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Medicine

신장 기능 사 질병 마우스 모델에서의 평가

doi: 10.3791/57764 Published: June 30, 2018

Summary

이 프로토콜에는 전체 신장 작업 업 사 질병 마우스 모델에서을 수행 하는 설명 합니다. 사 병의 모든 마우스 모델에 적용할 수 있는 사 기능의 자세한 기능, 구조, 및 기계적 분석 방법 허용.

Abstract

인간의 신장 질환을 모방 murine 모델의 사용은 점점 일반적 되고있다. 우리의 연구는 당뇨병 신 장병 및 podocyte 관련 VEGF A 녹아웃 쥐; 사 기능 평가에 초점을 맞춘합니다 따라서,이 프로토콜 설명 전체 신장 작업-최대 광대 한 양의 신장 및 단일 마우스에서 얻을 수 사 기능에 관한 정보를 사용 하면 사 병의 이러한 마우스 모델을 평가 하기 위해 우리의 실험실에 사용 합니다. 사 기능을 평가 하기 위해 문학에서 제시 하는 다른 방법, 비교이 문서에 설명 된 메서드를 사용 하 여 여러 측면에서 완전히 평가 하 사 형 수 있습니다. 이 메서드를 사용 하 여 연구원 모델의 신장 형을 결정 하 고 표현 형을 개발 하는 왜에 관해서는 메커니즘을 평가할 수 있습니다. 질병의 기계 장치에 중요 한 정보는이 모델에 잠재적인 치료도 검토할 때 필요 합니다. 방법의 구조와 매우 구조 시험 뿐만 아니라 오 줌 알 부 민 크 비율 및 개별 사 물 침투성, 측정을 통해 사 여과 방 벽의 상세한 기능 평가 대 한 허용 정기 산 Schiff 얼룩이 및 전자 현미경을 사용 하 여. 또한, mRNA와 단백질 수준에 유전자 dysregulated의 분석을 사 기능의 기계적 분석을 수 있습니다. 이 프로토콜 사 질병의 모든 마우스 모델에 적용 될 수 있는 일반 하지만 적응할 수 있는 방법을 설명 합니다.

Introduction

인간의 신장 질환을 모방 murine 모델의 사용은 점점 일반적 되고있다. 이러한 murine 모델 포함 자발적인 모델을 자연스럽 게 고혈압 쥐 (SHR)1, streptozotocin (STZ)-당뇨병 쥐와 쥐2, 유도 및 db/db 타입 II 당뇨병 쥐3와 같은 유전자 조작된 모델 기본 podocyte 특정 초점 단편 사 경화 증 (FSGS) 모델4, podocyte 특정 혈관 내 피 성장 인자 (VEGF-A) 노크 아웃 (VEGF-A 코) 모델5, 그리고 Alport 증후군6, 모델 인수 5/6 신78의 일방적인 ureteral 방해 (UUO) 모델 등 모델. 이러한 모델에서 사 기능의 다양 한 측면을 평가, 몇 가지 기술을 사용할 수 있습니다. 이 방법은 종이의 목적은 완전히 평가 사 기능 신장 질환의 마우스 모델에서 수행 해야 하는 포괄적인 작업 최대 보여.

이 메서드를 사용 하 여 뒤에 근거는 그것 완전히 여러 측면에서 평가 하 사 형 수 있습니다. 이 평가 사 침투성, 단백질, 물, 사 구조 이상, 그리고 식/mRNAs 및 단백질 정상 사 기능에 대 한 필수의 접합에 변화를 포함 한다. 이 메서드를 사용 하 여 연구원 모델의 신장 형을 결정 하 고 표현 형을 개발 하는 왜에 관해서는 메커니즘을 평가할 수 있다. 이것은 이러한 모델에 잠재적인 치료도 검토할 때 필요한은 질병의 메커니즘에 대 한 중요 한 정보 이다.입니다.

문학, 그것은 사 질병 표현 형의 소변에서 알 부 민 증가 수준에 의해 결정 됩니다의 마우스 모델을 제시 하는 일반적인 발생. 그러나, 증거가 제안 사 기능을 결정 하는 하나의 방법을 하지 항상 효과; 총 신장 기능, 그리고 개별 glomeruli의 정보를 제공 합니다만 요 알 부 민 배설 속도 또는 오 줌 알 부 민 크 비율 (uACR)를 측정. 이전 연구 침투성 다른 glomeruli 같은 신장5,,910에서에서 변화할 수 있다 설명 했다. 또한, 개별 glomeruli의 침투성의 평가 평가 사 기능;의 더 민감한 방법 개별 사 물 침투성 측정 기술 (LpA / V) uACR9측정 보다 사 기능에서 변화에 더 민감한 것으로 나타났습니다. 이 분석 결과 저항 proteinuria c57BL/6 배경11등을 마우스 모델에서 유용 합니다. 현재 방법 종이의 장점은 그것은 알 부 민을 총 신장 침투성 뿐만 아니라 개별 사 침투성 물 검사.

사 구조적 이상이의 검사는 종종 얼룩 등 정기 산 Schiff (PA), trichrome, 그리고 실버 얼룩의 배터리에 의해 평가 됩니다. 이러한 점수 매기기 방법을 통해 신장 질병의 수준을 평가 하는 훈련된 신장 병리학 자 가능 모든 좋은 방법, 사 매크로 구조에 변화에 항상 나타나지 않으면 비록 급성 신장 손상 모델12. 이 메서드는 실행 위에서 설명한 신장 조직학 기술, 뿐만 아니라 사 울트라 구조 또한 평가 되어야 합니다 전자 현미경 (EM)를 통해 제시 한다. 얼룩진된 glomerulus 상대적으로 일반 조명 현미경; 정상 볼 수 있습니다. 그러나, EM, 작은 변화, 사 지하실 멤브레인 (GBM) 폭에서과 평가 시 podocyte 발 과정 겸, 내 피 fenestrations, 그리고 하위-podocyte 공간 범위 분석 이다. 따라서, 사 울트라-구조와 마이크로 구조 사 역의 메커니즘을 확인 평가 생명 이다.

평가 사 구조 이상, 뿐만 아니라 사 질병의 메커니즘을 더 명료 하 mRNA와 단백질 표정 및 접합로 단백질 활성화 (예를 들어, 인 산화), 변화를 시험 한다. 사 병을 볼 때 또는, 예를 들어, 코/오버-expressing 유전자는 podocyte 전용 VEGF-A 코 마우스5, 같이 사 셀에 특히 중요 하다 단백질 mRNA의 변화만 내 검사는 사 세포, 그리고 전체 신장 하지입니다. 이 프로토콜 있는 glomeruli 마우스 신장 피 질에서 격리 되며 다음 단백질/RNA 격리 하는 방법을 설명 합니다. 이 질병 모델의 glomeruli 단백질/mRNA dysregulation의 특정 분석을 수 있습니다.

