. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3. Misura della permeabilità glomerulare. (A) il glomerulo è catturato la micropipetta tramite aspirazione; il perifusate è passato da BSA 1% (Ai) a 8% BSA (Aii), e restringimento glomerulare è osservato. (B) le misurazioni effettuate prima e dopo il passaggio di BSA 8% vengono utilizzate per determinare la glomerulare LpA / Vho. (C) VEGF-A KO topi sviluppano un aumento glomerulare LpA / Vho a 14 settimane post induzione di VEGF-A KO confrontati ai comandi WT. Questo non è stato impedito significativamente nei topi di b165VEGF-A X Jhonny-VEGF-A (* p < 0,05; One-way ANOVA, correzione di Bonferroni per il confronto tra le coppie; n = 4-9 topi, 15-30 glomeruli; barre di errore: SEM). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4. Analisi strutturale glomerulare. (A) PAS macchiatura della corteccia del rene non ha indicato tutte le anomalie strutturali nei glomeruli da topi WT, VEGF-A KO e VEGF-A X Jhonny-VEGF-A165b (Ai - iii). EM ha rivelato le anomalie ultrastrutturali nei glomeruli VEGF-A KO (Aiv - vi). (B) la media FPW non è cambiato tra gruppi. (C) The GBM aumentato nei glomeruli VEGF-A KO, che è stato impedito di VEGF-A165b. (D) il numero di fenestrae è stato diminuito in glomeruli VEGF-A KO, che è rimasto inalterati dalla copertura di VEGF-A165b. (E) la SPS è stato diminuito in glomeruli VEGF-A KO, che inoltre è rimasto invariati da VEGF-A165b. (F) la media a taglio larghezza è stata aumentata in glomeruli VEGF-A KO, che è stato impedito di VEGF-A165b. (G) il numero di fessura è rimasto invariato fra i tre gruppi (* p < 0,05; One-way ANOVA, correzione di Bonferroni per il confronto tra le coppie; n = 3 topi, 9 glomeruli; barre di errore: SEM). Questa figura è stata modificata da Stevens et al.5. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5. espressione di mRNA e proteina di marcatori. (A) RT-PCR ha mostrato che umana espressione di mRNA di VEGF-A165b solo era evidente nei glomeruli setacciati dai topi di VEGF-A KO X Jhonny-VEGF-A165b. (B) Western blotting hanno indicato che l'espressione della proteina VEGFR-2 era down-regolata in glomeruli VEGF-A KO, che è stata impedita in glomeruli di b165VEGF-A KO X Jhonny-VEGF-A (* p < 0,05; One-way ANOVA, correzione di Bonferroni per il confronto tra le coppie; n = 3 - 6 topi; barre di errore: SEM). Questa figura è stata modificata da Stevens et al.5. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Questo protocollo descrive un work-up completo del rene che deve essere eseguito in modelli murini di malattia glomerulare, consentendo una grande quantità di informazioni per quanto riguarda il rene e la funzione glomerulare devono essere ottenuti da un unico mouse. Consentono i passaggi critici di ogni metodo per dettagliate analisi funzionali, strutturali e meccanicistiche della funzione glomerulare, compresa la valutazione della permeabilità dei reni nel suo complesso (misure della creatinina del plasma e dell'uACR), la permeabilità della singoli dei glomeruli (glomerulare LpA / Vho), esame delle alterazioni strutturali (PAS, Trichrome blu ed EM), la localizzazione della proteina (se) e l'espressione genica glomerulare (RT-PCR e Western blotting). Questi metodi sono fondamentali per la valutazione completa della funzione glomerulare in modelli murini di malattia renale.

Nel valutare la permeabilità della GFB, molti studi hanno optato per utilizzare il tasso di escrezione dell'albumina dell'uACR o 24h convenzionale come una misura efficace17,18. Anche se queste tecniche permettono la valutazione della permeabilità GFB nel suo complesso, non consente per la valutazione individuale permeabilità glomerulare e variazione tra i glomeruli. Gli studi precedenti hanno trovato misura del glomerulare LpA / V,i , per essere una misura più sensibile delle modifiche al GFB permeabilità5,9. Infatti, nei risultati della rappresentativi ha dimostrati in questa carta, a 14 settimane post induzione di VEGF-A KO, VEGF-A KO X Jhonny-VEGF-A165b topi hanno un significativamente più bassa dell'uACR rispetto ai topi KO VEGF-A; Tuttavia, questo risultato non viene riflessa nella glomerulare LpA / Vho misure, dove VEGF-A165b non ha impedito significativamente aumenta in GFB permeabilità (Figura 1 e Figura 2)5. Ciò dimostra l'importanza di utilizzare saggi multipli per valutare sia la permeabilità del rene e la permeabilità dei glomeruli individuali. Inoltre, la glomerulare LpA / Vho oncometric l'analisi suggerisce che la permeabilità dei glomeruli individuali dal rene stesso può variare notevolmente, in particolare malattia modelli5,10, 19. una limitazione alla misura la glomerulare LpA / Vho è che essa può essere eseguita solo nel punto finale sperimentale; Pertanto, misure regolari dell'uACR vengono richiesto di fornire un'indicazione del punto finale sperimentale.