이 프로토콜의 광대 한 양의 신장 및 단일 마우스에서 얻을 수 사 기능에 관한 정보를 사용 하는 사 질병 마우스 모델에서 실행 되어야 하는 최대-전체 신장 작업에 설명 합니다. 사 병의 모든 마우스 모델에 적용할 수 있는 사 기능의 자세한 기능, 구조, 및 기계적 분석 방법 허용.

Protocol

모든 실험은 영국 입법 및 지역 윤리 위원회 승인에 따라 실시 했다. 동물 연구는 연구 윤리 위원회는 브리스톨의 대학에 의해 승인 되었다.

1. 오 줌 알 부 민 크 비율 (uACR)

참고: uACR는 알 부 민을 GFB의 침투성을 평가 하기 위해 사용 됩니다. 소변에서 알 부 민의 존재는 크 소변 유량 변화에 대 한 제어를 정규화 GFB 걸쳐 증가 침투성을 나타냅니다. 단백뇨는 만성 신장 질환에 대 한 일반적인 마커.

  1. 실험적인 끝점까지 실험 초기에 고 (일단 일단 월간에 주간) 정기적으로 소변을 수집 합니다.
  2. 물과 농축 다이어트와 마우스 대사 케이지를 설정 합니다. 조용한 방에 6 h에 대 한 개별 장에 마우스 (남성, 세 6-8 주)를 배치 합니다.
  3. 빈 연습장에서 일반 주택 및 수집 소변 반환 쥐 50 µ L의 최소가 필요 합니다.
    참고: 경우 마우스는 주어진된 시간에 소변을 생성 하지 않는, 따뜻한 방에 또 다른 날에 반복 합니다.
  4. 원심 500 x g 10 분 수집에서 소변 소변 그리고 podocyte 손실을 평가 하기 위해 토사를 유지 합니다. 이 시점에서 짧은 기간에-20 ° C에서 소변을 저장 합니다.
  5. 1 버퍼링 x Tris 염 분 (TBS pH 7.5)에 단백뇨의 정도 따라 1:10000 희석을 1: 500에에서 1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA)로 소변을 희석.
    참고: 최종 볼륨 이어야 한다 > 400 µ L. 각 시간에 바로 희석을 결정 하는 최적화 포인트.
  6. 요 알 부 민 농도 마우스 알 부 민 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA) 당 제조업체의 지침을 사용 하 여 계량.
    1. 간단히, ELISA 격판덮개, 실 온에서 1 h에 대 한 반대로 마우스 알 부 민 주 항 (0.5 M 탄산-중 탄산염 ph 9.6 10 µ g/mL)의 100 µ L 단백질 바인딩을 최적화 코트.
    2. 5 번 1 x TBS 플러스 0.05%와 우물에서 워시 초과 항 체 트윈 (pH 8.0), 솔루션 (1 x TBS 1% BSA ph 8.0) 실 온에서 하룻밤 차단의 200 µ L을 추가 하 고.
  7. 세척 접시 5 번 하 고 기준의 100 µ L를 추가 (직렬 희석: 15.63 µ g/ml 1 %BSA, pH 8.0와 1 x TBS에서 2000 µ g/mL), 공백, 그리고 3 중에 희석된 샘플. 실 온에서 1 h 동안 둡니다 다음 세척 접시 5 번.
    1. 각 잘 (1 %BSA, pH 8.0와 1xTBS에서 10 ng/mL)에 HRP 탐지 항 체의 100 µ L을 추가 하 고 1 시간에 대 한 실 온에서 품 어.
    2. 세척 접시 5 번 하 고 각 우물에 효소 기판 솔루션의 100 µ L를 추가 합니다. 15 분에 대 한 개발 및 0.18 M 황산의 100 µ L을 추가 하 여 반응을 중지 어둠 속에서 접시를 두고 (H2이렇게4).
      주의: H24 부식성 이므로.
  8. 450의 흡 광도에서 접시를 읽어서 각 샘플의 알 부 민 농도 결정 nm. 표준 곡선을 사용 하 여 각 샘플에 있는 알 부 민을 계량. 기술 반복 CV 값 5% 보다 큰 경우, 그 샘플에 대 한 분석 결과 반복 합니다.
  9. 또는 전기 이동 법을 사용 하 여 오 줌 알 부 민 농도 평가 합니다. 15 µ L의 소변에 단백질 샘플 로딩 버퍼 x 4의 5 µ L를 추가 합니다. 샘플 10 분 동안 95 ° C에가 열 하 고 4-12% 트리 스 캐스트 젤으로 로드 합니다.
    1. 100 V와 제조 업체의 프로토콜 당 Coomassie 파란에서 얼룩 하룻밤에 젤을 실행 합니다.
    2. 젤 이미징, 후 densitometry 사용 하 여 컨트롤에 상대적인 배 변경 알 부 민 농도 평가.
      참고: 아무 밴드는 예상 하는 경우 알 부 민에 대 한 경우, 소변의 단백질 농도 평가 하 고 젤에 추가 하는 소변의 볼륨을 조정 합니다.
  10. DH2O 1:1, 1:5, 1시 10분에서에서 원시 소변 샘플을 희석.
    참고: 최종 볼륨 이어야 한다 > 70 µ L. 각 샘플의 오른쪽 희석을 결정 하는 최적화.
  11. 요 크 농도 키트 지침 당 화학 분석 결과 사용 하 여 계량. 간단히, 3 중에서 96 잘 접시에 크 표준, 공백, 또는 희석 소변의 20 µ L 로드.
  12. 490의 흡 광도에서 접시를 읽어서 각 샘플의 크 농도 결정 nm 전과 산 성 솔루션을 추가 후 (주의 부식성; 피부에 접촉 하지 않도록).
    참고: 흡 광도 값 사이의 차이 각 샘플에 있는 크 농도에 직접 비례. 표준 곡선에서 기준 세대입니다. 기술 반복 CV 값 5% 보다 큰 경우, 그 샘플에 대 한 분석 결과 반복 합니다.
  13. UACR (µ g/mg)을 생성 합니다. 데이터를 그래픽 표현에 대 한 각 마우스의 기준 값을 정상화.

2. 조직 및 혈액 컬렉션

참고: 사 조직과 신장 신장 질병의 구조, 단백질, 및 mRNA 식 마커를 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. 혈액 마커 크는 glomeruli의 여과 용량에 있는 감소를 나타내는, 신 장병에 최대 통제 될 수 있는 등 신장 기능을 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다.

  1. 다음과 같은 솔루션을 준비: 0.1 M 나트륨 cacodylate (pH 7.3), 4 %paraformaldehyde 버퍼링 하는 인산 염 (PBS), 포유류 벨의 솔루션 (115 m m 염화 나트륨 (NaCl), 10 m m 나트륨 아세테이트 (채널3COONa), 1.2 x 1에서에 신선한 2.5%도 m m 인산 나트륨 (Na2HPO4), 25 m M 탄산 (NaHCO3), 1.2 m m 황산 마그네슘 (MgSO4), 1 m m 칼슘 염화 물 (CaCl2), 5.5 m m D (+) 포도 당, pH 7.4) 1 %BSA 1 x PBS.
    주의: 2.5%도: 독성, 감광, 자극; 연기 캐비닛에 사용 합니다. 0.1 M 나트륨 cacodylate: 독성, 연기 캐비닛에 사용. 4 %PFA: 정착 액, 연기 캐비닛에 사용
  2. 다음 재료 준비: isoflurane, 작은 ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)-혈액 튜브, 23-25 G 바늘, 5 mL EDTA 코팅 주사기, 10 mL 유리 튜브, 10 mL 플라스틱 튜브, 0.5 mL 플라스틱 튜브, 일회용 티슈 형, 드라이 아이스, 액체 N 코팅 2, 마우스 수술 도구, 그리고 최적의 절단 매체 (10 월).
  3. 깊은 마 취 비 isoflurane 챔버, 또는 터미널 마 취 등 마 취 에이전트 (pentobarbital, 50 mg/kg의 해당 경로 사용 하 여 발 패드에 바늘 찌 르 기에 반응 하는 마우스를 통해 확인 되는 마우스 복 [IP]; avertin, 240 mg/kg IP), 또는 이산화탄소 (CO2) 노출 (75% CO2/25% O2).
  4. 좌 심 실에 심장 빵 꾸를 통해 마우스를 추려 고 가능한 많은 혈액을 수집 합니다. 최대 4 h EDTA 코팅 혈액 튜브에 전송. 선호 하는 경우 경 정 맥 파열를 하지 않도록 주의 쥐 경부 전위 통해 잡아가고 있습니다.
  5. 복 부와 얼음 감기 1 x PBS에 세척을 통해 신장 밖으로 해 부.
  6. 대뇌 피 질의 glomeruli 검사, 신장 피 질에의 한 극을 제거 하 고 1 m m3 조각으로 잘라. 깊은 juxta 골 수 glomeruli 검사 하려면 조직에서 모 수와 동일한 기술을 반복 합니다. 유리 안에 유리병에 2.5%도 솔루션의 5 mL에 놓습니다. 4 ° c.에 게
    주의: 2.5%도 솔루션: 독성, 감광, 자극; 연기 캐비닛에 사용
    참고: 최상의 결과 위해 1 개월 이내에 처리 합니다.
  7. 조직학, 24 h. 70%의 5 mL에 4 ° C에서 4 %paraformaldehyde 5 mL에 신장 외피 및 juxta 골 수 glomeruli 있을 것입니다, 있도록 수정의 상단 세번째 제거 EtOH 파라핀에 포함 하기 전에 24 시간 동안.
    주의: 4 %PFA: 정착 액, 연기 캐비닛에 사용
  8. 면역 형광 검사, 신장 피 질과 골 수 glomeruli 조직 형 및 10 월에 외 투에 존재 될 제 3 장소에 동결 하 고-80 ° c.에 저장 드라이 아이스
  9. 단백질 및 RNA, 신장 피 질 0.5 mL 플라스틱 튜브와 스냅의 장소 3 x 2 mm3 조각 액체 N2에 고정합니다. -80 ° c.에 게 RNA에 대 한 장기 조직의 스토리지, 조직 RNA 안정화 솔루션의 5 볼륨에 배치 하 고-80 ° c.에 저장
  10. Glomeruli의 격리, 나머지 신장 조직을 슬라이스와 얼음에 1 %BSA 포유류 벨의 솔루션의 5 mL에. 즉시 glomeruli 체를 준비 합니다.

3. 플라즈마 크

참고: 플라즈마 크는 glomeruli의 여과 용량에 있는 감소를 나타내는, 신 장병에 최대 통제 될 수 있습니다. 프로토콜 여기 설명 하지는 않지만, 혈액 우 레 아 질소 (롤빵) 수준 또한 평가 될 수 있습니다.

  1. 4 ° c.에 15 분 동안 500 x g에서 혈액 샘플을 원심
  2. 짧은 기간에-20 ° C에이 시점에서 저장 될 수 있는 플라즈마를 수집 합니다.
  3. 플라즈마 크 농도 프로토콜 1.11에에서 요 크에 대 한 위의 지침 당 화학 크 분석 결과 사용 하 여 계량.
  4. 490의 흡 광도에서 접시를 읽어서 각 샘플의 크 농도 결정 전과 산 성 솔루션을 추가 후 nm.
    참고: 이러한 흡 광도 값 사이의 차이 각 샘플에 있는 크 농도에 직접 비례. 표준 곡선에서 기준 세대입니다. 기술 반복 CV 값 5% 보다 큰 경우, 그 샘플에 대 한 분석 결과 반복 합니다.

4입니다. Glomeruli 격리

참고: Glomeruli 개별 glomeruli 비보 전,의 침투성 뿐만 아니라 특정 단백질의 표현과 사 병의 mRNA 마커를 평가 하기 위해 고립 될 수 있다.

  1. 신장 조직 1 %BSA 포유류 벨의 솔루션에 배치 하 고 glomeruli 기법13체질 표준을 사용 하 여 해 부. 간단히, 스택 70 µ m (아래), 100 µ m, 125 µ m, 175 µ m, 250 µ m, 고 유리 비 커에 425 µ m (최고) 체.
  2. 매 시 신장, 425 µ m로 주사기 플런저를 사용 하 여 체 1 %BSA 얼음 차가운 포유류 벨의 솔루션을 사용 하 여이 겨. 신장의 비트를 통해 올려집니다, 상위 체를 제거 하 고 같은 일을 진행. 만 100까지 반복 µ m 및 70 µ m 체 남아 있다.
  3. 전송 100 µ m 및 70 µ m에 의해 유지 하는 사 베스트 10 mL의 얼음에 1 %BSA 신선한 포유류 벨의 솔루션을 체.
    참고: glomeruli mL 벨의 솔루션 당 수가 몇 경우는 glomeruli 마지막 두 체에서 수집 하는 데 사용 하는 벨의 솔루션의 볼륨을 줄일 수 있습니다.
  4. 두 개의 별도 튜브 (각 2.5 mL) glomeruli 및 4 ° c.에서 10 분 1000 x g에서 원심 분리기를 포함 하는 솔루션의 5 mL을 제거 상쾌한을 제거 하 고 스냅 단백질 및 RNA 추출 나중에-80 ° C에서 저장 하기 전에 액체 N2 glomeruli 동결.
  5. 장소 glomeruli 사 LpA의 측정에 대 한 37 ° C에서 물 욕조에 포함 된 나머지 솔루션 / V비보 전. 신장 제거 3 h 이내 완료 합니다.

5. 사 물 침투성 (LpA / V)

참고: 사 LpA / V 분석 결과 ex vivo 측정이 가능 개별 glomeruli의 침투성의 빠른 재현 하는 방식으로. 증가는 사 LpA / V 는 신장 질병의 암시는 GFB의 나타냅니다.