Oltre a valutare il fenotipo funzionale, il presente metodo incoraggia inoltre la valutazione del fenotipo strutturale ed ultrastrutturale. Questo può essere fatto utilizzando una selezione di macchie quali PAS, tricromica e le macchie d'argento; ogni valutare diversi aspetti della morfologia glomerulare. Nei modelli acuti della malattia glomerulare, che è spesso il caso in modelli murini, è può essere difficile da rilevare eventuali anomalie strutturali maggiori utilizzando queste macchie, a meno che non sei un patologo renale addestrato. Di conseguenza, realizzazione di EM è suggerito per valutare l'ultrastruttura di GFB, che permette la misurazione quantitativa di parametri quali il GBM, fenestrae endoteliale e numero le dimensioni caratteristiche del Podocita. Tali misure richiedono una formazione minima eseguire e permette al ricercatore di determinare la cella-tipi e strutture interessate in un modello di malattia. Nell'esempio indicato nei risultati rappresentativi, il mouse VEGF-A KO è stato trovato per essere un modello delicato della malattia glomerulare, così, non presenti anomalie strutturali maggiori erano presenti al momento di colorazione PAS. Tuttavia, specifici del Podocita VEGF-A KO ha indotto i cambiamenti il GBM, podociti e cellule endoteliali durante l'esame l' ultra-struttura glomerulare5. Purtroppo, la preparazione del rene per EM descritte nel presente metodo non attivare il rilevamento del glicocalice endoteliale, che è anche conosciuto per avere effetti significativi sulla permeabilità del GFB19. Al fine di misurare con precisione la profondità di glicocalice, rene dovrebbe essere irrorare-fisso con glutaraldeide 2,5% con 1% Alcian blu per l'etichettatura di glicocalice endoteliale, come descritto in Oltean et al.19.

Una volta che sono stati valutati il fenotipo funzionale e strutturale, il pattern di espressione/attivazione di diversi geni e vie quindi può essere valutato specificamente nei glomeruli. Previa valutazione ultra-strutturale potrebbe dare alcune informazioni per quanto riguarda la cella tipi/glomerulare strutture coinvolte, che indica se Podocita o endoteliali specifici geni/pathways dovrebbe essere esaminato. Ad esempio, nei risultati rappresentativi dai topi KO VEGF-A, è stata osservata una riduzione del numero di fenestrae endoteliale (Figura 3D); Pertanto, l'espressione della proteina glomerulare di un indicatore endothelial noto per essere coinvolti nella via del VEGF-A è stato esaminato; VEGFR-2 (Figura 4B)5. Oltre l'espressione delle proteine nei glomeruli, la loro localizzazione possa anche essere visualizzata con se. In uno studio di Zhang et al.20, specifiche del Podocita sovraespressione di GLUT1 è stata confermata in podociti di se co-localizza il GLUT1 aumentata con podocina.

Rispetto ai metodi alternativi presentati nella letteratura per valutare la funzione glomerulare, l'uso del metodo descritto in questo documento per valutare la funzione del rene in modelli murini di malattia glomerulare permette il fenotipo glomerulare completamente essere valutata da molteplici aspetti. Utilizzando questo metodo, il ricercatore è in grado di determinare il fenotipo renale del modello e valutare il meccanismo quanto a perchè il fenotipo si sviluppa. Queste informazioni vitali sul meccanismo della malattia sono necessarie quando si esaminano le potenziali vie terapeutiche in questi modelli. Questo metodo può essere applicato facilmente per le indagini future in funzione glomerulare nella valutazione di fenotipi di malattia e di terapeutica potenziale.

In conclusione, questo protocollo generico ed adattabile descrive un work-up completo del rene per modelli murini di malattia glomerulare, consentendo una grande quantità di informazioni per quanto riguarda il rene e la funzione glomerulare devono essere ottenuti da un unico mouse. I metodi consentono di dettagliate analisi funzionali, strutturali e meccanicistiche della funzione glomerulare, che può essere applicato a tutti i modelli murini di malattia glomerulare.

Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato supportato dalla British Heart Foundation, Richard Bright VEGF Research Trust e il MRC.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Metabolic Cages Harvard Apparatus 52-6731
Tris buffered saline (10x) Sigma-Aldrich T5912-1L
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A2058
Mouse Albumin ELISA Quantitation Set Bethyl Laboratories E90-134
TMB ELISA Substrate solution ThermoFisher Scientific 34028
Sulphuric acid Sigma-Aldrich 339741
SPECTRstar nano BMG Labtech SPECTRstar nano or equivalent
RNAlater stabilisation solution ThermoFisher Scientific AM7020
4-15% precast protein gel BIORAD 4568084
4x Laaemmli Sample buffer BIORAD 161-0747
Mini Trans-Blot cell BIORAD 1703930
10x Tris running buffer BIORAD 1610732
Coomassie Brilliant Blue Dye ThermoFisher Scientific 20278
Creatinine Companion Exocell 1012 Strip Plate
Glutaraldehyde Solution Sigma-Aldrich G5882
Sodium Cacodylate Sigma-Aldrich C0250
10x Phosphate Buffered Saline ThermoFisher Scientific AM9625
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S7653
Sodium Acetate Sigma-Aldrich S2889
Sodium Phosphate Sigma-Aldrich 342483
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich S5761
Magnesium Sulfate Sigma-Aldrich M2643
Calcium Chloride Sigma-Aldrich C5670
D(+)Glucose Sigma-Aldrich G8270
EDTA Blood Collection tubes BD 367835
23-25G Needle BD PMC0735
EDTA Sigma-Aldrich E9884
10 ml Glass Vial Thomas Scientific 0914X10
Falcon 10 ml Polypropylene Tubes ThermoFisher Scientific 10110101
0.5 ml Tubes ThermoFisher Scientific 10681894
Disposable Tissue Molds ThermoFisher Scientific 22-363-553
Mouse Surgical Disection Kit ThermoFisher Scientific 13-005-204
Optimal Cutting Medium ThermoFisher Scientific 23-730-571
4% Paraformaldehyde ThermoFisher Scientific AAJ19943K2
Glass Capillary Tubes Harvard Apparatus EC1 64-0770
Glomerular Permeability Rig Built at the Univeristy of Bristol - not comercially available Citation of LpA rig: Salmon et al. 2006; J. Physiol
Stainless Steel Sieves Cole-Parmer WZ-59984
Periodic Acid-Schiff (PAS) Staining System Sigma-Aldrich 395B-1KT
Hematoxylin Sigma-Aldrich H3136
Xylene MerckMillipore 108298
Poly-Prep Slides Sigma-Aldrich P0425-72EA
Mounting Medium ThermoFisher Scientific 8030
Osmium tetroxide solution Sigma-Aldrich 75632
Aradite Resin Agar Scientific CY212
Uranyl Acetate Agar Scientific AGR1260A
Lead Citrate Agar Scientific AGR1210
Cryostat ThermoFisher Scientific e.g. 957000H
Hydrophobic Pen Abcam ab2601
Nephrin (1243-1256) Antibody Acris BP5030
Anti-Podocin Sigma-Aldrich P0372-200UL
Anti-CD31 BD Biosciences 550274
Alexa Fluor Secondary Antibody ThermoFisher Scientific A32732
Vectashield Mounting Medium with DAPI Vector Labs H-1200
NP40 Cell Lysis Buffer ThermoFisher Scientific FNN0021
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail ThermoFisher Scientific 78437X4
10x Transfer Buffer BIORAD 1610734
PVDF Membrane ThermoFisher Scientific LC2002
HRP-Conjugated Secondary Antibodies Abcam ab6721
ECF Substrate for Western Blotting Fisher 10713387
TRIzol ThermoFisher Scientific 15596018
Dnase I New England Biolabs M0303S
M-MLV Reverse Transcriptase New England Biolabs M053S
Oligo dT ThermoFisher Scientific 18418012
Random Primers ThermoFisher Scientific 48190011
dNTP ThermoFisher Scientific 18427088
Ribonuclease Inhibitor ThermoFisher Scientific 10777019
DEPC Water ThermoFisher Scientific AM9915G
Fluorescent Light Miscroscope Leica Microsystems
Image J Analysis Software Image J
PCR Thermocycler ThermoFisher Scientific
TEM Microscope Britannica

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References

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Valutazione della funzione del rene in modelli murini di malattia glomerulare
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Stevens, M., Oltean, S. Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease. J. Vis. Exp. (136), e57764, doi:10.3791/57764 (2018).More

Stevens, M., Oltean, S. Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease. J. Vis. Exp. (136), e57764, doi:10.3791/57764 (2018).

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