  1. 설정 사 LpA / V장비 연어 10에 설명 된 대로. 설정의 자세한 다이어그램 그림 1 을 참조 하십시오.
  2. 다음과 같은 솔루션을 준비: 1 %BSA (pH 7.4)와 포유류 벨의 솔루션 및 8 %BSA (pH 7.4)와 포유류 벨의 솔루션. 37 ° c 둘 다 따뜻한
  3. Micropipettes 유리 모 세관 튜브에서 당겨 (광학 밀도: 1.2 m m). 5-8 µ m 조리개 팁 현미경 micropipette 절단 하 여 생성 합니다.
  4. 사 LpA를 사용 하 여 / V보 먼의 캡슐 및 흡입을 사용 하 여 micropipette에 관 파편은 그대로 개별 glomeruli 잡으려고 장비. Oncometric 분석 결과의 자세한 요약 연어 10에서 발견 된다. 간단히는 glomerulus 잡은 흡입 micropipette에 일단 현미경 glomerulus의 비디오 녹화를 시작 합니다.
  5. 첫째, 30 대 1 %BSA 벨 솔루션에서 glomerulus equilibrate s 10에 대 한 집중된 8 %BSA 벨의 솔루션에는 perifusate를 전환 하기 전에 s. 그리고 다시 1 %BSA 벨의 솔루션에는 perifusate 전환 녹음을 중지 합니다.
  6. glomerulus를 멀리 세척 하 고 10-15 glomeruli 마우스 당에 대 한 과정을 반복. Perifusate 유량은 동일을 하지 빠른 확인 (10 mL/min)을 사 구조를 왜곡.
  7. (Vi) 사 볼륨 정규화 사 물 침투성 (LpA)를 계산 하기 위해 사 수축의 초기 속도 측정 합니다. 연어 10분석에 대 한 자세한 정보를 찾을 수 있습니다.

6. 정기 산 Schiff (PA) 얼룩

참고: 사 모 세관 루프의 지하실 막과 관 상피 파스 얼룩 강조 표시 됩니다. 사 셀, mesangial 매트릭스 및 잠재력 확장, 및 잠재적인 변경 (, 두껍게 및 부정) GBM의의 상세한 시각화 수 있습니다.

  1. 폴 리-L-리 신 코팅된 슬라이드에 5 µ m 두께 톰을 사용 하 여 파라핀 포함, PFA 고정 신장 피 질 섹션. 1 헤 확인에 대 한 37 ° C에서 건조 섹션 포함 되지 않습니다 어떤 주름 또는 구멍, 현미경 형태학을 왜곡할 수 있다.
  2. 크 실 렌에서 배양 하 여 슬라이드를 deparaffinize (주의 자극; 연기 캐비닛에 사용) 3 분, 100% EtOH 3 분 각, 그리고 95%, 70% 및 50% 다음 한 번에 두 번 EtOH 3 분 각, 실 온에서 모두. 다시 슬라이드 dH2오 수 화
  3. 품 어 주기 산 성 솔루션에 슬라이드 (주의 자극; 연기 캐비닛에 사용) (1 g/dL) 5 분, 그리고 다음 린스 dH2오의 여러 변화에 슬라이드 사용 하 여 컨테이너 100 mL dH2O 실내 온도에.
    주의: 주기 산 솔루션: 자극; 연기 캐비닛에 사용
  4. Schiff의 시 약에 슬라이드를 품 어 (Parasoaniline HCl 6 g/L, 나트륨 metabisulfite 4% HCl 0.25 mol/L에) 실 온에서 15 분. 슬라이드 실행 5 분 동안 수돗물에 씻어.
  5. 3 Hematoxylin와 counterstain 실행 하는 15 분 동안 수돗물에 슬라이드를 철저 하 게 rinsing 전에 s.
    참고: 일부 최적화 되며 얼룩에 대 한 최적의 시간을 결정 하는 필요할 수 있습니다.
  6. 6.2 단계에서 deparaffinization 프로토콜의 역을 사용 하 여 슬라이드를 탈수. 크 실 렌으로 마무리.
  7. 공기 건조 슬라이드 그리고 크 실 렌 기반 설치 미디어와 함께 탑재.
  8. 사 구조를 평가 하기 위해 400 X 확대 가벼운 현미경에 이미지. 다음 평가: 두껍게 하 고는 GBM의 부정 모 세관 루프, 거리 조직, 경화 증, 세포 확산의 축소 (내 피, podocyte, 및 mesangial, 또는 선 동적인 세포 침투 술).
    참고: 사 이상 종합 평가, 대 한 신장에 다른 병 변 평가, tubules는 같은 이어야 한다.

7. 전송 전자 현미경 (TEM)

참고: 가장 GBM, podocyte 발 프로세스, 가벼운 현미경 검사 법으로 표시 되지 않습니다 내 피 fenestrations 등 신장에 매우 구조적 이상이 시험을 수 있습니다. 이 어디 신장 손상 안 그래서 발음 (, 단백뇨 및 주요 구조 이상) 모델에서 중요 하다.

  1. 2.5 %gluteraldehdye-고정된의 절단된 신장 고 후 1% 오스뮴 tetroxide 1 h. 워시 50 mL의 0.1 m M cacodylate 버퍼 (pH 7.3) 그리고 dH2O의 50 mL (3 x 15 분 변경) 수정.
    주의: 2.5%도: 독성, 감광, 자극; 연기 캐비닛에 사용 합니다. 0.1 M 나트륨 cacodylate: 독성, 연기 캐비닛에 사용
  2. EtOH와 디하이드레이션 및 Araldite 수 지에 포함.
  3. 50-100 nm 두께에서 섹션을 잘라내어 3% (수성) uranyl 아세테이트와 레이놀즈 리드 시트르산 솔루션 얼룩.
  4. 940 X에서 glomerulus의 여러 지역에 디지털 현미경, 1250 X, 그리고 6200 X 반드시 podocytes, GEnCs, GBM, 및 mesangium 확인 될 수 있다.
  5. ImageJ를 사용 하 여 멀게 glomeruli 분석. 통치자와 같은 알려진된 거리의 두 점 사이의 선을 그려 각 6200 X 현미경 사진에 대 한 규모를 설정 합니다. 분석, 이동한 다음 설정 규모, 선의 길이 픽셀 단위로 표시 됩니다. 알려진된 거리에 측정 단위를 입력 합니다. 각 매개 변수 측정에 대 한 아래에 나열 된 프로토콜을 사용 합니다.
    참고:이 분석 마우스 당 약 1 일 필요합니다. 3 쥐에서 3 glomeruli에서 평균 측정을 사용 하 여 적절 한 통계적 인 힘에 대 한 있습니다.
    1. GBM를 위한 6200 X 현미경 사진에 고정된 디지털 그리드 (10 x 10)를 삽입 하 고 그리드 라인은 GBM을 교차 하는 지점에 GBM의 두께 측정 합니다. 직선 도구를 사용 하 여 내 피 세포 막에 수직인 탄젠트에 기저 podocyte 발 과정 세포 막에는 기저 내 피 세포 막에서 측정 합니다. 10 개별 측정에서 각 glomerulus에 대 한 평균 측정을 결정 합니다.
    2. 내 피 창문 내기 수 6200 X 현미경 사진에 GBM의 길이 측정 하 고 GBM의 단위 길이 당 내 피 fenestrations의 수를 계산 합니다. 받아 glomerulus 당 최소 4 현미경에서 평균.
    3. podocyte에 대 한 프로세스 폭 발, 6200 X 현미경 사진에 고정된 디지털 그리드 (10 x 10)를 삽입 합니다. 그리드 라인을 교차 하는 podocyte 발 프로세스의 너비를 측정 합니다. 발 프로세스 GBM;을 만나는 그것의 가장 넓은 부분에 폭을 측정 라인은 podocyte 기저 막의 접선에 수직인 확인 합니다. 10 개별 측정에서 각 glomerulus에 대 한 평균 측정을 결정 합니다.
    4. 슬릿 폭 podocyte, 6200 X 현미경 사진에 고정된 디지털 그리드 (10 x 10)를 삽입 합니다. 그리드 라인 크로스 podocyte 슬릿 격 막의 너비를 측정 합니다. 이것은 발 프로세스 podocyte 막 막에서에서 함께, 각 발 과정의 가장 넓은 부분에서 가장 가까운 지점 이다. 측정은 podocyte 기저 막의 접선에 수직인 확인 합니다. 10 개별 측정에서 각 glomerulus에 대 한 평균 측정을 결정 합니다.
    5. Podocyte의 수에 대 한 프로세스를 발, 6200 X 현미경 사진에 GBM의 길이 측정 하 고 GBM의 단위 길이 당 podocyte 발 프로세스의 수를 계산. 받아 glomerulus 당 최소 4 현미경에서 평균.
    6. 하위 podocyte 공간 범위에 대 한 닐 에 자세한 방법을 참조 하십시오. 14.
  6. 940 X 현미경을 사용 하 여, 눈으로 glomeruli 비정상적인 구조, 예금, 그리고 침투의 존재에 대 한 검사 합니다.

8입니다. 면역 형광이 Podocyte과 내 피에 대 한

참고: Immunostaining는 사 병에서 축소 수 내 피 모 세관 루프는 단백질 식 패턴의 시각화 수 있습니다.

  1. OCT-형 단면 이전 2 시간 동안-20 ° C에서 냉동된 신장 포함 된 장소. 신장의 절단된 표면 신중 하 게 잘 방향의 조직 섹션 수 있도록 OCT 몰드의 하단에 배치 됩니다 확인 하십시오.
  2. cryostat 사용 하 여, 폴 리-L-리 신에 5 µ m 두께에 섹션 조직 슬라이드 코팅.
    주: 아무 주름 또는 구멍 형태를 왜곡할 수 있다 조직 섹션에서 확인 하십시오.
  3. 제거는 cryostat에서,에 따라 슬라이드 수정 4% PFA 10 분 세척에 대 한 슬라이드 dH2o.의 100 mL 용기에서 3 x 5 분
    주의: 4 %PFA: 정착 액, 연기 캐비닛에 사용
  4. 사용 하는 항 체의 양을 최소화 하기 위해 소수 펜 섹션 주위 그릴. 섹션을 건조 하지 마십시오.
  5. 실 온에서 1 h에 대 한 솔루션 (3 %BSA 및 1 x PBS에 5% 정상 혈 청) 차단에 품 어.
  6. 한 흡 인기와 차단 솔루션을 제거 하 고 기본 항 체 (Nephrin, podocin, 또는 PECAM-1) 희석 1: 250 (1 x PBS에 3 %BSA) 섹션을 품 어. 장소 슬라이드 4 ° C에서 습도 챔버에 하룻밤. 습 한 챔버를 사용할 수 없는 경우 가볍게 항 체-코팅 슬라이드 parafilm의 작은 스트립 장소. 섹션을 방해 하지로 다음 날을 분리할 때 주의 합니다.
  7. 1 x PBS에 슬라이드 3 x 5 분을 씻어.
  8. 어둠 속에서 실 온에서 2 h에 대 한 적절 한 형광 이차 항 체 희석 1:1000 (1x PBS에 3 %BSA)와 품 어.
  9. 1 x PBS에 슬라이드 3 x 5 분을 씻어. DAPI 포함 된 미디어를 탑재 하는 형광으로 탑재 합니다.
  10. 이미지 슬라이드는 glomeruli 볼 400 배 확대에 형광 현미경으로. 이것을 편견을 피하기 위해 눈을 멀게입니다 확인 하십시오.
  11. 사 지역 및 착 색, , 모 세관 루프의 수의 패턴으로 정규화 착 강도 분석 사용 ImageJ 멀게 방식에서 사 지역에 정규화.

9. 단백질 추출 및 서 부 럽

참고: 신장 질환에서 dysregulated 것으로 알려져 식 단백질을 평가 하기 위해 수 있습니다 부 럽. 예를 들어 podocin 및 nephrin 식 감소 podocyte 손실을 나타냅니다.

  1. 신장 피 질과 체질된 glomeruli;에서 단백질을 추출 프로토콜은 각 동일 하 고 세포의 용 해 버퍼의 볼륨 조직 금액 조정 됩니다.
  2. NP-40 세포를 추가 하기 전에 얼음에 녹여 신장/glomeruli 버퍼 (150 m m NaCl, 1 %NP-40, 50 mM Tris pH 8) 포함 하는 프로 테아 제와 인산 가수분해 효소 억제제. 30에 대 한 샘플을 균질 s.
  3. Vortexing 정기적으로 30 분 동안 얼음에 무 균된 샘플을 품 어.
  4. 4 ° c.에 15 분 동안 10000 x g에서 샘플을 원심
  5. 얼음에 신선한 튜브에 상쾌한을 제거 합니다.
    참고: 샘플 당 약 1 mg 단백질 복구를 기대 합니다.
  6. 표준 4 x Laemmli 버퍼를 사용 하 여 단백질 변성 5 분 동안 95-100 ° C에 혼합물을 비등 하십시오.
  7. 평가 사 세포 마커 단백질 (Nephrin, Podocin, PECAM-1, ) 및 인 산화의 표현과 알려진/서양 (blotting를 사용 하 여 질병 모델의 신장/glomeruli에서 변경할 가상 단백질의 표현 표준 방법; 마흐무드와 양15)입니다.
    참고: 프로토콜 크기와 관심사의 단백질의 따라 달라 집니다.

10. RNA 추출 및 연쇄 반응 (PCR)

참고: mRNA 표정 분석 어떻게 유전자 유전자 발현 및 대체 접합 변화 등 신장 질환에 통제 되는지 결정 하기 위해 수 있습니다.

  1. 신장 피 질이 여전히 고정 하는 동안 철저 하 게 유 봉과 박격포를 사용 하 여 페 놀 시 약 3 mL에 갈기. 사용 사 추출 물, 페 놀 시 약의 1 mL을 추가 하 고 30에 대 한 샘플을 균질 s.
    주의: TRIzol 시 약: 자극; 연기 캐비닛에 사용
  2. RNA 추출 Chomczynski 및 Sacchi16에서 설명 하는 방법을 사용 하 여 수행 합니다.
    참고: 상업 RNA 추출 키트가이 메서드 대신 사용할 수 있습니다.
  3. 사용할 수 있는 다양 한 방법 중 하나를 사용 하 여 얻은 RNA의 품질과 수량을 평가 합니다. RNA는이 시점에서 aliquoted 및-80 ° C에서 저장. 반복 하지 않도록 녹고 동결.
    참고:이 방법에 새로운 경우 분명 28S 고 18S ribosomal 밴드는 agarose 젤에 RNA를 실행 하 여 다음 단계로 진행 하기 전에 RNA의 품질을 확인 합니다. 이 메서드를 사용 하 여 RNA의 2 ~ 5 µ g 사이 복구를 기대 합니다.
  4. DNase 37 ° c.에 1 µ g RNA (RNase 무료 물으로 10 µ L 플러스 DNase의 1 µ L DNase 버퍼의 1 µ L 확인 볼륨)의 1 시간에 대 한 치료 10 분 동안 65 ° C에서 DNase 정지 솔루션의 1 µ L 반응을 중지 합니다.
  5. 올리고 (dT)와 임의의 뇌관의 0.5 µ L를 추가 합니다. 10 분 동안 70 ° C에서 품 어.
  6. 5 분 동안 얼음에 즉시 끄다.
  7. 다음 추가 합니다. MMLV 역전사 효소 (400 U; DEPC H2O RT-컨트롤 샘플에서에서 바꾸기), MMLV 버퍼 (1x), dNTP 믹스 (0.5 m m), 그리고 ribonuclease 억제제 (40 U); DEPC 물으로 50 µ L를 확인 합니다.
  8. 1 시간 뒤에 효소를 비활성화 하려면 5 분 동안 95 ° C에서 37 ° C에서 반응 혼합 품 어.
    참고: cDNA의 높은 수익률을 생성 하기 위해 품 어 3 h 37 ° C에서.
  9. 사용할 수 있는 다양 한 방법을 사용 하 여 cDNA의 품질과 수량을 평가 합니다.
  10. 유전자의 mRNA 접합 표현과 패턴을 평가 하는 PCR를 사용 하 여 사 질병 모델에서 dysregulated 수 가설. 프로토콜은 관심사의 유전자에 따라 달라 집니다.

Representative Results

야생 타입 (WT), (VEGF-A 코), 밖으로 유도할 수 있는 podocyte 전용 VEGF A 노크와 VEGF-A 코 X Neph-VEGF165b 쥐 대사 케이지를 사용 하 여 소변 수집 (VEGF-A 코 쥐-인간의 VEGF A165b isoform에 podocytes에서 표현 하는 구성 방식)입니다. 측정 오 줌 알 부 민 크 비율의 주 0, 4, 10, 14에서 VEGF-A 코의 doxycycline 유도 후, 시 VEGF-A 코 쥐 10 주 WT littermate 컨트롤에 비해 진보적인 단백뇨를 개발. 그림 2A, 및 그림 2B에 각 마우스 값의 기준선에 정규화 된 절대 값을 볼 수 있습니다. 그러나,에서 단백뇨 VEGF-A X Neph VEGF-A-165b 생쥐 (그림 2)에서 관찰 되지 않는 그 VEGF A165b은 단백뇨5의 모델에서 보호입니다.

사 LpAV 개별 glomeruli WT, VEGF-A 코, VEGF-A X Neph VEGF-A-165b 신장에서 sieved에서 측정 했다. 어떻게는 glomerulus는 고 수축의 예로 그림 3A에서8 %BSA perifused 표시 하면 관찰. 이 수축 사 LpA를 결정 하는 데 사용은 / V 각 glomerulus (그림 3B)에 대 한. VEGF A 코 쥐 했다는 크게 증가 사 LpA / V 14 주에 WT 제어 glomeruli에 비해 VEGF 코 유도 포스트. 비록 낮은 VEGF-A X Neph VEGF-A-165b 쥐, 증가 사 LpA / V 14 주5에서 VEGF A165b-식으로 하지 못했습니다.

싶어 서 신장 피 질 부분의 VEGF-A 코의 유도 후 14 주 얼룩 VEGF-A 코 또는 VEGF-A X Neph-VEGF-165b 생쥐 (그림 4A)에서 어떤 사 구조 이상 공개 하지 않았다. 그러나, 그들을 통해 사 울트라 구조 분석, 시 VEGF-A 코 쥐 했다 증가 GBM 폭을 개발, 내 피 fenestrae의 수를 감소, SPS 범위 감소 및 평균 podocyte 슬릿 폭을 증가 (그림 4C-4 층 ). 평균 podocyte 피트 폭 및 슬릿 변하지 않게 남아 있었다 (그림 3B 및 3 세대)의 수를 처리합니다. -표현의 VEGF-A 코 쥐에서 VEGF A165b는 GBM을 변화를 방해 하 고 슬릿 폭 (그림 4C 와 4 층). 그러나, A VEGF165b이 했다 변경 된 fenestrae 수와 SPS 범위 (그림 4D 및 4E)5에 영향을 주지 않습니다.

RT-PCR 체질된 glomeruli에서 추출한 RNA에 수행 이라고 밝혔다 인간의 VEGF A165b mRNA만 (그림 5A) VEGF-A 코 X Neph-VEGF-A165b 쥐에. VEGF A165b ( -식에 의해 방지 되었다 VEGF-A 코 생쥐에서 감소 VEGFR-2의 사 단백질 표정 발견 체질된 glomeruli 및 서쪽에 게 더 럽 히기를 통해 단백질의 수준을 평가 하 고에서 단백질을 추출 하는 경우 그림 5B 와 5 C)5.

Figure 1
그림 1입니다. 사 침투성 (LpA) 장비의 도식 설정. (A)는 glomerulus 적발 (B) 흡입을 사용 하 여 홀더 내 micropipette에 안정성에 대 한 마운트에 고정 됩니다. (C) 사각형 microslide입니다. (D) 4 X 비디오 카메라와 현미경의 목적. (E) 37 ° c 1 %BSA 솔루션 따뜻하게 ((F)) 8 %BSA 솔루션 37 ° c 예 열 (G) 원격 탭 베어링 두 포함 하는 perifusate 라인 빠른 perifusate 교류를 허용 합니다. (H) 다음은 glomerulus 목욕 microslide로 perifusate의 경로입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2입니다. 요 알 부 민 크 비율입니다. (A) uACR 값 0, 4, 10, 및 14 주 WT, VEGF-A 코와 VEGF-A X Neph-VEGF-165b 쥐에서 VEGF-A 코의 유도 후에. (B) 같은 uACR 값을 기준 값 (주 0) 각 개별 마우스의 정규화. uACR 주 10와 14 WT littermate 컨트롤에 비해 VEGF-A X Neph VEGF-A-165b 쥐에 방해 했다 VEGF-A 코 쥐에 크게 증가 (* p < 0.05; 양방향 ANOVA, 쌍; 사이의 비교에 대 한 보정 n = 4-12 시간 포인트; 당 쥐 오차 막대: [SEM] 의미의 표준 오류). 이 그림은 스티븐 스 5에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3입니다. 사 물 침투성의 측정입니다. (A) 는 glomerulus 흡입; 통해 micropipette에 잡힌 perifusate 1 %BSA (Ai)에서 8 %BSA (좋아), 전환 그리고 사 수 축을 관찰. (B) 측정 전후에 8 %BSA 스위치를 사용 하 결정 사 LpA / V. (C) 마우스 VEGF-A 코 개발 한 증가 사 LpA / V 14 주에 포스트 VEGF-A WT 컨트롤에 비해 코의 유도. 이것은 크게 막을 수 없습니다 VEGF-A X Neph VEGF-A-165b 쥐에 있는 (* p < 0.05; 한 가지 방법은 ANOVA, Bonferroni 보정 쌍; 사이의 비교에 대 한 n = 4-9 마우스, 15-30 glomeruli; 오차 막대: sem의). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4입니다. 사 구조 분석입니다. (A) 파 신장 피 얼룩 WT, VEGF-A 코와 VEGF-A X Neph-VEGF-165b 쥐 (Ai-iii)에서 glomeruli에 어떤 구조적 이상이 표시 하지 않았다. EM은 VEGF-A 코 glomeruli (Aiv-vi)에 매우 구조적 이상이 나타났다. (B) 평균 FPW 그룹 사이 변화 하지 않았다. (C)는 GBM 증가 VEGF-A 코 glomeruli는 VEGF A165b. fenestrae 수 VEGF-A 코 glomeruli, VEGF A165b. (E)는 SPS 보도 의해 불변에 남아 있었다 감소 되었다 (D) 에 의해 방지 되었다 이었다 VEGF-A 코 glomeruli, 또한 VEGF A165b. 슬릿 폭 평균 VEGF-A 코 glomeruli에 증가 되었다 (F) 불변에 남아 있었다에서 감소는 VEGF A165b. (G) 슬릿 수에 의해 방지 되었다 아니었다 변경 3 개 그룹 사이 (* p < 0.05; 한 가지 방법은 ANOVA, Bonferroni 보정 쌍; 사이의 비교에 대 한 n = 3 마우스, 9 glomeruli; 오차 막대: sem의). 이 그림은 스티븐 스 5에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5. 마커의 mRNA와 단백질 표정. (A) RT-PCR 인간의 VEGF A165b mRNA 표현 했다 VEGF-A 코 X Neph-VEGF-A165b 쥐에서 체질된 glomeruli 분명만 보였다. (B) 서 부 럽 표시는 VEGFR-2 단백질 표정 VEGF-A 코 glomeruli 아래로 통제 되는 VEGF-A 코 X Neph-VEGF-A165b glomeruli에서 방지 되었다 (* p < 0.05; 한 가지 방법은 ANOVA, Bonferroni 보정 쌍; 사이의 비교에 대 한 n = 3-6 쥐; 오차 막대: sem의). 이 그림은 스티븐 스 5에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Discussion

이 프로토콜의 광대 한 양의 신장 및 단일 마우스에서 얻을 수 사 기능에 관한 정보를 사용 하는 사 질병 마우스 모델에서 실행 되어야 하는 최대-전체 신장 작업에 설명 합니다. 각 방법의 중요 한 단계 (uACR 및 플라즈마 크 측정), 전체적으로는 신장에의 침투성의 평가 포함 하 여 사 기능의 자세한 기능, 구조, 및 기계적 분석에 대 한 허용의 침투성 개별 glomeruli (사 LpA / V), 구조 변경 (파, Trichrome 블루, 그리고 EM), 단백질 지 방화 (면), 그리고 사 유전자 발현 (RT-PCR 및 서쪽 blotting)의 검사. 이 메서드는 키 사 기능 신장 질병 마우스 모델에서의 전체 평가를.

GFB의 침투성을 평가할 때 효과적인 측정17,18로 기존의 uACR 또는 24 시간 알 부 민 배설 속도 사용 하 여 많은 연구 하셨습니다. 비록 이러한 기술을 허용 전체 GFB 침투성의 평가, 개별 사 침투성 평가 및 glomeruli 사이 유사에 대 한 허용 하지 않습니다. 이전 연구는 사 LpA의 측정 발견 / Vi GFB 침투성5,9에 변화의 더 민감한 측정 될. 사실,이 문서에서 설명 하는 대표적인 결과에서 14 주에 게시 VEGF-A 코의 유도, VEGF-A 코 X Neph-VEGF-A165b 쥐 VEGF-A 코 쥐;에 비해 상당히 낮은 uACR 그러나,이 결과는 사 LpA에에서 반영 되지 않습니다 / V 측정, VEGF A165b 크게 방지 하지 않았다 GFB 침투성 (그림 1그림 2)5증가. 이 신장 침투성 및 개별 glomeruli의 침투성을 평가 하기 위해 여러 개의 분석 실험을 사용의 중요성을 보여줍니다. 또한, 사 LpA / V oncometric 분석 결과 제안 같은 신장에서 개별 glomeruli의 침투성 크게 다를 수 있습니다, 특히 질병 모델5,10, 19. 사 LpA를 측정 한 제한 / V 그것만 실험 끝점;에서 수행할 수 있습니다 따라서, 일반 uACR 측정 실험 끝점의 표시를 제공 해야 합니다.

기능 형 평가, 이외에 현재 메서드는 또한 구조 및 ultrastructural 표현 형의 평가 권장 합니다. 이 행 해질 수 있다 파, trichrome, 같은 얼룩은 얼룩;의 선택을 사용 하 여 각 사 형태학의 다양 한 측면을 평가 하기 위해. 종종 마우스 모델의 경우는 사 병의 급성 모델에는 어떤 주요 구조적 이상이 있습니다 훈련된 신장 병리학이이 얼룩을 사용 하 여 감지 하기가 어려울 수 있습니다. 따라서, EM 수행 평가 매개 GBM, 내 피 fenestrae 크기 및 수, 및 podocyte 특성의 정량적 측정을 허용 GFB의 열 대권 외 건의 된다. 이러한 측정 수행에 최소한의 교육 요구 및 셀-종류/구조는 질병 모델에 영향을 확인 하기 위해 조사를 수 있습니다. 예 대표 결과에 VEGF-A 코 마우스 발견 사 질병의 가벼운 모델로, 따라서, 아무 주요 구조적 이상이 파스 얼룩에 참석 했다. 그러나, podocyte 특정 VEGF-A 코 않았다 유도 GBM, podocytes, 및 내 피 세포에 대 한 변경 사항을 사 울트라 구조5를 조사 하면. 불행 하 게도, 현재의 방법에서 설명 하는 그들에 대 한 신장의 준비 또한 GFB19의 침투성에 중요 한 영향으로 알려져 내 피 glycocalyx의 감지를 사용 하지 않습니다. Glycocalyx 깊이 정확 하 게 측정 하기 위해서는 신장 해야 합니다 2.5%도 내 피 glycocalyx 라벨에 대 한 1 %Alcian 블루 perfuse-고정 Oltean 19에 설명 된 대로.

기능과 구조 표현 형 평가 되어, 일단 다른 유전자 및 통로의 식/활성화 패턴은 glomeruli에서 특히 평가 다음 수 있습니다. 이전 초 구조 평가 관련 된, podocyte 또는 내 피-특정 유전자/경로 검사 해야 합니다 여부를 나타내는 형식/사 구조 셀에 대 한 몇 가지 정보를 줄 수 있습니다. 예를 들어 VEGF-A 코 쥐에서 대표적인 결과에서 내 피 fenestrae 수에 있는 감소 (그림 3D) 관찰 되었다; 따라서, VEGF A 통로에 관련 된 것으로 알려져 내 피 마커의 사 단백질 발현 조사 되었다; VEGFR-2 (그림 4B)5. glomeruli에 단백질의 표현 뿐만 아니라 그들의 지 방화 수 또한 구상 될 경우를 사용 하 여. 연구에서 장 20, podocyte 특정 overexpression GLUT1의 공동 podocin와 증가 GLUT1 지역화 하는 경우 의해 podocytes에서 확인 됐다.

사 기능을 평가 하기 위해 문학에서 제시 하는 다른 방법, 비교 사 질병 마우스 모델에서 신장 기능을 평가 하기 위해이 문서에서 설명 하는 메서드를 사용 하 여 수에서 완전히 평가 하 사 형 여러 측면입니다. 이 메서드를 사용 하 여 연구원 모델의 신장 형을 결정 하 고 표현 형을 개발 하는 왜에 관해서는 메커니즘을 평가할 수 있다. 질병의 기계 장치에 중요 한 정보는이 모델에 잠재적인 치료도 검토할 때 필요 합니다. 이 메서드는 질병 고기 및 잠재적인 치료제의 평가에 모두 사 기능으로 미래의 수사에 쉽게 적용할 수 있습니다.

결론적으로,이 일반 및 적응 프로토콜의 광대 한 양의 신장 및 단일 마우스에서 얻을 수 사 기능에 관한 정보를 사용 하는 사 질병 마우스 모델에 대 한 전체 신장 작업을 설명 합니다. 사 병의 모든 마우스 모델에 적용할 수 있는 사 기능의 자세한 기능, 구조, 및 기계적 분석 방법 허용.

Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

이 작품은 영국 심장 재단, 리처드 밝은 VEGF 연구, 믿음과 MRC에 의해 지원 되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Metabolic Cages Harvard Apparatus 52-6731
Tris buffered saline (10x) Sigma-Aldrich T5912-1L
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A2058
Mouse Albumin ELISA Quantitation Set Bethyl Laboratories E90-134
TMB ELISA Substrate solution ThermoFisher Scientific 34028
Sulphuric acid Sigma-Aldrich 339741
SPECTRstar nano BMG Labtech SPECTRstar nano or equivalent
RNAlater stabilisation solution ThermoFisher Scientific AM7020
4-15% precast protein gel BIORAD 4568084
4x Laaemmli Sample buffer BIORAD 161-0747
Mini Trans-Blot cell BIORAD 1703930
10x Tris running buffer BIORAD 1610732
Coomassie Brilliant Blue Dye ThermoFisher Scientific 20278
Creatinine Companion Exocell 1012 Strip Plate
Glutaraldehyde Solution Sigma-Aldrich G5882
Sodium Cacodylate Sigma-Aldrich C0250
10x Phosphate Buffered Saline ThermoFisher Scientific AM9625
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S7653
Sodium Acetate Sigma-Aldrich S2889
Sodium Phosphate Sigma-Aldrich 342483
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich S5761
Magnesium Sulfate Sigma-Aldrich M2643
Calcium Chloride Sigma-Aldrich C5670
D(+)Glucose Sigma-Aldrich G8270
EDTA Blood Collection tubes BD 367835
23-25G Needle BD PMC0735
EDTA Sigma-Aldrich E9884
10 ml Glass Vial Thomas Scientific 0914X10
Falcon 10 ml Polypropylene Tubes ThermoFisher Scientific 10110101
0.5 ml Tubes ThermoFisher Scientific 10681894
Disposable Tissue Molds ThermoFisher Scientific 22-363-553
Mouse Surgical Disection Kit ThermoFisher Scientific 13-005-204
Optimal Cutting Medium ThermoFisher Scientific 23-730-571
4% Paraformaldehyde ThermoFisher Scientific AAJ19943K2
Glass Capillary Tubes Harvard Apparatus EC1 64-0770
Glomerular Permeability Rig Built at the Univeristy of Bristol - not comercially available Citation of LpA rig: Salmon et al. 2006; J. Physiol
Stainless Steel Sieves Cole-Parmer WZ-59984
Periodic Acid-Schiff (PAS) Staining System Sigma-Aldrich 395B-1KT
Hematoxylin Sigma-Aldrich H3136
Xylene MerckMillipore 108298
Poly-Prep Slides Sigma-Aldrich P0425-72EA
Mounting Medium ThermoFisher Scientific 8030
Osmium tetroxide solution Sigma-Aldrich 75632
Aradite Resin Agar Scientific CY212
Uranyl Acetate Agar Scientific AGR1260A
Lead Citrate Agar Scientific AGR1210
Cryostat ThermoFisher Scientific e.g. 957000H
Hydrophobic Pen Abcam ab2601
Nephrin (1243-1256) Antibody Acris BP5030
Anti-Podocin Sigma-Aldrich P0372-200UL
Anti-CD31 BD Biosciences 550274
Alexa Fluor Secondary Antibody ThermoFisher Scientific A32732
Vectashield Mounting Medium with DAPI Vector Labs H-1200
NP40 Cell Lysis Buffer ThermoFisher Scientific FNN0021
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail ThermoFisher Scientific 78437X4
10x Transfer Buffer BIORAD 1610734
PVDF Membrane ThermoFisher Scientific LC2002
HRP-Conjugated Secondary Antibodies Abcam ab6721
ECF Substrate for Western Blotting Fisher 10713387
TRIzol ThermoFisher Scientific 15596018
Dnase I New England Biolabs M0303S
M-MLV Reverse Transcriptase New England Biolabs M053S
Oligo dT ThermoFisher Scientific 18418012
Random Primers ThermoFisher Scientific 48190011
dNTP ThermoFisher Scientific 18427088
Ribonuclease Inhibitor ThermoFisher Scientific 10777019
DEPC Water ThermoFisher Scientific AM9915G
Fluorescent Light Miscroscope Leica Microsystems
Image J Analysis Software Image J
PCR Thermocycler ThermoFisher Scientific
TEM Microscope Britannica

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References

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신장 기능 사 질병 마우스 모델에서의 평가
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Stevens, M., Oltean, S. Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease. J. Vis. Exp. (136), e57764, doi:10.3791/57764 (2018).More

Stevens, M., Oltean, S. Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease. J. Vis. Exp. (136), e57764, doi:10.3791/57764 (2018).

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